Fluorescencinės in situ hibridizacijos metodo etapai. FISH testas: greita vėžio diagnozė


Fluorescencinės in situ hibridizacijos metodas (FISF – fluorescencinė in situ hibridizacija) apima unikalių nukleotidų DNR sekų naudojimą kaip zondą, ieškant norimų DNR sekų iš paciento gautoje medžiagoje. Lokusui arba genui būdingas DNR zondas yra paženklintas specifiniu žymeniu (pvz., fluorochromu), kad jį būtų galima aptikti fluorescencine mikroskopija. Ištirta DNR yra chromosomų preparatas mikroskopiniam tyrimui, turintis sruogų metafazės branduolyje tarpfazėje (nesidalančioje būsenoje). DNR zondas ir tiriamoji DNR yra denatūruojami, todėl susidaro viengrandė DNR. DNR zondas dedamas į chromosomų preparatą ir inkubuojamas tiek laiko, kiek pakanka DNR zondo ir paciento komplementariųjų DNR sekų hibridizacijai, jeigu pacientas turi DNR zondui komplementarią DNR sritį. Hibridizacija vyksta tik papildomose DNR srityse ir neturi įtakos fragmentams su kitomis DNR sekomis iš kitų genomo dalių. Fluorochromu pažymėto zondo buvimas ar nebuvimas DNR po hibridizacijos nustatomas tiriant chromosomas naudojant fluorescencinę mikroskopiją. Rezultatas, kaip taisyklė, nekelia abejonių (28.1 pav.).

FISH pranašumai apima greitą didelio ląstelių skaičiaus analizę, didelį jautrumą ir specifiškumą bei galimybę ištirti nekultūrinamas ir nesidalijančias ląsteles. Naudojant šį metodą, galima ištirti ląsteles, esančias parafino sekcijose. Metodo trūkumai yra tai, kad neįmanoma gauti informacijos apie tiriamos DNR ar chromosomos srities fizinę būklę. FISH reikia žinoti apie lokusą, susijusį su chromosomų aberacija, taip pat pasirinkti tinkamą DNR zondą, galintį aptikti šią aberaciją. ŽUVYS nenaudojamos kaip atrankos metodas. Metodas naudojamas norint gauti atsakymą į konkretų klausimą (nustatyti įtariamos specifinės mutacijos nebuvimą ar buvimą). Paprastai jis papildo klasikinius chromosomų dažymo metodus, taip pat yra pagrindinis būdas identifikuoti chromosomas metafazėje arba tarpfazėje ir specifines DNR nukleotidų sekas, kurios yra konkrečios ligos (fenotipo) pagrindas.

FISH naudojamas prenatalinei diagnostikai ir naviko apibūdinimui; pediatrinėje praktikoje jis paprastai naudojamas submikroskopinėms ištrynoms, susijusioms su specifiniais apsigimimais, nustatyti. Mikrodelecijomis pagrįsti sindromai anksčiau buvo laikomi nežinomos etiologijos ligomis, nes chromosomų ištrynimai ir pertvarkymai, sukeliantys šių ligų vystymąsi, dažniausiai nėra vizualizuojami naudojant tradicinius chromosomų analizės metodus. Tokias mažas delecijas tam tikruose chromosomų regionuose gali labai tiksliai aptikti FISH. Ligos, kurias sukelia submikroskopinės delecijos, apima

Onkologinėms patologijoms gydyti mokslininkai dar nesukūrė tobulų terapijos metodų, skatinančių sveikimą. Žuvies analizė krūties vėžiui suteikia vilties anksti diagnozuoti ligą. Šis metodas leis moterims pradėti gydymą ankstyviausiose stadijose, o tai padidins išgijimo tikimybę.

Kas tai yra?

Žuvies tyrimas sergant krūties vėžiu yra viena iš progresyvių ir svarbių ankstyvos diagnostikos priemonių. Išvertus iš anglų kalbos, tai reiškia tarpląstelinės fluorescencinės hibridizacijos testą. Atlikdami šį genų tyrimą, onkologai analizuoja navikų kilmę. Analizė taip pat rodo teigiamą arba neigiamą agresyvaus tipo vėžio patogenezėje ir progresavime dalyvaujančio geno – HER2 – poveikį.

Nuolatinė mokslinių tyrimų plėtra daro įtaką FISH testo kainos mažėjimui ir daro jį prieinamu vis daugiau moterų.

Padidėję limfmazgiai pažastyse gali signalizuoti apie ligos vystymąsi.
  • padidėję limfmazgiai pažastyse;
  • ruoniai krūtinės srityje;
  • skausmas spaudžiant spenelį;
  • pieno liaukų asimetrija;
  • diskomfortas ir skausmas vienoje iš krūtų;
  • išskyros iš spenelių;
  • raukšlėta oda ant pieno liaukos;
  • apverstas spenelis.

Analizės paruošimas ir pateikimas

Norint išlaikyti žuvies testą, specialaus pasiruošimo nereikia. Galite ne tik gerti alkoholį, bet ir prieš atliekant bet kokius tyrimus valgyti riebų, mėsišką ir sunkų maistą. Maistas turi būti lengvas, geriau, jei tai daržovių patiekalai ir sultys. Žuvies testas dėl krūties vėžio yra nekenksminga ir saugi procedūra, kuri vyksta dviem etapais:

  • Histologinis. Taikant vietinę nejautrą, atliekama biomedžiagos biopsija iš krūties. Gauta medžiaga apdorojama specialiais dažais su fluorescenciniais žymenimis. Pagal savo chemines savybes šie žymenys yra siejami tik su nurodytomis chromosomomis ir jų rinkiniais ląstelėse. Tyrimo metu matomi žymenu labiausiai nudažyti chromosomų rinkiniai, kurie parodo genomo pakitimų laipsnį pagal onkologinę priklausomybę.
  • Žuvies analizė. Į veną suleidžiamas DNR komponentas – dezoksiribonukleino rūgštis, nudažyta specifiniais žymenimis. Žymeklių žymės yra integruotos į genomus ląstelių lygiu. Tyrimas atliekamas dalyvaujant pacientui, analizės rezultatai pateikiami nedelsiant.

Ką rodo rezultatai?


Krūties histologija leidžia nustatyti naviko tipą ir jo atsiradimo priežastis.

Žuvies krūties vėžio analizė rodo šiuos rezultatus:

  • Histologinis tyrimas. Rezultatai nustatomi pagal žymenų prisotinimą chromosomų rinkinių regionuose. Skaičius 1 ar mažiau reiškia, kad pavojaus nėra. Skaičius rodo ribinę būklę, dėl kurios reikia atlikti papildomus tyrimus. Skaičius 3 reiškia onkologinio proceso vystymąsi.
  • Žuvies reakcija sergant krūties vėžiu. Neigiamas reakcijos rezultatas reiškia, kad dezoksiribonukleino rūgšties molekulės nedalyvauja netipinių ląstelių patogenezėje. Vystantis piktybiniam dariniui HER2 genas neveikia vėžio ląstelės. Esant teigiamai reakcijai, onkologinių molekulių patogenezėje dalyvaujančių genų dalijimosi greitis padvigubėja.

hibridizacijos metodas savo vietoje* (vietoje, lot.) yra pagrįstas DNR arba RNR gebėjimu formuoti stabilias hibridines molekules su DNR/RNR zondais tiesiai ant fiksuotų chromosomų ir tarpfazių branduolių preparatų. Naudodami šį metodą galite nustatyti tikslią beveik bet kurios DNR ar RNR sekos vietą tiesiai ląstelėje, ląstelės branduolyje ar chromosomose.

Dėl hibridizacijos. savo vietoje tinkami bet kokių audinių ar organų ląstelių citologiniai arba histologiniai preparatai, paruošti standartiniais metodais. Klinikinėje citogenetikos laboratorijoje naudojami kultivuotų periferinio kraujo limfocitų, chorioninio epitelio citotrofoblastų, kultivuotų ir nekultivuotų vaisiaus vandenų ląstelių, įvairių audinių iš abortinės medžiagos preparatai, taip pat žandinio epitelio ir kraujo ląstelių tepinėliai.

hibridizacijos metodas savo vietoje yra ypač svarbus praktinei citogenetikai dėl neizotopinio varianto, pagrįsto naudojant zondus, paženklintus neradioaktyviais modifikuotais nukleotidais, sukūrimo. Neizotopiniai hibridizacijos ant preparatų variantai (ypač fluorescenciniai) turi nemažai privalumų, lyginant su izotopiniais: didelė skiriamoji geba, kuri prilygsta mikroskopo raiškai (0,1 - 0,2 μm), nereikia statistinio rezultatų apdorojimo, greitis ir saugumas sveikatos tyrėjams

Be to, skirtingai modifikuotų zondų, aptiktų naudojant skirtingas aptikimo sistemas, derinys leidžia vienu metu nustatyti dviejų ar daugiau DNR sekų vietą vienoje ląstelėje arba vienoje metafazės plokštelėje. O naudojant pasikartojančias sekas, pažymėtas fluorochromais, kaip DNR zondus, procedūros laikas sutrumpėja iki 7–9 valandų (klasikinė neizotopų hibridizacija trunka dvi dienas, izotopų variantai – nuo ​​savaitės iki mėnesio), o tai ypač svarbu prenatalinei diagnostikai. Naudojimas FISH metodas citogenetinėje diagnostikoje leidžia nustatyti struktūrinius chromosomų persitvarkymus, nustatyti žymenų chromosomų pobūdį, analizuoti skaitinius chromosomų rinkinio pažeidimus tiek metafazinėse chromosomose, tiek tarpfazių branduoliuose.

FISH metodo principas

Pagrinde FISH metodas yra hibridizacijos reakcija tarp dirbtinai sukurto DNR zondo ir jį papildančios branduolinės DNR nukleotidų sekos. DNR molekulė susideda iš dviejų spirališkai sujungtų nukleotidų grandinių, o hibridizacija galima tik grandinėms atsiskyrus. Norint atjungti DNR nukleotidų grandines, naudojama denatūracija (toliau hibridizacijai turi būti denatūruota ir tiriamo mėginio branduoliuose esanti DNR, ir pats DNR zondas). Po denatūravimo DNR zondas hibridizuojasi su savo komplementaria nukleotidų seka ir gali būti aptiktas naudojant fluorescencinį mikroskopą.

Taigi, bendroji nustatymo protokolo forma ŽUVYS gali būti pateikta tokia forma:

1. Histologinio arba citologinio preparato paruošimas.
Histologinis preparatas ruošiamas pagal standartinę schemą: pjovimas, žymėjimas, laidų sujungimas, išpylimas, mikrotomija, pjūvio uždėjimas ant stiklelio ir deparafinavimas. Ruošiant citologinį preparatą, naudojami specialūs nusodinimo tirpalai ir centrifugavimas, todėl galima gauti koncentruotą ląstelių suspensiją.

2. Pirminis apdorojimas (jei reikia).
Preparatas apdorojamas proteazėmis, kad pašalintų hibridizaciją trukdančių baltymų buvimą.

3. DNR zondo uždėjimas preparatui ir vėlesnis denatūravimas.
Norint denatūruoti zondą ir mėginio DNR, jie apdorojami formamidu ir kaitinami iki maždaug 85-90°C temperatūros.

4. Hibridizacija.
Po denatūravimo preparatas atšaldomas iki tam tikros temperatūros (klinikinių tyrimų atveju 37°C) ir kelias valandas inkubuojamas drėgnoje kameroje (inkubavimo trukmė nurodyta kiekviename konkrečiame protokole). Šiuo metu denatūravimui ir hibridizavimui naudojami automatiniai hibridizatoriai.

5. Skalbimas.
Pasibaigus hibridizacijai, neprisirišę zondai turi būti nuplauti, nes kitaip susidarytų fonas, dėl kurio būtų sunku įvertinti FISH rezultatus. Skalavimui paprastai naudojamas tirpalas, kuriame yra citrato ir natrio chlorido (SSC).

6. Priešinis dažymas.
Fluorescencinių dažų (DAPI – 4,6-diamidin-2-fenilindolas; propidžio jodidas) pagalba nudažoma visa branduolinė DNR.

7. Rezultatų analizė naudojant fluorescencinį mikroskopą. Įprastos operacijos (vaško šalinimas, išankstinis apdorojimas, plovimas) gali būti automatizuotos.

* - Medžiaga parengta remiantis informacija iš atvirų šaltinių.

FISH dažymo metodas (fluorescencinė in situ hibridizacija) buvo sukurtas Livermore nacionalinėje laboratorijoje (JAV) 1986 m. Tai iš esmės naujas chromosomų tyrimo metodas – fluorescencinės DNR aptikimo metodas in situ hibridizuojant su specifiniais molekuliniais zondais. Metodas pagrįstas chromosominės DNR gebėjimu tam tikromis sąlygomis prisijungti prie DNR fragmentų (DNR zondų), kurie apima nukleotidų sekas, papildančias chromosomų DNR. DNR zondai yra iš anksto paženklinti specialiomis medžiagomis (pavyzdžiui, biotinu arba digoksigeninu). Ženklinti DNR zondai naudojami citogenetiniams metafazių chromosomų preparatams, paruoštiems hibridizacijai. Po hibridizacijos preparatai apdorojami specialiais fluorescenciniais dažais, konjuguotais su medžiagomis, kurios gali selektyviai jungtis su biotinu arba digoksigeninu. Kiekviena chromosoma turi tam tikrą spalvą. Hibridizacija taip pat gali būti atliekama naudojant radioaktyviai paženklintus zondus. Citogenetinė analizė atliekama fluorescenciniu mikroskopu ultravioletinėje šviesoje.

FISH metodas naudojamas aptikti mažas delecijas ir translokacijas. Chromosomų mainai (translokacijos ir dicentrikai) tarp skirtingų spalvų chromosomų lengvai atpažįstami kaip daugiaspalvės struktūros.

Darbo pabaiga -

Ši tema priklauso:

Mokymosi modulis. ląstelių biologija

Aukštasis profesinis išsilavinimas.. Baškirijos valstybinis medicinos universitetas.. Sveikatos ir socialinės plėtros ministerija..

Jei jums reikia papildomos medžiagos šia tema arba neradote to, ko ieškojote, rekomenduojame pasinaudoti paieška mūsų darbų duomenų bazėje:

Ką darysime su gauta medžiaga:

Jei ši medžiaga jums pasirodė naudinga, galite ją išsaugoti savo puslapyje socialiniuose tinkluose:

Visos temos šiame skyriuje:

Mokymosi modulis. Bendrosios ir medicininės genetikos pagrindai
(gairės studentams) Akademinė disciplina Biologija Rengimo krypčiai Bendroji medicina Co.

Laboratorinių darbų registravimo taisyklės
Būtinas mikroskopinio objekto tyrimo elementas yra jo eskizas albume. Eskizo tikslas – geriau suprasti ir užfiksuoti atmintyje objekto struktūrą, atskirų struktūrų formą.

Praktinis darbas
1. Laikinojo preparato "Svogūnų plėvelės ląstelės" paruošimas Norėdami paruošti laikiną preparatą su svogūnų plėvele, nuimkite

Citoplazminių membranų struktūra. Membranų transportavimo funkcija
2. Mokymosi uždaviniai: Žinoti: - universalios biologinės membranos sandarą; - pasyvaus medžiagų pernešimo per membranas modelius.

Eukariotinių ląstelių struktūra. Citoplazma ir jos komponentai
2. Mokymosi uždaviniai: Žinoti: - eukariotinių ląstelių sandaros ypatumus - citoplazminių organelių struktūrą ir funkcijas.

Organelės, dalyvaujančios medžiagų sintezėje
Bet kurioje ląstelėje atliekama jai būdingų medžiagų sintezė, kurios yra arba statybinės medžiagos naujai suformuotoms struktūroms, o ne susidėvėjusioms, arba fermentai, dalyvaujantys biocheminėse reakcijose.

Organelės, turinčios apsauginę ir virškinimo funkciją
Lizosomos Šios organelės buvo žinomos nuo šeštojo dešimtmečio, kai belgų biochemikas de Duve kepenų ląstelėse atrado mažas granules, turinčias hidrolizės.

Organelės, dalyvaujančios ląstelės energijos tiekime
Didžioji dauguma ląstelių funkcijų yra susijusios su energijos sąnaudomis. Gyva ląstelė ją suformuoja dėl nuolat vykstančių redokso procesų, sudarydama

Organelės, dalyvaujančios ląstelių dalijime ir judėjime
Tai apima ląstelių centrą ir jo darinius - blakstienas ir žiuželes. Ląstelių centras Ląstelių centras yra gyvūnų ląstelėse ir kai kuriose

Praktinis darbas Nr.1
1 pav. Permanentinio preparato "Golgi kompleksas stuburo ganglioninėse ląstelėse" mikroskopinė analizė Ant preparato buvo pavadintos nervinės ląstelės

Ribosomos
Elektroniniu mikroskopu jie aptinkami visų pro- ir eukariotų organizmų ląstelėse, jų dydis 8-35 nm, yra greta išorinės endoplazminio tinklo membranos. Atliekama ant ribosomų

Granuliuotas endoplazminis tinklas
Ištirkite neapdoroto endoplazminio tinklo submikroskopinę struktūrą elektroniniu mikrografu. Atskleidžiamos trys badaujančio šikšnosparnio kasos acinarinių ląstelių sritys. Prieš

Citoplazminiai mikrotubulai
Citoplazminiai kanalėliai randami visų gyvūnų ir augalų organizmų ląstelėse. Tai cilindriniai, siūliški 20–30 mikronų ilgio dariniai, 1

Mitozinis aktyvumas audiniuose ir ląstelėse
Šiuo metu yra ištirti daugelio gyvūnų ir augalų audinių mitoziniai ciklai ir mitozinio aktyvumo būdas. Paaiškėjo, kad kiekvienas audinys turi tam tikrą mitozinio aktyvumo lygį. Apie m

Mitozė (netiesioginis dalijimasis) svogūnų šaknų ląstelėse
Mažu mikroskopo padidinimu suraskite svogūno galiuko veisimosi zoną, matymo lauko centre padėkite sritį su aiškiai matomomis aktyviai besidalijančiomis ląstelėmis. Tada nustatykite vaistą iki didelio padidinimo

Amitozė (tiesioginis dalijimasis) pelių kepenų ląstelėse
Ištirkite pelių kepenų ląsteles dideliu mikroskopo padidinimu. Preparato ląstelės turi įvairiapusę formą. Nesiskiriančiose ląstelėse branduolys yra suapvalintas branduoliu. Dalijantis ląstelėms, kurios pradėjo

Ascaris ovum synkaryon
Mažu mikroskopo padidinimu suraskite apvaliosios kirmėlės gimdos dalį, užpildytą folikulais su kiaušinėliais. Žiūrėkite pavyzdį dideliu padidinimu. Kiaušinio citoplazma susitraukia ir atsisluoksniuoja

DNR ir RNR struktūra ir funkcijos. Genų struktūra ir genų ekspresijos reguliavimas pro- ir eukariotuose. Baltymų biosintezės etapai
2. Mokymosi uždaviniai: Žinoti: - nukleorūgščių cheminę sudėtį ir sandaros ypatumus; - DNR ir RNR skirtumai;

Monohibridinio kryžminimo bruožų paveldėjimo modeliai. Alelinių genų sąveikos tipai
2. Mokymosi tikslai: Žinoti: - monohibridinio kryžminimo modelius; - I ir II Mendelio dėsniai; - sąveikos rūšys

Savarankiško požymių paveldėjimo dėsnis. Nealelinių genų sąveikos tipai
2. Mokymosi tikslai: Žinoti: - di- ir polihibridinio kryžminimo modelius; - III Mendelio dėsnis; - sąveikos rūšys

Kintamumas kaip gyvųjų savybė, jo forma. Fenotipinis (modifikacijos arba nepaveldimas) kintamumas. Genotipinis kintamumas
2. Mokymosi tikslai: Žinoti: - pagrindines kintamumo formas; - pasisemti idėjų apie atpažinimo skvarbumą ir išraiškingumą

Savarankiškas mokinių darbas vadovaujant mokytojui
Praktinis darbas Požymio kintamumo laipsnio ir variacijos koeficiento, priklausomai nuo aplinkos sąlygų, nustatymas.

Kilmės analizė
Ne visi genetikos metodai pritaikomi analizuojant tam tikrų žmogaus savybių paveldimumą. Tačiau ištyrus kelių giminaičių kartų fenotipus, galima nustatyti paveldėjimo pobūdį.

Dvynių metodas žmogaus genetikai tirti
Dvynių metodas įvertina santykinį genetinių ir aplinkos veiksnių vaidmenį tam tikros savybės ar ligos vystymuisi. Dvyniai yra monozigotiniai (identiški) ir dizigotiniai (kartai

Dermatoglifinis metodas žmogaus genetikai tirti
Dermatoglifinė analizė – tai pirštų, delnų ir pėdų papiliarinių raštų tyrimas. Šiose odos vietose yra didelės odos papilės, o jas dengiantis epidermis sudaro g

Citogenetinis metodas tiriant žmogaus genetiką
Tarp daugelio žmogaus paveldimos patologijos tyrimo metodų citogenetinis metodas užima svarbią vietą. Citogenetinio metodo pagalba galima išanalizuoti materialinius paveldimumo pagrindus

Chromosomų rinkinio tyrimas
Jis gali būti atliekamas dviem būdais: 1) tiesioginiu metodu – metafazių chromosomų tyrimas besidalijančiose ląstelėse, pavyzdžiui, kaulų čiulpuose (naudojamas

Praktinis darbas
1. Demonstracinio preparato "Žmogaus kariotipas" peržiūra citogenetikos laboratorijoje. Su X90 padidinimu regėjimo lauke matomi leukocitai

Kariotipo analizė pacientams, sergantiems chromosomų ligomis (iš nuotraukų)
Nr 1. trisomija 13 chromosomoje (Patau sindromas). Kariotipas 47, +13. Nr. 2. trisomija 18 chromosomoje (Edwardso sindromas). Kariotipas 47, +18. Nr.3. 21 chromosomos trisomija (Dauno liga).

Pirštų atspaudų analizės atlikimas
Norėdami patys pasidaryti pirštų atspaudus, jums reikės šios įrangos: fotografinio volelio, 20x20 cm2 stiklo, porolono gabalo, spausdinimo rašalo (ar pan.

Citogenetinė kariotipo analizė (remiantis metafazių plokštelių mikrofotografijomis)
1. Nubraižykite metafazės plokštelę. 2. Suskaičiuokite bendrą chromosomų skaičių. 3. Nustatykite A (3 poros didelių metacentrinių chromosomų), B (dvi poros didelių) chromosomas.

Express metodas tiriant X-lyties chromatiną burnos gleivinės epitelio branduoliuose
Prieš darant grandymą, paciento prašoma dantimis įkąsti skruosto gleivinę ir nuvalyti vidinį skruosto paviršių marlės servetėle. Ši procedūra reikalinga sunaikintoms ląstelėms pašalinti, pvz

Gyventojų statistinis metodas
Populiacija – tos pačios rūšies individų visuma, ilgą laiką gyvenanti toje pačioje teritorijoje, santykinai izoliuota nuo kitų šios rūšies individų grupių, laisvai kryžminantis vienas su kitu ir suteikiantis

Biocheminis metodas
Biocheminiai metodai yra pagrįsti fermentų sistemų aktyvumo (arba paties fermento aktyvumo, arba šio fermento katalizuojamų reakcijos produktų kiekio) tyrimu. Biochemikalai

Molekulinis genetinis metodas
Visi molekulinės genetikos metodai yra pagrįsti DNR struktūros tyrimu. DNR analizės etapai: 1. DNR išskyrimas iš ląstelių, kuriose yra branduolių (kraujo

DNR sintezės polimerazės grandininė reakcija
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra in vitro DNR amplifikacijos (dauginimo) metodas, kurį galima naudoti norint identifikuoti ir padauginti dominantį DNR fragmentą iš 80


Nr Pilnas vardas Genotipas Ivanovas AA Petrovas Aa

Stebėtas genotipas ir alelių dažniai
Genotipai, aleliai Atvejų skaičius Dažnis (dalimis) АА 1/5 = 0,2 Аа

Stebimi ir numatomi genotipų ir alelių dažniai
Stebėtas atvejų skaičius Stebimas dažnis Numatomas AA dažnis (p2)

Stebėtas genotipas ir alelių dažniai
№ p / p Gebėjimas įsukti liežuvį į vamzdelį Genotipai Galiu (taip) A_

Trumpas atsakymas: Fluorescencinės in situ hibridizacijos metodas (FISH – fluorescencinė in situ hibridizacija) apima unikalių DNR nukleotidų sekų naudojimą kaip zondą, ieškant norimų DNR sekų iš paciento gautoje medžiagoje. Metodas pagrįstas papildomu DNR zondo prisijungimu prie metafazių chromosomų arba tarpfazių ląstelių DNR. DNR zondas ir tiriamoji DNR denatūruojami, kad susidarytų viengrandė DNR. DNR zondas pridedamas prie chromosomų preparato ir tam tikrą laiką inkubuojamas. Fluorochromu pažymėto zondo buvimas arba nebuvimas DNR po hibridizacijos nustatomas tiriant chromosomas naudojant fluorescencinę mikroskopiją.

Išsamus atsakymas: Fluorescencinės hibridizacijos metodas savo vietoje leidžia identifikuoti atskiras chromosomas arba jų atskiras sritis metafazių chromosomų preparatuose arba tarpfaziuose branduoliuose, remiantis DNR zondo, konjuguoto su fluorescencine etikete, ir norimos chromosomos srities papildoma sąveika. Norint vizualizuoti peptidinius-nukleininius junginius chromosomoje, naudojami PNA zondai, kurių pagrindą sudaro baltyminis produktas.
Metodas pagrįstas papildomu DNR zondo prisijungimu prie metafazių chromosomų arba tarpfazių ląstelių DNR ir apima šiuos veiksmus:
1. Denatūravimas dvigrandė zondo DNR ir tikslinė DNR į viengrandę, veikiant aukštai temperatūrai arba cheminiams veiksniams.
2. Hibridizacija DNR zondas su DNR taikiniu pagal komplementarumo principą susidarant dvigrandei hibridinei molekulei
3. Plovimas po hibridizacijos pašalinti nehibridizuotą DNR zondą
4. Analizė hibridizacijos signalus fluorescenciniu mikroskopu

Privalumai FISH molekulinės genetinės diagnostikos metodai apima greitą daugybės ląstelių analizę, didelį jautrumą ir specifiškumą bei galimybę tirti nekultūrinamas ir nesidalijančias ląsteles.
Trūkumai Taikant metodą neįmanoma gauti informacijos apie tiriamo DNR ar chromosomos segmento fizinę būklę.
FISH naudojamas prenatalinei molekulinei genetinei diagnostikai ir navikų apibūdinimui; pediatrinėje praktikoje jis paprastai naudojamas submikroskopinėms ištrynoms, susijusioms su specifiniais apsigimimais, nustatyti. Mikrodelecijomis pagrįsti sindromai anksčiau buvo laikomi nežinomos etiologijos ligomis, nes chromosomų ištrynimai ir pertvarkymai, sukeliantys šių ligų vystymąsi, dažniausiai nėra vizualizuojami naudojant tradicinius chromosomų analizės metodus. Tokias mažas delecijas tam tikruose chromosomų regionuose gali labai tiksliai aptikti FISH. Ligos, kurias sukelia submikroskopinės delecijos, apima Prader-Willi, Angelman, Williams, Miller-Dieker, Smith-Magenis sindromai ir velokardiofacialinis sindromas. FISH palengvina šių sindromų diagnostiką netipiniais atvejais, ypač kūdikystėje, kai daugelio diagnostiškai reikšmingų ligos požymių dar nėra. Šį molekulinės genetinės diagnostikos metodą patartina naudoti ir paauglystėje bei pilnametystėje, kai kinta tipiški vaikystėje būdingi klinikiniai ligos požymiai.

121. DNR zondai. Jų naudojimas nustatant paveldimas ligas.

Trumpa apžvalga

DNR zondas yra trumpas DNR fragmentas, konjuguotas su fluoresceinu, fermentu arba radioaktyviu izotopu, kuris naudojamas hibridizuotis su tikslinės DNR molekulės komplementaria sritimi.

Pagrindinė dalis

DNR diagnostikos sistemos

Informacija apie visą organizmo savybių įvairovę yra jo genetinėje medžiagoje. Taigi bakterijų patogeniškumą lemia konkretaus geno ar genų rinkinio buvimas jose, o paveldima genetinė liga atsiranda dėl konkretaus geno pažeidimo. DNR segmentas, lemiantis šį biologinį požymį, turi griežtai apibrėžtą nukleotidų seką ir gali tarnauti kaip diagnostinis žymeklis.

Daugelis greitų ir patikimų diagnostikos metodų yra pagrįsti nukleorūgščių hibridizacija – dviejų vienas kitą papildančių skirtingų DNR molekulių segmentų suporavimu. Procedūra bendrais bruožais yra tokia.

1. Viengrandės DNR taikinio fiksavimas ant membraninio filtro.

2. Pažymėto vienos grandinės DNR zondo, kuris tam tikromis sąlygomis (temperatūra ir jonų stiprumas) poruojasi su tiksline DNR, panaudojimas.

3. Filtro plovimas, kad būtų pašalintas nesurišto žymėto DNR zondo perteklius.

4. Zondų/taikinių hibridinių molekulių aptikimas.

Atliekant diagnostinius tyrimus, pagrįstus nukleorūgščių hibridizacija, pagrindiniai yra trys komponentai: DNR zondas, DNR taikinys ir hibridizacijos signalo aptikimo metodas. Aptikimo sistema turi būti labai specifinė ir labai jautri.

* Fluoresceinas (dioksifluoranas, uranas A) yra organinis junginys, fluorescencinis dažiklis. Analitinėje chemijoje fluoresceinas naudojamas kaip liuminescencinis rūgšties ir bazės indikatorius. Biochemijoje ir molekulinėje biologijoje fluoresceino izotiocianato dariniai kaip biologiniai dažikliai antigenams ir antikūnams nustatyti.

* Aptikimas yra kažko aptikimas, identifikavimas, radimas.

*konjugacija=konjugacija

*Jei DNR mišinys, pavyzdžiui, žmogaus ir pelės, išlydomas ir atkaitinamas viename „mėgintuvėlyje“, kai kurios pelės DNR grandinių dalys rekombinuosis su papildomomis žmogaus DNR grandinių dalimis, kad susidarytų hibridai. Tokių vietų skaičius priklauso nuo rūšies giminingumo laipsnio. Kuo rūšys arčiau viena kitos, tuo daugiau DNR grandžių komplementarumo regionų. Šis reiškinys vadinamas DNR-DNR hibridizacija.

122. Tiesioginės DNR diagnostikos naudojimo metodai ir sąlygos.

Trumpa apžvalga:

Taikant tiesioginius metodus, nustatomi pirminės DNR nukleotidų sekos sutrikimai (mutacijos ir jų tipai). Tiesioginiai metodai pasižymi tikslumu, siekiančiu beveik 100%.

Tiesioginės diagnostikos tikslas – nustatyti mutantinius alelius (pirminės DNR nukleotidų sekos anomalijas, mutacijas ir jų tipus).

Tiesioginės DNR diagnostikos trūkumas – būtinybė tiksliai žinoti geno vietą ir jo mutacijų spektrą. Tiesioginės DNR diagnostikos metodai skirti esant tokioms ligoms kaip fenilketonurija (mutacija R408W), cistinė fibrozė – (dažniausia delF508 mutacija), Hantingtono chorėja (trinukleotidų pasikartojimų išsiplėtimas-CTG pasikartojimai) ir kt.

Pilnas atsakymas:

Taikant tiesioginius metodus, nustatomi pirminės DNR nukleotidų sekos sutrikimai (mutacijos ir jų tipai). Tiesioginiai metodai pasižymi tikslumu, siekiančiu beveik 100%. Tačiau praktikoje šie metodai gali būti taikomi tam tikromis sąlygomis:

1) žinoma citogenetinė geno, atsakingo už paveldimos ligos vystymąsi, lokalizacija,

2) ligos genas turi būti klonuotas ir žinoma jo nukleotidų seka.

Tiesioginės diagnostikos tikslas – nustatyti mutantinius alelius (pirminės DNR nukleotidų sekos anomalijas, mutacijas ir jų tipus). Dėl didelio tiesioginio DNR diagnostikos metodo tikslumo daugeliu atvejų nereikia atlikti visų šeimos narių DNR analizės, nes atitinkamo geno mutacijos nustatymas leidžia beveik 100% tikslumu patvirtinti diagnozę ir nustatyti genotipą. visi sergančio vaiko šeimos nariai, įskaitant heterozigotinius nešiotojus.

Tiesioginės DNR diagnostikos trūkumas – būtinybė tiksliai žinoti geno vietą ir jo mutacijų spektrą.

Tiesioginės DNR diagnostikos metodai skirti esant tokioms ligoms kaip fenilketonurija (mutacija R408W), cistinė fibrozė – (dažniausia delF508 mutacija), Hantingtono chorėja (trinukleotidų pasikartojimų išsiplėtimas-CTG pasikartojimai) ir kt.

Tačiau iki šiol daugelio ligų genai nėra kartografuoti, nežinoma jų egzonintronų organizacija, daugeliui paveldimų ligų būdingas ryškus genetinis heterogeniškumas, neleidžiantis visapusiškai panaudoti tiesioginių DNR diagnostikos metodų. Todėl tiesioginės DNR diagnostikos metodo informacinis turinys labai skiriasi. Taigi, diagnozuojant Huntingtono chorėją, achondroplaziją, ji yra 100%, su fenilketonurija, cistine acidoze, adrenogenitaliniu sindromu - nuo 70 iki 80%, o su Wilson-Konovalov liga ir Duchenne / Becker miopatija - 45-60%. Šiuo atžvilgiu naudojami netiesioginiai paveldimų ligų molekulinės genetinės diagnostikos metodai.