О возбудителе, эпидемиологии и патогенезе дифтерии. Посев на дифтерию (Corynebacterium diphtheriae)

Коринебактерии. Микробиологическая диагностика дифтерии .

М и кобактер ии . Лабораторна я д и агностика туберкул е з а .

Род Corynebacterium объединяет бактерии, имеющие булавовидные утолщения на концах (от лат. согупе - булава), окрашивающиеся по Граму положительно. К ним относятся врзбудители дифтерии (Corynebacteruim diphtheriae), листериоза (Listeria monocytogenes) и ряд сапрофитных коринебактерий - дифтероиды и ложно- дифтерийная палочка Гоффмана, которые встречаются на слизистых оболочках и коже человека.

Коринебактерий дифтерии

Возбудитель дифтерии - Corynebacterium diphtheriae. Открыт в 1883 ‑ 1884 гг. Клебсом и Леффлером.

Морфология и биологические свойства. Коринебактерии дифтерии - слегка изогнутые небольшие тонкие палочки размером 0,3-0,4*4-5 мкм, с небольшими булавовидными утолщениями на концах, в которых находятся зерна волютина. Спор и капсул не образуют, неподвижны. Характерными признаками этих бактерий являются полиморфизм (наличие, помимо типичных палочек, длинных, коротких, ветвящихся форм, грушевидных), метахромазия (неравномерное окрашивание тела в связи с более интенсивно окрашивающимися зернами волютина) и расположение палочек в мазке под углом друг к другу, в виде «растопыренных пальцев», горсти булавок. Грамположительны. Зерна волютина хорошо выявляются при окраске по Иейссеру: тело бактерий окрашивается в темно-желтый, а зерна волютина - в темно-синий цвет. В носоглотке часто обнаруживаются ложнодифтерийные палочки Гоффмана, более короткие и толстые, чем дифтерийные, и находящиеся в мазках параллельно друг другу в виде частокола; зерна волютина у них обнаруживаются редко и располагаются беспорядочно.

Возбудитель дифтерии - факультативный аэроб. Температурный оптимум 37°С, рН 7,6-7,8. На простых питательных средах растет плохо. Для выращивания используют элективные сывороточные среды (Ру и Леффлера) и среды с теллуритом калия: кровяно-тёллуритовые (среда Клауберга), сывороточно-теллуритовые (среда/Гинсдаля), хинозольная среда Бучина. Коринебактерии дифтерии при росте на теллуритовых средах восстанавливают металлический теллур из теллурита калия, поэтому колонии их темного цвета. На чашке со средой Бучина колонии дифтерийных бактерий окрашены в синий цвет. Колонии на средах Ру и Леффлера выпуклые, блестящие, их рост напоминает шагреневую кожу. На бульоне Мартена характерен рост в виде пленки.

По культуральным, ферментативным и другим свойствам различают три типа коринебактерий дифтерии: gravis, mitis, intermedius. На теллуритовых средах бактерии типа gravis образуют колонии плоские, крупные, с радиальной исчерченностью и зубчатыми краями, серовато-черного цвета. Колонии коринебактерий дифтерии типа mitis более мелкие, выпуклые, блестящие, гладкие, черного цвета. Тип intermedius занимает промежуточное положение. Биохимические свойства дифтерийных бактерий позволяют дифференцировать их от непатогенных представителей рода Corynebacterium, а также разделить на типы .

Коринебактерии дифтерии ферментируют глюкозу, мальтозу, галактозу до кислоты, не изменяют лактозу, сахарозу, маннит, не разлагают мочевину (проба на уреазу), продуцируют фермент цистиназу (проба Пизу). Бактерии типа gravis ферментируют крахмал, а типа mitis не ферментируют.

Токсинообразование. Дифтерийные бактерии образуют сильный экзотоксин, который при введении в организм избирательно поражает сердечную мышцу, надпочечники и периферическую нервную систему. Дифтерийный токсин - простой белок, состоящий из двух фракций: фракция А связана с токсической функцией, фракция В - с функцией прикрепления токсина к чувствительным клеткам организма. Силу токсина определяют на морских свинках и измеряют минимальной смертельной дозой (Dim), убивающей животное массой 250 г в течение 4 дней. Дифтерийный токсин малоустойчив, легко разрушается при 60°С под действием солнечного света и различных химических веществ. Под влиянием 0,3-0,4% формалина и выдерживания при 40°С в течение месяца превращается в не ядовитое соединение - анатоксин. Анатоксин сохраняет иммуногенные свойства и его используют для иммунизации людей.

Ранее считали, что токсигенным является тип gravis, а тип mitis нетоксигенен. Однако в последние годы установлено, что бактерии типов как gravis, так и mitis могуг быть и токсигенными, и нетоксигенными.

Устойчивость. Дифтерийные бактерии довольно устойчивы к низкой температуре. В высушенной дифтерийной пленке остаются жизнеспособными 3-4 мес, на различных предметах и одежде сохраняются много дней. Чувствительны к действию высоких температур: при кипячении погибают мгновенно, при 60°С - в течение 10 мин. Быстро гибнут при действии прямого солнечного света, дезинфицирующих растворов: 3-5% раствор карболовой кислоты убивает их в течение минуты.

Антигенная структура у дифтерийных бактерий изучена недостаточно. Описано 11 серологических типов, отличающихся между собой в реакции агглютинации со специфическими типовыми дифтерийными сыворотками.

У возбудителей дифтерии изучены типовые фаги, с помощью которых производят фаготипирование выделенных штаммов, что имеет большое значение в эпидемиологической практике для выявления источника инфекции.

Патогенность. Животные дифтерией не болеют. В экспериментальных условиях наиболее чувствительны к заражению морские свинки и кролики. При подкожном введении морским свинкам культуры или токсина развивается картина токсикоинфекции, на месте инъекции возникают воспаление и некроз, а затем животное гибнет.

Патогенез и клиника. Входными воротами дифтерийных микробов являются слизистые оболочки носоглотки, иногда глаз, половых органов (у девочек), кожа и раны. Инкубационный период равен 3-10 дням. Микроб локализуется на месте входных ворот, где возникает местное фибринозное воспаление и образуются дифтеритические пленки серовато-желтого цвета, тесно спаянные с подслизистым слоем. Иногда процесс со слизистой оболочки глотки распространяется на гортань и бронхи, что сопровождается отеком, сужением гортани и может привести к асфиксии.

В месте своего внедрения возбудители дифтерии размножаются, выделяют экзотоксин, который всасывается в кровь и обусловливает тяжелую общую интоксикацию организма, избирательно поражая сердечную мышцу, надпочечники, нервные клетки. Таким образом, дифтерия- типичная токсинемическая инфекция. Клиническая» тяжесть заболевания зависит от степени токсигенности штамма.

Иммунитет. После перенесенной инфекции стойкий, хотя возможны повторные заболевания. Формирование иммунитета связано с накоплением в крови антитоксина. Антитоксин к дифтерийному токсину обнаруживают у детей до 6-месячного возраста в результате передачи его с кровью матери через плаценту. У взрослых, он также накапливается вследствие постоянной «бытовой» иммунизации. О состоянии иммунитета к дифтерии можно судить по реакции Шика. Для этого во внутреннюю поверхность предплечья внутрикожно вводят 1/40 Dlm дифтерийного токсина. Токсин перед введением разводят таким образом, чтобы данная доза содержалась в объеме 0,2 мл. Для контроля в другую руку вводят прокипяченный токсин. При отсутствии иммунитета на месте введения токсина через 2-3 дня появляются краснота и припухлость диаметром до 2 см. Если же ребенок невосприимчив к дифтерии, реакция будет отрицательной вследствие нейтрализации введенного токсина содержащимся в крови антитоксином.

В настоящее время применение реакции Шика ограничено и ее используют только по эпидемиологическим показаниям.

Микробиологическая диагностика. Лабораторное исследование проводят с целью ранней диагностики заболевания и выявления бактерионосителей среди здоровых лиц. Материалом для исследования служат дифтеритическая пленка или отделяемое из мест поражения, а также слизь из носа и глотки. Материал берут стерильным ватным тампоном и немедленно отправляют в лабораторию. Если материал не может быть засеян в течение ближайших 3-4 ч, то во избежание снижения высеваемости его берут тампоном, смоченным 5% раствором глицерина в изотоническом растворе хлорида натрия. С этой же целью материал забирают тампоном, смоченным 2% раствором теллурита калия.

Основным методом диагностики является микробиологический.

Первый день. Посев производят на чашки со средой Клауберга или Тинсдаля, а также на среду Бучина. При необходимости, по требованию врача, берут материал еще одним тампоном для микроскопического исследования. С тампона делают мазок, окрашивают его по Граму и по Нейссеру.

Второй день. Через 18-24 ч инкубации в термостате просматривают посевы. На средах с теллуритом калия колонии дифтерийных бактерий окрашены в черный цвет разной степени интенсивности. Колонии дифтероидов влажные, выпуклые, коричневого или серого цвета.
На среде Бучина колонии возбудителей дифтерии синего цвета, дифтероидов - бесцветные, а палочек Гоффмана - голубоватые. Для выделения чистой культуры часть отдельно лежащей подозрительной колонии пересевают на скошенный сывороточный агар, или свернутую сыворотку (среда Ру или Леффлера). Вторую половину колонии пересевают в виде бляшки на поверхность среды, для определения токсигенности и, не прожигая петли, производят посев уколом в пробирку со столбиком питательной среды с цистином (проба Пизу) для выявления фермента цистиназы.

Токсигенность выделенной культуры в настоящее время определяют методом диффузионной преципитации в геле.

Третий день. Со скошенного сывороточного агара или свернутой сыворотки приготовляют мазок, окрашивают, по Нейссеру, микроскопируют. Учитывают токсигенность. - Отмечают появление коричневого облачка вокруг темного стержня по ходу укола в среде Пизу, что характерно для роста дифтерийных микробов. Для изучения ферментативных свойств и установления типа возбудителя дифтерии производят посев в среды Гисса с глюкозой, сахарозой, крахмалом и в среду с мочевиной для определения наличия уреазы.

Четвертый день. Окончательный положительный ответ дают при наличии типичных дифтерийных бактерий в мазках из чистой культуры, характерных колоний на Средах с теллуритом калия, результата пробы на токсигенность и определения ферментативных свойств. Принадлежность выделенной культуры к виду Corynebacterium diphtheriae можно установить в реакции агглютинации с поливалентной дифтерийной сывороткой. Однако многие нетоксигенные штаммы возбудителей дифтерии не агглютинируются этой сывороткой. С помощью типовых агглютинирующих дифтерийных сывороток можно установить серологический тип возбудителя.

Для ускоренной диагностики дифтерии стерильный ватный тампон смачивают нативной сывороткой, которую свертывают на тампоне нагреванием при 80°С. Сывороточным тампоном берут мазок из патологического очага и инкубируют в термостате в течение 3-4 ч. Затем делают мазки, окрашивают их по Нейссеру. У больных дифтерией обнаруживается значительное число возбудителя в мазках.

Профилактика и лечение. Для предупреждения распространения дифтерии необходимы ранняя диагностика заболевания, госпитализация больных, дезинфекция, выявление носителей дифтерийных микробов среди детей и лиц, работающих в детских учреждениях. Специфическую профилактику осуществляют введением дифтерийного анатоксина для создания активного иммунитета против дифтерии. В настоящее время в Советском Союзе проводят обязательную вакцинацию детей комплексной вакциной АКДС, в состав которой входят, помимо дифтерийного, столбнячный анатоксин и взвесь убитых коклюшных бактерий. Для ревакцинации используют вакцину АДС-М (без коклюшных бактерий) с уменьшенным содержанием анатоксинов. В особых случаях детям, контактировавшим с больным дифтерией, для создания кратковременного пассивного иммунитета вводят наряду с анатоксином противодифтерийную антитоксическую сыворотку.

Для лечения применяют противодифтерийную антитоксическую сыворотку в дозе 1000-5000 АЕ на 1 кг массы тела ребенка. Раннее введение сыворотки имеет часто решающее значение в исходе болезни. Одновременно назначают антибиотики тетрациклинового ряда, пенициллин, сульфаниламидные препараты. Применяют также сердечные средства, витамины, переливание крови и др.

С. diphtheriae обнаружен в 1883 г. Э. Клебсом, выделен в чистой культуре Ф. Леффлером в 1884 г.

Морфология, физиология. Коринебактерий дифтерии - пря­ мые или слегка изогнутые палочки, длиной 1-8 мкм, шириной 0,3-0,8 мкм. В препаратах микроорганизмы располагают под углом друг к другу в виде букв L , V или китайских иероглифов. Зерна волютина., расположенные на концах палочек, выявляются при окраске синькой Леффлера или по методу Нейс сера. Дифтерийные палочки - факультативные анаэробы, хорошо размножаются при свободном доступе кислорода. К питательным средам требовательны: не способны утилизировать азот из ам­ монийных соединений и требу­ют наличия почти всех ами­ нокислот, солей магния, цинка, меди, железа; для культивиро­вания необходимы углеводы. Этим потребностям удовлетво­ряют питательные среды, полу­ ченные на основе фермента­тивного расщепления белка (казеина, дрожжей) с добав­ лением крови или сыворотки. На поверхности плотных сред с теллуритом калия дифтерий- ные палочки образуют темно-серые или черные колонии (гравис или митис), что служит основой для подразделения этого вида бактерий на биовары. Рост на скошенном сывороточном агаре сравнивают с шагреневой кожей - колонии не сливаются.

Коринебактерии дифтерии.

Corynebacterium diphtheriae, окраска по Грам у

окраска по Нейссеру

Corynebacterium diphtheriae, окраска по Леффлеру

По культуральным свойствам коринебактерии дифтерии разделяются на биовары gravis , mitis, intermedius .

Коринебактерии gravis на телуритовом агаре, который содержит дефибринированную кровь и теллурит калия, образуют крупные шероховатые (R-формы) розетковидные колонии черного или серого цвета. Они ферментируют декстрин, крахмал и гликоген, в бульйоне образуют поверхностную пленку и зернистый осадок, обычно высокотоксичные и имеют более выраженныеинвазивныесвойства.

Коринебактерии mitis на телуровом агаре растут с образованием темных гладких (S-формы) и блестящих колоний. Они не ферментують крахмал и гликоген, непостоянно ферментують декстрин, вызывают гемолиз эритроцитов всех видов животных, в бульйоне даюгь диффузное помутнение, менее токсичные и инвазивные.

Ферментативные свойства . Коринебактерии дифтерии не разлагают мочевину, не выделяют индол, слабо образуют сероводород, восстанавливают нитраты в нитриты, а также теллурит калия к металлу, в результате чего колонии возбудителя дифтерии на телуровом агаре становятся черными или серыми. Коринебактерии дифтерии ферментируют глюкозу и мальтозу, непостоянно - галактозу, крахмал, декстрин,глицерин.

Токсинообразование. Коринебактерии дифтерии продуцируют в бульйонных культурах сильные экзотоксины (гистотоксин, дермонекротизин, гемолизин). Токсигенность коринебактерий связана с лизогенностью (наличием в токсигенних штаммах умеренных фагов - профага). Классический международный эталонный штамм Вильямс Парка 8 - продуцент экзотоксина - также лизогенный и свыше 85 лет сохраняет свойство токсинообразования. Генетические детерминанты токсигенности (tox + -гены) локализованы в геноме профага, интегрированного с нуклеоидом коринебактерий дифтерии.

Дифтерийный экзотоксин состоит из двух (А и В) полипептидных цепей, соединенных дисульфидным мостиком. Под воздействием восстановительных агентов расщепляются дисульфидные связи, которые соединяют А- и В-цепи. А-цепь переходит в цитоплазму, а В-цепь остается в мембране эндосомы и вызывает связывание токсина с рецепторами на поверхности клеток.

Дифтерийный токсин неустойчив, легко разрушается под воздействием температуры, света и кислорода воздуха, но сравнительно резистентный к действию ультразвука. После добавления к токсину 0,3-0,4 % формалина и последующего выдерживания при температуре 38-40 °Св течение З-4 недель он превращается в анатоксин, который имеет большую стойкость относительно физических и химических воздействий, чем исходный токсин.

Коринебактерии дифтерии продуцируют бактериоцины (коринецины), которые предоставляют им некоторых селективные преимущества.

Коринебактерии лизируются вирулентными фагами. Они спе­ цифичны для отдельных видов. Созданная коллекция коринефа говпозволяетустанавливатьфаговарыисследуемых культур.

Антигены. С. diphtheriae имеют белковую поверхностную структуру - микрокапсулу, которая содержит К-антиген. Опре­ деление этого антигена позволяет установить серовар (их более 10). Группоспецифический полисахаридный антиген кле­ точной стенки дает перекрестные серологические реакции с ми- кобактериями, нокардиями.

Экология и распространение. С. diphtheriae обитают в орга­низме больного человека или носителя. Инфекция передается аэрозольным путем. В настоящее время дифтерия «постарела», зарегистрированы многочисленные случаи заболеваний у взрос­лых, которые протекают в тяжелой форме. Токсигенность дифтерийных бактерий связана с их лизогенизацией специфичес­ ким профагом. Выделяясь в окружающую среду со слюной, пленками, дифтерийные палочки сохраняют жизнеспо­ собность в течение нескольких дней на посуде, игрушках, других предметах. Эти микроорганизмы хорошо переносят высушива­ ние - в пыли могут не погибать в течение 5 мес. К дезинфи­цирующим растворам чувствительны: 5 % раствор карболовой кислоты губит их в течение 1 мин, 1 % раствор фенола - за 10 мин. Коринебактерии чувствительны к пенициллину, тетра- циклинам, эритромицину.

Патогенность возбудителя и патогенез дифтерии. Основной механизм передачи возбудителя дифтерии - воздушно-капель­ ный. Возможно также заражение через предметы, пищевые продукты, инфицированные дифтерийными палочками. Заболе­вание развивается у лиц, не имеющих антитоксического им­ мунитета.

На месте внедрения (зев, гортань, трахея, реже - нос, ухо, половые органы девочек, конъюнктива глаза) развивается местный воспалительный процесс. Все виды коринебактерии, па­ тогенные для животных, обладают фимбриями, которые обеспе­ чивают микроорганизмам адгезию к клеткам хозяина. Выявляют­ся фимбрии в реакции агглютинации трипсинизированных бараньих эритроцитов.

Основное свойство возбудителя дифтерии - токсигенность - способность секретировать гистотоксин, действие которого про­ является не только локально в виде воспалительной реакции, но и в общей интоксикации организма, поражении особенно чувствительных к нему надпочечников, миокарда, нервной систе­ мы. Токсин, блокируя ферменты синтеза белка в клетках хо­ зяина, приводит их к гибели, что обусловливает некроз и ле­ тальный исход.

Ферменты, выделяемые дифтерийной палочкой (гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин), обеспечивают микроорганиз­ мам распространение в тканях, но в отличие от токсинемии бактериемия клинически не проявляется. Возможно, что фермен­ты, продуцируемые атоксигенными штаммами дифтерийных кори­ небактерии, позволяют им персистировать в организме человека.

Корд-фактор (димиколат трегалозы), которым обладают воз­ будители дифтерии, нарушает фосфорилирование и процессы дыхания клеток макроорганизма.

Кл и н и ч еские прояв ления дифтер ии :

Дифтерия носа

Дифтер и йн ые пл енки на ми нд али н ах

Дифтер и я ротоглотки и гортан и

Взятие и доставка материала в лабораторию. Материалом для исследования является пленка с миндалин, дужек, неба, язычка, слизь с зева и носам,выделения из глаза, уха, раны, влагалища, пораженного участка кожи. По требованию эпидемиолога исследуют смывы с игрушек и других предметов, некоторые пищевые продукты (молоко, мороженое и тому подобное). Материал нужно брать к началу этиотропного лечения натощак или через 2 час после приема еды.

Для взятия материала используют тампоны, сухие или предварительно смоченные 5 % раствором глицерина, помещенные в пробирку и простерилизированные вместе с ней. Исследуемый материал из ротоглотки и носа берут двумя отдельными тампонами, пытаясь взять его на грани здорового и пораженного участка вращательными движениями, не касаясь тампоном слизистой щек, зубов и языка, который прижимают шпателем. При ларингоскопии пленку или слизь берут непосредственно из гортани. Пленки и слизь из рта и носа берут обязательно во всех случаях, даже при дифтерии других локализаций (кожа, рана, глаз, ухо, вульва).

Если необходимо провести первичную бактериоскопию по требованию врача, материал берут отдельным (дополнительным) тампоном или направляют часть снятой пленки, тщательным образом растертой между двумя предметными стеклами.

Тампоны после забора материала помещают в те же пробирки, на которых надписывают номер, дату и время забора, фамилию врача. Они должны быть доставлены в лабораторию не позже 3-х час после взятия материала. Если схема забора предусматривает посев возле кровати больного, то пробирки и чашки с посевами немедленно направляют в лабораторию или инкубируют при 37 °С и доставляютчерез 20-23 час, в холодную пору в сумках с грелками.

Бактериоскопическое исследование материала от больного проводят лишь по требованию врача и только для того, чтобы распознать некротическую ангину Симановского-Плаута-Венсана (выявление веретенообразных палочек и спирохет Венсана, которые при обычных методах культивирования не растут).

На протяжении многих лет микроскопическое исследование и выявление зерен валютина, окрашенных по Леффлеру и Нейссеру, было основой лабораторной диагностики дифтерии и выявления бактерионосительства. Теперь, в связи с изменчивостью дифтерийных бактерий под воздействием антибиотиков, первичная микроскопия исследуемого материала не рекомендуется.

Бактериоскопическое исследование проводится с целью идентификации нетипичных колоний на кровяно-телуритовых средах и при проверке чистоты выделенных культур. Мазки окрашивают по Граму, Леффлеру и Нейссеру. Можно также красить их уксуснокислым метиловым фиолетовым, толуидиновым синим или бентиазоловым и тиазиновым красителями.

Бактериологическое исследование . Клинический материал засевают на кровяной агар и кровяно-телуритовий агар (или среда Клауберга ІІ), разлитые в чашки Петри. Кроме того, некоторые штаммы C.diphtheriae чувствительные к действию теллурита калию, потому их рост на телуритових средах может подавляться. Для выявления дифтерийного бактерионосительства посевы производят только на кровяно-телуритовий агар, поскольку в посевном материале может содержаться небольшое количество дифтерийных палочек, рост которых на неселективных средах будет подавляться другой микрофлорой. При этом допускается использование и транспортной среды.

Кровяно-теллури т овый агар. К 100 мл 2 % расплавленного и охлажденного 50 °С питательного агара рН 7,6 добавляют 10-15 мл дефибринованой крови и 2 мл 2 % раствора теллурита калию. Смесь тщательным образом перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри слоем толщиной 3- 4 мм

У C . diphtheriae выделяют три биовара - gravis , mitis , intermedius

Бактерии биовара gravis - короткие, неправильной формы, с небольшим количеством метахроматических гранул.

Биовар mitis образует длинные согнутые полиморфные палочки, которые содержат много волютинових зерен (тельца Бебеша-Эрнста)

Бактерии биовара intermedius наиболее длинные с бочкообразными контурами, для них характерны поперечные перегородки, которые разделяют клетку на несколько сегментов.В настоящем биовар intermedius относят в группу gravis.

Ро ст на кровяном агар е (біовар intermedius )

Б и овар gravisБ и овар mitis

(р о ст на кровяном агар е )

Среда Клауберга ІІ. К 100 мл 3 % питательного агара рН 7,6, расплавленного и охлажденного 50 °С, добавляют 3 мл 2 % раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл гемолизированной крови. Глицериновую смесь готовят путем добавления 20 мл стерильного глицерина до 40 мл дефибринованой крови. Смесь можно хранить в холодильнике на протяжении 4-х месяцев. Для приготовления гемолизированной ("лаковой") крови до 34 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16 мл дефибринованой крови.

Транспортная полужидкая среда. К 100 мл перевара Хоттингера или мясо-пептонного бульйона добавляют 1 г любого коммерческого агара, устанавливают рН 7,6, стерилизуют в автоклаве при 112 °С 30 хв, асептически добавляют 10 мл сыворотки и 1 мл 2 % теллурита калия. Среду разливают в пробирки по 5 мл. При возможности используют и более сложную транспортную среду ЕМЕС (AMIES), модифицировано Стюартом.

Посев от одного больного делают на одну чашку, используя при этом одну половину среды для посева из ротоглотки (миндалин, дужек, язычка), а вторую - для посева другим тампоном из носа. Если есть исследуемый материал из кожи, глаза, уха и других локализаций - добавляют еще одну чашку. Нельзя засевать материал от нескольких больных водну чашку. Среды перед посевом согревают в термостате 15-20 мин.

При посеве исследуемого материала его втирают тампоном сначала в отдельный участок кровяного агара площадью 2х1 см, потом аналогично на кровяно-телуритовом агаре (или среде Клауберга ІІ), при этом тампон все время вращают, чтобы засеять из него весь материал. Потом тем же тампоном штрихами засевают остальную поверхность среды (половину чашки). Такая техника посева позволяет получить изолированные колонии (чистую культуру), которые используют непосредственно из чашки для определения токсигенности и последующей их идентификации. Засеяные чашки или пробирки с транспортной средой инкубируют в термостате при 37 °С на протяжении 20-24 час.

На второй день с помощью стереоскопического микроскопа исследуют характер колоний. Если рост отсутствует на обеих средах делают повторный забор материала. Чашки с типичными и подозрительными на C.diphtheriae колониями отбирают для последующей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопию подозрительных колоний можно и не проводить.

Культуральные свойства. Колонии дифтерийных палочек на кровяном агаре беловатого или желтоватого цвета, непрозрачные, круглой, слегка выпуклой формы, диаметром 1- 2 мм Обычно они имеют маслянистую консистенцию, хотя некоторые могут образовывать хрупкие шереховатые R-колонии.

На кровяно-телуритовых средах колонии C.diphtheriae через 24 час роста имеют серый цвет, выпуклые, с ровным краем, вязкие. Через 48 год они приобретают темносерый или черный цвет с металлическим блеском, ровными или слегка фестончатыми краями, гладкой и блестящей или с радиально исчерченой поверхностью (R-формы), вязкие или хрупкие при прикосновении петлей. По структуре 48-часовых колоний на телуритовых средах и некоторыми ферментативными признаками возбудителя дифтерии разделяют на четыре культурально-биохимических варианта (биовары) - gravis, mitis, belfanti, intermedius.

Если типичный рост отсутствует, из других, сомнительных, колоний готовят мазки. При выявленииспоровых палочек, коков, дрожжей и др., исследование на дифтерию прекращают и дают негативный ответ. Однако, важно помнить, что дифтерийные бактерии, которые образовали нетипичные колонии на средах с ингибиторами роста (теллурит калия), могут быть укорочены, утолщены, но сохраняют полиморфизм и характерное расположение.

При росте типичных колоний сразу же приступают к изучению их токсигенности и идентификации.

Токсигенные свойства. Исследуют не меньше 2-х изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности и непрожженной петлей на среду Пизу, а второй половины - на скошенный сывороточный агар для выделения чистой культуры и сохранения ее к окончанию лабораторной диагностики. В случае, если на чашке вырастают одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности C. diphtheriaе, необходимо примножественном росте подозрительных колоний исследовать токсигенные свойства около 20 колоний, засевая в одну бляшку материал из 5-6 колоний. При росте лишь одной колонии ее засевают на среду для определения токсигенности и, не прожаривая петлю, - в пробирку со средой Пизу. Если применяли транспортную среду высев из нее делают на плотные кровяно-телуритовые среды.

На третий день при появлении специфических линий преципитации в агаровом геле и позитивной пробе на цистиназу выделенную культуру определяют как токсигенную С. diphtheriае. Если линии преципитации через 24 год отсутствуют, чашки инкубируют еще в течение суток. В случае негативной пробы Пизу культуру идентифицируют как другой вид коринебактерий.

Чистую культуру на скошенном сывороточном агаре высевают на углеводородные среды с глюкозой, сахарозой, растворимым крахмалом, ставят пробы на выявление уреазы, пиразинамидазы и нитратнедуктазы.

На четвертый день делают учет результатов всех посевов и выдают аргументированный бактериологический вывод о выделенной культуре.

Используют такие методы идентификации коринебактерий.

Определение токсигенности in vitro. В его основе лежит взаимодействие токсина с антитоксином в агаровом геле. В местах оптимального количественного соотношения токсина и антитоксина в толще агара выпадает преципитат в виде тонких нежных белых линий ("стрелы", "усики"). Этот тест во многих странах за рубежом называют Элек-тестом.

Пробу на токсигенность, как правило, проводят с чистыми культурами. Можно определить ее и с культурами, загрязненными сторонней микрофлорой, что на сутки убыстряет лабораторную диагностику дифтерии. Но при негативной пробе ее повторяют с выделенной чистой культурой.

Для постановки этой пробы микробиологическая промышленность выпускает специальную сухую стандартную среду для определения токсигенности дифтерийных микробов (ВТДМ) и стандартные бумажные диски, пропитанные антитоксической противодифтерийной сывороткой, и высушенные.

На поверхность свежеизготовленной среды ВТДМ накладывают бумажные диски с антитоксином (не более четырех на одну чашку). На расстоянии 0,5 см от диска вокруг него засевают культуры в виде "бляшек" диаметром 7- 8 мм, чередуя "бляшки" исследуемой культуры и контрольного штамма.

Результаты учитывают через 18-24 и 48 час. Критерием специфичности преципитатов является слияние линий преципитации исследуемой культуры с линиями токсигенного штамма. В таком случае выделенную культуру считают токсигенной.

При отсутствии стандартных бумажных дисков можно использовать полоски фильтровальной бумаги, пропитанные дифтерийным антитоксином. Их изготовляют непосредственно в лаборатории. Нарезанные по указанным размерам и простерилизированные в автоклаве при 121°С на протяжении 30 мин бумажные полоски смачивают 0,25 мл очищенного дифтерийного антитоксина, который содержит 500 МО в 1 мл. В таком случае на чашку с соответствующей средой кладут смоченную антитоксином полоску бумаги, подсушивают, открыв чашку на 15-20 мин в термостате и перевернув ее вверх дном. После этого с обеих сторон полоски засевают культуры "бляшками", чередуя исследуемые и контрольные штаммы.

Для определения токсигенности возбудителя дифтерии можно использовать также и другие среды (АГВ, мартеновский агар и т. п.), рецепты изготовления которых приведены в "Инструкции по бактериологической диагностике дифтерии", Киев (1999).

На протяжении многих лет токсигенность дифтерийных бактерий определяли подкожным или внутрикожным введением культуры двум гвинейским свинкам, одной из которых накануне вводят 100-1000 МО антитоксической противодифтерийной сыворотки. Теперь этот метод бактериологические лаборатории практически почти не используют из-за его дороговизны и значительной задержки ответа.

Изучение токсигенности внутрикожным введением культуры

гвинейской свинке

В последнее время разработан очень чувствительный и высокоспецифический метод определения гена дифтерийного токсина путем цепной полимеризной реакции. Он основан на определении участка ДНК C. diphtheriaе, где локализован ген дифтерийного токсина, с помощью ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ. Метод имеет преимущества перед традиционным определением токсигенности: высокую чувствительность, скорость получения результатов (4-6 час), не нуждается в выделении чистой культуры.

Но для его проведения необходимы специальная аппаратура, дорогие реактивы и соответствующее помещение, а потому может быть проведен лишь в специализированной лаборатории

Ферментативные свойства. Определение цистинази (проба Пизу). C. diphtheriaе, C. ulcerans,C. Pseudotuberculosis выделяют фермент цистиназу, псевдодифтерийные бактерии и другие дифтероиды его не продуцируют.

Выделенную культуру засевают уколом в среду с цистином, разлитую столбиком в узкие пробирки. Цистиназоположительные бактерии расщепляют цистин с выделением сероводорода, который с уксуснокислым свинцом, имеющимся всреде, образует сернокислый свинец, в результате чего среда окрашивается в темно-коричневый цвет. C. diphtheriaе вызывает не только потемнение среды по ходу укола но и образует вокруг него "тучку" темно-коричневого цвета на расстоянии 1 см от поверхности.

Результаты учитывают через 20-24 час инкубации в термостате.

Определение уреазы (проба Закса) . Дифтерийные бактерии этого фермента не образуют. Позитивную пробу на уреазу дают лишь некоторые другие виды коринебактерий. Для постановки пробы выделенную культуру сеют на бульйон с мочевиной. Уреаза разлагает мочевину, изменяет рН среды, что сопровождается его покраснением. Если фермент не выделяется, изменение расцветки бульйона не происходит.

Определения пиразинамидазы проводят путем гидролиза пиразинамида до пиразиновой кислоты и аммония. Для этого в стерильную пробирку вливают 0,25 мл стерильной дистиллированной воды, в которой готовят густую взвесь выделенной культуры, потом вносят одну диагностическую таблетку Rosko 598-21.Инкубируют на протяжении 4-х час при 37 °С, после чего добавляют одну каплю только что приготовленного 5 % водного раствора сульфата аммонийного железа. При наличии фермента суспензия приобретает красный или оранжевый цвет.

Патогенные коринебактерии не выделяют пиразинамидазу, а следовательно и не изменяют цвет суспензии.Сахаролитические ферменты определяют путем посева полной петли выделенной культуры в каждую пробирку короткого пестрого ряда Гиса (глюкоза, сахароза, растворимый крахмал). Результаты учитывают через 24 час инкубации в термостате. Расщепление крахмала может задерживаться до 48 час.

Определение нитратредуктазы является дополнительным тестом для идентификации С. belfanti и C. ulcerans, которые не образуют этого фермента. В пробирку с бульйоном, к которому добавляют 0,1 % KNO3, засевают исследуемую культуру, инкубируют в термостате на протяжении суток. Обязательно ставят контроль с незасеянной средой. В случаеналичия нитратредуктазы при добавлении к засеяному бульйону 3-х капель реактива Касаткина возникает красная окраска. Среда в контрольной пробирке цвет не изменяет.

Для идентификации коринебактерий в последнее время используют бумажные индикаторные диски с глюкозой, сахарозой, мочевиной и крахмалом из набора "Б" для идентификации энтеробактерий (фирма "ИмБио", г. Нижний Новгород). В 4-х пробирках готовят густую взвесь исследуемой культуры и в каждую из них погружают диск с соответствующим углеводом или другим реактивом. После инкубации в термостате учет выделения уреазы проводят через 40-120 мин, а определение сахаролитической активности - через 5-24 час. При наличии уреазы белый диск с мочевиной становится розово-малиновым, при отсутствии - остается белым. Диски с глюкозой и сахарозой при наличии соответствующих ферментов уже через 5-6 час изменяют цвет из красного на желтый. При определении амилазы в пробирку с соответствующим субстратом добавляют индикаторный диск с иодом. Если фермента нет - появляется темно-синяя окраска, если есть - цвет раствора

остается без изменений.

Иммунитет. Наиболее восприимчивыми к дифтерии являются дети в возрасте 1-4 лет. Заболевание оставляет антитоксичес­ кий иммунитет, но не очень прочный - у 6-7 % переболевших возникают повторные заболевания дифтерией.

Невосприимчивость к дифтерии зависит главным образом от содержания антитоксина в крови. Однако антимикробные ан­ титела (опсонины, преципитины, комплементсвязывающие) так­ же имеют значение в становлении иммунитета. Уровень антиток­ сического иммунитета можно установить, определяя в крови ан­ титела в РНГА с эритроцитарным диагностикумом - эритроциты нагружены дифтерийным анатоксином. Титры 1:20 и выше сви­детельствуют об иммунности обследуемого лица. С этой же целью применяется реакция Шика:внутрикожно вводят дифтерийный токсин, который вызывает местную воспалительную реакцию у неиммунных людей, а при наличии антитоксина такая реакция не возникает.

Профилактика и лечение. Основное значение в профилак­ тике дифтерии имеет активная иммунизация, создание антиток­ сического иммунитета. В нашей стране иммунизируют всех детей: начиная с 3-месячного возраста по разработанной схеме вводят вакцину, содержащую как один из компонентов дифтерийный анатоксин (АКДС, АДС).

Другое направление - борьба с дифтерийным носительст вом. Выявленных носителей санируют эритромицином.

Лечение дифтерии должно быть начато как можно раньше - не дожидаясь результатов микробиологического диагноза, вво­ дят антитоксическую противодифтерийную сыворотку. Серотера­пия эффективна в ранний период болезни, пока токсин еще не фиксирован клетками организма и ткани существенно не повреж­ дены. Количество вводимой антитоксической сыворотки, необхо димость повторного введения определяет лечащий врач в зависи­ мости от тяжести инфекции, ее формы и прочих клинических дан­ ных. Создание пассивного антитоксического иммунитета не ис­ ключает и антибактериальную терапию (пенициллин, тетрацик­ лин, эритромицин, сульфамидные препараты).

Палочка коклюша - Bordetella pertussis. Выделена от больного в 1906 г. Бор де и Жангу. Существуют разно-видности возбудителя коклюша - паракоклюшные бактерии (Bact. parapertussis).

Морфология и биологические свойства. Палочки коклюша мелкие, овальные, неподвижные, размером 0,2- 0,3X1 мкм, грамотрицательные, более интенсивно окрашиваются по полюсам. При специальной окраске видна нежная капсула. Хорошо растут на глицериново-картофельном или кровяном агаре при 35-37°С и рН 6,8-7,4. В настоящее время для их. выращивания используют синтетическую казеиново-угольную агаровую среду (КУА). Колонии микробов мелкие, выпуклые, блестящие, прозрачные, окружены небольшой нерезкой зоной гемолиза. На средах без крови растут в форме S- и R-кoлоний. Неактивны в биохимическом отношении. Образуют термостабильный токсин, а также продуцируют гиалуронидазу, плазмокоагулазу, лецитиназу. Наряду с О-антигеном (соматический) у них имеются поверхностные капсульные антигены. Возбудитель коклюша малоустойчив: погибает при действии солнечных лучей в течение часа, при 56°С - через 10-15 мин, быстро гибнет в 3% растворах фенола и лизола.

Патогенез и клиника. Коклюшем обычно болеют дети. Заболевание характеризуется типичными симптомами и цикличностью течения. Возбудители коклюша, проникнув в организм через верхние дыхательные пути, вызывают катаральное воспаление слизистой оболочки трахеи и бронхов. Катаральный период заболевания длится около 2 нед и переходит в конвульсивный (судорожный), сопровождающийся тяжелыми приступами судорожного кашля, возникающего иногда при различных внешних раздражениях (звук, осмотр, инъекции). Основное значение в патогенезе имеет раздражение кашлевого центра. Судорожный период продолжается 4-6 нед и заканчивается с угасанием приступов (период разрешения) выздоровлением. Источником инфекции могут быть больные, а также здоровые бактерионосители, но наиболее опасны больные в катаральном периоде заболевания. Основной путь передачи - воздушно-капельный. Роль предметов в передаче инфекции незначительна ввиду малой устойчивости бактерий коклюша во внешней среде.

Микробиологическая диагностика. Материал берут тампоном со слизистой оболочки носоглотки. Хороший результат дает метод «кашлевых пластинок». Во время кашля ко рту больного вертикально, на расстоянии 5-10 см, подставляют чашку с питательной средой так, чтобы уловить 5-6 кашлевых толчков. Чашку с посевом быстро закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре 37°С. Колонии коклюшного микроба вырастают через 2-5 суток, а паракоклюшного через 1-2 сут. Перед посевом поверхность питательной среды обрабатывают пенициллином (7,5 ЕД на чашку) или добавляют его в питательную среду (30 ЕД на 100 мл). Это задерживает размножение сопутствующей микрофлоры. Колонии бордетелл рассматривают с помощью лупы или бинокулярного стереоскопического микроскопа (МБС-1 или МБС-2). При наличии на чашках подозрительных колоний из части их готовят мазок и окрашивают по Граму. При обнаружении грамотрицательных овоидных мелких палочек из остатка колонии ставят реакцию агглютинации на стекле с коклюшной и паракоклюшной сывороткой, разведенной 1:10 (контроль культуры с каплей изотонического раствора хлорида натрия). Агглютинация наступает в течение 5 мин. Для дифференциации коклюшных и паракоклюшных микробов проводят дополнительные исследования. Паракоклюшные бактерии в отличие от коклюшных растут на простом агаре, изменяют цвет казеиново-угольного агара в буро-коричневый, вызывают потемнение кровяного агара и обладают ферментом уреазой. Серологические методы исследования применяют в поздние сроки заболевания. Реакция агглютинации используется для обнаружения антител в сыворотке крови больного с помощью диагностикумов из коклюшных и паракоклюшных микробов. Диагностическим титром антител считают разведение сыворотки 1:20 и выше, учитывая нарастание титра антител в процессе заболевания. РСК при коклюше чувствительна, антигеном служит взвесь живой культуры.

Профилактика и лечение. Общие меры профилактики сводятся к раннему выявлению и изоляции больных. Для специфической профилактики применяют адсорбированную коклюшно-дифтерийно-столбнячную вакцину (АКДС).

Иммунитет. После перенесенного заболевания возникает прочный и длительный иммунитет.

Для лечения используют антибиотики (стрептомицин, левомидетин, тетрациклины), 7-глобулин и витамины. Детям во время лечения необходим свежий воздух.

МИКОБАКТЕРИИ

Род Mycobacterium (сем. Mycobacteriaceae , порядок Actino - mycetales ) включает более 100 видов, ширрко распространенных в природе. Большая часть - сапрофиты и условно-патогенные. У человека вызывают туберкулез (М. tuberculosis - в 92 % слу­чаев, М. bovis - 5 %, М. africanus -в 3%) и лепру (М. 1ер- гае).

Возбудитель туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis . Открыт Кохом в 1882 г.

Морфология и биологические свойства. Является типичным представителем рода Mycobacterium и обладает наибольшей кислотоустойчивостью. В мазках из мокроты или органов микобактерии - небольшие тонкие палочки размером 1,5-4x0,4 мкм, грамположительны. На искусственных питательных средах могут образовывать ветвящиеся формы. Микобактерии туберкулеза обладают большой полиморфностью: встречаются палочковидные, зернистые, нитевидные, кокковые, фильтрующиеся и L-формы. Как результат изменчивости появляются кислотоподатливые формы, среди которых часто встречаются так называемые зерна Муха.

Морфологически все виды микобактерий туберкулеза сходны между собой и культивируются на одних и тех же питательных средах. Наилучший метод окраски по Цилю - Нильсену.

Факторы патогенности. Микобактерии туберкулеза содержат эндотоксин. Вирулентные штаммы включают особый липид, который получил название корд-фактора. Вирулентность микробов связана также с наличием фтионовых и миколовых кислот, а также полисахаридно-миколового комплекса. Кох получил из туберкулезных бактерий ядовитое вещество белковой природы - туберкулин, патогенное действие которого проявляется только в зараженном организме. Туберкулин обладает свойствами аллергена и в настоящее время его используют при постановке аллергических проб, позволяющих определить инфицированность человека или животных микобактериями. Существует несколько препаратов туберкулина. «Старый» туберкулин Коха (альт-туберкулин) представляет собой фильтрат убитой нагреванием 5-6-недельной культуры микробактерий, выращенной на глицериновом бульоне. «Новый» туберкулин Коха - высушенные микобактерии туберкулеза, размельченные в 5% глицерине до гомогенной массы. Получают туберкулин из микобактерий бычьего вида. Существуют также очищенные от балластных веществ препараты туберкулина (PPD, РТ).

Устойчивость. Микобактерии туберкулеза долго сохраняют жизнеспособность вне организма человека или животного. В высохшей мокроте они живут до 10 мес. Выдерживают температуру 70°С в течение 20 мин, а кипячение - 5 мин; в 5% растворе карболовой кислоты и растворе сулемы 1: 1000 погибают через сутки, в 2% растворе лизола - через час. Из дезинфицирующих средств наиболее чувствительны к хлорной извести и хлорамину.

Патогенность. Туберкулез широко распространен среди крупного скота, кур; реже болеют мелкий скот и свиньи. Из экспериментальных животных наиболее чувствительны к человеческому типу микобактерий туберкулеза морские свинки, кролики, к бычьему - кролики, морские свинки, к птичьему типу - птицы и белые мыши. Эти свойства микобактерий используют для дифференциации различных их типов.

Патогенез и клиника. Заражение происходит чаще всего воздушно-капельным путем. Инкубационный период при туберкулезе длится 15-30 дней. В случае проникновения микобактерий туберкулеза в организм человека или животного происходит образование туберкулезных бугорков в пораженных тканях. Они представляют собой скопление лейкоцитов и гигантских клеток, в центре которых находятся микобактерии. При хорошей сопротивляемости организма плотная соединительная ткань окружает бугорок и микобактерии не выходят за его пределы, оставаясь жизнеспособными многие годы. У лиц с пониженной устойчивостью к инфекции или при ослаблении иммунного состояния под влиянием неблагоприятных воздействий микобактерии туберкулеза начинают размножаться в первичном очаге, в результате чего туберкулезный бугорок подвергается творожистому некрозу. В процесс иногда быстро вовлекаются значительные части легкого или другого органа.

Различают легочную и внелегочные клинические формы туберкулеза, при которых поражаются кости, суставы, кожа, почки гортань, кишечник и другие органы.
Обычно наблюдаются периоды улучшения и ухудшения; конечный результат определяется состоянием макроорганизма. Заболевание может развиваться остро, но чаще протекает хронически, многие годы. Отмечаются слабость, ночные поты, утомляемость, потеря аппетита, небольшие подъемы температуры вечером, кашель. При рентгеноскопии легких обнаруживаются затемнения различной степени: очаговые или диффузные.

Иммунитет. Большинство людей достаточно устойчивы к туберкулезной инфекции, и заражение их в детстве ведет обычно к образованию первичных туберкулезных очагов, подвергающихся обызвествлению (очаги Гона). Приобретенный иммунитет носит характер нестерильного, т. е. сохраняется до тех пор, пока в организме имеется возбудитель.

Микробиологическая диагностика. Включает микроскопический, микробиологический, биологический и серологический методы. Микроскопия - наиболее распространенный метод. Он прост, доступен, позволяет быстро получить ответ. При микроскопии мокроты выбирают гнойные плотные частички, тщательно растирают их тонким слоем между двумя предметными стеклами. Сушат на воздухе, фиксируют пламенем и окрашивают по Цилю - Нильсену. Микобактерии туберкулеза - тонкие, слегка изогнутые палочки, окрашенные в ярко-красный цвет; остальной фон препарата голубой. Недостатком метода является его небольшая чувствительность. Увеличения чувствительности микроскопии при диагностике туберкулеза достигают использованием методов обогащения. Одним из них является гомогенизация материала путем воздействия на него различными веществами, растворяющими

Более эффективен метод флотации (всплывание), основанный на том, что после длительного встряхивания гомогенизированного едким натром исследуемого материала с дистиллированной водой и ксилолом (или бензолом) образуется слой пены, всплывающий наверх и захватывающий микобактерии туберкулеза. Слой пены снимают и наслаивают на теплое предметное стекло несколько раз по мере высыхания. Это увеличивает возможность обнаружения микобактерий туберкулеза.

Люминесцентная микроскопия более чувствительна, чем обычная. Препарат готовят, как обычно, фиксируют смесью Никифорова и окрашивают аурамином в разведении 1: 1000. Затем препарат обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают кислым фуксином, который «гасит» свечение находящихся в препаратах лейкоцитов, слизи и тканевых элементов, создавая контраст между темным фоном и светящимися ярким золотисто-зеленым светом микобактериями туберкулеза. Препарат микроскопируют в люминесцентном микроскопе. Недостаток микроскопии - возможность ошибок при наличии кислотоупорных сапрофитов.

При отрицательном результате микроскопического исследования используют микробиологические и биологические методы. Исследуемый материал предварительно обрабатывают 6% раствором серной кислоты для уничтожения посторонней микрофлоры.

Микробиологический метод позволяет выявить в исследуемом материале 20-100 микобактерий. От микобактерий туберкулеза дифференцируют по культуральным признакам кислотоупорные сапрофиты (рост сапрофитов возможен при комнатной температуре в течение нескольких дней). Недостатком метода является медленный рост микобактерий туберкулеза на питательных средах (посевы выдерживают в термостате 2- З мес).

Разработаны ускоренные методы выделения культур микобактерий туберкулеза - Прайса и Школьниковой. Сущность этих методов заключается в том, что исследуемый материал наносят на предметное стекло, обрабатывают серной кислотой, промывают изотоническим раствором хлорида натрия и помещают в питательную среду с цитратной кровью. Через 5-7 дней стекло вынимают и опрашивают по Цилю - Нильсену. Микроскопируют при малом увеличении. Микроколонии вирулентных штаммов микобактерий имеют вид жгутов, кос.

При использовании биологического метода обработанный патологический материал вводят в паховую область морским свинкам. Даже при наличии единичных туберкулезных микобактерий животное заболевает: через 6-10 дней регионарные лимфатические узлы увеличиваются, в них обнаруживают большое количество микобактерий туберкулеза. Через 3-6 нед животное погибает от генерализованной туберкулезной инфекции.

Для определения инфицированности организма микобактериями используют аллергический метод. Применяют внутрикожную пробу с туберкулином (реакция Манту) и накожную пробу Пирке. У инфицированных микобактериями на месте введения туберкулина образуются покраснение и припухлость.

Профилактика и лечение. Профилактика основана на своевременном выявлении больных туберкулезом, диспансеризации их, обезвреживании молока и мяса больных животных и птиц. Большое значение имеет также активная иммунизация людей, которая способствует уменьшению заболеваемости, облегчению тяжести течения туберкулезного процесса и снижению летальности. Используют живую вакцину БЦЖ, полученную французскими учеными Кальметтом и Гереном (лат. BCG-Ваcilla Calmette - Guerin) при культивировании туберкулезных микобактерий бычьего типа на глицериновом картофеле с желчью в течение 13 лет. Эту вакцину вводят новорожденным однократно внутрикожно на наружную поверхность левого плеча. Ревакцинацию проводят через 7-12 лет и в дальнейшем 4 раза через 3-6 лет. Иммунитет развивается через 3-4 нед и сохраняется 1 - 17,2 года.

Лечение проводят различными антибиотиками и химиопрепаратами (стрептомицин, ПАСК, ИНХА-17, ларусан, пассомин, тубазид, фтивазид и др.). Разрабатывают и применяют антибиотики резерва: циклосерин, этоксид, тибон, виомицпн, каиамицин и др. В ряде случаев показано хирургическое и курортное лечение.

Микобактери и туберкулеза

М. tuberculosis - основной возбудитель туберкулеза у челове­ка - был открыт в 1882 г. Р. Кохом.

Туберкулез - хроническое инфекционное заболевание. В за­висимости от локализации патологического процесса выделяют туберкулез органов дыхания и внелегочные формы (туберкулез кожи, костей и суставов, почек и др.). Локализация процесса в определенной степени зависит от путей проникновения мико­ бактерий в организм человека и вида возбудителя.

Морфология, физиология. Микобактерий туберкулеза - грам- положительные прямые или слегка изогнутые палочки 1-4Х X 0,3-0,4 мкм (рис. 20.8). Высокое содержание липидов придает клеткам микобактерий туберкулеза ряд характерных свойств: устойчивость к кислотам, щелочам и спирту, трудное восприятие анилиновых красителей (для окраски туберкулезных палочек применяют метод Циля - Нильсена). В культурах встречаются зернистые формы, ветвящиеся, зерна Муха - шаровидные кисло- топодатливые, легко окрашивающиеся по Граму. Возможен пере­ ход в фильтрующиеся и L -формы. Неподвижны, спор и капсул не образуют.

Для размножения микобактерий туберкулеза в лабораторных условиях используют сложные питательные среды, содержащие яйца, глицерин, картофель, витамины. Стимулируют рост мико­ бактерий аспарагиновая кислота, соли аммония, альбумин, глю­коза, твин-80. Чаще всего применяют среду Левенштейна - Йен- сена (яичная среда с добавлением картофельной муки, глице­ рина и соли) и синтетическую среду Сотона (содержит аспара гин, глицерин, цитрат железа, фосфат калия). Размножаются микобактерий туберкулеза медленно. Велик период генерации - деление клеток в оптимальных условиях происходит 1 раз в 14- 15 ч, тогда как большинство бактерий других родов делятся че­ рез 20-30 мин. Первые признаки роста можно обнаружить через 8-10 дней после посева. Затем на плотных средах появляются морщинистые, сухие с неров­ными краями колонии. В жид­ких средах сначала образуется нежная пленка на поверхности, которая утолщается и падает на дно. Среда при этом остает­ся прозрачной.

Микобактерий туберкулеза в мокроте больного.

Антигены. Клетки микобактерий содержат соединения, бел­ ковые, полисахаридные и липидные компоненты которых обуслов­ ливают антигенные свойства. Антитела образуются на туберку­ линовые протеиды, а также на полисахариды, фосфатиды, корд-фактор. Специфичность антител к полисахаридам, фосфатидам определяется в РСК, РНГА, преципитации в геле. Антигенный состав М. tuberculosis , M . bovis , M . leprae и других микобак­ терий (включая многие сапрофитические виды) сходен. Туберку­ линовый протеин (туберкулин) обладает выраженными аллерген­ными свойствами.

Экология и распространение. В естественных условиях М. tuberculosis вызывает туберкулез у человека, человекооб­ разных обезьян. Из лабораторных животных высокочувствитель­ ными являются морские свинки, менее - кролики. К М. bovis - возбудителю туберкулеза у рогатого скота, свиней и человека - высокочувствительны кролики и менее - морские свинки. М. africanus вызывает туберкулез у людей в странах тропи­ ческой Африки. Наиболее распространен воздушно-капельный путь заражения, при котором возбудитель проникает в организм через верхние дыхательные пути, иногда через слизистые обо­ лочки пищеварительного тракта или через поврежденную кожу.

Попадая в окружающую среду, микобактерий туберкулеза длительное время сохраняют свою жизнеспособность. Так, в вы­ сохшей мокроте микроорганизмы выживают в течение нескольких недель, на предметах, окружающих больного (белье, книги) - более 3 мес, в воде - более года; в почве - до 6 мес. Дли­ тельно сохраняются эти микроорганизмы в молочных продуктах.

Одно из опасных инфекционных заболеваний, которое набирает обороты в последнее время, - дифтерия. Оно опасно не столько воспалительными процессами в верхних дыхательных путях, коже, глазах и половых органах, сколько отравлением организма токсинами возбудителя - коринебактериями дифтерии. Поражение главных систем организма (нервной и сердечно-сосудистой) может быть довольно опасным, а также привести к печальным последствиям. О морфологии и микробиологии коринебактерий дифтерии, их патогенности и токсикогенности, путях заражения, симптомах и лечении болезни читайте в статье

Дифтерия вчера и сегодня

Данное заболевание известно человечеству с античных времен. Его описал в своих трудах Гиппократ (460 год до нашей эры), в 17 веке эпидемии дифтерии выкашивали жителей городов Европы, а с 18 века и жителей Северной и Южной Америки. Название болезни (от греческого Diphthera, что означает "пленка") ввел в медицину французский педиатр Арман Труссо. Возбудитель заболевания - бактерия Corynebacterium diphtheriae - была впервые обнаружена в 1883 году немецким врачом Эдвином Клебсом. А вот выделил бактерию в чистую культуру его же соотечественник - микробиолог Фридрих Леффлер. Последнему принадлежит и открытие токсина, выделяемого коринебактериями дифтерии. Первая вакцина появилась в 1913 году, и изобрел ее Эмиль Адольф фон Беринг - немецкий микробиолог и врач, лауреат Нобелевской премии по физиологии.

С 1974 года заболеваемость и смертность от дифтерии значительно снизилась во всех странах, которые являлись участниками Всемирной организации здравоохранения, благодаря программам массовой вакцинации. И если до этого в мире ежегодно заболевало более миллиона человек, а умирало до 60 тысяч, то после применения программ вакцинирования регистрируются лишь единичные случаи вспышек заболевания дифтерией. И чем больший процент граждан подвергся профилактическими прививкам, тем меньше вероятность эпидемий. Так, снижение охвата населения СНГ прививками в 90-х годах привело к вспышке болезни, когда было зарегистрировано порядка 160 тысяч заболевших.

Сегодня, по данным органов здравоохранения, привито от дифтерии порядка 50% населения, а учитывая, что график прививок предполагает повторную вакцинацию раз в 10 лет, все чаще можно услышать в средствах массовой информации данные о возможной эпидемиологической вспышке дифтерии в России и странах бывшего СНГ.

Уже не детская болезнь

Дифтерия - это острое, преимущественно детское инфекционное заболевание. Оно характеризуется фибринозным воспалением места локализации дифтерийной палочки и сильной интоксикацией организма ее токсинами. Но за последние 50 лет эта болезнь «повзрослела», и ею все чаще болеют люди, которые значительно старше 14 лет. У взрослых пациентов дифтерия - это тяжелое заболевание с возможным летальным исходом.

Наиболее восприимчивой группой риска являются дети от 3 до 7 лет. Источниками инфекции могут быть больные и здоровые носители возбудителя. Наиболее заразны больные с дифтерией верхних дыхательных путей, ведь основной путь заражения - воздушно-капельный. Пациенты с дифтерией глаз и кожи могут передать инфекцию контактным путем. Кроме того, источником заражения могут стать люди, которые не имеют внешних проявлений болезни, но являются носителями коринебактерий дифтерии - инкубационный период заболевания составляет до 10 дней. Поэтому симптоматика проявляется не сразу.

Дифтерия - это опасная болезнь для невакцинированного человека. При отсутствии незамедлительного введения антидифтерийной сыворотки вероятность летального исхода составляет 50%. И даже при своевременном ее введении остается 20% вероятности летального исхода, причинами которого становятся удушье, инфекционно-токсический шок, миокардит и паралич дыхания.

Род Corynebacterium

Возбудитель дифтерии Corynebacterium diphtheriae (дифтерийная палочка, или палочка Леффлера) входит в род грамположительных бактерий, который насчитывает более 20 видов. Среди бактерий этого рода имеются патогены как человека, так животных и растений. Для практической медицины, кроме дифтерийной палочки, значение имеют и другие представители этого рода:

• Corynebacterium ulcerans - вызывает фарингит, инфекционные поражения кожных покровов, часто выявляется в молочных продуктах.
• Corynebacterium jeikeium - вызывает пневмонии, эндокардиты и перитониты, инфицирует кожные покровы.
• Corynebacterium cistitidis - может быть инициатором образования камней в мочевыводящих каналах.
• Corynebacterium minutissimum - провоцирует абсцесс легких, эндокардит.
• Corynebacterium xerosis и Corynebacterium pseudodiphtheriticum - ранее считались возбудителями конъюнктивита и воспалений носоглотки, а сегодня признаны сапрофитами, проживающими на слизистых оболочках в составе другой микрофлоры.

Морфология коринебактерий дифтерии сходна со морфологией всех представителей данного рода. Дифтерийная палочка имеет капсулу и перетяжки (пили). Коринебактерии дифтерии в мазке имеют форму палочек и располагаются по отношению друг к другу под углом, напоминая римские пятерки. Среди всего многообразия представителей данного вида бактерий существуют как токсикогенные формы (вырабатывающие экзотоксины с патогенным влиянием), так и бактерии, которые токсины не секретируют. Однако есть данные о том, что даже нетоксикогенные штаммы палочек Леффлера содержат в геноме гены, ответственные за выработку токсинов. А значит, что при соответствующих условиях эти гены могут включиться.

Вирулентность и стойкость

Возбудитель дифтерии довольно устойчив во внешней среде. Свою вирулентность коринебактерии сохраняют на поверхностях бытовых предметов до 20 дней при комнатной температуре. Микроорганизмы хорошо переносят высушивание и низкие температуры. Бактерии погибают:

• При термообработке при температуре от 58 °С за 5-7 минут, а при кипячении - в течении 1 минуты.
• На одежде и постельных принадлежностях - через 15 дней.
• В пыли они погибнут через 3-5 недель.
• При воздействии дезинфицирующих средств - хлорамина, сулемы, карболовой кислоты, спирта - за 8-10 минут.

Механизм развития заболевания

Через входные ворота (слизистые миндалин, носа, глотки, половых органов, повреждения кожи, конъюнктивы) коринебактерии дифтерии проникают в организм, где размножаются и вырабатывают экзотоксин. При наличии высокого антитоксического иммунитета происходит нейтрализация токсина. Но, тем не менее, в дальнейшем возможны два варианта развития возбудителя дифтерии:

• Коринебактерии гибнут, и человек остается здоровым.
• При недостаточном статусе иммунитета и высокой вирулентности дифтерийные палочки размножаются в месте инвазии и вызывают здоровое бактерионосительство.

Если отсутствует, токсигенные коринебактерии дифтерии приводят к развитию клинических и морфологических признаков инфекции. Токсин проникает в ткани, лимфатическую и кровеносную системы, вызывает парезы сосудов и повышение проницаемости их стенок. В межклеточном пространстве образуется фибриногенный экссудат, развиваются некрозные процессы. В результате превращения фибриногена в фибрин на поверхности пораженных слизистых появляются пленки фиброзного налета - характерного признака дифтерии. С кровью токсин попадает в органы кровообращения и нервную систему, надпочечники и почки, другие органы. Там он приводит к нарушению белкового обмена, гибели клеток и замене их клетками соединительной ткани.

Токсины возбудителя

Коринебактерии дифтерии характеризуются высокой патогенностью в связи со способностью секретировать экзотоксин, в состав которого входит несколько фракций:

• Нейротоксин, который приводит к некрозу клеток слизистого эпителия, расширяет кровеносные сосуды и повышает их проницаемость. В результате в межклеточное пространство выходит жидкая составляющая крови, что приводит к отекам. Кроме того, фибриноген крови вступает в реакцию с некротизированными клетками и образует фиброзные пленки.
• Вторая фракция токсина состоит из вещества, по своему строению схожего с цитохромом С - белком всех клеток организма, обеспечивающим дыхание. Токсин коринебактерий замещает нормальный цитохром клетки и приводит к ее кислородному голоданию и гибели.
• Гиалуронидаза - усиливает отек и проницаемость стенок сосудов.
• Гемолизирующий элемент - приводит к разрушению эритроцитов крови.

Эти свойства коринебактерий дифтерии, задача которых - распространить патогенное действие посредством токсинов по всему организму, и являются причинами осложнений при данной инфекции.

Классификация заболевания

Дифтерия - это заболевание со множеством форм и проявлений. По локализации инвазии выделяют локализованную и распространенную формы заболевания.

По форме и варианту течения различают:

• Дифтерию ротоглотки - локализованную (с катаральным, островным или пленочным воспалением), распространенную (налеты расположены за пределами носоглотки), токсическую (1, 2 и 3 степени), гипертоксическую. Встречается в 90-95% всех случаев заболевания.
• Дифтерийный круп - локализованный (гортань), распространенный (гортань и трахеи), нисходящий (инфекция распространяется в бронхи).
• Дифтерию носа, глаз, кожных покровов и половых органов.
• Комбинированную форму болезни, при которой поражается сразу несколько органов.

По степени интоксикации организма заболевание может быть следующих форм: нетоксическая (вызвана нетоксигенными штаммами коринебактерий дифтерии), субтоксическая, токсическая, геморрагическая и гипертоксическая дифтерия.

Клиника и симптомы

При контакте с больными или носителями токсичного штамма, вероятность инфицирования составляет порядка 20%. Первые симптомы в виде повышения температуры до 38-39 °С, болей в горле и сложностей в глотании появляются на 2-10 день.

Так как первые симптомы самой распространенной формы дифтерии с атипичным проявлением схожи с симптомами ангины, рекомендуется при первых признаках сдать мазки на обнаружение возбудителя. Но, кроме сходных с ангиной симптомов, у типичной формы заболевания имеются характерные признаки, которые заключаются в специфическом поражении миндалин. Образовавшийся на них фиброзный налет образует плотные пленки. Свежие они легко снимаются, но по мере утолщения при их снятии остается кровоточащая рана. Но дифтерия страшна не пленками на слизистых, а своими осложнениями, вызванными действием дифтерийного токсина.

Возможные осложнения

По мере размножения возбудителя, выделяемого токсина становится все больше, и он с током крови распространяется по всему организму. Именно токсин вызывает развитие осложнений, которые могут быть следующие:

• Токсический шок.
• Поражение сердечной мышцы (миокардит).
• Дистрофические поражения почек (нефрозы).
• Нарушения свертываемости крови (ДВС - синдром).
• Поражение периферической нервной системы (полинейропатия).
• Крупозные проявления (стеноз гортани).

Диагностика заболевания

Основной метод диагностики - микробиологическое исследование. При всех подозрительных ангинах назначается этот анализ на идентификацию коринебактерий. Для его проведения с пораженных миндалин берут мазки и помещают материал в питательную среду. Анализ длится 5-7 дней и дает понимание токсигенности штамма дифтерийной палочки.

Дополнением к данному методу служит анализ на антитела в крови. Методик проведения данного анализа много, но суть сводится к тому, что если в крови пациента нет антител к дифтерийному токсину, то при контакте с инфекцией вероятность заражения становится близкой к 99%.

Неспецифическим исследованием при дифтерии является общий анализ крови. Он не подтверждает и не опровергает наличие возбудителя в организме, а только показывает степень активности инфекционного и воспалительного процесса у пациента.

Лечение исключительно в стационаре

Очень важно незамедлительно приступать к лечению дифтерии, только так вероятность развития осложнений минимальна. Пациенты с подозрением на данную инфекцию немедленно госпитализируются в инфекционные отделения. Обеспечивается изоляция, постельный режим и полный спектр лечебных мероприятий, а именно:

Активная профилактика дифтерии

Защитой от данного опасного инфекционного заболевания является вакцинация. Так как главный вред наносит не сама дифтерийная палочка, а ее токсин, то и вакцинация проводится анатоксином. В ответ на введение его в организм образуются антитела именно к токсинам бактерии.

Сегодня профилактическая вакцинация проводится ассоциированными комплексными вакцинами против коклюша, дифтерии и столбняка (АКДС). В России зарегистрированы несколько комплексных вакцин, включающих дифтерийный анатоксин, отечественного и импортного производства. Дифтерийный анатоксин абсолютно безвреден, анафилактического шока и аллергических реакций не вызывает. В некоторых случаях (10%) могут развиваться местные аллергореакции в виде отека, покраснения покровов и болезненности, которые проходят сами в течении 2-3 дней. Противопоказаниями к вакцинации могут стать аллергические реакции на какой-либо компонент комплексной вакцины, применение иммунодепрессантов, иммунодефицитные состояния.

В соответствии с календарем прививок, вакцинируются дети в возрасте от 3 до 6 месяцев. Повторные ревакцинации проводятся в 1,5 года, в 7 и 14 лет. Для взрослых рекомендована ревакцинация каждые 10 лет.

Природная защита

В пользу вакцинации говорит и тот факт, что после перенесенной инфекции у человека формируется довольно нестойкий иммунитет, который сохраняется до 10 лет. По истечении этого срока вероятность заразиться данным заболеванием повышается. И хотя повторная дифтерия во многих случаях носит более легкий характер, переносится пациентом гораздо легче, но возникновение интоксикаций вполне вероятно.

Сегодня вопросы вакцинации вызывают в обществе множество вопросов. Но в нашем случае при принятии решения стоит руководствоваться не эмоциями, а фактами.

Дифтеритические пленки могут закупорить дыхательные пути в течении 15-30 минут. Экстренная помощь в таком случае может быть только профессиональная - наложение трахеостомальной трубки. Готовы ли вы рисковать своей жизнью и жизнью своих близких - выбирать вам.

Возбудитель дифтерии (Corynebacterium diphtheriae).

Дифтерия (diphtheria) - острое инфекционное заболевание, характеризующееся общей интоксикацией организма и образованием пленчатых налетов в месте внедрения возбудителя. Возбудитель дифтерии - Corynebacterium diphtheriae. Этот род не включен ни в какое семейство, содержит патогенные и непатогенные виды.

Морфология . Тонкие, прямые или слегка изогнутые полочки, на одном или обоих концах клетки есть утолщение, что придает им вид булавы. Микроорганизмы весьма полиморфны, могут встречаться нитевидные, ветвящиеся образования, иногда приобретают вид кокков или дрожжевых грибов. Неподвижны, не образуют спор и капсул. Грам-положительные. В мазках располагаются под углом друг к другу в виде буквы “V”, иногда больше двух - тогда их сравнивают с растопыренными пальцами руки. В цитоплазме имеются включения - гранулы волютина (у Corynebacterium diphtheriae их не более шести, у некоторых непатогенных видов количество гранул достигает 18-20). Волютин обладает способностью необычно воспринимать окраску. При окраске метиленовой синью волютин окрашивается в синий, черный или даже красный цвет - метахроматический эффект, поэтому волютин называют метахроматином. Волютин представляет собой неорганические полифосфаты (запас энергии).

Коринебактерии относятся к факультативным анаэробам, лучше растут в аэробных условиях. Плохо растут на обычных питательных средах, лучше на средах с добавлением крови, сыворотки крови любого вида животных, с добавлением теллурита калия (среда Клауберга), подавляющего рост сопутствующей микрофлоры. На средах с теллуритом колонии коринебактерий темно-серые или черные, это объясняется тем, что коринебактерии восстанавливают теллурит до металлического теллура.

По культуральным свойствам коринебактерии делятся на три биовара:

1. gravis (грубый) - на кровяном теллуритовом агаре - радиально исчерченные колонии серовато-черного цвета с уплощенным центром, диаметр 2-3 мм, на жидких средах - в виде пленки и зернистого осадка, не обладают гемолитической активностью.

2. mitis (тонкий) - на кровяном теллуритовом агаре - выпуклые черные гладкие колонии с ровными краями, мелкие - диаметр 1-2 мм, на бульоне - помутнение и осадок, вызывают гемолиз.

3. intermedius (промежуточный) - сочетает признаки gravis и mitis, по основным признакам ближе к mitis, на бульоне - в виде зернистого осадка, не обладают гемолитической активностью.

Коринебактерии ферментируют глюкозу, мальтозу, галактозу до кислоты, не сбраживают лактозу, сахарозу, маннит. Обладают каталазной активностью, восстанавливают нитраты в нитриты, расщепляют цистин с образованием H 2 S. Не расщепляют мочевину (не обладают уреазной активностью). Вариант gravis сбраживает кроме этого крахмал и гликоген.

Все три биовара продуцируют одинаковый экзотоксин. Летальная доза дифтерийного экзотоксина для человека 0.5 мг/кг массы тела. Экзотоксин имеет белковую природу, получен в кристаллическом виде. Образованию экзотоксина способствует низкая концентрация Fe в среде, это объясняется тем, что у коринебактерий образуется белок-репрессор гена, кодирующего синтез экзотоксина. Этот белок является Fe-содержащим, чем больше он насыщается Fe, тем выше его репрессорная активность. Экзотоксин термолабилен (56-60°C - 1 час, 80°C - несколько минут), инактивируется прямым солнечным светом, ультрафиолетовым облучением, O 2 . При добавлении слабого раствора формалина (0.3-0.4%, 1 месяц, 38-40°C) превращается в анатоксин (токсоид). Дифтерийный токсин разрушается протеолитическими ферментами ЖКТ. Образуется как в организме, так и на питательных средах. Состоит из двух фрагментов - A и B. Фрагмент B (39000 Да) обеспечивает адсорбцию молекулы токсина на клеточной мембране и последующее проникновение токсина в клетку. Фрагмент A (24000 Да) инактивирует фактор элонгации полипептидной цепи (трансфераза II) и тем самым нарушает синтез белка в клетке. В 1951 г. была установлена возможность перехода нетоксигенных штаммов в токсигенные вследствие заражения умеренным фагом β-tox+ (фаговая (лизогенная) конверсия). Это может происходить in vitro и in vivo. Таким образом экзотоксин продуцируется лизогенным штаммом.

Коринебактерии образуют дермонекротический фактор, продуцируют ферменты агрессии (гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин), гемотоксин, лейкоцидин.

Антигены. Коринебактерии содержат K-антиген (термолабильный, обладает типовой специфичностью), содержат соматический O-антиген (термостабильный, обладает родовой специфичностью). На основе O-антигена выделяют 11 сероваров (7 основных и 4 дополнительных, редко встречающихся).

Резистентность . В окружающей среде довольно устойчивы, хорошо сохраняются при низкой температуре, при высушивании, в пыли - в течении 5 недель, в воде и молоке - до 20 дней, в тканях трупа - в течении 2 недель. При воздействии высокой температуры довольно быстро погибают, но если они находятся в сухой пленке, то выдерживают нагревание до 98°C.

Устойчивы к обычно использующимся дезинфектирующим веществам. Уступают по устойчивости только спорообразующим микроорганизмам.

Чувствительны к пенициллину, умеренно резистентны к сульфаниламидным препаратам.

Патогенез и клиника. В естественных условиях болеет только человек. К действию дифтерийного токсина чувствительны также кролики и морские свинки.

Входные ворота - слизистые оболочки верхних дыхательных путей (миндалины, зев, носоглотка, гортань, трахея), реже - конъюнктива глаз, кожа наружного слухового прохода, слизистая оболочка гениталий девочек, раневая поверхность (чаще в странах с тропическим климатом).

Возбудители остаются в месте внедрения, размножаются, вырабатывают экзотоксин, который оказывает как местное, так и общее действие. Местное - возникновение воспалительных реакций, формирование пленчатых налетов (diphthera), характер которых определяется локализацией ворот (на слизистой, покрытой однослойным эпителием - крупозная пленка, рыхло связанная с подлежащей тканью; на слизистой, покрытой многослойным эпителием - дифтерическая пленка, плотно спаянная с подлежащей тканью, с трудом снимается, если снять - образуется кровоточащая поверхность). Пленчатые налеты - конгломераты нитей фибрина, некротизированных клеток эпителия, эритроцитов, лейкоцитов и самих бактерий. В легких случаях пленки могут отсутствовать, местные изменения ограничены воспалением.

Обычно наблюдается увеличение регионарных лимфатических узлов, у некоторых больных может развиться массивный отёк шеи (ложный круп), если входные ворота - верхние дыхательные пути. Экзотоксин всасывается в кровь → токсинемия → поражение всех органов и тканей. Наиболее чувствительны сердечная мышца, нервная ткань и ткань надпочечников. В этих органах - дегенеративные изменения клеток, может наблюдаться жировая инфильтрация, затем очаги некроза. Могут наблюдаться обширные кровоизлияния.

Инкубационный период 2-10 дней (в среднем 5-7 дней). В зависимости от локализации входных ворот различают клинические формы. Самая частая - дифтерия зева, вовлекаются в процесс полость носа или гортань (самая тяжелая форма дифтерии - дифтерийный (истинный) круп - поражение гортани → отслаивание дифтерических пленок → обтурация гортани, ларингоспазм → асфиксия - лечение наложением трахеостомы ниже места обтурации). Также может быть дифтерия глаза, уха, половых органов, ран. Во всех случаях патогенез один и тот же.

Есть корреляция между биоваром и тяжестью болезни. Раньше самую тяжелую форму вызывал mitis, сейчас - gravis (в 90 гг.).

Иммунитет антитоксический и антибактериальный. Основная защитная роль у антитоксического иммунитета. После перенесения дифтерии - прочный, продолжительный, но не абсолютный (5-6% повторные заболевания) иммунитет.

Лабораторная диагностика. Основной метод - бактериологический. Материал исследования - пленка, фрагмент на границе со здоровой тканью. Если клетки там отсутствуют, берут отделяемое слизистых. Материал берут сухим тампоном или увлажненным (перед стерилизацией) 5% глицерином.

I этап - ● Посев на элективные среды (кровяной теллуритовый агар - среда Клауберга).

● Одновременно - посев на среды накопления (они же являются транспортными средами) - 5% глицерин, pH = 7.2.

II этап - накопление чистой культуры (среда Ру со свернувшейся лошадиной сывороткой).

III этап - ● У выделенной культуры определение токсигенности методом Оухтерлони - реакция преципитации в сывороточном агаре (помещают на среду полоску, смоченную антитоксином, по одну сторону сеют исследуемый штамм, по другую - музейные штаммы (заведомо токсигенные и нетоксигенные)).

● Серологические методы (РГА, РНГА) имеют вспомогательное значение - диагноз лишь ретроспективно, можно применять для оценки уровня напряженности антитоксического иммунитета (титр 1:80 и выше - невосприимчивые люди, если в меньшем разведении или нет - нужна ревакцинация), а также для планирования прививочных мероприятий (оценка напряженности антитоксического иммунитета у населения).

● Определение биохимической активности - проба Закса (на уреазу) и проба Пизу (на цистиназу).

На всех этапах - микроскопия. Но при микроскопировании нативного материала, нельзя определить токсигенность и дифференцировать от непатогенных дифтероидов.

Ускоренная диагностика - бактериоскопическая (эффективность невелика), люминесцентно-серологический (не позволяет определить токсигенность).

Для оценки напряженности антитоксического иммунитета на протяжении многих лет использовалась кожная проба Шика (1/40 DLM токсина), если иммунитет напряженный, никаких изменений в месте введения не будет, если мало напряженный, будет воспалительная реакция (покраснение, припухлость). Это не аллергическая проба. Сейчас проба Шика практически не используется, применяется РНГА (см. выше).

Эпидемиология . Источник инфекции - больной человек, носитель. Больные заразны на протяжении всей болезни и в период выздоровления. Особенное эпидемиологическое значение имеют больные со стертыми формами, важную роль играют носители. Носительство (2-3 недели, редко до месяца) обнаруживалось в некоторые периоды у 10% людей. Пути передачи: воздушно-капельный, воздушно-пылевой, предметно-бытовой, алиментарный (молоко и молочные продукты). Подъем заболеваемости в холодное время года. До начала массовой вакцинации были наиболее уязвимы дети первых 5 лет, после - сдвиг на более старшие возрастные группы, нередко болеют взрослые (у них чаще стертая форма, клиническая картина ангины). В настоящее время среди детей подъем заболеваемости в 100 раз, среди взрослых - в 260 раз, но все равно меньше чем до массовой вакцинации.

Лечение и профилактика. Лечение антитоксической противодифтерийной лошадиной сывороткой как можно раньше. Антибиотики (пенициллин). С целью специфической профилактики - анатоксин (в составе АКДС, АДС, АД), иммунизация проводится в 6 месяцев, в 3 года, в 7 и 17 лет.

Возбудитель коклюша (Bordetella pertussis).

Коклюш (pertussis) - острое инфекционное заболевание дыхательных путей, основной симптом которого - приступы судорожного кашля. Возбудитель коклюша - Bordetella pertussis - был выделен в 1906 г. Ж. Борде и О. Жангу.

Морфология . Короткие грам-отрицательные палочки овоидной формы. При окраске наблюдается биполярность (концы окрашиваются более интенсивно вследствие неравномерного распределения липидов в клетке). Неподвижны, не образуют спор. При окраске по Романовскому-Гимзе видна капсула. Облигатные анаэробы. Оптимум температуры 35-37°C. Очень требовательны к питательным средам. В процессе роста выделяют много жирных кислот, которые препятствуют росту самих бактерий. Для нейтрализации их к среде примешивают ионообменные смолы, кровь, древесный уголь. Используют комбинированный казеиново-угольный агар - КУА. Кровь содержит также факторы роста (необязательные для микроорганизмов, но в их присутствии колонии растут лучше). При культивировании на плотных средах неоднородны, выделяют 4 фазы:

1) гладкие колонии (S-форма), микроорганизмы образуют капсулу;

4) R-форма - не образуют капсулу, теряют вирулентность;

2-3) переходные;

Вирулентна только первая фаза колоний.

Колонии мелкие (диаметр < 1 мм), вязкой консистенции, формируются на 3-4 день после посева. На жидких средах - равномерное помутнение и осадок. Биохимическая активность - инертны, вызывают гемолиз эритроцитов.

Антигенная структура очень сложная. Диагностическое значение имеют только агглютиногены. Делятся на несколько сероваров. Содержат эндотоксин, вырабатывают экзотоксин, частично связанный с бактериальной клеткой → может освобождаться только после разрушения клеток, имеет белковую природу. При введении мышам токсин вызывает некроз, геморрагии и дегенерацию клеток почек, селезенки и печени.

Кроме того микроорганизм продуцирует гистаминсенсибилизирующий фактор и лимфоцитозстимулирующий фактор. К факторам вирулентности относится и капсула.

В естественных условиях болеет только человек. В эксперименте удалось воспроизвести заболевание у обезьян.

Патогенез и клиника. Входные ворота - слизистые оболочки гортани, трахеи и бронхов. Микроорганизмы локализуются на поверхности клеток, размножаются, часть погибает, освобождая эндо- и экзотоксин. Это приводит к возникновению воспалительной реакции эпителия, затем появляются очаги некроза. Все это вызывает постоянное раздражение окончаний афферентных волокон nervus vagus → импульсы в кашлевой центр → стационарный очаг возбуждения (по типу доминанты) → приступы судорожного кашля. Из области кашлевого центра возбуждение иррадиирует на соседние участки → рвота, спазм, снижение артериального давления. Нарушается легочная вентиляция, увеличивается проницаемость сосудов → гипоксемия и ацидоз. Формируется реакция ГЧЗТ (сильный бактериальный аллерген). Для заболевания характерна цикличность:

1. инкубационный период (5-21 день);

2. катаральный период - субфибрильная температура, может быть насморк, слабо выраженный кашель, постепенно усиливающийся, к концу 2 недели - приступообразный характер;

3. конвульсивный (судорожный) период - появление приступов кашля при действии любых раздражителей (специфических и неспецифических). Во время приступа кашля толчки быстро следуют друг за друга на фоне затрудненного вдоха → характерный свистящий звук - кашель с репризами. Приступ заканчивается отделением густой вязкой мокроты (или рвотой) - до 40-50 раз в сутки. Во время приступа - цианоз лица и тела. На высоте приступа может быть асфиксия, имеются данные о случаях разрыва ребер.

Осложнения:

а) бронхопневмония,

б) ателектазы (полное спадение бронхов) → нарушение вентиляции → размножение анаэробной микрофлоры → гангрена легкого,

в) клапанная обтурация → эмфизема → бронхоэктатическая болезнь (размножение гноеродных кокков (Staphylococcus, Streptococcus)).

Температура в течении всего периода - нормальная. Продолжительность конвульсивного периода - 4-6 недель.

4. период угасания (разрешения) - 2-3 недели, число приступов сокращается.

Может быть стертое течение (в основном у привитых) - отсутствуют приступы кашля, представляет эпидемиологическую опасность. После перенесения заболевания - прочный. пожизненный иммунитет.

Лабораторная диагностика. Основной метод - бактериологический. Способ взятия материала:

1) мазок с задней стенки глотки стерильным тампоном (возникает кашель → капли попадают на тампон).

2) “кашлевые пластинки” - подносится чашка с питательной средой (Клауберга) к лицу и капли при кашле засеиваются на неё (в основном для детей).

3) у взрослых материал можно брать с помощью бронхоскопии.

Серологические методы - РСК, РНГА - второстепенное значение.

Эпидемиология . Источник - больной (наиболее опасен - в катаральный период). Часто носительство у взрослых. Коклюш - одна из самых высоко заразных инфекций. Из-за малой устойчивости возбудителя единственный путь передачи - воздушно-капельный. Сезон подъема заболеваемости - холодное время года.

Специфическая профилактика : используются убитые вакцины (АКДС), коклюшный компонент - самый нестабильный, самый реактогенный, у привитых могут возникать аллергические реакции (вплоть до анафилаксии).

В 1937 году был открыт возбудитель паракоклюша - Bordetella parapertussis. Морфологически сходна, растет быстрее на тех же средах (1-2 сутки), колонии больше, имеют общие формы антигенов, но перекрестного иммунитета нет. Образует уреазу. Клинически вызывает легкую форму коклюша. Лабораторная диагностика такая же. Специфической профилактики не проводится, встречается реже.

Микробиологическое исследование, позволяющее выявить возбудителя дифтерии (C. diphtheriae) в исследуемом биоматериале.

Синонимы русские

Посев на бациллы Леффлера, посев на BL, посев на дифтерийную палочку.

Синонимы английские

Corynebacterium diphtheriae сulture, Diphtheria сulture.

Метод исследования

Микробиологический метод.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок из зева и носа.

Как правильно к исследованию?

Подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Corynebacterium diphtheriae (бациллы Леффлера) – это грамположительные бактерии рода Corynebacterium, являющиеся возбудителями дифтерии и способные к выработке дифтерийного токсина. Заболевание передается воздушно-капельным путем, источником инфекции являются больные люди или бактерионосители.

Инкубационный период составляет в среднем 2-5 дней. Происходит фибринозное воспаление слизистых оболочек ротоглотки и дыхательных путей с формированием псевдомембран и с симптомами общей интоксикации.

При токсической форме дифтерии также может поражаться сердце и нервная система. В некоторых случаях возможно бессимптомное носительство.

Диагноз «дифтерия» основывается на клинических данных, посев на дифтерию проводится для подтверждения.

Для чего используется исследование?

• Для подтверждения диагноза «дифтерия».
• Для дифференциальной диагностики заболеваний, протекающих со сходными симптомами, таких как ангины различного происхождения, паратонзиллярный абсцесс, инфекционный мононуклеоз, острый ларинготрахеит, эпиглоттит, бронхиальная астма.
• Чтобы оценить эффективность проводимой антибактерильной терапии.

Когда назначается исследование?

• При подозрении на дифтерию.
• Когда известно, что пациент контактировал с больными дифтерией.
• После проведения антибактериальной терапии – не менее чем через 2 недели после окончания курса антибиотиков.
• В некоторых случаях перед госпитализацией в стационар (с профилактической целью).

Что означают результаты?

Референсные значения: нет роста.

Выявление возбудителя дифтерии подтверждает диагноз «дифтерия» или, если симптомы заболевания отсутствуют, свидетельствует о бактерионосительстве. При отрицательном результате посева у больного с подозрением на дифтерию диагноз может быть подтвержден в том случае, когда у контактных лиц результат посева положительный, то есть выделяется возбудитель дифтерии.

Причины положительного результата

• Дифтерия или бессимптомное носительство C. diphtheriae.

Причины отрицательного результата

• Отсутствие дифтерии. Исключение составляют случаи, когда на момент исследования проводилось лечение антибиотиками.

Что может влиять на результат?

Предшествующая антибактериальная терапия.

Важные замечания

Диагноз «дифтерия» основывается на клинической картине заболевания, поэтому лечение должно быть начато до получения лабораторного подтверждения заболевания. При положительном результате посева необходимо исследовать выделенный штамм С. diphtheriae на токсигенность.

• Посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам

Кто назначает исследование?

Инфекционист, терапевт, врач общей практики, педиатр, ЛОР.

Литература

1. Macgregor R.R. Corynebacterium diphtheriae. In: Principles and practice of infectious disease / G.L. Mandell, Bennett J.E., Dolin R (Eds) ; 6th ed. – Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. – 2701 p.
2. Efstratiou A. Laboratory guidelines for the diagnosis of infections caused by Corynebacterium diphtheriae and C. ulceran / A. Efstratiou, R.C. Georg // Communicable disease and public health. – 1999. – Vol. 2, № 4. – P. 250–257.
3. Current approaches to the laboratory diagnosis of diphtheria / A. Efstratiou // J. Infect. Dis. – 2000. – Vol. 181 (Suppl 1). – P. S138–S145.

Реже - в других органах, и явлениями интоксикации (поражение сердечно-сосудистой, кортикоадреналовой систем и периферических нервов). Механизм передачи - респираторный. Источник инфекции - больные и носители токсигенных штаммов С. diphtheriae.

Полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки (0,3-0,8 х 1,5-8 мкм), иногда с булавовидными концами (Corynebacterium от греч. koryne - булава). Располагаются в виде буквы «V». Грамположительные. По полюсам клеток видны зерна полиметафосфата (зерна волютина), обладающие метахромазией, т. е. окрашиваются метиленовым синим или по Нейссеру в иной цвет, чем бактерия (рис. 3.87 и 3.88).

Рис. 3.87. Рисунок мазка из чистой культуры С diphtheriae . Окраска по Нейссеру

Таблица З.Зб. Коринебактерии, наиболее клинически значимые в патологии человека
Виды рода Corynebacterium
	Дифтерия
	Ангина у иммунодефицитных лиц
С. jeikeium (группа JK)	Септицемия, инфекции мягких тканей
С. urealyticum (группа D2)	Инфекции мочевого тракта (пиелонефрит, цистит и др. оппортунистические инфекции)
С. minutissimum	Эритразма, оппортунистические инфекции
	Оппортунистические инфекции
С. pseudodiphtheriticum	Эндокардит, оппортунистические инфекции
	Оппортунистические инфекции
Arcanobacterium (ранее Corynebacterium) haemolyticum	Хронические тонзилиты, поражения кожи

С. ulcerans - вид мелких палочковидных грамположительных бактерий рода Corynebacterium. Иногда из-за наличия профага продуцирует дифтериеподобный экзотоксин. Штаммы С. ulcerans продуцируют также фосфолипазу D. Представители вида родственны С. diphtheriae. Являются патогенами для крупного рогатого скота. Возможно заражение человека через молоко больных коров. Вызывают дифтериеподобные заболевания, фарингит, поражения кожи у лиц с иммунодефицитами.

Рис. 3.88 . Мазок из чистой культуры С. diphtheriae . Окраска щелочной синькой Леффлера

Имеют микрокапсулу. Неподвижны. Факультативные анаэробы. Выделяют 4 биовара: gravis, mitis, intermedius, belfanti.

Рис. 3.89. Колонии С. diphtheriae gravis (слева) - крупные матовые, выпуклые в центре с радиальной исчерчеиностыо и неровными краями («маргаритки») и mitis (справа) - мелкие, черные, гладкие, блестящие с ровными краями

Дифтерийные палочки могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование токсина. При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность - продукцию дифтерийного экзотоксина (см. реакция преципитации).

Микробиологическая диагностика . Исследуют слизь и пленку из очагов поражения. Бактериоскопический метод имеет ориентировочное значение: мазок окрашивают щелочной метиленовой синькой Леффлера или уксусно-кислой толуидиновой синькой, а другой мазок - по Граму. Зерна волютина метахроматически окрашиваются метиленовым синим в темно-бордовый цвет (клетка окрашивается в синий цвет). Бактериологический метод: посев на среду Клауберга И, хинозольную среду Бучина, модифицированную среду Тинсдаля (цистин-теллурит-сывороточная среда), кровяной агар, на плотную сывороточную среду для выявления продукции цистиназы (проба Пизу - коричневый ореол вокруг посева «уколом»), на среды Гисса, на среду для определения токсигенности возбудителя (преципитация в геле) и др. Молекулярно-генетический метод: ПЦР.

Специфическая профилактика. В качестве вакцины применяют дифтерийный анатоксин, входящий в состав препаратов АКДС (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина), АДС и АД. Препарат вводится грудным детям, начиная с трехмесячного возраста. Ревакцинацию проводят с помощью АДС. Людям, ранее иммунизированным, но не имеющим достаточно напряженного антитоксического иммунитета, при контакте с больными вводят дифтерийный анатоксин. Ранее неиммунизированным - дифтерийный анатоксин + антитоксическую сыворотку. Последную, как и при лечении, вводят дробно по Безредке (профилактика анафилактического шока).