Рифови директни и индиректни методи. Лабораторна диагностика на полово предавани инфекции
Понастоящем широко се използват серологични тестове, в които участват белязани AG или AT-la. Те включват имунофлуоресцентни реакции, радиоимунни и ензимни имуноанализни методи.
Те се прилагат:
1) за серодиагностика на инфекциозни заболявания, т.е. за откриване на антитела с помощта на набор от известни конюгирани (химически комбинирани) антигени с различни етикети (ензими, флуорохромни багрила);
2) за определяне на микроорганизма или неговия серовар с помощта на стандартни маркирани диагностични антитела (бърза диагностика).
Серумите се приготвят чрез имунизиране на животни със съответните антигени, след което се изолират имуноглобулини и се конюгират със светещи багрила (флуорохроми), ензими и радиоизотопи.
Маркираните SR не отстъпват на другите SR по специфичност и превъзхождат всички SR по своята чувствителност.
Няма свързано съдържание
Като етикет се използват светещи флуорохромни багрила (флуорисцеин изотиоцианат и др.).
Има различни модификации на RIF. За експресна диагностика на инфекциозни заболявания - за откриване на микроби или техни антигени в изследвания материал се използва RIF по Кунс.
Има два метода на RIF според Кунс: директен и индиректен.
Директни RIF компоненти:
1) изследваният материал (изпражнение, отделено от назофаринкса и др.);
2) белязан специфичен имунен серум, съдържащ AT-la към желания антиген;
3) изотоничен разтвор на натриев хлорид.
Намазка от тестовия материал се третира с белязан антисерум.
Възниква AG-AT реакция. При луминесцентно микроскопско изследване в областта, където са локализирани комплексите AG-AT, се установява флуоресценция - луминесценция.
Индиректни RIF компоненти:
1) изследваният материал;
2) специфичен антисерум;
3) антиглобулинов серум (AT-la срещу имуноглобулин), маркиран с флуорохром;
4) Изотоничен разтвор на натриев хлорид.
Намазка от тестовия материал първо се третира с имунен серум към желания антиген и след това с маркиран антиглобулинов серум.
Светещи AG-AT комплекси - белязани с AT се откриват с помощта на флуоресцентен микроскоп.
Предимството на индиректния метод е, че не е необходимо да се приготвя широка гама от флуоресцентни специфични серуми и се използва само един флуоресцентен антиглобулинов серум.
Изолира се и 4-компонентна разновидност на индиректен RIF, когато допълнително се въвежда комплемент (серум от морско свинче). При положителна реакция се образува комплекс AG-AT - белязан - AT-комплемент.
RIF се основава на комбинацията от антигени на бактерии, рикетсии и вируси със специфични антитела, маркирани с флуоресцентни багрила (флуоресцеин изотиоцианат, родамин, B-изотиоцианит, лизатинродамин B-200, сулфохлорид и др.), притежаващи реактивни групи (сулфохлорид, изотиоцианит и др.). .) . Тези групи се комбинират със свободните аминогрупи на молекулите на антитялото, които не губят своя специфичен афинитет към съответния антиген, когато се третират с флуорохром. Получените AG-AT комплекси стават ясно видими, ярко светещи структури под флуоресцентен микроскоп (фиг. 7). RIF може да открие малки количества бактериални и вирусни антигени. Методът RIF се използва в два варианта: директен и индиректен метод.
Директният метод се основава на прякото свързване на антиген с белязано антитяло. Индиректният метод се основава на поетапно откриване на комплекса AG-AT с помощта на флуоресцентни багрила. Първият етап се състои в образуването на имунни комплекси на определен антиген със специфични антитела. Вторият етап е да се идентифицира този комплекс чрез третиране с белязан антигамаглобулин.
Предимството на RIF е простотата, високата чувствителност, скоростта на получаване на резултата. RIF се използва като метод за ранна експресна диагностика на грип, дизентерия, малария, чума, туларемия, сифилис и др. За провеждане на такова изследване се използва луминисцентен микроскоп.
Радиоимуноанализ (RIA)
RIA е един от най-чувствителните методи за имунодиагностика. Използва се за откриване на антигена на вируса на хепатит В при пациенти с вирусен хепатит. За тази цел към тестовия серум се добавя референтен серум (серум, съдържащ антитела срещу вируса на хепатит B). Сместа се инкубира 1-2 дни при температура 40°C, след което се добавя референтен антиген (антиген, белязан с изотоп 125 J) и инкубацията продължава още 24 часа. Към получения комплекс антиген-антитяло се добавят преципитиращи антиимуноглобулини срещу референтни серумни протеини, което води до образуването на преципитат (фиг. 8). Резултатът се отчита от наличието и броя на импулсите в утайката, записани от брояча. Ако има антиген, свързан със специфични антитела в тестовия серум, последните не се свързват с белязания антиген и следователно не се открива в утайката. По този начин RIA се основава на принципа на конкурентно взаимодействие на определения антиген и известно количество от белязания антиген с активните центрове на антителата.Като маркер се използват радиоактивни изотопи.
В зависимост от техниката на поставяне се разграничават два метода на RIA.
1) Техника "течна фаза" (класически RIA). Недостатъкът на тази постановъчна техника е необходимостта
специално разделяне на свободни и свързани белязани антигени (или антитела).
2) Техника "твърда фаза".
AG или AT с известна специфичност се свързват със сорбенти (твърда фаза) - стените на полистиролова ямка или пластмасова тръба. Останалите IC компоненти се сорбират последователно върху имобилизирания AG (AT).
В зависимост от естеството на реакцията се разграничават следните методи:
1) Състезателен метод - метод, основан на конкуренцията на АГ.
Компоненти на реакцията:
а) откриваема АГ (изследван материал - кръв, храчка и др.);
б) антиген, белязан с радиоизотоп, идентичен на изследвания антиген;
в) специфични антитела с известна концентрация, свързани със сорбента;
г) стандартен AG (контролен);
д) буферен разтвор.
Първо, изследваният AG се въвежда в реакцията. На повърхността на сорбента се образува комплекс AG-AT. Сорбентът се отмива, след което се въвежда маркиран AG.Колкото по-високо е съдържанието на изследвания AG, толкова по-малко белязан AG се свързва с AT-m на повърхността на сорбента. Концентрацията на белязан антиген се определя чрез измерване на радиоактивността на реакцията с помощта на броячи. Стойността на радиоактивността на реакцията ще бъде обратно пропорционална на количеството AG в тестовата проба.
2) Несъстезателен метод.
Компоненти на реакцията:
а) определен AG;
б) специфичен AT-a с известна концентрация, свързан
nye върху сорбента;
в) антитела, идентични на свързаното антитяло, маркирани
радиоизотоп;
г) стандарт AG;
д) буферен разтвор.
Изследваният АГ се добавя към свързаните антитела. В процеса на инкубация върху сорбента се образуват комплекси AG-AT. Сорбентът се отмива от свободните компоненти и се добавят белязани антитела, които се свързват със свободните валенции на AG-on в комплекса. Количеството радиоактивност е пропорционално на концентрацията на изследвания АГ.
3) "Метод на сандвич" (непряк метод) - най-често срещаният метод.
Компоненти:
а) тест серум (или тест AG);
b) AG, свързани с сорбента (или AT-la, свързани с сорбента при определяне на AG-a);
в) диагностични антитела срещу белязани с радиоизотопи имуноглобулини;
d) контролни серуми (или антигени);
д) буферни разтвори.
Изследваните Abs (или AGs) реагират с твърдофазни AGs (ATs), след което инкубата се отстранява и в реакцията се въвеждат белязани антиглобулинови Abs, които се свързват със специфични AG-AT комплекси на повърхността на сорбента. Големината на радиоактивността на реакцията е правопропорционална на количеството на изследваното AT (или AG).
Предимства на RIA:
1) висока специфичност и чувствителност;
2) простота на техниката на настройка;
3) точността на количествената оценка на резултатите;
4) лесен за автоматизиране.
Недостатък: използване на радиоактивни изотопи.
Няма свързано съдържание
ELISA метод (ELISA)
Методът се използва за откриване на антигени, като се използват съответните им антитела, конюгирани с белязан ензим (пероксидаза от хрян, b-галактоза или алкална фосфатаза). След като антигенът се комбинира с ензимно-маркирания имунен серум, субстратът и хромогенът се добавят към сместа. Субстратът се разцепва от ензима и неговите продукти на разграждане причиняват химическа модификация на хромогена. В този случай хромогенът променя цвета си - интензитетът на цвета е правопропорционален на броя на свързаните молекули антиген и антитяло (фиг. 9).
Най-разпространеният е твърдофазният ELISA, при който един от компонентите на имунния отговор (антиген или антитяло) се сорбира върху твърд носител. Като твърд носител се използват микропанели от полистирен. При определяне на антитела, кръвен серум на пациенти, антиглобулинов серум, маркиран с ензим, и смес от субстратни разтвори за ензима и хромогена се добавят последователно към ямките с адсорбирания антиген. Всеки път след добавяне на следващия компонент, несвързаните реагенти се отстраняват от ямките чрез щателно измиване. При положителен резултат цветът на хромогенния разтвор се променя. Твърдофазовият носител може да бъде сенсибилизиран не само с антиген, но и с антитяло. След това желаният антиген се въвежда в ямките със сорбирани антитела, добавя се имунният серум срещу антигена, маркиран с ензима, и след това се добавя сместа от субстратни разтвори за ензима и хромогена.
ELISA се използва за диагностициране на заболявания, причинени от вирусни и бактериални патогени.Ензимите се използват като етикет: пероксидаза, алкална фосфатаза и др.
Индикаторът за реакцията е способността на ензимите да предизвикват цветни реакции, когато са изложени на съответния субстрат. Например, субстратът за пероксидазата е разтвор на ортофенилдиамин.
Най-широко използваният твърдофазен ELISA. Същността на ELISA е подобна на RIA.
Резултатите от ELISA могат да бъдат оценени визуално и чрез измерване на оптичната плътност на спектрофотометър.
Предимствата на ELISA включват:
Няма контакт с радиоактивни вещества;
Простота на методите за оценка на отговорите;
Стабилност на конюгатите;
Лесно се поддава на автоматизация.
Въпреки това, в сравнение с RIA, се отбелязва по-ниска чувствителност на метода, но в някои случаи чувствителността е по-добра от RIF и RIM.
Като примери са дадени следните видове ELISA:
състезателен тип.
Назначаване.
Проектиран за откриване на повърхностния антиген на вируса на хепатит B (HB3 Ad) в серум и плазма при диагностицирането на вирусен хепатит B и определяне на носителството на HB5 Ad.
Компоненти:
1) тестов материал серум или кръвна плазма;
2) антитела срещу HB3 Ad, адсорбирани върху повърхността на ямка на полистиролова микроплака;
3) конюгат - миши моноклонални антитела към HB3 Ad, белязани с пероксидаза,
4) ортофенилендиамин (OPD) -субстрат;
5) фосфатно буфериран физиологичен разтвор;
6) контролни серуми:
Положителен (серум с HBe Ad);
Отрицателен (серум без HBs Ad). Напредък
1) Въвеждане на контролни и тестови серуми.
2) Инкубация 1 час при 37°C.
3) Измиване на кладенци.
4) Въвеждане на конюгата.
5) Инкубация 1 час при 37°C.
6) Измиване на кладенци.
7) Въвеждане на OFD. В присъствието на HBs Ad разтворът става жълт в ямките.
ELISA се взема предвид чрез оптична плътност с помощта на фотометър. Степента на оптичната плътност ще бъде обратно пропорционална на концентрацията на изследваните HBs Ad.
Механизъм
Реакцията протича в три фази:
1) HB3 Кръвното налягане на изследвания серум (плазма) се свързва с хомоложни антитела, адсорбирани на повърхността на ямката. Образува се ИР АГ-АТ. (NVz Ad - agl \ NVz AT).
2) HBs Ad антителата, белязани с пероксидаза, се свързват с останалите свободни HBs Ad детерминанти на AG-AT комплекса. Образува се комплекс от белязани с AT-AG Abs (an!1 HBs AT-HBs Ad-ap(1 HBs Abs, белязани с пероксидаза).
3) OPD взаимодействат (с пероксидаза) на комплекса AT-AG-AT и се появява жълто оцветяване.
индиректен тип
Това е основната тестова реакция за диагностика на HIV инфекция.
Цел: серологична диагностика на HIV инфекция - откриване на антитела срещу HIV антигени, Компоненти:
1) материал за изследване - кръвен серум;
2) синтетичен
Реакция на имунофлуоресценция - РИФ (метод на Кунс) Има три вида директен метод, индиректен метод, с комплемент. Реакцията на Кунс е бърз диагностичен метод за откриване на микробни антигени или откриване на антитела.
Директният RIF метод се основава на факта, че тъканните антигени или микроби, третирани с имунни серуми с антитела, маркирани с флуорохроми, могат да светят в UV лъчите на флуоресцентен микроскоп. Бактериите в намазка, обработени с такъв луминисцентен серум, светят по периферията на клетката под формата на зелена граница.
Индиректният RIF метод се състои в идентифициране на комплекса антиген-антитяло с помощта на
антиглобулинов (анти-антитела) серум, белязан с флуорохром. За да направите това, петна от суспензия от микроби се третират с антитела от антимикробен заешки диагностичен серум. След това антителата, които не са свързани с микробни антигени, се отмиват и антителата, останали върху микробите, се откриват чрез третиране на цитонамазката с антиглобулинов (анти-заешки) серум, маркиран
флуорохроми. В резултат на това се образува сложен микроб + антимикробни заешки антитела + анти-заешки антитела, белязани с флуорохром. Този комплекс се наблюдава във флуоресцент
микроскоп, както при директния метод.
23. Ензимен имуноанализ Състав, формулировка, отчитане, оценка. Области на използване.
I Радиоимуноанализ.
Радиоимунният метод или анализ (RIA) е високочувствителен метод, базиран на реакцията антиген-антитяло, използваща антигени или антитела, маркирани с радионуклид (125J, 14C, 3H, 51Cr и др.). След взаимодействието им, полученият радиоактивен имунен комплекс се отделя и радиоактивността му се определя в подходящ брояч (бета или гама лъчение). Интензитетът на радиацията е право пропорционален на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.
добавете серум на пациента, антиглобулинов серум, маркиран с ензима и субстрата/хромогена за ензима.
II. При определяне на антигена, антигенът (например кръвен серум с желания антиген) се въвежда в ямките със сорбирани антитела, диагностичен серум срещу него и се добавят вторични антитела (срещу диагностичен серум), маркирани с ензима, и тогавасубстрат/хромоген за ензима.
24. Реакции на имунен лизис, приложение. Реакция на свързване на комплемента. Съставки, рецептура, отчитане, оценка. Приложение.
Реакцията на фиксиране на комплемента (RCC) се състои в това, че когато антигените и антителата съответстват едно на друго, те образуват имунен комплекс, към който комплементът (C) е прикрепен чрез Fc фрагмента на антителата, а комплементът е свързан с антиген-антитяло. комплекс. Ако комплексът антиген-антитяло не се образува, тогава комплементът остава свободен. RSK се провежда в две фази 1-ва фаза - инкубация на смес, съдържаща антиген + антитяло + комплемент, 2-ра фаза (индикатор) - откриване на свободен комплемент в сместа чрез добавяне към нея на хемолитична система, състояща се от еритроцити на коч и хемолитичен серум, съдържащ антитела на тях. В 1-ва фаза на реакцията, когато се образува комплекс антиген-антитяло, настъпва свързване на комплемента, а след това във 2-ра фаза няма да настъпи хемолиза на еритроцити, сенсибилизирани от антитела (реакцията е положителна). Ако антигенът и антитялото не съвпадат (няма антиген или антитяло в тестовата проба), комплементът остава свободен и във 2-ра фаза ще се присъедини към комплекса еритроцит-антиеритроцитно антитяло, причинявайки хемолиза (отрицателна реакция).
25. Динамика на формирането на клетъчния имунен отговор, неговите прояви. Имунологични
памет.
Имунният клетъчен отговор (CIR) е сложна, многокомпонентна кооперативна реакция на имунната система, индуцирана от чужд антиген (Т-клетъчни епитопи). Осъществява се от Т-системата на имунитета. КИО етапи
1. APC улавяне на антиген
2. Процесор. AG в протеазомите.
3. Образуване на комплекса пептид + МНС клас I и II.
4. Транспорт на комплемента към APC мембраната.
5. Разпознаване на комплемента от AG-специфични Т-хелпери 1
6. активиране на APC и Т-хелпери 1, освобождаване на IL-2 и гама-интерферон от Е-хелпери1. Пролиферация и диференциация в областта на АГ-зависимите Т-лимфоцити.
7. Образуване на зрели Т-лимфоцити от различни популации и Т-лимфоцити на паметта.
8. Взаимодействие на зрелите Т-лимфоцити с АХ и реализация на крайния ефектор.
Прояви на КИО:
антиинфекциозен AI:
антивирусно,
антибактериални (вътреклетъчно разположени бактерии);,
алергии IV и I тип;
антитуморен IO;
трансплантация AI;
имунологична толерантност;
имунологична памет;
автоимунни процеси.
26. Характеристика на регулаторни и ефекторни субпопулации на Т-лимфоцити. Основен
маркери. Т-клетъчен рецептор (TCR). Генетичен контрол на разнообразието на TCR
Т-лимфоцитите представляват втората важна популация от лимфоцити, чиито предшественици се образуват в костния мозък и след това мигрират за по-нататъшно съзряване и
диференциация в тимуса (името "Т-лимфоцит" отразява зависимостта от тимуса, като основно място на ранния етап на съзряване).
Според спектъра на биологична активност Т-лимфоцитите са регулаторни и ефекторни клетки, които осигуряват адаптивната функция на Т-системата на имунитета. Те не произвеждат молекули на антитела. TCR е мембранна молекула, която се различава от HCR, но е структурно и функционално подобна на антителата.
TCR - AG-специфичен. рецептор. Това е основната молекула, принадлежаща към суперсемейството Ig. Състои се от 3 части: надмембранна, мембранна и цитоплазмена. TCR опашката се формира от 2 глобуларни алфа и бета молекули, които имат променливи и постоянни домени (Vα и Vβ, Сα и Сβ).
Vα и Vβ образуват активния TCR комплекс. Има 3 хиперпроменливи области - постоянни детерминистични области (CDO). Функцията на KDO е разпознаването и свързването на Т-клетъчните пептиди, т.е. детерминантни групи на АГ. TCR седи плътно върху клетката и нейната цитоплазмена опашка, нейната цитоплазмена част, участва в извършването на инф. В ядрото при взаимодействието му с АГ. Приблизително 90% TCR. Те носят алфа и бета вериги, а приблизително 10% носят гама и делта вериги.
TCR е генетично кодиран. α и γ веригите, по аналогия с IG леките вериги, се кодират от V, G и C гени, а β и δ, по аналогия с IG тежките вериги, от V, G, E. α и γ на хромозома 7 и β и δ на хромозома 14.
CD-3 рецепторът е комплементарна структура, Ig молекула. Образува се от 3 трансмембранни протеина: εδ, εγ и димер-зета., надмембранна, вембранна и цитозолна опашка. Те представляват единен комплекс с TCR, който осигурява провеждането на AG-специфични сигнали към клетъчното ядро.
CD4 и CD8. Те се експресират или едновременно с TCR, или отделно от него. Те играят функцията на корецептори. Те подобряват адхезията към AG-представящата клетка. Те осигуряват провеждането на АГ-специфичен сигнал към клетъчното ядро.
Т-лимфоцитите се разделят според вида на разпознаване, МОЛЕКУЛА:
CD4 rec. Пептид MHC 2-ри клас
CD8 пептид + MHC 1-ви клас
Характеристики на основните субпопулации на Т-лимфоцитите: популацията на Т-лимфоцитите може да бъде класифицирана в три класа:
A. Помощници, HRT ефектори (CD 4+) и цитотоксични супресори (CD 8+);
Б. Нестимулирани (CD 45 RA+) и клетки на паметта (CD 45 RO+);
В. Тип 1 - (IL-2, INF-гама, TNF-бета продуциращ);
Тип 2 - (продуциране на IL-4, IL-5, IL-6, IL9, IL 10).
Този метод използва явлението луминесценция.
Същността на явлението луминесценция се състои в това, че когато различни видове енергия (светлинна, електрическа и т.н.) се абсорбират от молекулите на определени вещества, техните атоми преминават във възбудено състояние и след това, връщайки се в първоначалното си състояние , излъчват погълнатата енергия под формата на светлинно лъчение.
В RIF луминесценцията се проявява под формата на флуоресценция - това е блясък, който възниква в момента на облъчване с вълнуваща светлина и спира веднага след края му.
Много вещества и живи микроорганизми имат собствена флуоресценция (т.нар. първична), но нейният интензитет е много нисък. Вещества, които имат интензивна първична флуоресценция и се използват за придаване на флуоресцентни свойства на нефлуоресцентни вещества, се наричат флуорохроми. Такава индуцирана флуоресценция се нарича вторична.
За възбуждане на флуоресценцията при флуоресцентна микроскопия най-често се използва ултравиолетовата или синьо-виолетовата част на спектъра (дължина на вълната 300-460 nm). За тези цели лабораториите разполагат с луминесцентни микроскопи от различни модели - ML-1-ML-4, "Lumam".
Във вирусологичната практика се използват два основни метода на флуоресцентна микроскопия: флуорохромизация и флуоресцентни антитела (или RIF).
Флуорохромизация- това е обработката на препарати с флуорохром с цел увеличаване на силата и контраста на тяхната луминесценция. Най-голям интерес представлява флуорохромът акридин оранжево, който причинява полихроматична флуоресценция на нуклеинови киселини. Така че, когато препаратите се третират с този флуорохром, дезоксирибонуклеиновата киселина флуоресцира ярко в зелено, а рибонуклеиновата киселина - рубиненочервена.
Методът RIF се състои в това, че антителата, свързани с флуорохром, запазват способността да влизат в специфична връзка с хомоложен антиген. Полученият комплекс антиген + антитяло, поради наличието на флуорохром в него, се открива под флуоресцентен микроскоп чрез характерно сияние.
За получаване на антитела се използват високоактивни хиперимунни серуми, от които се изолират антитела и се маркират с флуорохром. Най-често използваните флуорохроми са FITC-флуоресцеин изотиоцианат (зелена светлина) и PCX-родамин сулфохлорид (червена светлина). Антитяло, белязано с флуорохром, се нарича конюгат.
Методът на приготвяне и оцветяване на препаратите е както следва:
- подгответе петна, отпечатъци от органи или върху покривни стъкла - инфектирана клетъчна култура върху предметни стъкла; Могат да се използват и хисторазрези;
- препаратите се сушат на въздух и се фиксират в охладен ацетон при стайна температура или при минус 15 °C (от 15 минути до 4-16 часа);
- оцветени чрез директен или индиректен метод; водят записи под флуоресцентен микроскоп според интензитета на блясъка, оценен в кръстове.
Успоредно с това се приготвят и оцветяват препарати от здраво животно - контрола.
Има два основни метода за прилагане на флуоресцентни антитела: директен и индиректен.
Директен метод (една стъпка). Конюгат (флуоресцентен серум към предполагаемия вирус) се прилага към фиксирания препарат, инкубира се в продължение на 30 минути при температура 37 ° C във влажна камера. След това лекарството се измива от несвързания конюгат с физиологичен разтвор (рН 7,2 - 7,5), изсушава се на въздух, прилага се нефлуоресцентно масло и се изследва под микроскоп.
Директният метод позволява откриване и идентифициране на антигена. За да направите това, трябва да имате флуоресцентен серум за всеки вирус.
Индиректен метод (двуетапен). Небелязан серум, съдържащ антитела срещу предполагаемия вирус, се прилага към фиксирания препарат, инкубира се 30 минути при 37 °C, несвързаните антитела се отмиват. Към препарата се прилага флуоресцентен антивидов серум, съответстващ на вида животно, което произвежда хомоложни антивирусни антитела, и се инкубира за 30 минути при 37 °C. След това лекарството се измива от несвързани белязани антитела, изсушава се на въздух, прилага се нефлуоресцентно масло и се изследва под флуоресцентен микроскоп.
Антивидовите серуми се получават чрез имунизиране на животни с глобулини от тези видове, които служат като производители на антивирусни антитела. Така че, ако са получени антивирусни антитела върху зайци, тогава се използва флуоресцентен анти-заешки серум.
Индиректният метод позволява не само да се открие и идентифицира антигена, но и да се открие и определи титъра на антителата. В допълнение, този метод може да открие антигени на различни вируси с един белязан серум, тъй като се основава на използването на антивидови серуми. По-често се използват анти-заешки, анти-говежди, анти-конски серуми и серуми срещу морски свинчета глобулини.
Разработени са няколко модификации на индиректния метод. Най-голямо внимание заслужава методът с използване на комплемент. Методът се състои в прилагане на инактивиран нефлуоресцентен специфичен серум и комплемент от морско свинче към фиксирания препарат, задържането му за 30 минути при 37 °C, промиването му и за откриване на комплекса антиген + антитяло + комплемент, прилагане на флуоресцентен антикомплементарен серум , като се държи в продължение на 30 минути при 37 °C, измива се, суши се на въздух и се изследва под флуоресцентен микроскоп.
Предимства на RIF: висока специфичност и чувствителност; лекота на техниката на настройка; изисква минимален брой компоненти. Това е експресен диагностичен метод, тъй като можете да получите отговор в рамките на няколко часа. Недостатъците включват субективност при оценката на интензивността на луминесценцията и, за съжаление, понякога флуоресцентните серуми са с лошо качество. В момента RIF се използва широко в диагностиката на вирусни заболявания по животните.
Ако намерите грешка, моля, маркирайте част от текста и щракнете Ctrl+Enter.
Открита през 1942 г. от Кунс, реакцията на имунофлуоресценция не е нов изследователски метод. Въпреки това, появата на хибридомни технологии, които направиха възможно получаването на моноклонални антитела, даде "втори живот" на тази реакция, тъй като тяхното използване направи възможно повишаването на чувствителността на тази реакция и нейната специфичност няколко пъти.
И днес ще ви разкажем подробно за реакцията на директна и непряка имунофлуоресценция (RIF) като диагностичен метод на Кунс за възрастни мъже и жени по време на бременност.
Какво е реакция на имунофлуоресценция
Представлявайки отлична възможност за бързо получаване на точна диагноза, имунофлуоресцентната реакция ви позволява да определите наличието на причинителя в патологичния материал. За целта се използва цитонамазка от материал, който е специално обработен с белязан FITC (флуоресцеин изотиоцианат) и изследван като хетерогенен анализ.
За получаване на резултата се използва флуоресцентен микроскоп, в оптичната му система има набор от светлинни филтри, които осигуряват на препарата синьо-виолетова или ултравиолетова светлина с определена дължина на вълната. Това условие позволява на флуорохрома да свети в даден диапазон. Изследователят оценява свойствата на сиянието, неговата природа, размера на обектите и тяхното взаимно разположение.
На кого е възложено
Провеждането на реакция на имунофлуоресценция може да бъде предписано при диагностицирането на много вирусни заболявания. По-специално, предписано е цялостно изследване за идентифициране на следните фактори:
- наличието на вирус в тялото;
- инфекция със салмонела;
- наличието на определени антигени в тялото;
- разкрива се вероятността от инфекция на тялото с хламидии, микоплазми и други микроорганизми, които имат способността да инициират човешки вирусни заболявания;
- диагностика на вирусни заболявания при животните.
Тези индикации позволяват използването на имунофлуоресцентната реакция за откриване на вирусни заболявания от различно естество в организма на човека и животните.
Целите на
Тъй като този диагностичен метод има много предимства, които включват неговата висока ефективност, скорост на провеждане и получаване на резултати, както и липсата на голям брой противопоказания, той се използва за определяне на наличието на вирусни инфекции в организма. Следователно този анализ може да бъде предписан както за поставяне, така и за изясняване на диагнозата, въз основа на която се предписва режим на лечение.
Процедурата не причинява дискомфорт, за нея е необходимо да се получи материал за анализ, който се взема от всяка телесна течност: слюнка, храчки, изстъргвания от повърхността на лигавиците. Може да се вземе и кръв за анализ. Честотата на реакцията на имунофлуоресценция се предписва от лекуващия лекар, който трябва да получи данни за динамиката на процесите, протичащи в тялото.
Тъй като този анализ не вреди както на тялото, така и на общото благосъстояние на човек, той може да бъде предписан, ако е необходимо.
Видове такава процедура
Днес се използват няколко разновидности на този анализ, всеки от които има редица специфични характеристики и ви позволява да получите най-подробната картина на процесите, протичащи в тялото.
Видовете имунофлуоресцентни реакции включват:
- - един от най-бързо развиващите се видове диагностика, този анализ дава възможност за получаване на количествени данни без използването на серийни разреждания. Използвайки получените измервания на оптичната плътност на течността, е възможно точно да се определи нивото на концентрация на желания компонент. Широките възможности на този вид анализ се използват, когато за неговото прилагане се използват моноклонални антитела, което позволява да се определи фазата на инфекциозния процес, неговата тежест;
- ДНК диагностика- този метод се основава на комплементарно свързване на нуклеотиди, за което могат да се използват течности като слюнка, кръв, цереброспинална течност, урина, храчки, проби от биопсия и кръв. Този метод най-ефективно открива наличието на папиломавируси в тялото, но много съвременни тестови системи понякога могат да дадат фалшиво положителни и фалшиво отрицателни резултати. Причината за тях може да бъде замърсяване на течни проби за анализ на специфична ДНК, чието наличие може да има гнездов или тотален характер;
- имунохроматография- спецификата на този метод за определяне на наличието на патологична среда и вируси в тялото е използването на белязани антитела по време на реакцията. Този диагностичен метод се използва за идентифициране и степента на активност на процеса на инфекция със стрептококи от група А, както и хламидия от следните видове: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia от Oxoid. Притежаващи най-висока чувствителност, тестови системи, които се основават на тази изследователска методология. обикновено се използват като тест за ориентация.
Изброените разновидности имат характеристики на поведение и специфични характеристики на резултатите, но всички те са насочени към получаване на данни за наличието на патологични микроорганизми и вируси в организма, както и за степента на тяхното размножаване и активност.
Показания за провеждане
Може да се предпише имунофлуоресцентна реакция за откриване на всякакъв вид патологична среда в тялото.
По време на този тип диагностика се определят хламидия, трихомонади, гонококи и, както и всички видове ламблии. и други заболявания също изискват RIF. Назначаването на лекар за провеждането му е задължително.
Противопоказания за провеждане
Тъй като за тази реакция са необходими всякакви телесни течности, приемането им обикновено не е трудно и няма противопоказания за провеждане на имунофлуоресцентна реакция. Но по време на бременност и при деца под 6-месечна възраст вземането на проби за изследване се извършва с най-големи предпазни мерки.
Липсата на противопоказания позволява този вид диагностика да се извършва, когато лекарят предписва на всички пациенти. Безопасността му се гарантира от използването на дезинфекциран инструмент и спринцовки за еднократна употреба.
Подготовка за процедурата
Няма характеристики за вземане на материал за този анализ. Кръвта за него се взема на празен стомах, така че в нея няма високо съдържание на вещества, които могат да променят истинското свидетелство и да дадат фалшива картина.
Как е вземането на проби
Тъй като не се изисква специална подготовка за анализа, само хранене 12 часа преди него и липсата на употреба на лекарства е изключено, материалът за изследване се приема като нормален процес на вземане на телесна течност за анализ.
Субективните усещания по време на процедурата могат да варират в зависимост от чувствителността.
Дешифриране на резултатите
Използването на съвременни тестови системи ви позволява да получите най-точните резултати от анализа. За дешифриране на резултата се използват следните данни:
- степен на интензитет на флуоресценция;
- флуоресцентен нюанс;
- периферния характер на светещия процес на обекта;
- характеристики на морфологията, местоположението на патогена в взетата намазка от изследвания материал и неговите размери.
По време на изследването на обекти, които са големи (например gardenerella, Trichomonas, клетки, които вече са засегнати от вируси), изброените по-горе критерии позволяват да се получат най-надеждните резултати. Елементарните тела на микоплазмата и хламидията обаче имат размери, които са на границата на разделителната способност на флуоресцентен микроскоп, което затруднява
затруднява получаването на точен резултат, тъй като периферното сияние губи част от своя интензитет. Останалите критерии вече не са достатъчни за точна идентификация на изследваните микроорганизми. Поради тази причина към специалистите, които провеждат този тип изследвания, се налагат специални изисквания: нивото на тяхната квалификация трябва да е достатъчно, за да работят с наличните данни.
Поради тази причина само лекар с подходящо ниво на квалификация може да се справи с декодирането на получения анализ. Прочетете за цената на изследването на RIF по-долу.
средна цена
Цената на имунофлуоресцентно изследване зависи от местоположението и нивото на лечебното заведение, както и от квалификацията на специалиста, който извършва анализа. Днес цената варира от 1280 до 2160 рубли.
Видеото по-долу ще ви разкаже повече за имунологичните реакции:
Има два варианта за настройка на RIF (реакция на Coons) - директна и индиректна имунофлуоресцентна реакция.
Direct RIF е проста реакция в една стъпка, но тъй като изисква голямо количество
маркирани антимикробни серуми, тогава по-рядко е индиректно, чието производство се осигурява от един маркиран антисерум.
Индиректният RIF е двуетапна реакция, при която антигенът първо се свързва с небелязан видов серум и след това образуваният имунен комплекс антиген-антитяло се третира с FITC-белязан антисерум, съдържащ антитела срещу имуноглобулина на този комплекс. Обикновено, на етап I от неговата формулировка, имунен заешки серум, получен чрез имунизиране на животни със съответния микроорганизъм, се използва като видов серум, а на етап II, FITC-белязан анти-заешки серум на магарета или други животни, имунизирани със заешки гама-глобулини ( Фиг. 9).
Директна настройка на RIF. Върху обезмаслено предметно стъкло се правят тънки петна от изследвания материал, а петна-отпечатъци от органи и тъкани. Препаратите се изсушават, фиксират, върху тях се нанася луминисцентен серум, взет в работно разреждане, и се поставят във влажна камера при температура 37 ° C за 20-30 минути (за 25-40 минути - при стайна температура). След това, за да се отстранят излишните флуоресцентни антитела, препаратът се промива в буфериран изотоничен разтвор на натриев хлорид за 10-15 минути, последвано от изплакване в дестилирана или течаща вода за 10 минути. Изсушава се при стайна температура и се изследва под флуоресцентен микроскоп, като се използва маслена имерсионна система.
За да се оцени интензивността на специфичната флуоресценция на бактериалните клетки, се използва скала от четири плюс: "++++", "+++" - много ярка и ярка; "++", "+" - изразена и слаба колонна зелена флуоресценция на клетките. Задължителни са три контроли: 1) третиране с флуоресцентни антитела на хомоложни бактерии (положителна контрола); 2) хетероложна култура (отрицателна контрола); 3) незаразен материал (отрицателна контрола).
Антикомплементарна RIF. Реакцията е модификация на CSC, при която антикомплементарни антитела, белязани с FITC, служат като индикаторна система (фиг. 10).
Индиректният антикомплементарен RIF се настройва по следния начин: антигенният препарат се приготвя върху предметно стъкло, както при RIF, но в етап I се обработва не с един имунен серум, а със сместа му с комплемент от морско свинче, а в етап II с антисерум, съдържащ маркирани с FITC антитела за допълване. Широкото използване на анти-комплементарни RIF е ограничено от трудността за получаване на анти-комплементарни антитела и начина, по който те са "етикетирани".