Методика шик-реакции на гликоген - оценка результатов. Аллергены и токсины для диагностических кожных проб Аллергены и токсины

Аллергены и токсины

Диагностические препараты

Иммуноглобулин противококлюшный антитоксический человека (Россия)

Сыворотка противодифтерийная лошадиная очищенная концентрированная жидкая (Россия)

Сыворотки и иммуноглобулины

Вакцина туберкулезная БЦЖ-М сухая (для щадящей первичной иммунизации, Россия)

Вакцина туберкулезная (БЦЖ) сухая для внутрикожного введения (Россия)

Акт-Хиб (Hib-вак, Южная Корея)

Коклюшная моновакцина (Россия)

Содержит коклюшные бактерии, консервант – мертиолят. Используют только по эпидпоказаниям вочагах коклюшной инфекции.

Содержит в 1 дозе 10 мкг полисахарида Haemophilus influenzae тип b, конъюгированного со столбнячным анатоксином, консервант – трометамол. Применяют для вакцинации детей с 2 месяцев по эпидпоказаниям.

Mycobacterium bovis BCG-1. Вакцинный штамм получен путем длительного (в течение 13 лет) выращивания туберкулезных микобактерий бычьего вида в неблагоприятных условиях на картофельно-глицериновой среде с добавлением желчи. Применяют для специфической профилактики туберкулеза. Вакцинацию проводят в на 5-7 день жизни, когда организм свободен от микобактериальной инфекции. Ревакцинации подлежат все здоровые дети, подростки и взрослые до 30 лет, отрицательно реагирующие на туберкулин. Механизм иммунитета при туберкулезе полностью не раскрыт. В клинической практике основным критерием напряженности вакцинального иммунитета служит переход отрицательной кожной реакции на туберкулин в положительную.

Содержит лиофильно высушенные в 1,2%-ном растворе натрия глютамината живые бактерии вакцинного штамма Mycobacterium bovis BCG-1. Применяют для щадящей специфической профилактики туберкулеза (первичная вакцинация) у новорожденных в районах с неблагополучной ситуацией по туберкулезу.

Содержит антитела против экзотоксина дифтерийных палочек. Антитоксическую активность выражают в международных единицах (10000 и 20000 МЕ/мл). Применяют для лечения больных дифтерией. Кроме лечебных целей, противодифтерийную сыворотку используют для определения токсигенности культур дифтерийной палочки в реакции гелевой преципитации.

Содержит иммунологически активную фракцию плазмы крови доноров с антителами к экзотоксину коклюшного микроба (не менее 750 ЕД антитоксических противококлюшных антител). Применяют для лечения коклюша.

Содержит очищенный дифтерийный токсин в 0,2 мл препарата 1/40 DLM токсина для морской свинки. Применяют для внутрикожных проб с целью иммунодиагностики. У лиц в месте введения развивается воспалительная реакция. Если в крови содержится более 0,03 ME антитоксина, проба отрицательна. Ранее пробу Шика использовали часто для выявления лиц, восприимчивых к дифтерии. В настоящее время из-за возможности осложнений ее применение ограничено строгими эпидемическими показаниями.

Реакция Шика может оказать помощь в дифференциальной диагностике между атипичной дифтерией и другими заболеваниями с сопутствующим носительством дифтерийных палочек (в тех случаях, где реакция Шика ставится до введения противодифтерийной сыворотки).

Исследования в течение последних двух лет диагностического значения пробы Шика в титрационной методике по В. И. Иоффе, с 1/40, 1/10, 1/5 DLM дифтерийного токсина (1, 4 и 8 кожных доз), привели к выводу, что определение высоты иммунитета помогает в дифференциальной диагностике.

У большинства носителей токсигенных дифтерийных палочек определяется напряженный антитоксический иммунитет, выражающийся отрицательными реакциями не только на одну, но и на 4 и 8 кожных доз токсина (К. В. Блюменталь).

У некоторых больных дифтерией, у которых удалось до введения сыворотки определить состояние иммунитета по реакции Шика, последняя оказалась положительной на одну кожную дозу.

Таким образом, если при сомнительной клинической картине и обнаружении токсигенных дифтерийных палочек реакция Шика в обычной постановке (1/40 DLM токсина) дает положитлеьный результат, более обоснованно предположение о дифтерии.

Реакция агглютинации может также помочь в дифференциальной диагностике, так как при заболевании дифтерией отмечается закономерное нарастание антител в крови ко 2 — 3-й неделе от начала болезни, в то время как, по данным авторов, сопутствующее носительство не дает заметного нарастания антител в указанные сроки.

В заключение следует сказать, что отказ от диагноза дифтерии при обнаружении дифтерийных палочек во всех случаях должен быть достаточно обоснован убедительными клиническими данными.

Учитывая, что при дифференциальной диагностике в подобных случаях нередко возникают большие трудности, особенно для участкового врача, рекомендуется направление этих больных в диагностические отделения. При отсутствии диагностических коек диагноз дифтерии может быть снят только после консультации с опытным врачом.

«Дифтерия у детей», М.Е.Сухарева, К.В.Блюменталь

Обнаружение BL при типичной клинической картине фолликулярной ангины, когда нагноившиеся фолликулы, как просяные зерна, просвечивают из-под слизистой миндалины, также легко может быть расценено как сопутствующее носительство, ибо островки дифтерийных налетов всегда располагаются на поверхности слизистой. Хронический тонзиллит нередко сопровождается более или менее длительным носительством дифтерийных палочек и в силу этого часто приходится дифференцировать атипичную дифтерию…

Несложна для опытного врача диагностика грибковой ангины (вызываемой leptotrix) с сопутствующим носительством дифтерийных палочек, так как клиническое проявление микоза глотки по существу не имеет никакого сходства с дифтерийным процессом; но, повидимому, одни и те же причины, чаще всего хроническое поражение носоглотки, способствуют одновременно и длительной вегетации грибка, и носительству дифтерийных палочек. Более сложна дифференциальная диагностика…

Люда П., 8 лет, поступила в больницу им. И. В. Русакова 9 сентября 1960 г. с диагнозом «дифтерия зева?». Девочка правильно иммунизирована против дифтерии, очень часто болеет ангиной. Заболела 5 сентября, температура 37,5°, головная боль, умеренная боль в горле. 6 — 7-го сентября температура в пределах 38 — 39°, плохое самочувствие, боль в горле держалась….

Обнаружение дифтерийных палочек в посеве из зева или носа при типичной клинической картине гриппозного крупа или крупа при катаре верхних дыхательных путей не может являться решающим доводом в пользу дифтерийной этиологии крупа. В таких случаях необходима идентификация выделенных микробов, однако вполне возможно носительство BL в зеве или носу, сопутствующее недифтерийному крупу. Приводим выписку из истории…

Боря Б., 8 лет, поступил в дифтерийно-диагностическое отделение больницы им. И. В. Русакова 27 сентября I960 г. с диагнозом «дифтерия зева?». Мальчик правильно иммунизирован против дифтерии. Повторно болеет ангинами. Заболел 24. IX, температура 39,5°, озноб, боль в горле. 25. IX ребенок осмотрен врачом: температура оставалась высокой, отмечена яркая гиперемия зева, желтоватые, рыхлые, но довольно обширные…

Цитохимические методы преследуют отождествление химических и ферментных веществ в клетках, используя для этого цветные реакции. Цитохимические препараты сохраняют клеточную структуру, что допускает выявление клеток и внутриклеточную локализацию исследувмого составного. Вот почему в гематологии отдается предпочтение не биохимическим, трудоемким, разрушающим клеточную структуру о относящимся к весьма разнородной клеточной популяции, а цитохимическим способам.

Цитохимия доказала, что среди морфологически одинаковых клеток имеются существенные химические и ферментативные различия.

Гликоген (реакция ШИК) (PAS) - метод Гочкисс - Мак Минус

Принцип ШИК-реакции . Полисахариды выявляются путем реакции, окисляющей спиртные группы, которые преобразуются в альдегидные группы, и отождествления последних путем цветной реакции реагентом Шифф.

Реагенты для ШИК-реакции : 1. Закрепляющий смесь спирт-формалин: 9 частей абсолютного этилового спирта +1 часть 40% формалина; сохранять при температуре +4°.

2. Периодння кислота, 1% водный раствор. Раствор бесцветный. Хранить в бутылке из коричневого стекла, в темноте, при лабораторной температуре. Пожелтевший раствор неприменим.

3. Реагент Шиффа. Развести 1 г основного фуксина в 200 мл дистилированной воды при температуре кипения. Болтать 5 минут, охладить до температуры 50°, профильтровать и добавить 20 мл нормальной соляной кислоты. Охладить до 25°, добавить 2 г метабисульфита натрия или калия, которые полностью обеспечивают раствор. Раствор должен простоять сутки в условиях темноты и холода (+4°). Затем добавить 2 г активированного угля, поболтать 1 мин. и профильтровать.
Полученный фильтрат прозрачный и бесцветный. Допускается слегка желтоватый оттенок; если раствор розовеет, становится неприменимым. Хранить при температуре +4° в герметически закрытой бутылке из коричневого стекла.

4. Зеленый светлый -1% водный раствор.

5. Диастаз: неразжиженная слюна человека или 0,1% раствора амилолитического-диастатического фермента в физиологическом солевом растворе.

Техника проведения ШИК-реакции

1) 10-тиминутное закрепление мазков смесью спирт-формалин; промывание дистилированной водой;
2) окисление 1% раствором периодной кислоты, 10 мин.; промывание дистилированной водой;
3) окраска реагентом Шиффа в накрытой посуде, в условиях темноты и холода, в течение 2 часов; промывание проточной водой;
4) контрастная окраска 1% зеленым-светлым в течение 1 минуты; промывание проточной водой.

Контрольный закрепленный мазок подвергается инкубации диастазом, 60 мин. в условиях комнатной температуры для выборочного удаления гликогена. После промывания дистилированной водой подвергается обработке по обычному методу.

Оценка результатов ШИК-реакции

Гликоген , окрашенным в багряно красный- цвет, представляется в виде зерен или рассеянный. Для контроля реакции используются зрелые гранулоциты мазка. Помимо гликогена ШИК положительную реакцию дают и другие вещества углеводной природы, такие как, муцин, мукопротеины, цереброзиды, фибрин. Дифференциация гликогена от этих составных осуществляется путем предварительной обработки диастазом, после чего гликоген более не окрашивается.

В гранулоцитах гликоген находится в рассеянном виде уже на стадии промиелоцита и начинает увеличиваться по мере созревания. В нормальных условиях лимфоциты отрицательны или в 20% из них могут находиться несколько мелких зерен гликогена. Моноциты отрицательные либо имеют тонкую зернистость.

Интенсивность окраски определяется полуколичественно. В реакция ШИК отражается в виде гликогенного показателя, или среднего показателя реакции (Астальди). Нормальный показатель гликогена колеблется в пределах от 0,10 до 0,30. Обычно лишь у патологических лимфоцитов наблюдается степень нагрузки более 3.

Значилось метода ШИК-реакции :
а) При постановке дифференциального диагноза отдельных цитологических видов острой лейкемии:
- Миелобласты и промиелоуиты ШИК-отрицательные или приобретают слабую диффузную окраску. Тела Ауера дают положительную реакцию, которая ослабевает после переваривания со слюной.
- Лимфобласты при острой лейкемии и лимфосаркоме дают резкую ШИК-положительную реакцию в виде зерен или крупных блоков гликогена.
- Эритробласты при эритремии и острой эритролейкемии дают резко положительную рассеянную или зернистую реакцию, в противоположность нормальным эритробластам, которые ШИК-отрицательные;
- Моноцитоидные б ласты непостоянно слабо положительные, с тонкой зернистостью.

б) В целях постановки диагноза и наблюдения за эффективностью лечения при хронической лимфатической лейкемии: завышенный показатель гликогена указывает на тяжелую форму заболевания и тяжкий прогноз.
Рост гликогена в патологических лимфоцитах не характерное для лейкемии явление, оно объясняется ростом метаболической активности при любом виде лимфоидной пролиферации.

в) Для дифференциации клеток Гоше от иных макрофагов с накоплением.

Реакция Шика указывает на наличие или отсутствие необходимого уровня антитоксина в крови для защиты организма от дифтерии. В настоящее время эта реакция применяется реже в связи с внедрением в практику более чувствительных методов (РПГА).

Реакцию Шика проводят привитым против дифтерии детям с законченной вакцинацией и не менее чем с одной ревакцинацией. В возрасте 13 лет и старше реакцию можно ставить и с неизвестным прививочным анамнезом. Состояние противодифтерийного иммунитета проверяют не ранее чем через 6 месяцев после последней ревакцинации и не ранее двух месяцев после перенесенного острого заболевания.

Реакцию Шика ставят также в коллективах, неблагополучных по дифтерии, вновь прибывшим детям, когда нет сведений о прививках. Детям с отрицательной реакцией Шика дополнительные прививки не делают. Дополнительные прививки независимо от иммунной прослойки в коллективе проводят детям с положительной и сомнительной реакциями.

Результаты реакции Шика заносят в карту учета профилактических прививок (ф. 63) с указанием даты постановки и проверки реакции, серии токсина и института, изготовившего токсин.

Для постановки реакции Шика используют разведенный активный (негретый) дифтерийный токсин. В 0,2 мл содержится одна Шик-доза.

Для постановки реакции Шика должны применяться однограммовые (туберкулиновые), тщательно проверенные шприцы с точной градуировкой, не пропускающие жидкость между стенками шприца и его поршнем.

Категорически воспрещается постановка реакции Шика в помещениях, где в этот день проводилась ревакцинация против туберкулеза, а также использовать шприцы, иглы и прочий инструментарий, применявшиеся при иммунизации против туберкулеза.

Кожу на месте инъекции протирают ватой, смоченной 70 % этиловым спиртом. Токсин (0,2 мл) вводят внутрикожно в среднюю часть ладонной поверхности, как правило, левого предплечья. Введение производят медленно с известным напряжением, характерным для внутрикожного введения жидкости. Инъекцию делают под очень небольшим уклоном шприца к предплечью, почти параллельно поверхности кожи. Срез иглы должен целиком войти в кожу и просвечивать через эпидермис. На месте инъекции должен образоваться беловатый, хорошо ограниченный пузырек (папула) диаметром около I см, имеющий вдавление на месте волосяных мешочков («лимонная корочка»). Этот пузырек (папула) рассасывается через 10 - 15 мин. Если при введении токсина пузырек (папула) не образуется или слишком быстро исчезает, это указывает на то, что инъекция сделана неправильно, глубоко и токсин, попавший подкожно, может не вызвать реакции. Вследствие этого может быть получен неправильный результат.

Учет реакции производят через 72 или 96 ч. Результаты оценивают следующим образом:

а) реакция Шика положительная, если на месте введения токсина появляются краснота и инфильтрат. Степень реакции обозначается: « + » - если краснота имеет диаметр 1 -1,5 см, (+ + » - если 1,5 - 3 см, «+ + + » - если больше 3 см;

б) реакция Шика отрицательная, когда на месте введения токсина краснота и инфильтрат отсутствуют;

в) реакция Шика сомнительная, если краснота и инфильтрат при введении токсина либо выражены нечетко, либо при выраженной реакции диаметр красноты равен примерно 0,5 см (обозначается «±»).

Противопоказания к постановке реакции Шика: спазмофилия, эпилепсия, гнойничковые заболевания, контакт с больными вирусным гепатитом, бронхиальная астма.