Kako se vrši IF analiza? ELISA analiza: šta je to? zašto je to potrebno? prednosti i mane metode

ELISA analiza - šta je to? Puni naziv ove dijagnostičke metode naziva se enzimski imunoesej, a zasniva se na određivanju u perifernoj krvi antitijela različitih klasa, odnosno imunoglobulina, koje proizvodi ljudski organizam.

U praksi liječnika ELISA analiza zauzima vrlo važno mjesto kada je potrebno dijagnosticirati bilo koju zaraznu patologiju. Ova analiza pokazuje ne samo činjenicu prisutnosti zarazne bolesti, već i stadij patološkog procesa. Također, ne samo u odnosu na patogen, ELISA metoda je indicirana za upotrebu: koristi se za dijagnosticiranje alergijskih stanja. Ovaj test vam omogućava da identifikujete probleme u imunološkom sistemu, uz mnoge bolesti hematopoetskog sistema, autoimune i druge poremećaje.

Zašto je potrebna ELISA?

Svi istraživači su skloni vjerovanju da je naziv "antitijelo" previše loše odabran. Ali ipak, to odražava jednu važnu osobinu imunoglobulina: oni su u stanju da vežu i neutraliziraju štetne tvari, približavajući im se poput "ključa" za "bravu". Količina antitijela u krvi ne odražava samo ukupnu sposobnost tijela da se brani od infekcija, već i sposobnost formiranja cirkulirajućih imunoloških kompleksa, koji se mogu javiti kod raznih autoimunih bolesti, kao što su reumatoidni artritis ili ankilozantni spondilitis.

Kompleksi antitijela s antigenom (štetni faktor zarazne prirode) rezultat su odgovora tijela na uvođenje "stranaca". Zbog toga imuni sistem uči da ih prepozna, uz pomoć limfocita trenira imunokompetentne ćelije, a one su u stanju da proizvode visoko specifična antitela. Dakle, antitijela na Epstein virus su raspoređena drugačije od antitijela na virusni hepatitis C, ili na E. coli, i anti-HAV, ili antitijela na virus hepatitisa A, drugačije od autoantitijela na hrskavično tkivo. Visoka specifičnost i korespondencija imunoglobulina sa infektivnim patogenom čini takvu laboratorijsku studiju kao što je enzimski imunotest krvi visoke vrijednosti.

Nakon snažnog povezivanja antitijela i antigena u jedan kompleks (antigen-antitijelo), štetni faktori gube sposobnost oštećenja tjelesnih tkiva, a zatim se ti kompleksi ili neutraliziraju ili liziraju fagocitozom od strane neutrofila, i, "svareni", napuštaju tijelo.

ELISA test krvi može pokazati s kojim specifičnim patogenim faktorom se naše tijelo suočava, u kojoj je fazi interakcija tijela sa infekcijom. Nakon studije, liječnik može sa visokim stupnjem sigurnosti napraviti prognozu, propisati određene vrste liječenja, au nekim slučajevima čak i odrediti životni vijek pacijenta, posebno kod kroničnih virusnih infekcija, kao što je virusni hepatitis C.

Ali u nekim slučajevima u tijelu uopće nema infektivnih agenasa, a antitijela "greškom" napadaju vlastite organe i tkiva, budući da su imunokompetentne stanice dobile lažne informacije. Takve bolesti se nazivaju autoimune, a enzimski imunotest također pomaže u prepoznavanju ove kronične patologije i pomaže u dijagnozi.

Više o imunoglobulinima

Ukupno, ljudsko tijelo proizvodi 5 poznatih klasa antitijela, koje su označene Ig(što je skraćenica od imunoglobulina), koji pripadaju klasama A, M, G, E i D. Svi su od velikog značaja u interpretaciji rezultata ELISA - analize. Naravno, kompleksa je mnogo više, a još nisu svi otvoreni. Ali u dijagnostici raznih bolesti, prve tri vrste antitijela su najvrednije. ELISA test krvi koristi maksimum informacija: trenutak pojave antitijela u krvi, promjenu njihove koncentracije ovisno o vremenu, vrijeme nestanka i vrstu specifičnih antitijela.

Dakle, učesnici primarnog, akutnog infektivnog procesa su imunoglobulini klase M, koji uvek ukazuju na akutnu fazu, čak i kada je klinički tok bolesti izbrisan. Tipičan primjer je anikterični oblik akutnog virusnog hepatitisa B ili C. Enzimski imunosorbentni test na hepatitis će pokazati da osoba ima akutni hepatitis i simptome kao što su bol u hipohondrijumu, suha usta, bolovi u zglobovima i druge ne- specifični simptomi postaju lako razumljivi.

Nekoliko sedmica kasnije, ova antitijela se nalaze u koncentracijama koje sve više nestaju, popuštajući imunoglobulinima klase G. U krvi se određuju mjesecima, pa čak i godinama, i ukazuju na oporavak, a zatim mogu ostati doživotno, formirajući jak imunitet. Ovo ukazuje na snažnu odbranu od antigena patogena. Dakle, antitijela ove klase čine osobu imunom na ponovljene slučajeve antraksa i kuge. Ali postoje slučajevi kada ova antitijela ne ometaju svoje štetno djelovanje u prisustvu antigena. U ovom slučaju možemo govoriti o povećanju aktivnosti kroničnog procesa.

Prije svega, morate shvatiti da ne postoji takva analiza - "samo krv za ELISA". Postoji analiza na hepatitis, ponekad na ureaplazmu, ili na sifilis. Dakle, davanje krvi za ELISA može biti samo ciljano, "naručujući" potragu za željenom infekcijom. Baš je neshvatljivo zašto darivati ​​krv iz vene, ne znajući šta da tražim. Zato je metoda enzimske imunoeseje moćno sredstvo koje je važno u dijagnostičkoj potrazi. Samo liječnik može propisati ovu analizu, jer on namjerno traži infekciju koju karakterišu ovi simptomi. Obična osoba, naravno, može naručiti 150 ELISA testova krvi za "sve infekcije", ali to bi bio nerazuman i skup pristup dijagnozi, uzimanje testova za sve.

Imenovanje ovih analiza je najtraženije kod sledećih bolesti i stanja:

Razne mikrobne i virusne infekcije, simptomi zaraznih bolesti - osip, groznica, žutica, otečeni limfni čvorovi, sindrom dijareje, sumnja na polno prenosive bolesti.

ELISA tehnika pomaže u određivanju ureaplazme i mikoplazme, sifilisa i klamidije, tuberkuloze i citomegalovirusne infekcije, herpesa, virusnog hepatitisa i Epstein-Barr virusa. Trenutno se oko 500 različitih infekcija može potvrditi metodom enzimskog imunotestiranja,

Ako sumnjate na helmintičku invaziju i prisutnost simptoma kao što su alergije, eozinofilija u krvi, svrab, dispepsija i gubitak težine,

Prilikom identificiranja alergena koji uzrokuju Quinckeov edem, urtikariju, otežano disanje i napade astmatičnog gušenja.

U ovom slučaju se otkrivaju specifični Ig E, a postoje i cijeli alergo paneli koji će pomoći da se precizno odredi alergen - lignje ili škampi, suha hrana za ribe koja sadrži dafnije, kućnu prašinu. Kod peludne groznice, ova metoda vam omogućava da pronađete upravo žitarice, grm ili drvo koje uzrokuje proljetno kihanje i suzenje,

  • Ova metoda je indicirana kod sumnje na autoimune bolesti koje liječe reumatolozi,
  • Ako se sumnja na rast i aktivnost tumora,
  • U kompleksnoj dijagnostici stanja imunodeficijencije i HIV infekcije,
  • Kod bolesti krvi i kod transplantacije, za sveobuhvatnu procjenu imuniteta, na primjer, prije transplantacije jetre ili bubrega.

Sada znamo zašto morate donirati krv za ELISA test. Hajde da saznamo kako se ovo istraživanje provodi.

Kako se vrši analiza?

Klasični materijal je venska krv pacijenta. Ali ako je potrebno, možete pregledati širok spektar tečnosti i tkiva: sluz, pljuvačku, cervikalni sekret, likvor, staklasto tijelo oka, sadržaj pupčane vrpce i plodove vode. Važno je zapamtiti da uzimanje raznih lijekova, prekomjerna fizička aktivnost, zloupotreba alkohola mogu u velikoj mjeri iskriviti rezultate testova.

Postoji nekoliko metoda koje omogućavaju provođenje ove analize. Najčešće se u kliničkim laboratorijama koristi fotometrijska metoda. U ovom slučaju koriste se tvari označene bojom, nakon čije reakcije i obilježavanja kompleksa antigen-antitijelo, njihova se boja mijenja. Kao rezultat, mijenja se i optička gustoća otopine, a ta promjena je direktno proporcionalna koncentraciji otkrivenih antitijela. Laboratorijski spektrofotometri se uspješno koriste za mjerenje ovih odstupanja.


Također, za provođenje ELISA-e koristi se fluorimetrijska metoda, čija je osnova fluorescencija. I ovdje se izračunava intenzitet fluorescentnih supstanci koje su se taložile na ispitivanim uzorcima.

Konačno, u imunotestovima se koriste elektrohemijske metode za određivanje aktivnosti enzima, koji su specifične oznake za antigene i antitijela. Sama ELISA metoda najčešće uključuje korištenje enzima kao što su alkalna fosfataza, peroksidaza hrena i galaktozidaza. Ovi enzimi su sposobni da se vežu za antitela ili antigene i obeleže ih zbog svoje aktivnosti.

Nedostaci metode i njene prednosti

Očigledne "prednosti" uključuju demokratsku cijenu analize, mogućnost njenog skrininga u velikim grupama stanovništva, na primjer, prilikom pregleda trudnica na HIV. Metoda enzimskog imunotestiranja je prilično specifična i može se koristiti za kontrolu kvalitete liječenja mnogih bolesti. Važno je da se analiza pripremi brzo, te da bude jednostavna i sigurna za pacijenta.

Međutim, postoje mnoge zamke. Dakle, ako se imunoglobulini ne otkriju, onda to ne znači 100% odsustvo bolesti. Zaista, u pozadini imunodeficijencije, tijelo jednostavno možda nije "snažno" za sintezu antitijela. Ako pacijent ima ozbiljno zatajenje jetre, tada jetra jednostavno nije u stanju sintetizirati protein - građevinski materijal za antitijela. U ovom slučaju, rezultat se naziva seronegativnim, a potvrda infekcije potrebna je direktnom i najnaprednijom metodom istraživanja - PCR, odnosno lančanom reakcijom polimeraze. Za razliku od enzimskog imunosorbentnog testa, ova metoda ne otkriva reakciju organizma na infektivni proces (koji može biti neispravan ili potpuno odsutan), PCR direktno utvrđuje nasljedni materijal ili se pronalazi sam patogen.

- moderna laboratorijska studija, tokom koje se traže specifična antitela u krvi ili antigeni za određene bolesti kako bi se identifikovala ne samo etiologija, već i stadijum bolesti. ELISA rezultati se mogu izdati kvalitativno i kvantitativno.

Trenutno se ELISA koristi u sljedećim situacijama:

1) Traženje specifičnih antitela na bilo koju zaraznu bolest;
2) traženje antigena bilo koje bolesti (zarazne, venerične bolesti);
3) proučavanje hormonskog statusa pacijenta;
4) pregled tumorskih markera;
5) pregled na prisustvo autoimunih bolesti.

Prednosti ELISA metode:

1) Visoka specifičnost i osjetljivost ELISA metode (više od 90%).
2) Sposobnost utvrđivanja bolesti i praćenja dinamike procesa, odnosno poređenja količine antitela u različitim vremenskim intervalima.
3) Dostupnost ELISA dijagnostike u bilo kojoj medicinskoj ustanovi.

Relativni nedostatak:

1) Identifikacija imunološkog odgovora (antitijela), ali ne i samog patogena.

Osnovni koncepti

Prije nego što razjasnimo suštinu ELISA metode, ukratko razumijemo neke koncepte.
Antitijela (ili imunoglobulini - Ig) - specifični proteini koje proizvodi B -
limfociti (imune ćelije) kao odgovor na gutanje bilo kojeg infektivnog patogena (virusa, bakterija, gljivica, itd.). Postoje imunoglobulini A (IgA), imunoglobulini E (IgE), imunoglobulini M (IgM), imunoglobulini G (IgG), imunoglobulini D (IgD). Međusobno se razlikuju po molekularnom obliku i masi, poluživotu, učešću/nesudjelovanju u infektivnim procesima, vremenu otkrivanja od trenutka infekcije. Ako uzmemo u obzir molekularnu težinu, onda je najviše IgM ima - to je pentamer (950 000 daltona), za razliku od ostatka Ig (od 150 do 200 000 Da), zbog kojeg IgM jednostavno ne može proći kroz placentnu barijeru. Stoga je otkrivanje IgM kod djeteta od 1 godine uvijek znak infekcije u fetusu. U krvnom serumu najveći dio imunoglobulina predstavlja IgG (75-85%), a najmanji IgE (0,003%). U infektivni proces direktno su uključeni samo IgA, M, G. IgE su znak alergijskih reakcija i bolesti, a IgD se nalazi samo u tkivu limfnih čvorova i krajnika, igra ulogu u formiranju lokalnog imuniteta.

Antigeni - makromolekularne supstance organskog porekla, posebno uzročnici zaraznih i drugih bolesti, kao i supstance različitih izmenjenih ćelija koje nastaju u određenoj bolesti (autoimune bolesti, onkologija).

imuni kompleks - kompleks antigen-antitijelo uključen u imunološki proces.

Šta je osnova ELISA metode.

Postoji nekoliko tipova ELISA (direktna, indirektna, blokirajuća metoda, kompetitivna), međutim u praksi se najčešće koristi heterogeni imunoesej čvrste faze ili ELISA (enzimski imunosorbentni test).

Osnova enzimskog imunosorbentnog testa je imunološka reakcija antigena i antitijela sa stvaranjem imunološkog kompleksa: antigen-antitijelo, što rezultira promjenom enzimske aktivnosti specifičnih oznaka na površini antitijela.

Jednostavno rečeno, ovaj proces se može podijeliti u nekoliko faza:

1) Na površini jažica tablete doktora koji vrši pregled nalazi se pročišćeni antigen određenog patogena. Kada se doda biološki materijal (krvni serum) pacijenta, dolazi do specifične reakcije između ovog antigena i željenog antitijela (imunoglobulina). Ovo jedinjenje će djelovati kao "poseban antigen" u sljedećem koraku.

2) U ovoj fazi se odvija formiranje IR (imunih kompleksa) - reakcija između "posebnog antigena" i konjugata (ovo je imunoglobulin označen enzimom peroksidazom). Dodat je poseban hromogen. Rezultat takve enzimske reakcije je stvaranje obojene tvari u jažici tablete, čiji intenzitet boje ovisi o količini imunoglobulina (antitijela) sadržanih u materijalu pacijenta.

3) Zatim se evaluira rezultat: fotometrija pomoću višekanalnog spektrofotometra, poređenje optičke gustine ispitivanog materijala sa optičkom gustinom kontrolnih uzoraka, matematička obrada rezultata. Količina antitela kod pacijenta direktno zavisi od visine optičke gustine date jažice.

U praksi se obično koriste ploče sa 96 jažica.

Prilikom mjerenja optičke gustoće (OD) tečnosti za testiranje, izračunava se broj (ili koncentracija) antitijela u određenoj jedinici volumena. Rezultat se zatim upoređuje sa kontrolnim uzorkom.

Morate zapamtiti:za svaki sistem ispitivanja razvijaju se pojedinačni indikatori koji uzimaju u obzir rezultate, indikatore norme i patologije (odnosno „referentne vrijednosti“). Ovo treba uzeti u obzir prilikom evaluacije rezultata svake konkretne studije. Nije ispravno tumačiti rezultate jednog laboratorija iz "referentnih vrijednosti" drugog laboratorija. Takođe je netačno međusobno upoređivati ​​rezultate različitih laboratorija.

Prilikom postavljanja ELISA reakcija važan je i koncept kao što je avidnost antitijela.
Avidnost antitela - ovo je snaga veze antitelo-antigen i količina antigena koja je u vezi sa imunoglobulinima (antitelima). Avidnost je od velikog značaja u proceni očekivanog trajanja infekcije, što je izuzetno važno u dijagnostici primarne infekcije kod trudnica.

Osnova testa avidnosti antitijela sastoji se od tretiranja imunološkog kompleksa (antigen-antitijelo) otopinom uree za uništavanje proteina. Visoko avidne veze ostaju netaknute, dok su veze niske avidnosti uništene. Rezultat je dat kao indeks avidnosti, izražen u procentima (%).

Koje se bolesti otkrivaju ELISA dijagnostikom?

2. Markeri autoimunih bolesti i indikatori imuniteta ljudi(ukupni IgE, ukupni IgG, ukupni IgA, ukupni IgM, ukupni IgD, sekretorni IgA, IgG 2, IgG4, CEC-cirkulacijski imuni kompleksi, IgA i IgG na glijadin i drugi)

3. Onkološki markeri(TNF - faktor nekroze tumora, CEA - kancer-embrionalni antigen, PSA - prostata-specifični antigen, HCG - korionski gonadotropin, CA 125, alveomucin i mnogi drugi)

4. Reproduktivni poremećaji I (estradiol, progesteron, prolaktin, testosteron, AFP-alfafetoprotein, FSH - folikulostimulirajući hormon i drugi)

5. Bolesti štitne žlijezde(slobodni i vezani T3, T4, tireoglobulin, tireperoksidaza - TPO, tireostimulirajući hormon - TSH).

Ova lista nije predstavljena svim bolestima koje se dijagnosticiraju uz pomoć enzimskog imunotesta.

Materijal za ELISA analizu i pravila za njegovo prikupljanje

Najčešći materijal za ELISA reakciju je pacijentov krvni serum, uzet na prazan želudac. Materijal može poslužiti i kao likvor, amnionska tečnost, sadržaj staklastog tijela, sluz cervikalnog kanala i uretre, brisevi.

Priprema pacijenata za isporuku materijala za ELISA

Vrijeme proizvodnje ELISA

Imunoenzimska analiza materijala se vrši brzo, u roku od jednog dana. Kašnjenja mogu biti u različitim laboratorijama zbog nakupljanja određene količine seruma.

Mogući rezultati ELISA dijagnostike

Pri procjeni rezultata za specifične infekcije bitna je klasa otkrivenih antitijela i njihov broj. Ovo određuje ne samo pitanje etiologije infekcije (bilo da jeste ili ne), već i očekivani stadij bolesti (akutni, kronični), kao i prisutnost aktivne infekcije (akutna ili egzacerbacija kronične) u vreme pregleda.

Koje je otprilike vrijeme pojave antitijela (imunoglobulina - Ig)?

Najranija antitela su IgM. Mogu se otkriti 1-3 sedmice nakon moguće infekcije, što karakterizira akutnu fazu infektivnog procesa. Druga situacija za pojavu IgM antitijela je aktivacija (ili egzacerbacija) kroničnog procesa. IgM antitijela cirkuliraju u prosjeku oko 3 mjeseca, a zatim njihov broj postepeno nestaje. Međutim, kod nekih pacijenata, količine IgM u tragovima mogu se otkriti unutar 1-2 godine od infekcije.

Moderni test sistemi su visoko osjetljivi, što rezultira nespecifičnim lažno pozitivnim rezultatima (često kod trudnica). Stoga kod ove grupe pacijenata treba ponovo provjeriti pozitivan IgM!

IgA antitijela se pojavljuju 2-4 sedmice nakon infekcije, ali u količini dovoljnoj za otkrivanje - nakon mjesec dana. Serumski IgA sintetiziraju plazma ćelije slezene, limfnih čvorova i sluzokože, sekretorni IgA koncentrirani su na mukoznim membranama kako bi izvršili svoju zaštitnu funkciju - uključeni su u lokalni imunitet.

Od 4. sedmice nakon infekcije počinju se pojavljivati ​​IgG antitijela. Kod većine infekcija njihov titar se postepeno povećava s maksimumom u različito vrijeme (u prosjeku nakon 1,5-2 mjeseca), a zatim titar ostaje na niskom nivou i ukazuje na imunitet. Kod nekih bolesti (mikoplazmoza, klamidija, trihomonijaza) nivo IgG nije visok, značajno opada zbog nedostatka imuniteta kod ovih infekcija.

Opcije za otkrivanje antitijela različitih klasa:

Izolovana detekcija IgM antitijela sugerira primarnu
infekcije.
- Istovremeno otkrivanje IgM i IgG u krvi karakteristično je za primarnu infekciju
u prethodna 2-3 meseca, kao i tokom egzacerbacije hronične bolesti. Stoga, tokom trudnoće, prisustvo IgM nije uvijek znak primarne infekcije.
- Otkrivanje IgG u izolaciji može ukazivati ​​i na imunitet na ovu bolest,
kao i hronične infekcije. U drugoj situaciji bitna je i količina antitijela (titar) i promjena tog titra tokom vremena. Obično se studije provode u intervalima od 2-4-6 sedmica.
- Detekcija samog IgA ili sa IgM ukazuje na primarnu infekciju. At
Očekuje se da će pojava IgA zajedno sa IgG aktivirati hroničnu infekciju (u prosjeku 2 sedmice od trenutka egzacerbacije).

Definicija avidnost IgG antitela je odličan komplementarni korak u dijagnostici primarne infekcije od dugogodišnje infekcije, što ima svoj klinički značaj, prvenstveno u procjeni rizika od intrauterine infekcije fetusa. Otkrivanje niskoavidnog IgG ukazuje na primarnu infekciju i otkriva se u prosjeku 4-6 mjeseci nakon infekcije, rijetko duže. Niski avidni IgG zahtijevaju drugu laboratorijsku potvrdu primarne infekcije (IgM). Visoko izražena antitijela su ili znak hronične bolesti i njenog pogoršanja, ili razvijen imunitet.

Karakteristike kod dojenčadi:kod djece do godinu dana, a ponekad i do 1,5 godine, majčin IgG cirkuliše u krvi do raznih infekcija (odnosno, prodrle su kroz placentu od majke do fetusa tokom fetalnog razvoja). Oni sami po sebi nisu znak prisustva infekcije u sadašnjosti. Ako se IgM otkrije u ovoj dobi (podsjetimo da majčin IgM ne može proći kroz placentu), onda je to znak intrauterine infekcije ili infekcije stečene nakon rođenja.

Kvantitativna ELISA metoda

Rezultat ELISA dijagnostike (pomoću enzimskog imunološkog analizatora) se izdaje u određenim mjernim jedinicama:
- Optička gustina (OD) uzorka je koncentracija specifičnih antitijela po jedinici volumena. Što je veći OD uzorka, to je veća koncentracija antitijela. Neki od rezultata govore o koeficijentu pozitivnosti (PC) – to je ujedno i optička gustoća uzorka.
- Jedinice koncentracije antitijela (nanogram/mililitar ili ng/mL).
- U obliku titara seruma: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 i tako dalje. Dijagnostički titri (po kojima se dijagnostikuje bolest, a ne činjenica infekcije) su različiti za različite bolesti.
- U obliku simbola - "+", "-", "?" (+, ++, +++, ++++).
- U obliku kvalitativne ocjene prema datom kriteriju (pozitivno ili negativno).

Ispravno procijeniti količinu antitijela, varijantu detekcije klase imunoglobulina, i stoga samo liječnik može odrediti stadij bolesti i potrebu za liječenjem.

Ne smijemo zaboraviti da se za bilo koji sistem testiranja razvijaju vlastite "referentne vrijednosti" (varijante norme), ako su prekoračene, dijagnostikuje se određena bolest (varijante patologije). Za različite sisteme ispitivanja, "referentne vrijednosti" su različite.

Ispravno poređenje rezultata ELISA uzetih u dinamici moguće je samo ako su napravljeni u istoj laboratoriji.

Specijalista zarazne bolesti Bykova N.I.

Sadržaj

Savremena dijagnostika nije potpuna bez visoko osjetljivih laboratorijskih testova. Prije toga, kako bi se utvrdio uzrok bolesti i otkrio uzročnik infekcije, liječnici su provodili različite mikroskopske studije u više faza. Danas, da bi se opovrgla ili potvrdila početna dijagnoza, potrebno je uraditi jedini test - enzimski imunoesej (ELISA). Ova laboratorijska studija pomaže u procjeni stanja ljudskog zdravlja i dijagnostici hematoloških, onkoloških, autoimunih, infektivnih patologija.

Šta je enzimski imunotest

Metoda enzimskog imunoeseja je savremena laboratorijska analiza krvi na prisustvo antigena, antitijela na patogene i viruse bolesti u njoj. Metoda ELISA pomaže doktoru da identifikuje etiologiju bolesti, odredi njenu fazu, starost porekla, stepen opasnosti za ljude i izvrši neophodna prilagođavanja lečenja. Češće od drugih, enzimski imunotest ispituje prisustvo antitela grupa M i G. Šta su ona?

Kada patogeni mikroorganizam uđe u krvotok, imunološki sistem uključuje zaštitnu reakciju u obliku oslobađanja antitijela (imunoglobulina). Ove supstance se vezuju za ćeliju i otkrivaju da li je ona deo tela ili je došla izvana. Ako je sistem utvrdio da je mikroorganizam stran, tada se povećava broj antitijela u cilju borbe protiv patogenog virusa. Imunoglobulini (Ig) su nekoliko tipova: neki se pojavljuju u periodu infekcije, drugi ostaju tokom života, razvijajući jak imunitet. Antitijela u medicini se označavaju: A, D, E, M, G.

ELISA metoda ispituje krv, iako postoje i druge vrste enzimskog imunotestiranja. U pravilu se razlikuju po vrsti uzete tekućine, na osnovu čega se dalje proučava sastav i utvrđuje prisustvo antigena. Istovremeno se za istraživanje uzima i ljudska krv i druge tekućine:

  • sadržaj staklastog tijela;
  • sluz iz cervikalnog kanala i uretre;
  • amnionska tečnost;
  • razmazi;
  • cerebrospinalnu tečnost.

Indikacije za termin

  • alergijske reakcije;
  • imunodeficijencija;
  • bolesti virusnog porijekla (hepatitis, herpes, Epstein-Barr virus, citomegalovirus);
  • venerične bolesti, spolno prenosive spolno prenosive bolesti (ureaplazma, sifilis, trihomonas, klamidija, mikoplazma);
  • bolesti jetre;
  • neurosifilis (infektivna lezija centralnog nervnog sistema (centralni nervni sistem)).

Test krvi za ELISA se često radi tokom preoperativnog sveobuhvatnog pregleda kako bi se odredio nivo hormona i procenio kvalitet lečenja. Visoka tačnost dobijenih podataka pomaže doktoru da stekne predstavu o detaljnoj slici zdravstvenog stanja. Istovremeno, rezultati se dobijaju u kratkom vremenskom periodu, što vam omogućava da pratite dinamiku razvoja bolesti.

Prednosti metode

Neosporne prednosti ELISA metode krvi su njena visoka osjetljivost, tj. sposobnost određivanja željene tvari, čak i pri njenoj niskoj koncentraciji; i specifičnost, što podrazumijeva dijagnozu bez greške. Osim toga, ispitivanje krvnog seruma ELISA-om ima sljedeće prednosti:

Nedostaci

Glavni nedostatak enzimskog imunosorbentnog testa je da prilikom provođenja studije liječnik mora unaprijed imati pretpostavku o prirodi bolesti. Prilikom dijagnosticiranja zaraznih bolesti nemoguće je slučajno pronaći patogena i utvrditi njegova svojstva enzimskog imunotestiranja. Test može samo da ukaže na prisustvo antitijela u krvi pacijenta, što indirektno ukazuje na prisustvo štetnog mikroorganizma.

Osim toga, u slučaju kršenja tehnike izvođenja ili nepravilne pripreme, analiza može pokazati lažno pozitivan ili lažno negativan rezultat. Ispitivanje krvnog seruma ELISA je precizna, ali u isto vrijeme i skupa metoda, pa je treba koristiti u ekstremnim slučajevima. Tumačenje rezultata treba vjerovati samo kvalificiranom stručnjaku.

Priprema

Enzimski imunotest treba raditi po preporuci ljekara, jer. na rezultate istraživanja često utiču različiti spoljni faktori. Osnovna pravila za pripremu za ELISA:

  • venska krv se mora uzimati strogo na prazan želudac (obično, posljednji obrok bi trebao biti 12 sati prije studije);
  • uoči analize potrebno je isključiti uzimanje bilo kakvih lijekova (ako pacijent uzima antihistaminike (antialergijske) lijekove, trebate se posavjetovati s liječnikom o tome koliko dugo prije početka ELISA-e treba ih otkazati);
  • pre pregleda je nemoguće pušiti i piti alkoholna pića, jer to će negativno utjecati na rezultat;
  • svakako biste trebali dovoljno spavati prije analize;
  • potrebno je isključiti svaku fizičku aktivnost, faktore stresa;
  • Dijagnoza većine ženskih reproduktivnih hormona zahtijeva uzimanje uzoraka krvi u određenim danima menstrualnog ciklusa.

Kako se to sprovodi

Za provedbu enzimskog imunotestiranja, pacijent uzima krv iz kubitalne vene strogo na prazan želudac. Pacijent mora unaprijed obavijestiti liječnika o prisutnosti bolesti i uzimanim lijekovima kako se rezultati studije ne bi iskrivili. Kao opšte pravilo, sve lekove treba prekinuti 16 dana pre ELISA testa. Osjeti tokom postupka su slični vađenju krvi tokom biohemijske analize.

Materijal se šalje u laboratoriju, gdje se izoluje serum iz krvi u kojoj se nalaze antitijela. Dobiveni sastav se stavlja u epruvetu sa antigenima. To mogu biti različiti alergeni (mlijeko, vuna, polen, agrumi), uzročnici virusnih i zaraznih bolesti i drugi. Nakon primitka reakcije, sav preostali serum se iscijedi. Uz pomoć posebnih indikatora, stručnjaci određuju količinu antitijela. Vrijeme ELISA-e ovisi o laboratoriji. U pravilu se rezultati studije mogu dati u roku od dva dana do sedmice..


ELISA dekodiranje

Enzimski imunološki test pomaže u određivanju prisutnosti antitijela u tijelu. Postoji nekoliko klasa imunoglobulina:

  1. IgM. Prvi se pojavljuju nakon infekcije. Prisustvo ovih antitijela ukazuje na pojavu bolesti u svakom slučaju, jer. kod zdrave osobe ovaj razred izostaje. IgM imunoglobulini su u pravilu prisutni u krvi oko 6 sedmica.
  2. IgA. Antitijela se nalaze u velikim količinama u sluznicama, štiteći tijelo od prodora patogenih mikroba. Ako pacijent ima ovu klasu, potrebno je intenzivnije se boriti protiv bolesti. Uostalom, imunoglobulini A se javljaju samo kod hronične bolesti. Nestanak IgA ukazuje na uništenje infekcije.
  3. IgG. Imunoglobulini ove klase ukazuju na to da je osoba ili nosilac infekcije ili da je već imala bolest. Ova antitijela se proizvode nakon IgM mjesec dana nakon infekcije. Imunoglobulini klase G mogu biti prisutni u organizmu 5-6 godina, štiteći ga od ponavljanja bolesti, a kod sifilisa su takva antitijela doživotna.

Prilikom provođenja ELISA analize u djetinjstvu (do 1,5 godine), treba imati na umu da krv djeteta sadrži majčina IgG antitijela na infekcije. Iako to ne znači da je beba bolesna, već je ta činjenica norma. Prisutnost klase M ukazuje na intrauterinu ili stečenu infekciju nakon rođenja, tk. majčina IgM antitela nisu u stanju da prodru u telo deteta kroz placentu. Dekodiranje mogućih kombinacija prisutnosti ili odsustva antitijela 3 klase prikazano je u tabeli:

ELISA rezultate treba tumačiti kvalifikovani ljekar. Po pravilu, (+) označava pozitivan ishod analize, a (-) negativan. Rezultat, koji pokazuje odsustvo ili prisustvo supstance, naziva se kvalitativnim. Ponekad je dopunjen kvantitativnim, koji prikazuje broj različitih supstanci u tijelu. Često testni sistem ima svoje referentne (korelativne) vrijednosti. Prekoračenje takvih pokazatelja znači prisutnost patologija kod pacijenta.

Kontraindikacije

Nije bilo kardinalnih kontraindikacija za enzimski imunotest. Ponekad tokom trudnoće, kada pacijentkinja ima stalnu promjenu hormona u krvi, može biti potrebna ponovljena analiza za pouzdaniji rezultat. Dijagnostička metoda se ne preporučuje za korištenje nakon:

  • hirurške intervencije;
  • hemoliza (uništenje crvenih krvnih zrnaca);
  • transfuzije krvi;
  • uzimanje punkcije ili biopsije biološkog materijala.

Cijena enzimskog imunotesta

Cena ELISA studije zavisi od politike zdravstvene ustanove, vrste analize i antigena koji se utvrđuje, jer na osnovu ovih faktora izračunava se cijena kompleta reagensa i utvrđuje složenost studije. U pravilu, enzimski imunotest je javno dostupna procedura, prosječna cijena metode varira od 300 do 2000 rubalja. Približne cijene za enzimski imunotest u Moskvi prikazane su u tabeli:

Video

Savremene dijagnostičke metode omogućuju identifikaciju određene bolesti u laboratoriju uz pomoć posebnih testova. Jedan od njih bi trebao uključivati ​​enzimski imunotest, putem kojeg možete potvrditi preliminarnu dijagnozu.

ELISA je jedna od najefikasnijih i najsavremenijih metoda za otkrivanje poremećaja povezanih sa imunološkim i hormonskim poremećajima, kao i onkološkim procesima. Tokom analize u krvi mogu se otkriti antitijela koja nastaju kada postoji infekcija u tijelu. S obzirom na ovu nijansu, moguće je otkriti bolest čak iu vrlo ranoj fazi njenog razvoja.

Šta je osnova metodologije

Rezultati ELISA analize zasnivaju se na prijemu hemijskih reakcija na enzime koji služe kao posebne identifikacione oznake za prepoznavanje antitela. Zbog toga, tokom imunohemijskih reakcija, antitela počinju da stupaju u interakciju sa nekim antigenima. Sve ovo daje osnovu za tvrdnju da su lažni rezultati pri davanju krvi za ELISA minimalni.

Studija vam omogućava da odredite broj imunih ćelija, njihova svojstva, kao i prisustvo potrebnih antitijela

Pozitivan rezultat se smatra kada se otkrije boja otopine. Boja ukazuje da antigeni stupaju u interakciju s antitijelom. U slučaju da se ništa slično ne dogodi, rezultat je negativan.

Samoilikov Pavel Vladimirovič pripravnik Odeljenja za kliničku laboratorijsku dijagnostiku

Ruski državni medicinski univerzitet

Metode imunotestiranja postale su široko korištene u medicinskoj praksi. U svim oblastima moderne medicine imunotest se koristi, uglavnom u dijagnostičke i analitičke svrhe. Posebno je važno što omogućavaju identifikaciju bioloških komponenti (hormoni, enzimi, neuropeptidi, proizvodi imunog sistema, antigeni itd.) u niskim i vrlo niskim koncentracijama. Ovim metodama otkrivaju se svi proizvodi protiv kojih je moguće dobiti antitijela.

Imunološka analiza se zasniva na interakciji antigena (AG) i antitela (AT) korišćenjem različitih opcija obeležavanja za jednu od komponenti (enzim, radionuklid, fluorescentna boja i druge). Evaluacija reakcije se vrši automatski na posebnoj opremi, što omogućava standardizaciju ovih metoda.

U zavisnosti od vrste oznake koja se koristi i uslova za postavljanje testa, imunotest se naziva enzimski imunoesej (ELISA), radioimunotest (RIA), imunofluorescencija i drugi. Kada se reakcije odvijaju u jednoj ili više faza, one se označavaju kao direktne ili indirektne. Bitan je medij u kojem se reakcija odvija. Ako se reakcija provodi s reagensima fiksiranim na površini, tada se test označava kao test čvrste faze, na primjer, ELISA (enzimski imunosorbentni test).

U ovom radu će se razmatrati samo enzimski imunotest – metoda koja se široko koristi u biologiji i medicini, kako praktična tako i fundamentalna.

ELISA se pojavila sredinom 60-ih i prvobitno je razvijena kao metoda za identifikaciju antigena u histološkom preparatu, kao i za vizualizaciju linija precipitacije u imunodifuzijskom testu i imunoelektroforezi, a zatim se počela koristiti za kvantitativno određivanje antigena i antitela u biološkim tečnostima. U razvoju metode su učestvovali E. Engvall i R. Pelman, kao i, nezavisno od njih, W. Van Veeman i R. Schurs.

Slika 1. Osnovni princip ELISA.

1) Za otkrivanje antigena. 2) Za otkrivanje antitela.

Metoda se zasniva na specifičnom vezivanju antitela za antigen, dok se jedna od komponenti konjuguje sa enzimom, a kao rezultat reakcije sa odgovarajućim hromogenim supstratom nastaje obojeni proizvod čija se količina može određena spektrofotometrijski (slika 1).

Otkriće mogućnosti imobilizacije antigena i antitijela na različitim nosačima uz zadržavanje njihove aktivnosti vezivanja omogućilo je proširenje primjene ELISA-e u različitim poljima biologije i medicine.

Pojava monoklonskih antitijela poslužila je kao daljnji razvoj ELISA-e, što je omogućilo povećanje njene osjetljivosti, specifičnosti i ponovljivosti rezultata.

Teoretski, ELISA se zasniva na podacima savremene imunohemije i hemijske enzimologije, poznavanju fizičko-hemijskih zakona reakcije antigen-antitelo, kao i na osnovnim principima analitičke hemije. Osetljivost ELISA i njeno trajanje određuju nekoliko glavnih faktora: kinetičke i termodinamičke karakteristike reakcije antigen-antitelo, odnos reagensa, aktivnost enzima i rezolucija metoda njegove detekcije. Općenito, reakcija antigen-antitijelo može se opisati jednostavnom shemom:

+[AG]↔[ATAG]

Raznolikost predmeta proučavanja, od jedinjenja male molekularne težine do virusa i bakterija, kao i neobično širok spektar zadataka povezanih s različitim uvjetima za korištenje ELISA-e, određuju razvoj izuzetno velikog broja varijanti ove metode. .

Svaka varijanta ELISA-e sadrži 3 obavezne faze:

1. faza prepoznavanja ispitivanog jedinjenja od strane antitela koje je specifično za njega, što dovodi do stvaranja imunog kompleksa;

2. faza formiranja veze konjugata sa imunološkim kompleksom ili slobodnim veznim mjestima;

3. faza pretvaranja enzimske oznake u registrovani signal.

Klasifikacija ELISA metoda zasniva se na nekoliko pristupa:

1. Prema vrsti reagensa prisutnih u prvoj fazi ELISA-e, razlikuju se kompetitivne i nekonkurentne metode.

A) U kompetitivnoj ELISA testu, u prvoj fazi, sistem sadrži i analizirano jedinjenje i njegov analog, obeležen enzimom i takmičeći se za specifična mesta vezivanja sa njim.

B) Za nekonkurentne metode karakteristično je prisustvo u sistemu u prvoj fazi samo analiziranog jedinjenja i za njega specifičnih centara vezivanja.

2. Sve ELISA metode se dijele na homogene i heterogene.

Ako se sva tri etapa ELISA provode u rastvoru i između glavnih faza nema dodatnih faza odvajanja formiranih imunoloških kompleksa od neizreagovanih komponenti, metoda spada u grupu homogenih.

Osnova homogene ELISA, koja se obično koristi za određivanje supstanci male molekularne težine, je inhibicija enzimske aktivnosti kada se kombinuje sa antigenom ili antitijelom. Aktivnost enzima se obnavlja kao rezultat reakcije antigen-antitijelo.

Kada se antitijelo veže za antigen koji sadrži enzimsku oznaku, aktivnost enzima je inhibirana za 95% u odnosu na supstrat visoke molekularne težine, što je zbog sterične isključenosti supstrata iz aktivnog centra enzima. Kako se koncentracija antigena povećava, veže se više antitijela i zadržava se više slobodnih konjugata antigen-enzim koji mogu hidrolizirati supstrat visoke molekularne težine. Analiza se radi vrlo brzo, za jedno određivanje potrebna je 1 minuta. Osetljivost metode je prilično visoka. Pomoću njega možete odrediti tvar na nivou pikomola.

Za heterogene metode tipično je izvođenje analize u dvofaznom sistemu uz učešće čvrste faze - nosača i obaveznu fazu odvajanja imunih kompleksa od neizreagiranih komponenti (ispiranje) koje su u različitim fazama (formirane imuni kompleksi su na čvrstoj fazi, a neizreagovani kompleksi su u rastvoru). Heterogene metode, u kojima se formiranje imunih kompleksa u prvoj fazi odvija na čvrstoj fazi, nazivaju se metode čvrste faze.

Metode se klasifikuju kao homogeno-heterogene, ako se u 1. fazi - formiranje specifičnih kompleksa javlja u rastvoru, a zatim se za razdvajanje komponenti koristi čvrsta faza sa imobilisanim reagensom.

3. Prema principu određivanja ispitivane supstance:

A) Direktno određivanje koncentracije supstance (antigena ili antitijela) prema broju centara vezivanja koji s njom djeluju. U ovom slučaju, oznaka enzima će biti u rezultirajućem specifičnom AG-AT kompleksu. Koncentracija analita će biti direktno proporcionalna registrovanom signalu.

B) Određivanje koncentracije supstance razlikom između ukupnog broja veznih mjesta i preostalih slobodnih veznih mjesta. U tom slučaju će se koncentracija analita povećati, a snimljeni signal smanjiti, stoga u ovom slučaju postoji inverzna ovisnost o veličini snimljenog signala.

Enzimi.

Enzimske oznake imaju izuzetno snažan katalitički učinak; jedan molekul enzima može reagirati s velikim brojem molekula supstrata. Dakle, enzim prisutan u zanemarivim količinama može se otkriti i kvantificirati stvaranjem proizvoda, reakcijom koju katalizira. Još jedna prednost korištenja enzima kao oznaka je zbog prisutnosti u molekuli brojnih funkcionalnih grupa (sulfhidril, karboksil, tirazinski ostaci, itd.), preko kojih se molekuli liganda mogu kovalentno vezati.

Enzimski markeri koji se koriste u ELISA-i treba da imaju sljedeća svojstva:

– visoka aktivnost i stabilnost enzima u uslovima analize, tokom modifikacije iu konjugaciji sa antitelima ili drugim proteinima;

– prisutnost osjetljivih supstrata i jednostavnost metode za određivanje produkata ili supstrata enzimske reakcije;

– mogućnost prilagođavanja supstratnih sistema daljem ojačavanju;

- odsustvo enzima i njegovih inhibitora u ispitivanoj biološkoj tečnosti.

ELISA može koristiti najmanje 15 različitih enzima. Najveću primenu, u skladu sa navedenim zahtevima, našla je peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza (AP) i β-D-galaktozidaza (tabela 1). Sva tri su stabilna i katalizuju vrlo osjetljive reakcije. Osim toga, proizvodi koji nastaju reakcijama kataliziranim ovim enzimima, ovisno o korištenom supstratu, mogu se detektirati ne samo kolorimetrijskim metodama, već i fluorescentnim metodama. Drugi enzimi se koriste mnogo rjeđe. To se objašnjava njihovom nižom specifičnom aktivnošću u odnosu na HRP i AP.

Podloge.

Izbor supstrata prvenstveno je određen enzimom koji se koristi kao oznaka, budući da je reakcija enzim-supstrat vrlo specifična.

Osnovni zahtjevi za podlogu:

– obezbeđivanje visoke osetljivosti metode u detekciji enzima u konjugatu;

– formiranje dobro definiranih (na primjer, obojenih) proizvoda reakcije enzim-supstrat;

– podloga mora biti sigurna, jeftina, pristupačna i pogodna za upotrebu.

Tabela 1.

Enzimi i njihovi supstrati se najčešće koriste u ELISA testu.

Češće se koriste kromogeni supstrati, koji, kada se unište, formiraju obojenu tvar. Obećavajuća je upotreba visokoenergetskih supstrata - fluorescentnih, hemiluminiscentnih. Upotreba takvih supstrata teoretski omogućava povećanje osjetljivosti ELISA-e za dva reda veličine.

Antigeni i antitela.

AG i AT koji se koriste u ELISA-i trebaju biti visoko pročišćeni i visoko aktivni. Pored toga, AG treba da ima visoku antigenost, optimalnu gustinu i broj antigenskih determinanti, stranost i homogenost. Mnogi sintetički i rekombinantni antigeni virusa i bakterija su se dobro pokazali kada se koriste u ELISA testu. Ovo je značajno povećalo specifičnost i reproduktivnost metode minimizirajući unakrsne reakcije.

Jedan od najvažnijih reagensa u ELISA testu su antitela. ELISA osjetljivost ovisi o koncentraciji, aktivnosti i specifičnosti korištenih antitijela. Korištena antitijela mogu biti poli- ili monoklinalna, različite klase (IgG ili IgM) i podklase (IgGl, IgG2), antialotipska ili antiidiotipska. Kod niskog AT afiniteta, raspad AG-AT kompleksa dovodi do uklanjanja vezanog AG iz sistema. Osetljivost i specifičnost metode je poboljšana upotrebom monoklonskih antitijela. U tom slučaju postaje moguće detektovati niske koncentracije AG (AT) u ispitivanim uzorcima.

Formiranje konjugata

Konjugat je antigen ili antitijelo označeno enzimskom oznakom. Formiranje konjugata je jedan od važnih koraka u ELISA testu.

Prilikom formiranja konjugata, takva optimalna metoda za uvođenje enzimske oznake odabire se tako da obje komponente konjugata zadrže svoju biološku aktivnost: enzim - sposobnost interakcije sa supstratom, a antigen ili antitijelo - antigenost i vezanje antigena. aktivnost, respektivno. Prisustvo obilježenog, visoko pročišćenog antigena omogućava korištenje kompetitivnih metoda. U ovom slučaju, aktivnost konjugata koji nije vezan za imobilizirana antitijela može se izmjeriti u završnoj fazi, čime se izbjegava postupak ispiranja i analiza čini praktičnijom. Međutim, antigeni su raznoliki po svojim fizičko-hemijskim svojstvima i strukturi, što znači da je nemoguće razviti univerzalne metode za dobivanje konjugata s antigenom. U ovom slučaju, dobijanje konjugata antigen-enzim predstavlja poseban izazov. Priprema obilježenih antitijela za ELISA metodički je pristupačnija.

Konjugacija enzima sa imunohemijski aktivnim proteinima se vrši različitim metodama: hemijskim umrežavanjem, kovalentnim vezivanjem molekula enzima za AG ili AT i formiranjem jedinjenja preko nekovalentnih veza, na primer, kada se vezuje između enzim i AG ili AT se odvija imunološki, kroz interakciju antigen-antitijelo.

Najrasprostranjenije kovalentne metode za pripremu konjugata. Izbor reakcije vezivanja određen je tipom funkcionalnih grupa dostupnih u ovim proteinskim molekulima. Glutaraldehid, natrijum perjodat, itd. se koriste kao reagensi koji se koriste za uvođenje enzima u molekule antigena i antitela.

Postoje metode u jednom i dva koraka za dobijanje konjugata pomoću glutaraldehida. Mogu se formirati konjugati različitih veličina sa smanjenom enzimskom aktivnošću (15 - 60% slobodnog enzima). Dobiveni konjugat velike veličine može sterički ometati određivanje ispitivane tvari. Konjugati relativno niske molekularne težine sastoje se od Fab fragmenta i jedne molekule enzima.

Kao rezultat dvostepene sinteze, koja se sastoji u postupnoj pripremi enzima prvo modificiranog agensom za umrežavanje, njegovu izolaciju, a zatim njegovu naknadnu interakciju s antigenom (antitijelo), molekule a. formiraju se homogeni sastavi koji sadrže 1-2 molekula enzima po molekuli imunoglobulina i održavaju visoku enzimsku i imunološku aktivnost. Međutim, količina takvih konjugata je mala (za peroksidazu hrena iznosi 5-10%).

Najveću praktičnu primjenu našla je metoda dobivanja konjugata imunoperoksidaze, zasnovana na oksidaciji ugljikohidratne komponente enzima natrijum perjodatom (vezivanje peroksidaze za konjugat dostiže 70-90% početne količine enzima).

Pouzdan konjugat mora imati sljedeća svojstva:

Visok antitijelo tigrasto i visok afinitet za antigen tako da se može koristiti u visokom razrjeđenju i na taj način smanjiti nespecifično vezivanje;

Dovoljna specifičnost u radnom uzgoju;

Prevladavanje monomernih oblika nad polimernim, jer polimerni oblici imaju tendenciju da se nespecifično prianjaju na plastiku, što rezultira visokim pozadinskim nivoom reakcije;

Optimalni molarni omjer između enzima i antitijela (optimalan omjer je oko 1:1);

Dovoljna enzimska aktivnost konjugata. Ovo svojstvo je određeno uglavnom uslovima konjugacije i omjerom molekula enzima i antitijela u konjugatu.

čvrsta faza

Kao čvrsta faza za ELISA test mogu se koristiti različiti materijali: polistiren, polivinil hlorid, polipropilen i druge supstance. Čvrsta faza mogu biti zidovi epruvete, 96 jažica i druge ploče, kuglice, perle, kao i nitroceluloza i druge membrane koje aktivno apsorbuju proteine.

Imobilizacija antigena ili antitijela na čvrstoj fazi moguća je na tri načina:

– pasivna adsorpcija zasnovana na jakim hidrofobnim interakcijama između proteina i sintetičke površine;

– kovalentna vezanost za čvrstu fazu;

– imunohemijski, itd. (nekovalentni i neadsorpcioni spoj).

Pasivna adsorpcija proteina se široko koristi pri provođenju ELISA na titracionim pločama, na nitroceluloznim membranama. Pasivna adsorpcija slijedi princip zasićenja i korelira s molekulskom težinom adsorbirane tvari. Adsorpciona površina membrana različitih tipova (nitroceluloza, najlon, itd.) je 100-1000 puta veća od plastike.

Polisaharidi i visoko glikozilirani proteini često imaju nizak afinitet za polistiren. Za njihovu imobilizaciju potrebne su druge metode, kao što je kovalentno vezivanje glutaraldehidom. Kovalentno vezivanje je efikasno ako se kao čvrsta faza koriste hidrofilne kuglice (agaroza) i polistirenske kuglice.

Imunohemijske metode se zasnivaju na upotrebi prethodno adsorbiranih "zamki" antitijela za imobilizaciju antigena ili antitijela. Imunohemijski imobilisani antigen je 10 puta aktivniji od pasivno adsorbovanog antigena. Mogu se koristiti lektini ili imunoglobulin-vezujući proteini bakterija koji se lako adsorbiraju na plastične ili druge hidrofobne površine, kao što su konkanavalin A (Con A) ili stafilokokni protein A. Con A je u stanju da imobilizira gp 120 protein HIV virusa.

Slobodna mjesta na površini čvrste faze koja se nisu vezala za adsorbirani agens mogu fiksirati druge molekule tokom testa, uključujući konjugate, što dovodi do povećanja pozadinskog signala. Kako bi se spriječilo nespecifično vezivanje nakon imobilizacije na čvrstoj fazi osnovnog materijala, tretman se provodi supstancama koje su neutralne za test. Najpopularniji blokatori su goveđi serumski albumin (BSA), kazein itd. Izbor blokade i uslovi za ovu fazu zavise od vrste čvrste faze, osetljivosti sistema.

Trenutno se koristi veliki broj različitih sorti i modifikacija ELISA-e. Različite varijante enzim-vezanog imunosorbentnog testa (ELISA) postale su široko rasprostranjene.

ELISA u čvrstoj fazi je predložena 1971. Osnovni principi čvrste faze ELISA, bez obzira na modifikacije, su sljedeći:

1. U 1. fazi reakcije, antigeni ili antitela se adsorbuju na čvrstu fazu. U ovom slučaju, reagensi koji nisu vezani za čvrstu fazu lako se uklanjaju ispiranjem.

2. Test uzorak se inkubira u senzibiliziranim jažicama. Pozitivne kontrolne jažice sadrže standardne reagense. U tom slučaju na površini čvrste faze nastaju imuni kompleksi. Nevezane komponente se uklanjaju pranjem.

3. Kada se doda antitijelo-enzim ili konjugat antigen-enzim i veže se za imobilizirani imuni kompleks, aktivno mjesto enzima ostaje dostupno za naknadnu interakciju sa supstratom. Inkubacija supstrata u jažice sa imobilisanim konjugatom dovodi do razvoja reakcije boje. Ova reakcija se može zaustaviti u željenoj fazi, težina bojenja se može procijeniti vizualno ili optičkom gustoćom.

Važan korak u bilo kojoj varijanti analize čvrste faze je postupak ispiranja nevezanih reagensa. Važno je ne samo isprati komponente pričvršćene na čvrstu fazu, već i ukloniti reagense iz cijele dubine sloja. Ovo su faze analize koje zahtijevaju najviše vremena i rada. Uzorci se mogu prati automatski pomoću posebnog uređaja - perača ili ručno, višekanalnom pipetom. Za provođenje ELISA testa potrebno je:

- polistirenske tablete ili druge opcije čvrste faze koje se koriste;

- rastvor za pranje;

– konjugat (enzimski obeleženi antigeni ili antitela);

– mješavina korištenih supstrata;

- rastvor za zaustavljanje (Stop reagens - rastvor za zaustavljanje reakcije);

- uzorke koji se koriste za pozitivnu i/ili negativnu kontrolu;

– standardni antigen (za izradu kalibracione krive);

– jednokanalne i višekanalne pipete;

– podloška (podloška);

– optički uređaj za određivanje optičke gustine test rastvora (ELISA čitač, čitač koji sekvencijalno fotometrira sve bušotine);

- 5-100 µl proučavanog biološkog materijala.

Direktna ELISA

1. Antigeni ili antitela (test materijal) se adsorbuju u jažice panela. Gore je navedeno da se antigeni značajno razlikuju po svojoj sposobnosti da se adsorbiraju na različitim vrstama plastike, ovisno o tome kojoj klasi tvari (proteini, ugljikohidrati ili lipoproteini) pripadaju. Često u direktnoj ELISA-i, antigen imobiliziran na čvrstoj fazi su ćelije i drugi antigeni u obliku čestica.

Kontrola. Kao kontrola koriste se jažice sa adsorbovanim uzorkom pozitivne kontrole, koji obavezno sadrži željeni antigen, i negativni kontrolni uzorak, koji očigledno ne sadrži test antigen. U prisustvu pročišćenog standardnog antigena, reakcija se izvodi u nekoliko razblaženja tako da se može konstruisati kalibraciona kriva.

2. „Blokirajte slobodna mjesta vezivanja koja su ostala na čvrstoj fazi sa kazeinom BSA, itd. (da spriječite nespecifičnu sorpciju konjugata na čvrstoj fazi).

3. Enzimima obeležena antitela ili antigeni (konjugat) se dodaju u jažice i inkubiraju. Vezivanje konjugata za čvrstu fazu će se desiti samo ako su obe komponente sistema komplementarne. Nakon inkubacije s konjugatom, jažice se isperu, čime se uklanja nevezani dio konjugata.

4. Supstrat specifičan za korišćeni enzim se zatim dodaje u jažice i inkubira. Kada se postigne optimalni nivo bojenja u jažicama pozitivne kontrole, reakcija enzima se zaustavlja.

5. Obračunavanje reakcije. Prvo se vizualno uzimaju u obzir rezultati reakcije. Za precizniji prikaz rezultata, intenzitet bojenja se procjenjuje na ELISA čitaču s odgovarajućim svjetlosnim filterom. Prema rezultatima analize, iscrtan je graf zavisnosti optičke gustoće od koncentracije (slika 2).

Slika 2. Direktna ELISA.

a) za otkrivanje antigena; b) za otkrivanje antitela.

Ova varijanta ELISA obično se koristi za otkrivanje specifičnih antitijela. Standardni antigen se adsorbuje u jažice panela i inkubira sa uzorcima seruma ili drugog biološkog materijala dobijenog od pacijenta (likvor, pljuvačka, itd.). Specifična antitela vezana za antigen na čvrstoj fazi detektuju se upotrebom antiglobulinskog konjugata. U zavisnosti od svrhe analize, koriste se različiti antiglobulinski reagensi koji otkrivaju antitela svih izotipova, ili specifična za pojedine klase i podklase imunoglobulina. Glavna prednost metode je univerzalnost konjugata. Isti konjugat se može koristiti za otkrivanje ljudskih antitijela na širok spektar antigena u bilo kojem uzorku. Reakcija je metodički jednostavna.

Glavne faze indirektne ELISA za otkrivanje antitijela:

1. Antigen se adsorbuje na čvrstoj fazi, a zatim ispere sa nevezanih komponenti.

2. Blokirajte slobodne vezne stranice. Opran.

3. Ispitni materijal se dodaje u jažice, inkubira i zatim ispere. Paralelno se stavljaju uzorci sa pozitivnim i negativnim kontrolama.

4. Dodati antiglobulinski konjugat u radnom razblaženju, inkubirati, isprati nevezane komponente.

5. Podloga se unosi, inkubira. Nakon postizanja optimalnog nivoa bojenja u jažicama pozitivne kontrole, reakcija se zaustavlja dodavanjem stop rastvora.

6. Izmjerite količinu produkta reakcije na ELISA čitaču (slika 3).

U optimalnim uslovima ispitivanja, metoda je vrlo specifična i osjetljiva. Omogućava vam da otkrijete nanogramske količine antitijela u serumu ispitivanih pacijenata. Za postizanje zadovoljavajućih rezultata neophodna je standardizacija reagensa i metodologija. Ova varijanta ELISA se takođe može koristiti za testiranje monoklonskih antitela.

Antigeni otkriveni upotrebom ove ELISA varijante moraju imati više epitopa koji se vezuju za antitijela ili moraju imati ponavljajuće, prostorno odvojene epitope iste specifičnosti.

Prilikom izvođenja ove varijante ELISA-e, visoko specifična poli- ili monoklonska antitijela adsorbirana na čvrstoj fazi se inkubiraju sa test uzorkom. Nakon postupka ispiranja, u jažice se dodaju enzimski obilježena antitijela (konjugat) na isti antigen, a zatim se sprovode sve ostale faze reakcije. Efikasnost formiranja specifičnog kompleksa u svakoj fazi analize zavisi od konstante vezivanja reakcije antigen-antitelo.

Glavne faze analize:

1. Monoklonska antitijela ili afinitetno pročišćena poliklonska antitijela su imobilizirana na čvrstoj fazi.

2. Test uzorak se unosi u jažice panela, uzorak pozitivne kontrole i negativan kontrolni uzorak se stavljaju paralelno u različitim razblaženjima. Inkubirano i oprano.

3. Enzimom obeležena monoklonska ili poliklonska antitela (konjugat) se unose u jažice. Pranje se vrši nakon inkubacije.

4. Podloga se unosi, inkubira. Reakcija se zaustavlja kada se postigne optimalno bojenje u jažicama pozitivne kontrole.

5. Obračun rezultata na ELISA čitaču.

Glavna prednost metode je njena visoka osjetljivost, koja prevazilazi mogućnosti drugih ELISA shema (slika 4).

Slika 3. Indirektna ELISA za otkrivanje antitijela.

Ova opcija analize zasniva se na konkurenciji obeleženih (konjugat) i neobeleženih (test) antitela za vezivanje za antigen adsorbovan na čvrstoj fazi. Količina enzima vezanog za čvrstu fazu smanjit će se proporcionalno sadržaju slobodnih antitijela u smjesi. Za određivanje antigena koristi se ista opcija, ali se u ovom slučaju željeni antigen natječe sa obilježenim, standardnim antigenom za vezivanje za antitijela imobilizirana na površini čvrste faze.

Konkurentska metoda zahtijeva minimalan broj operacija, nisku potrošnju reagensa i može se lako automatizirati. Kada se provodi kompetitivna ELISA za otkrivanje antitijela, bolje je koristiti obilježena monoklinska antitijela, tada se konjugat natječe sa test uzorkom za jedan epitop antigena adsorbiranog na čvrstoj fazi. Ova ELISA varijanta se koristi za određivanje različitih jedinjenja, kao što su humani imunoglobulini, kancer-embrionalni antigen, insulin, itd. Omogućava otkrivanje antitela na dijagnostički značajne epitope infektivnih agenasa.

Glavne faze analize za detekciju antigena (slika 5):

1. Monoklonska antitela specifična za antigen koji se detektuju imobilizuju se na čvrstoj fazi.

2. Dodajte antigen označen enzimom i test uzorak u poznatoj koncentraciji u jažice panela. Izvršite inkubaciju i pranje. Paralelno, pozitivne i negativne kontrole se postavljaju u susjedne jažice. Za izgradnju kalibracije koristeći standardni neobilježeni antigen u različitim razrjeđenjima.

3. Dodajte supstrat, inkubirajte, zaustavite reakciju kada se razvije optimalno bojenje u jažicama pozitivne kontrole.

4. Obračunavanje reakcije na ELISA čitaču.

U ovom slučaju, količina antigena u uzorku za testiranje je obrnuto proporcionalna enzimskoj aktivnosti na čvrstoj fazi.

U ovoj varijanti ELISA, antigen prisutan u uzorku za testiranje vezuje se za monoklonska antitela obeležena enzimima i inhibira njihovu interakciju sa standardnim antigenom imobilisanim na čvrstoj fazi. Prisustvo u uzorku čak i tragova antigena specifičnog za konjugat će inhibirati vezivanje obilježenih antitijela za imobilizirani antigen. Stepen inhibicije je direktno proporcionalan sadržaju antigena u rastvoru. Za kvantitativnu analizu, kalibraciona kriva se gradi korišćenjem serijskih razblaženja standardnog antigena. Glavne faze inhibitorne ELISA za detekciju antigena (slika 6).

1. Adsorbirajte standardni antigen u jažice panela. Odaberite radno razrjeđenje označenih antitijela titracijom.

Slika 4. "Sendvič" - ELISA varijanta.

2. Konjugat je prethodno inkubiran na radnom razblaženju sa razblaženjima test uzorka, standardnog antigena i pozitivnih kontrolnih uzoraka.

3. Smjesa se prenosi u otvore panela. Da bi se kontrolisalo 100% vezivanje, samo obeležena antitela se dodaju u nekoliko jažica, bez inhibitornog antigena. Paneli se inkubiraju, a zatim peru.

4. Dodajte supstrat.

5. Zabilježite rezultate.

Koncentracija antigena koja se treba odrediti u uzorku za testiranje obrnuto je proporcionalna enzimskoj aktivnosti na čvrstoj fazi.

ELISA se može koristiti ne samo za određivanje rastvorljivog antigena ili antitijela, već i stanica koje proizvode različite proteine.

1983. ELISA tehnologija je prilagođena za otkrivanje limfoidnih ćelija koje luče antitela ili antigene (npr. citokine) in vitro. Metoda se zove ELISPOT (enzimski imunotest ili spot metoda). Glavni princip metode:

1. Na površini polistirenske jažice (koristeći ploče za ćelijsku kulturu sa 24 jažice) adsorbuju se antigeni ili antitela, koja služe kao reagensi za „hvatanje“.

2. Dodaju se proučavane limfoidne ćelije, kultivisane nekoliko sati na 37°C, dajući im mogućnost da zauzmu određeno mesto i vrše sekretornu funkciju. Antitijela ili antigeni koje luče takve ćelije hvataju se reagensima adsorbiranim na čvrstoj fazi.

3. Ćelije se uklanjaju pomoću rastvora za pranje sa deterdžentom za liziranje ćelija.

4. Mesta akumulacije sekretornih produkata prikazana su dodavanjem antitela povezanih sa enzimom (antiglobulinski reagens).

5. Doda se mješavina supstrat-agaroza (korišteni supstrati bi se trebali otopiti u agarozi i formirati nerastvorljive produkte reakcije), na površini čvrste faze se formiraju smeđe ili plave mrlje (ovisno o korištenim enzimima i supstratima), otkrivajući područja gdje se stanice nalaze. bili locirani.

Dobijene mrlje se broje pod mikroskopom, to će biti broj ćelija koje izlučuju.

Nitrocelulozna membrana se može koristiti kao čvrsta faza.U ovom slučaju postoji niz prednosti: zbog velikog adsorpcionog kapaciteta NCM-a, potrebna je znatno manja količina antigena koji se koristi kao reagens za „hvatanje“, osim toga, nema potrebe za uključivanjem agaroze u supstrat.

Istovremenim određivanjem broja sekretirajućih ćelija i ukupne količine izlučenog antigena ili antitela u jažici, što je moguće pri upotrebi drugačijeg supstrata, moguće je odrediti količinu izlučene supstance po jednoj ćeliji.

Ova metoda je našla široku primjenu za procjenu broja ćelija koje luče antigen zarobljen adsorbovanim antitelima, koristi se za određivanje broja ćelija koje luče citokine (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-y, TNF-a).

Kada se koriste antitijela visokog afiniteta, osjetljivost pojedinačnih ELISA varijanti je vrlo visoka i teoretski omogućava otkrivanje pojedinačnih molekula antigena, ali u praksi je osjetljivost ograničena brojnim faktorima: aktivnost enzima, intenzitet signala i metode obračuna signala. . Sistemi za pojačavanje signala omogućavaju povećanje osjetljivosti različitih ELISA varijanti. Razmotrite neke od ovih sistema:

Zasnovan na interakciji avidin-biotin.

Molekuli biotinskog koenzima (m.m. 244 Da) konjugiraju se s antitijelima korištenjem biotinil-N-hidroksisukcimida. Mali molekul biotina se lakše vezuje za imunoglobulin ili drugi protein bez narušavanja njegovih imunoloških ili enzimskih svojstava. Enzim je u ovom slučaju vezan za glikoprotein bjelanjka avidin. Afinitet vezivanja avidina za biotin je vrlo visok (konstanta disocijacije kompleksa je 10-15 mol), konjugat avidin-enzim je čvrsto fiksiran na kompleksu antigen-antitijelo-biotin. Nakon dodavanja odgovarajućeg supstrata, produkt reakcije se određuje spektrofotometrijski ili intenzitetom luminiscencije.

Jedna molekula avidina sastoji se od četiri identične podjedinice, sposobna je da stupi u interakciju sa četiri molekula biotina, što mu omogućava da se koristi kao molekul za vezu između dva spoja koja sadrže biotin. U ovom slučaju, enzim je također biotiniliran, a avidin djeluje kao most, povezujući dva molekula koji sadrže ostatke biotina. Rezultirajućem kompleksu antigen-antitijelo-biotin dodaje se slobodni avidin, a zatim biotinilirani enzim. Snimite reakciju.

Protein avidin se može nespecifično sorbirati na drugim molekulima; stoga se sve više koristi drugi protein koji vezuje biotin, streptavidin, koji se nalazi u bakteriji Streptomyces avidinii. Streptavidin takođe formira jak kompleks sa biotinom i sastoji se od četiri identične podjedinice.

Upotreba avidin-biotin kompleksa omogućava značajno povećanje osjetljivosti ELISA-e, budući da se desetine molekula biotina mogu vezati za jedan AT molekul tokom sinteze konjugata. Dobivanje konjugata (antitijela i enzima s biotinom) je prilično jednostavno i praćeno je minimalnim promjenama njihove imunološke i enzimske aktivnosti. Konjugati enzima sa biotinom mogu se koristiti kao univerzalni reagensi.

Upotreba hemiluminiscentnih reakcija.

Hemiluminiscentne reakcije se mogu koristiti za dobijanje signala u ELISA testu, uz povećanje osetljivosti metode i skraćivanje vremena analize. Peroksidaza hrena se široko koristi kao oznaka u ELISA testu, a različite hemiluminiscentne reakcije se također mogu koristiti za njeno otkrivanje. Hemiluminiscentne reakcije temelje se na sposobnosti luminola da svijetli kada se oksidira vodikovim peroksidom. U direktnoj analizi, enzimska reakcija proizvodi vodikov peroksid i oksidira luminol; ovu reakciju katalizira peroksidaza hrena. Da bi se pojačao signal, koriste se različiti spojevi, na primjer, luciferin, fenoli, u ovom slučaju se intenzitet luminiscencije povećava 10-100 puta, u nekim slučajevima i 500 puta (pojačana hemiluminiscentna analiza). Luminescentni signal je vrlo stabilan, njegov nivo dostiže maksimum za 30 s (za poređenje: reakcija u boji sa OPD kao indikatorom se u potpunosti razvija tek za 30 min).

U indirektnoj analizi sa luminolom ili njegovim derivatima, antitijelo se obilježava. Takva oznaka u slobodnom stanju može se oksidirati vodikovim peroksidom uz oslobađanje svjetlosti. Ako je formirao kompleks, gubi sposobnost oksidacije.

Zasnovan na kaskadnim sistemima.

Da bi se povećala osetljivost ELISA, mogu se koristiti enzimski kaskadni sistemi. U ovom slučaju, prvi enzim vezan za antitijela rezultira reducibilnim supstratom za drugi enzimski sistem. Drugi enzimski sistem može biti supstrat-ciklični ili redoksiciklični. U ovom slučaju, fosfo-glukoizomeraza, aldolaza, alkalna fosfataza mogu poslužiti kao oznake enzima. Konačni produkt reakcije se određuje vizualno ili spektrofotometrijski.

ELISA sistemi amplifikacije postižu visoku osjetljivost. Ovakvi ELISA sistemi se koriste za određivanje nivoa hormona (tireostimulišućih, progesterona itd.).

ELISA je našla široku primjenu u različitim područjima medicine i biologije zbog relativne jednostavnosti i visoke osjetljivosti metode. ELISA se uspješno koristi za:

Masovna dijagnostika zaraznih bolesti (detekcija različitih specifičnih antigena ili antitijela na njih);

Detekcija i određivanje nivoa hormona i lijekova u biološkim uzorcima;

Određivanje izotipa (IgG, IgM i drugi) antitijela protiv specifičnog antigena;

Detekcija imunoloških kompleksa;

Detekcija tumorskih markera;

Određivanje proteina u serumu krvi (feritin, fibronektin, itd.);

Određivanje ukupnog IgE i specifičnih IgE antitijela;

Skrining na mioklonska antitijela;

Definicije citokina u biološkim tekućinama.

Osetljivost metode

ELISA je zamijenila metode aglutinacije, precipitacije i RIA koje su se ranije koristile u kliničkoj praksi. U poređenju sa gore navedenim metodama, ELISA je manje naporna i zahteva manje vremena, pogodna je za izvođenje velikog broja analiza iste vrste.

ELISA kombinuje jedinstvenu specifičnost imunohemijskog testa sa visokom osetljivošću obeležavanja enzima. Osetljivost metode (pod osetljivošću označava minimalnu količinu antitela ili antigena koja se može detektovati) određuju sledeći faktori: afinitet antitela, poželjna je upotreba monoklonskih antitela; specifična aktivnost enzima; intenzitet signala; osetljivost na signal. Različite varijante ELISA testa razlikuju se po svojoj osjetljivosti. Odvojene varijante čvrste faze ELISA omogućavaju detekciju pojedinačnih molekula u uzorku. Prosječna osjetljivost ELISA je 10-9 - 10-12 mol.

Galaktionov V.G. Imunologija. Moscow University Press, 1998

Kishkun A.A. Imunološke studije i metode dijagnostike zaraznih bolesti u kliničkoj praksi. Medicinska novinska agencija, 2009

Kondratieva I.A. Radionica o imunologiji. Udžbenik za srednje škole. Akademija, 2004

Lefkovits I., Pernis B. Imunološke metode istraživanja. Mir, 1988

Roit A, Brostoff D, Meil ​​D. Imunologija. Mir, 2000

Sokolov E.I. Klinička imunologija. Medicina, 1998

Frimel G. Imunološke metode. Medicina, 1987

Khaitov R. M. Imunology. Medicina, 2000

Shigina Yu.V. Imunologija: Udžbenik. Izdavačka kuća RIOR, 2007

Yarilin A.A. Osnove imunologije. Medicina, 1999