Общая схема проведения бактериологической диагностики. Этапы бактериологического метода исследования
20. Характеристика бактериологического метода исследования
Культуральный (бактериологический) метод исследования - совокупность способов, направленных на выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов (бактерий) с помощью культивирования на питательных средах.
Чистая культура - совокупность микроорганизмов одного вида. Чаще всего чистую культуру получают путем отбора и культивирования изолированной колонии (потомство одной микробной клетки).
Этапы метода:
1. Забор материала для исследования.
2. Выделение чистой культуры и ее идентификация.
3. Заключение.
Забор материала для исследования. Вид исследуемого материала зависит от цели исследования (диагностика - от больного; эпиданализ - из внешней среды, продуктов питания, больного и (или) бактерионосителя).
Выделение чистой культуры . Включает 3 или 4 этапа:
1. Посев материала (после предварительной микроскопии) на чашку с плотной питательной средой (лучше дифференциально-диагностической или селективной) с целью получения изолированных колоний. Производят его чаще всего методом механического разобщения. В некоторых случаях (например, кровь) материал предварительно засевают в жидкую среду обогащения с последующим пересевом на чашку с агаровой средой. Иногда до посева проводят селективную обработку материала (с учетом свойств выделяемого микроорганизма; например, обработка кислотой или щелочью для выделения устойчивых бактерий). Культивируют при температуре 37°С в течение 18-24 часов. Время культивирования для разных видов бактерий может колебаться.
2(3):а) изучение колоний на чашке с агаром (культуральные признаки), отбор наиболее типичных; б) приготовление мазков из этих колоний с окраской (по Граму или другими методами); а) отсев остатка исследованной колонии на среду накопления и выращивание в термостате при оптимальной температуре.
3(4). Изучение чистоты культуры, полученной на среде накопления. С этой
целью готовят мазок, окрашивают (чаще по Граму), микроскопически изучают
морфологическую и тинкториальную однородность (в разных полях зрения).
4(5). Идентификация чистой культуры.
Заключение. По совокупности признаков в сравнении со свойствами эталонных (типовых) штаммов указывается вид выделенного из материала микроорганизма.
Оценка метода:
достоинства: относительно высокая чувствительность и точность, возможность определить численность микробов в исследуемом материале, а также чувствительность к антибиотикам;недостатки: относительная длительность, метод дорогостоящий.
21. Питательные среды для аэробов и анаэробов. Требования, предъявляемые к питательным средам, классификация.
Требования:
среды должны быть питательными
должны иметь определенные ph
должны быть изотоническими, т.е. осмотическое давление в среде должго быть такое же как в клетке.
должны быть влажными и не слишком жидкими
должны облпдпть определенным окислительно-восстановительным потенциалом
должны быть стерильными
должны быть унифицированными, т.е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов.
Питательные среды можно разделить:
А) По происхождению:
1} естественные - натуральные продукты питания (мясо, молоко, картофель);
2) искусственные - приготовленные специально для выращивания микробов: - среды из естественных продуктов (мясная вода, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), - не имеющие постоянного состава; - синтетические питательные среды - растворы строго определенных количеств солей, аминокислот, азотистых оснований, витаминов в дистиллированной воде - имеют постоянный состав, используются для выращивания микроорганизмов и культур клеток при получении вакцин, иммунных сывороток и антибиотиков;
Б) По назначению:
1) общего назначения (МПБ, МПА) - на них растет большинство микробов;
2) элективные - избирательно способствуют росту одного вида микробов из смеси (например, желточно-солевой агар для стафилококков);
3) дифференциально-диагностические - позволяют отдифференцировать по внешнему виду среды один вид микроба от других (например среды Эндо, Левина для кишечной группы микробов).
Кроме того, в зависимости от целей использования в схеме выделения чистых культур, по назначению можно выделить следующие среды:
1) обогащения - подавляют рост микробов, сопутствующих возбудителю;
2) для получения изолированных колоний;
3) накопления чистой культуры;
В) По консистенции:
1) жидкие;
2) полужидкие (при добавлении агар-агара в концентрации 0,5-0,7%);
3) плотные - выше 1%.
Суть бактериоскопического метода: обнаружение микробов в исследуемом материале; изучение их морфологических и тинкториальных свойств, характер расположения в бактериологическом мазке в поле зрения.
Техника выполнения. Материал от больного визуально изучается, выбирается порция, в которой с наибольшей долей вероятности может быть обнаружен возбудитель заболевания (комочки слизи, гнойные пробки). Он наносится на предметное стекло (иногда материал предварительно эмульгируется в физиологическом растворе, реже подвергается центрифугированию). Капля распределяется по стеклу, высушивается и фиксируется. После этого мазок окрашивается, и препарат просматривается под микроскопом. Обычно мазок окрашивается по Граму. Иногда, как наиболее щадящий, применяется один из простых методов окраски, тогда препарат красится одним красителем (например, при диагностике менингококковой инфекции, холеры).
При необходимости используются специальные сложные методы окраски, например метод Бурри-Гинса для выявления капсульных микроорганизмов или метод Циля-Нильсена для выявления наличия кислотно-устойчивых бактерий. В отдельных случаях (в частности, при изучении двигательной активности микроорганизмов) готовят препараты «висячая капля» и «раздавленная капля» и микроскопируют неокрашенные бактерии.
Достоинства бактериоскопического метода: простота исполнения, возможность быстрого получения результатов, техническая и экономическая доступность.
Недостатки метода: для определения вида микроорганизмов зачастую бывает недостаточным определение его морфологических свойств, так как они идентичны у представителей родственных видов. Кроме того, бактерии с характерной морфологией нередко подвергаются изменениям, особенно под действием антибиотиков, и становятся неузнаваемыми; наконец, концентрация возбудителей в исследуемом материале может быть чрезвычайно низкой, и тогда их трудно обнаружить.
С учетом вышеуказанного, бактериоскопический метод редко используется как единственный и окончательный способ установления этиологии заболевания. Чаще он применяется как ориентировочный, предварительный, а при диагностике некоторых инфекционных заболеваний он вообще не предусматривается.
Как понимать ориентировочность и предварительность? Это касается врача-клинициста и врача-бактериолога. Клиницист, получая предварительный ответ (положительный или отрицательный), в большей или меньшей степени использует полученную информацию в своих дальнейших исследованиях до получения окончательного результата бактериологического метода диагностики. Бактериолог, получив ориентировочные сведения о подозреваемом возбудителе, о его концентрации в используемом материале, о наличии сопутствующей микрофлоры, определяет способы обработки материала и выделения чистой культуры возбудителя, выбирает питательные среды для последующего культивирования.
Бактериологический метод
Суть метода - выделение чистой культуры микроба - возбудителя из патологического материала, подробное изучение его морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических свойств с целью последующей идентификации возбудителя. При осуществлении бактериологического метода исследования выделяют 4 этапа.
А. Учитывая данные, полученные при бактериоскопическом исследовании, осуществляется выбор максимально эффективных питательных сред, на которых с наибольшей долей вероятности удастся получить рост культуры предполагаемых микробов - возбудителей.
Б. Производится посев исследуемого материала на ряд питательных сред: жидких и плотных, универсальных, элективно-селективных, дифференциально-диагностических. При этом посев на чашки Петри с плотными питательными средами производится бактериологической петлей штрихом с целью обеспечить возможность получения роста изолированных друг от друга колоний микробов (можно пользоваться также способом Дригальского или другим методом разобщения культур микроорганизмов).
А. Изучаются культуральные свойства выросших на питательных средах микроорганизмов; производится отбор подозрительных колоний. Следует подчеркнуть, что отбор подозрительных колоний - самый ответственный и трудный этап работы. Он основан, прежде всего, на определении характерных особенностей колоний микробов, но зачастую это не позволяет дифференцировать колонии микробов отдельных видов и приходится дополнительно изучать морфологию микробов в мазках из подозрительных колоний, особенности роста микроорганизмов на дифференциально-диагностических средах и т.д. Выделение чистых культур бактерий и их изучение можно осуществлять, проводя предварительный посев на жидкие среды накопления, но при этом затрачивается дополнительное время исследования.
Б. Из подозрительных колоний готовится бактериологический мазок, окрашивается по Граму и микроскопируется (устанавливается идентичность микроорганизмов с изученными при микроскопическом исследовании на 1-ом этапе). В. Из оставшейся части подозрительной колонии производится пересев культуры на скошенный мясопептонный агар (можно использовать и другие питательные среды, на которых предполагается хороший рост выделенных микроорганизмов). Цель - накопление чистой культуры микроба - предполагаемого возбудителя заболевания, т.к. на следующем этапе исследования потребуется много микробной массы.
У предполагаемого возбудителя изучаются сахаролитические свойства (производится посев на среды пестрого ряда, среды Олькеницкого, Ресселя и др.), протеолитическая активность (посев на желатин, молоко по Тукаеву, определение образования индола и сероводорода при росте на мясопептонном бульоне). Исследуется чувствительность выделенных культур к антибиотикам (чаще методом стандартных бумажных дисков, реже - методом серийных разведений). Производится серотипирование в реакции агглютинации на стекле с групповыми и типовыми диагностическими сыворотками; фаготипирование со стандартными диагностическими бактериофагами. Для идентификации в некоторых случаях изучаются факторы патогенности у бактерий.
Производится учет результатов проведенных исследований. На основании сопоставления выявленных у микроорганизмов свойств (морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических и т.д.) осуществляется идентификация микробов. Выдается окончательный ответ с результатами бактериологического исследования, где указывается вид возбудителя (иногда - его серотип, биовар, фаготип) и его чувствительность к антибиотикам.
Довольно часто для получения достоверных результатов выдаче ответа предшествуют биологический, аллергологический или другие методы исследования.
Достоинства бактериологического метода диагностики: высокая достоверность результатов исследования; возможность получения дополнительных данных о чувствительности выделенных возбудителей к антибиотикам; возможность проведения эпидемиологических исследований.
К недостаткам метода можно отнести длительность исследования (не менее 4-5 дней), а также невозможность его использования в тех случаях, когда возбудители (например, риккетсии, хламидии) инфекции не растут на искусственных питательных средах.
Биологический метод
В некоторых случаях для оптимизации диагностики инфекционных заболеваний применяется биологический метод (биопроба), предусматривающий заражение лабораторных животных. При этом перед исследователем могут стоять различные цели:
Воспроизведение клинической и патологоанатомической картины заболевания (например, при диагностике столбняка, лептоспироза);
Выделение в короткие сроки чистой культуры возбудителя (при диагностике пневмококковой инфекции);
Определение вирулентности и патогенности возбудителя (при диагностике туберкулеза);
Определение вида и типа токсинов (при диагностике ботулизма)
Для диагностики инфекционных заболеваний используют различных животных. Выбор их определяется видовой восприимчивостью к различным этиологическим агентам. Например, мыши чувствительны к пневмококковой инфекции, сибиреязвенной, столбнячной; морские свинки - к возбудителям туберкулеза, бруцеллеза, туляремии; кролики - к стафилококкам, стрептококкам, ботулизму. Для исследования отбираются только здоровые животные определенного возраста и массы тела.
Перед введением материала животных фиксируют. Мелких животных держит экспериментатор, для крупных используют специальные приспособления. Место введения инфецированного материала обрабатывают спиртом или йодом. Инфицированный материал вводят в зависимости от особенностей патогенеза изучаемого заболевания подкожно, накожно, внутривенно, внутрибрюшинно, интрацеребрально и т.д.
При накожном методе заражения предварительно выстригают шерсть, скарифицируют кожу, после чего втирают в неё материал.
Подкожный метод: кожу животных захватывают в складку, лучше пинцетом, вводят иглу до половины, после инъекции накладывают ватку со спиртом и извлекают иглу.
Внутримышечный метод: материал вводят в мышечную ткань верхней части задней конечности.
Внутрибрюшинный метод: животное держат вниз головой, чтобы не поранить кишечник. Инъекцию делают в нижней части живота, сбоку от средней линии. Брюшную стенку прокалывают толчкообразным движением, шприц под прямым углом.
Внутривенный метод: мышам, крысам вводят материал - в хвостовую вену или внутрисердечно. Кролику вводят - в ушные вены, которые поверхностно расположены и хорошо видны (лучше пунктировать наружную вену). Место введения после инъекции зажимают ватой со спиртом, чтобы не было кровотечения. Морским свинкам при внутрисердечном заражении вкалывают иглу на высоте «толчка» сердца в межреберный промежуток. Если игла введена правильно, в шприце появится кровь.
Подготовка инструментов и материалов: шприцы, скальпели, иглы стерилизуются кипячением. В шприц набирают материал (немного больше, чем необходимо ввести), поворачивают вертикально вверх, покрывают иглу стерильной ваткой и выталкивают поршнем из шприца пузырьки воздуха. Эту манипуляцию проводят над дезраствором.
При диагностике инфекций, обусловленных действием токсина (ботулинического, сибиреязвенного) материал, предположительно содержащий возбудителя и токсины, помещают в физиологический раствор, затем фильтруют через бумажный фильтр, натертый тальком (он хорошо адсорбирует токсин). Чувствительных животных заражают смывами с фильтров. В некоторых случаях, когда патогенез заболевания обусловлен патогенными свойствами самого возбудителя, животных заражают микробной взвесью.
Зараженных белых мышей маркируют и помещают в специальные стеклянные банки; на них наклеивается бирка с указанием даты заражения и вида микроорганизма, с которым проводилась работа. Точно так же подписывают клетки с зараженными кроликами или морскими свинками. За животными наблюдают. В случае гибели их сразу же вскрывают.
Перед вскрытием белых мышей животных предварительно умерщвляют парами эфира. Мышей ненадолго погружают в дезраствор и затем фиксируют в кювете брюшком вверх за лапы. Отмечают наличие или отсутствие внешних патологических изменений. Разрез кожи делается продольно от лобка до нижней челюсти и поперечно - по направлению к конечностям. Отмечают изменения в кожной клетчатке и состояние лимфоузлов. Из последних делают мазки-отпечатки. Для осмотра грудной полости удаляют грудину, надрезав ножницами ребра с обеих сторон. После внешнего осмотра отрезают кусочки сердца и помещают в МПБ. Делают посев непосредственно на МПА мазки-отпечатки из сердца, легких.
Вскрывают брюшную полость, при внешнем осмотре отмечают состояние внутренних органов (величину, цвет, консистенцию, наличие гнойных очагов). Делают посевы печени, селезенки и мазки отпечатки.
Работа проводится стерильными инструментами, после каждого взятия органа пинцет и ножницы опускаются в стакан со спиртом и обжигают.
После вскрытия труп и кювету, где производилось вскрытие, заливают дезраствором на сутки.
Посевы инкубируют в течение 24 часов (при необходимости и более) при
t 37 о С. Затем их просматривают, выделяют чистую культуру возбудителя и осуществляют его идентификацию при помощи бактериологического метода.
Достоинства метода: достоверность полученных результатов, отсутствие необходимости в сложной аппаратуре.
Недостатки: дороговизна, ограниченность применения, опасность инфицирования.
Похожая информация.
ЦЕЛЬ:
1. Изучить методы выделения чистых культур бактерий
2. Овладеть бактериологическим методом диагностики инфекционных заболеваний.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ СПРАВКА
Бактериологический метод является основным методом диагностики инфекционных заболеваний. Его сущность – определение вида возбудителя инфекции, следовательно, на основании результатов бактериологического метода можно поставить этиологический (окончательный) диагноз. Основным недостатком метода является длительность исследования – от 3 до 5 суток, а в отдельных случаях и более.
Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление направления в бактериологическую лабораторию. При этом необходимо соблюдение ряда правил.
1. Забор исследуемого материала необходимо провести до начала антибактериальной терапии или через 8-10 часов после введения последней дозы антибиотика. Чтобы избежать загрязнения пробы микрофлорой окружающей среды необходимо соблюдать строжайшую асептику. Для этого использовать стерильный материал: а) ватные тампоны для взятия материала из раны, со слизистых оболочек (глаз, зева, носа); б) проволочную петлю для взятки материала из влагалища, анального отверстия; в) шприц для взятия крови, гноя; г) стерильную посуду для непосредственного сбора в нее мочи, мокроты, испражнений.
2. Транспортировку полученного материала следует производить в максимально короткие сроки (2-3 часа) в специальных биксах или пеналах.
3. Направление прилагают к клиническому образцу в качестве сопроводительного документа. Оно содержит основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования:
Фамилия, имя, отчество, возраст пациента;
Предполагаемый диагноз заболевания;
Предшествующая антимикробная терапия;
Характер материала;
Дата и время взятия материала;
Цель исследования;
Название лечебного учреждения, номер отделения, палаты;
Подпись лечащего врача.
Бактериологический метод осуществляется в два этапа (рис.2.1.):
1. Выделение чистой культуры возбудителя (1-2 суток);
2. Идентификация чистой культуры (1-3 суток).
На первом этапе проводится посев исследуемого материала на твердую или в жидкую питательную среду, оценка культуральных свойств, отбор подозрительных колоний и их отсев на скошенный агар. Этап идентификации включает обязательное изучение морфологии, биохимических свойств и антигенной структуры выделенной чистой культуры, а также проведение дополнительных исследований по определению антибиотикочувствительности, фагочувствительности, фаготипирования, изучения патогенности и персистентных свойств.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
1. Правила забора и транспортировки исследуемого материала для бактериологического исследования.
2. Правила оформления направления на бактериологическое исследование.
3. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.
4. Бактериологический метод диагностики. Цель. Этапы. Диагностическая ценность.
ПЛАН САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ:
1. Изучить таблицы «Методы выделения чистых культур бактерий» и «Выделение и идентификация чистой культуры».
2. Выделить из смеси бактерий чистую культуру и осуществить ее идентификацию – овладеть бактериологическим методом диагностики (Работа 1)
4.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Бактериологическая диагностика брюшного тифа и паратифов
А, В и С
Дата введения: с момента утверждения
1. РАЗРАБОТАНЫ: ФГУН
Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора
(Л.А.Кафтырева, З.Н.Матвеева, Г.Ф.Трифонова); ГОУВПО
"Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им.
И.И.Мечникова" Федерального агентства по здравоохранению и
социальному развитию (А.Г.Бойцов).
3. УТВЕРЖДЕНЫ
Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека, Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 декабря 2007
г. 0100/13745-07-34
4. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с
момента утверждения.
5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
1. Область применения
1. Область применения
1.1. В методических
рекомендациях изложены основные принципы и особенности
бактериологической диагностики брюшного тифа и паратифов А, В и С;
содержатся современные сведения о биологических свойствах
возбудителей, резистентности к антибактериальным препаратам, о
питательных средах для их выделения и особенностях дифференциации
возбудителей брюшного тифа и паратифов от других серологических
вариантов сальмонелл.
2. Список сокращений
АБП - антибактериальный
препарат
ВСА - висмут-сульфит
агар
ЛПУ -
лечебно-профилактическое учреждение
МПК - минимальная
подавляющая концентрация
П
- промежуточный
У
- устойчивый
Ч
- чувствительный
РИФ - реакция
иммунофлюоресценции
ЦНС - центральная нервная
система
В
таблицах:
"+" - положительная
реакция в первые сутки;
"-" - отрицательная
реакция на 4-20 сутки;
"(+)" - замедленная
положительная реакция на 2-20 сутки;
d
- различные ферментативные реакции.
Возможна дифференциация
на ферментативные варианты.
3. Общие положения
3.1. Брюшной тиф и
паратифы А, В и С являются антропонозными кишечными инфекциями,
вызываемыми микроорганизмами Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi
A, Salmonella Paratyphi В и Salmonella Paratyphi С. В настоящее
время чаще регистрируется брюшной тиф, реже - паратиф В, редко -
паратиф А и крайне редко - паратиф С.
3.2. Заболевания
характеризуются язвенным поражением лимфатической системы тонкой
кишки, бактериемией, лихорадкой, циклическим клиническим течением с
выраженной интоксикацией, розеолезной сыпью на кожных покровах
туловища, гепато- и спленомегалией. Более характерен запор, нежели
диарея. Изъязвление пейеровых бляшек подвздошной кишки примерно в
1% случаев приводит к кишечному кровотечению и прободению кишечника
с самыми неблагоприятными последствиями для больного.
3.3. Диагноз брюшного
тифа и паратифов А, В и С ставится на основании клинических
признаков болезни с учетом эпидемиологического анамнеза и данных
комплексного лабораторного обследования, которое включает
классические бактериологический и серологический методы.
Бактериологическая диагностика имеет приоритетное значение, т.к. в
этом случае удается получить наиболее полную информацию о
биологических свойствах возбудителя, включая его чувствительность к
антибактериальным препаратам.
3.4. Применение
антимикробных препаратов для этиотропной терапии брюшного тифа и
паратифов позволило, с одной стороны, снизить летальность с 10-20%
до уровня менее 1%, а с другой стороны - осложнило лабораторную
диагностику, т.к. нередко забор материала для лабораторного
исследования осуществляется уже после начала антибиотикотерапии.
Этот факт заставляет более тщательно подходить к вопросу выбора
материала для исследования, взятия исследуемого материала, техники
исследования.
3.5. Современной
особенностью эпидемиологии брюшного тифа является резкое увеличение
частоты завоза (заноса) инфекции с эндемичных по этому заболеванию
территорий, стран ближнего и дальнего зарубежья, а также заражение
жителей России при выезде в эти страны и в процессе миграции внутри
страны. Другой особенностью является наличие обширного контингента
высокого эпидемиологического риска в виде лиц без определенного
места жительства, среди которых регистрируется высокая
заболеваемость брюшным тифом.
3.6. Данные методические
рекомендации составлены с целью унификации методов
бактериологической диагностики брюшного тифа и паратифов А, В и С,
а также правильной интерпретации результатов лабораторного
исследования с учетом современных особенностей клиники, лечения и
эпидемиологической обстановки на конкретных территориях.
4. Показания к проведению бактериологической диагностики
Показанием к проведению
бактериологического исследования биологического материала на
наличие возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В и С является
необходимость обследования:
4.1) больных с
подозрением на тифопаратифозное заболевание, а также с лихорадкой
неясной этиологии, продолжающейся 5 и более дней;
4.2) лиц, общавшихся с
больными брюшным тифом и паратифами А, В, С;
4.3) работников отдельных
профессий, производств и организаций при поступлении на работу и по
эпидемиологическим показаниям;
4.4) лиц перед
поступлением в стационары и специализированные санатории по
клиническим и эпидемиологическим показаниям;
4.5) лиц при оформлении
на стационарное лечение в больницы (отделения)
психоневрологического (психосоматического) профиля, дома
престарелых, интернаты для лиц с хроническими психическими
заболеваниями и поражениями ЦНС, в другие типы закрытых учреждений
с круглосуточным пребыванием;
4.6) больных брюшным
тифом и паратифами после исчезновения клинических симптомов
перенесенного заболевания перед выпиской из стационара;
4.7) лиц, переболевших
брюшным тифом и паратифами, во время диспансерного наблюдения;
4.8) хронических
бактерионосителей, выявленных среди работников отдельных профессий,
производств и организаций, при повторном поступлении на работу на
указанные предприятия и объекты;
4.9) секционного
материала при подозрении на заболевание брюшным тифом и
паратифами.
5. Материально-техническое обеспечение метода
5.1. Стандартное
испытательное и вспомогательное оборудование, средства измерения
для микробиологических лабораторий.
5.2. Питательные среды,
диагностические сыворотки и химические реагенты для
культивирования, выделения, идентификации и определения
чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителей
брюшного тифа и паратифов А, В и С.
5.3. Для лабораторной
диагностики тифо-паратифозных заболеваний и выявления
бактерионосителей должны использоваться питательные среды и
реагенты, разрешенные к применению на территории Российской
Федерации в установленном порядке.
6. Лабораторная диагностика брюшного тифа и паратифов
6.1. Принцип
бактериологического метода основан на обнаружении живых
микроорганизмов в различных биологических субстратах (кровь, моча,
кал, желчь, костный мозг, розеолы) в зависимости от стадии
заболевания. Для этого производят посев определенного количества
биологического материала на специальные питательные среды с
последующей инкубацией в термостате и идентификацией выросших
колоний микроорганизмов, характерных для S. Typhi, S. Paratyphi A,
S. Paratyphi В и S. Paratyphi С, по культурально-ферментативным
свойствам и антигенной характеристике.
6.2. Только
бактериологическое исследование может обеспечить точную постановку
этиологического диагноза и контроль освобождения организма от
возбудителя. В отношении дифференциальной диагностики брюшного тифа
и паратифов единственным методом является лабораторное исследование
биологического материала с выделением возбудителя и идентификация
его до уровня серологического варианта, т.к. клиническое течение
инфекционного процесса не всегда позволяет различить эти
нозологические формы.
7. Бактериологическое исследование
7.1. Выделение
возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В и С проводят по одной и
той же схеме бактериологического исследования биоматериалов.
7.2. Порядок сбора
материала для лабораторных исследований на тифо-паратифозные
заболевания определен СП
3.1.1.2137-06 .
7.3. Техника сбора и
транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории
описана в МУ 4.2.2039-05 .
7.4. Материалом для
бактериологического исследования с целью диагностики брюшного тифа
и паратифов являются:
кровь;
испражнения;
моча;
Возбудители могут быть
также выделены из:
розеол;
костного мозга;
грудного молока.
Материалом для
бактериологического исследования с целью выявления
бактерионосителей, согласно СП
3.1.1.2137-06 , являются:
испражнения;
моча;
желчь (дуоденальное содержимое).
7.5. Исследование
секционного материала проводится с целью уточнения диагноза.
7.6. Сбор биологического
материала для лабораторных исследований осуществляется до начала
этиотропного лечения: медицинским работником, заподозрившим
тифо-паратифозную инфекцию; при групповой и вспышечной
заболеваемости - специалистами учреждений Роспотребнадзора и
персоналом лечебно-профилактических учреждений. От
госпитализируемых больных материал для бактериологического
исследования забирается в приемном отделении стационара.
7.7. От лиц, общавшихся с
больными или носителями (контактными), сбор материала проводится
медицинскими работниками ЛПУ и других организаций и учреждений по
месту выявления больных.
7.8. Биоматериал для
лабораторного исследования сопровождают специальным направлением.
Доставка материала самими обследуемыми не допускается. При
невозможности своевременной доставки материала используют
консерванты и транспортные среды (табл.1).
8. Бактериологическое исследование крови
Показанием к исследованию
крови является подозрение на тифо-паратифозные заболевания или
лихорадочное состояние невыясненного происхождения (лихорадка
неясного генеза), наблюдающееся в течение 5 и более дней (СП
3.1.1.2137-06).
Соотношение кровь -
питательная среда должно быть 1:10-1:60. Количество независимо
отбираемых проб крови и время их взятия определяется лечащим врачом
согласно МУ 4.2.2039-05 при
лихорадке неясного генеза или согласно МУ 04-723/3 МЗ СССР (1984)
при подозрении на тифо-паратифозные заболевания. У больных,
получающих антибактериальные препараты, пробы необходимо собирать
непосредственно перед введением (приемом) следующей дозы
препарата.
При наличии лихорадки
оптимальным является взятие крови на фоне повышения температуры
тела (но не на пике температуры!). Посев на питательные среды
проводят непосредственно у постели больного.
При подозрении на
тифо-паратифозные заболевания для посева крови можно использовать
среду Рапопорт, 20%-й желчный бульон, мясопептонный бульон с
добавлением 1%-й глюкозы (во флаконах по 100 мл). Ранее
использовали посев крови в стерильную дистиллированную
(водопроводную) воду. Однако предпочтительнее использовать
специальные среды для посева крови.
Количество засеваемой
крови в разгар лихорадки может составлять 10 мл, в более поздние
сроки - до 20 мл (у детей - до 5 мл).
При лихорадке неясного
генеза продолжительностью более 5 дней, как правило, должны
исследоваться несколько проб крови. Взятие крови из вены проводят
согласно МУ 4.2.2039-05 . Это
необходимо для дифференциации истинной бактериемии от случайной
контаминации крови при венопункции (вероятность загрязнения пробы
вследствие случайного прокола сальной или потовой железы составляет
3%). Для посева крови в этом случае используют две среды: 1) среду
для аэробов и факультативных анаэробов и 2) среду для облигатных
анаэробов (например, "двойная" среда + тиогликолевая среда согласно
приказу МЗ СССР от 12.04.85 N 535) или универсальную среду для
аэробов и анаэробов.
Предпочтительно
использовать промышленно произведенные среды, разрешенные к
применению в России.
Посевы инкубируют при 37
°С в течение 10 суток с ежедневным просмотром. При этом флаконы с
"двойной" средой наклоняют, омывая плотную часть среды.
При отсутствии признаков
роста на 10-й день выдается отрицательный ответ.
При наличии признаков
роста (помутнение, покраснение среды Рапопорт, появление видимых
колоний на плотной части "двойной" среды) проводят высев
параллельно на полиуглеводную среду и плотную среду в чашках Петри
(кровяной агар в случае лихорадки неясного генеза и среда Эндо при
подозрении на тифо-паратифозные заболевания).
Прямой высев на
полиуглеводные среды проводят для сокращения сроков исследования,
исходя из предположения, что при посеве крови с высокой
вероятностью будет наблюдаться рост монокультуры возбудителя. Для
контроля этого предположения и выделения чистой культуры путем
откола отдельных колоний необходим параллельный высев на среду Эндо
или кровяной агар.
Если на этих средах
наблюдается рост монокультуры, то можно учитывать биохимические
свойства по полиуглеводной среде. Для контроля чистоты культуры
необходимо провести микроскопию мазка с полиуглеводной среды,
окрашенного по Граму. На этом этапе возможна также постановка
реакции агглютинации на стекле с соответствующими агглютинирующими
О- и Н-сальмонеллезными сыворотками и выдача предварительного
ответа.
Схема бактериологического
исследования крови пациентов с подозрением на брюшной тиф и
паратифы представлена на рис.1.
Рис.1. Схема бактериологического исследования крови пациентов с подозрением на брюшной тиф и паратифы
Рис.1. Схема бактериологического исследования крови пациентов с подозрением на брюшной тиф и паратифы
Схема бактериологического
исследования крови пациентов при лихорадке неясного генеза
представлена на рис.2.
Рис.2. Схема бактериологического исследования крови пациентов с лихорадкой неясного генеза
Рис.2. Схема бактериологического исследования крови пациентов с лихорадкой неясного генеза
Ход дальнейшей
идентификации культуры по культурально-морфологическим,
ферментативным свойствам и серологической характеристике изложен
далее в соответствующих разделах.
9. Бактериологическое исследование испражнений
Пробы испражнений
отбирают сразу после дефекации из дезинфицированного и тщательно
вымытого судна, на дно которого был помещен лист плотной чистой
бумаги. Материал собирается с помощью ложки-шпателя,
вмонтированного в крышку стерильного контейнера. В отсутствие
контейнера со шпателем для отбора материала используют любой
стерильный инструмент (стерильный деревянный шпатель, проволочная
петля, ложечка и т.п.). При наличии патологических примесей
необходимо выбрать участки, содержащие слизь, гной, хлопья, но
свободные от крови. Образцы жидких испражнений отбирают с помощью
стерильной пластиковой пастеровской пипетки с замкнутым
резервуаром.
Объем забираемого
материала должен быть не менее 2 г. Оптимальным является взятие
материала в случае оформленного стула - в объеме грецкого ореха; в
случае жидкого стула его слой в контейнере должен быть не менее
1,5-2,0 см. Материал, помещенный в стерильный контейнер,
доставляется в лабораторию в течение 2 ч.
Если материал невозможно
доставить в лабораторию в течение 2 ч, его собирают в консервант
(транспортную систему со средой). Объем материала не должен
превышать объема среды.
Испражнения должны быть
тщательно гомогенизированы в среде. Образцы могут храниться до
начала исследования в течение суток в условиях холодильника (4-6
°С).
Транспортные среды и
консерванты, используемые для выделения возбудителей брюшного тифа
и паратифов А, В и С, а также других возбудителей острых кишечных
инфекций, представлены в табл.1.
Таблица 1
Транспортные среды и консерванты, наиболее часто используемые для транспортирования испражнений
|
Название
среды |
Обеспечивает сохранение |
|
среда
Кэрри-Блер |
всех кишечных патогенов, включая кампилобактерии |
|
среда
Эймс |
всех энтеробактерий |
|
среда
Стюарт |
сальмонелл и шигелл |
|
глицериновая
смесь |
всех
энтеробактерий, кроме иерсиний; предпочтительна для шигелл |
|
фосфатная
буферная смесь |
всех энтеробактерий |
|
боратно-буферный раствор |
всех энтеробактерий |
|
физиологический раствор |
всех энтеробактерий, включая кампилобактерии |
Пробы испражнений,
собранные непосредственно из прямой кишки с помощью ректального
тампона, используют преимущественно для объективизации диагноза
(МУ 4.2.2039-05). Взятие
материала осуществляется средним медицинским персоналом. Как
правило, специальный зонд для взятия мазка входит в состав
транспортной системы. Важно отметить, что попадание транспортных
сред на слизистую прямой кишки недопустимо! Поэтому ректальный
тампон должен погружаться в транспортную среду только после взятия
материала. Больного просят лечь на бок с притянутыми к животу
бедрами и ладонями развести ягодицы. Зонд-тампон вводят в задний
проход на глубину 4-5 см и, аккуратно вращая его вокруг оси,
собирают материал с крипт ануса. Осторожно извлекают зонд-тампон и
погружают его в транспортную среду. Транспортирование тампона без
среды не допускается.
В
лаборатории посев проб испражнений проводят непосредственно на
плотные дифференциально-диагностические питательные среды и
параллельно на среду обогащения.
Схема бактериологического
исследования испражнений представлена на рис.3.
Рис.3. Схема бактериологического исследования испражнений
Рис.3. Схема бактериологического исследования испражнений
Из нативных испражнений
готовят суспензию в 0,9%-м растворе хлорида натрия в соотношении
1:5-1:10, оставляют на 30 мин для оседания крупных частиц. После
этого одну каплю надосадочной жидкости засевают на чашки с плотными
питательными средами и 1 мл суспензии - в среду обогащения
(соотношение материал-среда должно быть 1:5).
Испражнения, доставленные
в лабораторию в консерванте (транспортной среде), перед посевом
должны быть тщательно гомогенизированы в среде, после чего проводят
прямой посев материала на плотные среды и среду обогащения в тех же
соотношениях, что и нативные испражнения.
Пробы испражнений,
собранные с помощью ректального тампона, исследуются аналогично
испражнениям, доставленным в консерванте. Следует помнить, что
ректальный тампон содержит меньшее количество микроорганизмов по
сравнению с нативными испражнениями, поэтому посевная доза должна
быть увеличена.
Максимальное выявление S.
Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi В и S. Paratyphi С в
испражнениях достигается при использовании сред обогащения, хотя у
больных в остром периоде заболевания возбудитель достаточно часто
выделяют и при прямом посеве. Посев на среды обогащения параллельно
с прямым высевом обязателен!
Все посевы инкубируют при
37 °С на дифференциально-диагностических средах 18-24 ч, на
висмут-сульфит агаре - 24-48 ч. Через 24 ч проводят высев со сред
обогащения на плотные среды (висмут-сульфит агар или среду Эндо).
Колонии, характерные для данных возбудителей, выросшие на плотных
средах, отсевают на полиуглеводную среду.
Необходимо отметить, что
техника распределения материала по поверхности чашки с плотными
средами должна обеспечить рост изолированных колоний типичного
вида, по которому можно визуально оценить культуральные свойства
микроорганизма.
Для выделения S. Typhi
предпочтительнее использовать висмут-сульфит агар (ВСА). Типичные
колонии S. Typhi имеют черный цвет и окружены черным или коричневым
ободком с металлическим блеском. Однако при обильном росте S. Typhi
часто не дает характерного почернения ВСА, поэтому чашки должны
быть засеяны так, чтобы обеспечить рост отдельных колоний.
Пробы фекалий можно
засевать на стандартные селективные среды для энтеробактерий,
разрешенные к применению на территории Российской Федерации. Тем не
менее, для выделения S. Турhi предпочтительнее всего использовать
висмут-сульфит агар. Ход дальнейшей идентификации культур по
ферментативным свойствам и серологической характеристике изложен
далее в соответствующих разделах.
10. Бактериологическое исследование мочи
Посев мочи производят для
диагностики с первых дней заболевания и вплоть до выписки больного,
а также с целью выявления бактерионосительства. Так как при тифе и
паратифах выделение возбудителя с мочой происходит периодически и
кратковременно, исследования мочи необходимо проводить повторно с
промежутками 5-7 дней.
Следует строго
придерживаться общих правил сбора мочи, изложенных в МУ 4.2.2039-05 . Вне зависимости от
способа получения мочи, она должна быть доставлена в лабораторию в
течение 2 ч. В крайнем случае допускается хранение мочи в течение
ночи в холодильнике.
Следует помнить, что в
зависимости от химического состава мочи бактерии в ней могут при
хранении как отмирать, так и размножаться.
Увеличение срока
сохранения материала может крайне затруднить интерпретацию
результата.
Производят прямой посев
мочи (или осадка после центрифугирования) без предварительного
обогащения согласно приказу МЗ СССР N 535 на плотные
дифференциально-диагностические среды, рекомендуемые для
сальмонелл, в том числе возбудителей брюшного тифа и паратифов.
Параллельно нативная моча засевается в среды обогащения двойной
концентрации в соотношении 1:1 или осадок мочи - в среды обычной
концентрации. Посевы помещают в термостат при 37 °С на 18-24 ч, а
затем со среды обогащения производят высев на плотные
дифференциально-диагностические среды. Колонии, выросшие на плотных
средах, идентифицируют по культурально-ферментативным и
серологическим свойствам.
11. Бактериологическое исследование желчи (дуоденального содержимого)
Желчь собирают в три
стерильные пробирки или стерильные одноразовые контейнеры раздельно
по порциям А, В, С согласно МУ
4.2.2039-05 и доставляют в лабораторию.
Проводят исследование
каждой порции (А, В, С) отдельно или готовят смесь из трех порций.
Пробы засевают:
на плотные дифференциально-диагностические
среды (ВСА, Эндо, ЭМС или др.) в количестве 0,5 мл;
в пробирку (флакон) с питательным бульоном
в соотношении 1:10. Нет необходимости засевать желчь на среды
обогащения, т.к. желчь сама является хорошей питательной средой для
возбудителей брюшного тифа и паратифов.
Засеянные среды вместе с
остатками желчи инкубируют при 37 °С.
Через 18-24 ч
просматривают посевы на плотных питательных средах (результаты
роста на ВСА учитывают через 24 и 48 ч) и делают пересев
подозрительных колоний на полиуглеводную среду.
Из питательного бульона
производят высевы на плотные дифференциально-диагностические
среды.
Из оставшейся желчи в
случае отрицательного результата прямого посева делают повторные
высевы на плотные дифференциально-диагностические среды через 18-24
ч и на 3, 5, 7 и 10 сутки.
Проводят идентификацию
выросших микроорганизмов по культурально-морфологическим,
ферментативным и серологическим свойствам.
12. Бактериологическое исследование материала из розеол
Бактериологическое
исследование ("соскоб" с розеол) проводят при наличии хорошо
выраженных розеол. Материал собирают асептически. Для этого участок
кожи над розеолами обрабатывают 70%-м этиловым спиртом, затем
протирают ватным тампоном, смоченным стерильным 0,9%-м раствором
хлористого натрия и осушают стерильным тампоном.
Материал для исследования
(тканевую жидкость) получают путем скарификации кожи над розеолой с
помощью скальпеля. На поврежденную кожу наносят 1-2 капли желчного
бульона или изотонического раствора хлорида натрия, смешивают с
выступившей тканевой жидкостью и собирают пастеровской пипеткой или
аналогичным одноразовым стерильным устройством в пробирку с одной
из жидких сред обогащения (желчный бульон, среда Рапопорт и др.). В
лаборатории посев выдерживают при 37 °С 18-24 ч с последующим
высевом на плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо,
ЭМС, ВСА).
13. Бактериологическое исследование костного мозга
Хорошо известно, что при
лабораторном подтверждении диагноза "брюшной тиф" наиболее
результативным является бактериологическое исследование костного
мозга (высеваемость возбудителя составляет 90-95%). Даже у
пациентов с легкими и стертыми формами брюшного тифа, трудными для
клинического распознавания, а также на фоне приема антимикробных
препаратов, высеваемость миелокультур значительно выше, чем
гемокультур.
Однако на практике
бактериологическое исследование костного мозга проводится очень
редко, только по особым клиническим показаниям, при отсутствии
других лабораторных данных, подтверждающих диагноз брюшной тиф или
паратиф, т.к. эта инвазивная процедура достаточно травматична.
Забор материала для исследования проводят только в условиях
стационара при наличии соответствующего специалиста.
Материал для
бактериологического исследования (аспират) в количестве 0,50-0,75
мл получают асептически, путем проведения пункции грудины (рукоятки
или тела) и засевают в пробирку с одной из сред обогащения (желчный
бульон, среда Рапопорт и др.).
Если аспират невозможно
засеять в среду обогащения сразу после пункции, его собирают в
стерильную пробирку и немедленно направляют в лабораторию, где
производится посев в среду обогащения. В лаборатории посевы
инкубируют при 37 °С 18-24 ч с последующим высевом на плотные
дифференциально-диагностические среды.
Дальнейшее исследование
проводят, как при бактериологическом исследовании другого
биологического материала.
14. Питательные среды и реактивы
Перечень питательных сред
для выделения и идентификации возбудителей кишечных инфекций, в
частности энтеробактерий, обширен и неуклонно расширяется. Выбор
конкретных сред во многом обусловлен местными экономическими
условиями и традициями. Тем не менее, при этом следует
руководствоваться несколькими основными принципами.
14.1. В описании
питательной среды должно быть указано, что она может быть
использована не просто для выявления сальмонелл, а именно
Salmonella Typhi и S. Paratyphi А, В и С.
14.2. Следует отдавать
предпочтение сухим питательным средам известных производителей по
сравнению со средами, непосредственно изготовляемыми в
лаборатории.
14.3. Каждая партия
питательной среды в лаборатории должна контролироваться с помощью
тест-штаммов (внутренний контроль качества).
14.4. Для лабораторной
диагностики тифо-паратифозных заболеваний и выявления
бактерионосителей должны использоваться питательные среды и
реагенты, разрешенные к применению на территории Российской
Федерации в установленном порядке.
15. Методы изучения ферментативных свойств
В
настоящее время для изучения ферментативной активности
микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, включая возбудителей
брюшного тифа и паратифов, разработаны, выпускаются и
зарегистрированы различные диагностические тест-системы
отечественного и зарубежного производства (от наиболее простых
классических сред Гисса в пробирках и планшетах до автоматических
анализаторов). Если тест-системы позволяют идентифицировать
микроорганизм до уровня рода и выявлять особенности ферментативной
активности штаммов, то они могут быть использованы для
идентификации возбудителей брюшного тифа и паратифов. Методика
работы с тест-системами подробно изложена в инструкциях по
применению и их следует строго соблюдать.
16. Биологические свойства возбудителей
Возбудители брюшного тифа
и паратифов А, В и С относятся к семейству Enterobacteriaceae, роду
Salmonella, виду enterica, подвиду I (enterica) и обладают
морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами,
характерными для данного подвида, вида, рода и семейства.
У
представителей рода сальмонелл вида enterica исторически сложилась
ситуация, когда для обозначения сероваров использовали не
антигенную формулу, как у других бактерий, а названия болезней
(человека или животных), страны, города или улицы, где они были
выделены, и др. Ошибочно считать эти названия видовыми, т.к. они не
имеют таксономического статуса. Тем не менее, названия наиболее
часто встречающихся сероваров сальмонелл настолько привычны, что
заменить их антигенными формулами практически нереально. Поэтому в
современной схеме Кауфмана-Уайта при обозначении сальмонелл только
вида enterica подвида I вместо видового обозначения используют
название серовара, но пишут его с заглавной буквы.
Таким образом, полные
названия возбудителей брюшного тифа и паратифов следующие:
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Typhi;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Paratyphi A;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Paratyphi B;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Paratyphi С
В
обычной практике возможно использование сокращенных вариантов
названий:
Salmonella ser. Typhi или Salmonella Typhi
или S. Typhi;
Salmonella ser. Paratyphi А или Salmonella
Paratyphi А или S. Paratyphi A;
Salmonella ser. Paratyphi В или Salmonella
Paratyphi В или S. Paratyphi B;
Salmonella ser. Paratyphi С или Salmonella
Paratyphi С или S. Paratyphi С
16.1. Культурально-морфологические свойства
Подвижные
грамотрицательные палочки не образуют спор и капсул, факультативные
анаэробы хорошо растут на обычных питательных средах.
На простом питательном
агаре - слегка выпуклые с ровным краем и гладкой поверхностью,
влажные с блеском колонии более 1 мм.
На
дифференциально-диагностических средах (содержащих лактозу как
дифференцирующее вещество) - прозрачные, бесцветные или
голубоватые, а иногда розоватые или цвета среды колонии (среды
Эндо, Плоскирева, ЭМС и другие аналогичные среды).
На SS-arape - колонии
цвета среды с черным центром.
На висмут-сульфитной
среде - изолированные колонии S. Typhi, S. Paratyphi В - черные с
характерным металлическим блеском, среда под колонией прокрашена в
черный цвет. Колонии S. Paratyphi A - зеленоватые, светлые в цвет
среды, нежные.
Штаммы S. Paratyphi В
(возбудитель паратифа В) на мясопептонном агаре могут образовывать
по периферии колоний приподнятый слизистый вал. Слизистый вал
развивается на 2-5 сутки при хранении посевов при комнатной
температуре. Этот признак не является постоянным и
диагностическим.
16.2. Ферментативные свойства
Изучение ферментативных
свойств проводится в отношении набора углеводов, многоатомных
спиртов, аминокислот и других органических соединений, применяемых
при идентификации и изучении сальмонелл и других энтеробактерий.
Как правило, в практических лабораториях используют небольшое
количество тестов, позволяющих идентифицировать основные роды,
входящие в семейство кишечных бактерий. Характеристика
ферментативных свойств сальмонелл, включая возбудителей брюшного
тифа и паратифов А, В и С, представлена в табл.2.
Таблица 2
Ферментативные свойства возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В, С
|
Субстрат |
S. Paratyphi
A |
||||
|
Глюкоза
(газ) |
Бактериологический метод исследования патматериала на предмет выделения и идентификации микобактерий включает 3 способа: бактериоскопический, культуральный и биологический / Р.В.Ткзова, 1983; И.И.Румачик, 1987,1993; А.С. Донченко, 1989; Ю.Я. Кассича, 1990; А.Х.Найманов, 1993; Л.П.Ходун, 1997/. Срок бактериологического исследования не должен превышать 3-х месяцев.
Учитывая, что макроскопические туберкулезные изменения в органах и тканях крупного рогатого скота вызывает возбудитель туберкулеза бычьего вида, исследовать такой материал бактериологически не имеет смысла. Если такой материал доставлен в лабораторию для исследования, то производят комиссионный осмотр и составляют акт. Материал обезвреживают.
Бактериоскопическое (микроскопическое) исследование материала заключается в приготовлении из каждого органа (или кусочков органа с подозрительными на туберкулез изменениями) и лимфатического узла, доставленных для исследования, по 2 мазка-отпечатка, высушивании их на воздухе, фиксации над пламенем спиртовки, окрашивании по Циль-Нильсену и просмотре окрашенных мазков под микроскопом, причем не менее 50 полей зрения в каждом мазке. Необходимо приготовить, как минимум, 20 мазков-отпечатков из материала от одной туши. Кроме того, мазки для микроскопии готовят также и из высеваемой на питательные среды взвеси материала.
Окраска мазков по Цилю-Нильсену является избирательной на выявление микобактерий: на синем фоне окрашенных тканей или посторонней микрофлоры микобактерии просматриваются как красные, розовые или рубиново-красные палочки. Лучше всего просмотр мазков вести под микроскопом-бинокуляром при увеличении 1,5 (насадка) х 7 (окуляр) х 90 или 100 (объектив).
Способ используют как сигнальный, поскольку наличие или отсутствие микобактерий в мазках абсолютно не влияет на ход дальнейших исследований и даже положительное заключение бактериоскопии не имеет юридической значимости (кроме птиц). Материал необходимо исследовать далее.
Лабораторный диагноз на туберкулез у птиц считают установленным, если из исследуемого материала выделена культура микобактерий птичьего вида (от попугаев - человечьего или птичьего видов), получен положительный результат биопробы, а также при обнаружении микобактерий в мазках из патологического материала при микроскопическом исследовании (п. 7.3.2. наставления).
Необходимо обратить внимание также и на то, что на приготовление мазков-отпечатков, их фиксацию и просмотр уходит очень много времени, а обнаружить в них микобактерии удается очень редко, даже в мазках из высеваемой взвеси материала. Поэтому в целях экономии рабочего времени и средств при исследовании материала от животных, не имевших изменений при убое, целесообразно ограничиться приготовлением и просмотром мазков только из высеваемой на питательные среды взвеси материала. Это не приведет к ущербу в диагностике туберкулеза, ведь исследование материала продолжается далее.
Кроме обычной световой микроскопии можно использовать люминесцентную микроскопию. Мазки готовят аналогичным образом, фиксируют и окрашивают смесью флуорохромов. Окрашенные мазки просматривают под люминесцентным микроскопом. Способ более чувствителен, однако менее специфичен, и поэтому мало приемлем, особенно в условиях практических лабораторий.
Культуральное выделение микобактерий на питательных средах является одним из важных звеньев в лабораторной диагностике туберкулеза на современном этапе. Однако питательные среды, на которые был высеян материал (на 5-10 пробирок в соответствии с наставлением), в первые 2-3 недели имеют частичный или полный пророст, как правило, из-за нарушения стерильности при посеве материала. Посевы выбраковываются как раз в тот период, когда вероятнее всего проявление первоначального роста атипичных микобактерий (не говоря уже о проявлении первоначального роста возбудителя туберкулеза, который проявляет рост еще позже). В таких случаях культуральный способ выделения микобактерий на питательных средах механически выпадает. Это одна из основных причин получения отрицательных результатов при бактериалогическом исследовании материала. В результате, не получив роста колоний микобактерий на питательных средах после посева материала, а лабораторные животные остались живы в течение 3-х месяцев, следует стандартный ответ лабораторий: «Возбудитель туберкулеза не выделен» или «Экспертиза материала на туберкулез отрицательная». На основании результатов проведенных исследований причина реагирования крупного рогатого скота на туберкулин не установлена, и это ведет к дальнейшему необоснованному убою значительного количества реагировавших на туберкулин животных в хозяйствах, благополучных по туберкулезу крупного рогатого скота, что наносит большой экономический ущерб, нарушает оборот и воспроизводство стада.
Учитывая вышеизложенное, необходимо первоочередное внимание уделять культуральному способу выделения микобактерий из материала на питательных средах, как самому слабому звену в бактериалогической диагностике туберкулеза в районных ветеринарных лабораториях.
Положительные результаты культурального метода выделения микобактерий зависят, в основном, от двух обстоятельств: увеличение достоверности высева микобактерий из материала и соблюдение условий стерильности при работе в боксе.
Увеличение достоверности высева микобактерий из взятого для исследования материала зависит, в первую очередь, от качественного его отбора, предпосевной обработки и увеличения количества пробирок среды, на которого производят посев.
Основные условия, соблюдение которых при посеве материала на питательные среды гарантирует получение рост колоний микобактерий:
а) отбирать материал для бактериологического исследования от убитых животных, не имевших изменений при убое, отдельно от каждой туши и высевать на 10-20 пробирок среды каждую пробу (материал от каждого животного) по следующей схеме:
Лимфатические узлы головы (подчелюстные, заглоточные);
Бронхиальные и средостенные лимфатические узлы;
Мезентериальные (брыжеечные) лимфоузлы;
Прочие лимфоузлы (при наличии подозрительных участков);
Органы (тоже при необходимости).
В результате получается посев материала от одного животного на 30-50 пробирок среды. Этим достигается увеличение достоверности высева микобактерий в 3-5 раз, так как без разделения проб (по наставлению) высев материала рекомендуется проводить всего на 5-10 пробирок среды от двух голов одной фермы.
б) Непосредственно при бактериологическом посеве материала вырезать кусочки с нарушенной морфологической структурой лимфатического узла или органа (гиперплазия, уплотнение, точечные и полосчатые кровоизлияния и т.д.). Причем необходимо вырезать все измененные участки. Если материала по объему получается много в одну ступку, то его можно разделить в две.
в) Строго соблюдать взятую для работы методику, не нарушая режим обработки и высева материала.
г) При гомогенизации материала, особенно лимфатических узлов, необходимо использовать стерильный песок или мелкобитое стерильное стекло. Максимально растирать материал (до сметанообразной консистенции) для лучшего извлечения микобактерий из исследуемого материала
д) Добавлять физраствор к гомогенизированному материалу в ступку в количестве, необходимом для высева взвеси материала на питательные среды и для биопробы (в среднем до 0,5 см3 в одну пробирку и 1 -2 см3 для подкожного заражения одной морской свинки). Это количество физраствора можно рассчитать заранее.
е) Просмотр посевов материала проводить через 3, 5, 7, 10, 15 дней и в дальнейшем один раз в неделю.
ж) Любая выросшая на среде колония микроорганизмов (типичная или атипичная, пигментная или беспигментная, слизистая или суховатая и т.д.) должна пройти микроскопию при избирательной окраске по Циль-Нильсену.
Следует обратить внимание на степень отмывки материала от кислоты (или щелочи), применяемой для обработки материала от контаминации посторонней микрофлорой. Остаточное количество кислоты всегда будет присутствовать во взвеси из высеваемого материла, однако оно должно быть минимальным. Показателем этого служит восстановление первоначального цвета среды на 2-4-ый день после посева материала. Если цвет среды не восстановился, это свидетельствует о повышенном количестве остаточной кислоты. Цвет среды приобретает синеватый оттенок различной интенсивности. Рост (предполагаемых) микобактерий в данном случае замедляется, либо его не будет вообще, особенно возбудителя туберкулеза как более требовательного к режиму культивирования. Остаточное количество кислоты действует на микобактерии в некоторой степени бактериостатически.
Для герметизации пробирок после посева материала можно применять ватные и ватно-марлевые пробки с последующей заливкой их парафином, резиновые без- и резиновые с вырезанным косым желобком, корковые и металлические пробки (затворы).
При определении видовой принадлежности выделенной культуры микобактерий известно много (около 300) различных тестов: культурально-морфологические, биологические, биохимические, серологические, определение лекарственной устойчивости и т.д. Однако в ветеринарной практике применяется их минимум (см. наставление). Для лабораторий достаточно определение выделенной культуры микобактерий следующих видов: бычий, человечий и птичий, что определяется биопробой, а атипичные микобактерии - разделить на группы по Runyon (1959): I - фотохромогенные (образующие пигмент под воздействием света), II - скотохромогенные (образующие пигмент независимо от воздействия света - и в темноте, и на свету), III - нехромогенные (не образующие пигмента) или еще их называют беспигментные (сюда же отнесен и возбудитель туберкулеза птичьего вида), IV - быстрорастущие микобактерии и кислоустойчивые сапрофиты.
Для этого достаточно эффективно и экономически оправдано изучение свойств выделенной культуры по сокращенной схеме, в которой основное внимание уделяется срокам появления первичного роста колоний, пигментообразованию, культурально-морфологическим и тинкториальным свойствам при окраске по Цилю-Нильсену. Особенно значим тест на корд-образование в первичной или даже в субкультуре в сочетании с результатами биопробы. Для приготовления мазков из выросших колоний целесообразно одновременно делать их как из колоний, так и из остатков взвеси и конденсата, т.е. с жидкой части на дне пробирки.
Кроме того, сотрудники лабораторий имеют возможность не только проводить контрольный убой реагировавших на туберкулин животных и отбирать пробы материала для исследования, но и отбирать для бактериологического исследования при жизни животных (бронхиальная или носовая слизь, молоко, фекалий, моча, экссудат, кровь и т.д.), а также пробы кормов, воды, объектов внешней среды на предмет выделения микобактерий и, таким образом, косвенно доказывать причину реагирования скота на туберкулин. При посеве дополнительного материала и проб из объектов внешней среды используют общеизвестные методы концентрирования микобактерий: седиментационный, флотационный, флотационно-седиментационный и другие.
Сокращенная схема дифференциации микобактерий с использованием биопробы
