Riff direkte und indirekte Methoden. Labordiagnostik sexuell übertragbarer Infektionen

Derzeit sind serologische Tests weit verbreitet, an denen markierte AGs oder AT-la beteiligt sind. Dazu gehören Immunfluoreszenzreaktionen, Radioimmun- und Enzymimmunoassay-Verfahren.

Sie gelten:

1) für die Serodiagnostik von Infektionskrankheiten, d. h. für den Nachweis von Antikörpern unter Verwendung eines Satzes bekannter konjugierter (chemisch kombinierter) Antigene mit verschiedenen Markierungen (Enzyme, Fluorochrom-Farbstoffe);

2) zur Bestimmung des Mikroorganismus oder seines Serovars unter Verwendung von standardmäßig markierten diagnostischen Antikörpern (Schnelldiagnostik).

Seren werden hergestellt, indem Tiere mit den entsprechenden Antigenen immunisiert werden, dann werden Immunglobuline isoliert und mit leuchtenden Farbstoffen (Fluorochrome), Enzymen und Radioisotopen konjugiert.

Markierte SR sind anderen SR in ihrer Spezifität nicht unterlegen und übertreffen alle SR in ihrer Sensitivität.

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Als Markierung werden leuchtende Fluorochromfarbstoffe (Fluorisceinisothiocyanat etc.) verwendet.

Es gibt verschiedene Modifikationen des RIF. Zur Express-Diagnostik von Infektionskrankheiten – zum Nachweis von Mikroben oder deren Antigenen im Untersuchungsmaterial – wird RIF nach Koons eingesetzt.

Es gibt zwei RIF-Methoden nach Koons: direkt und indirekt.

Direkte RIF-Komponenten:

1) das zu untersuchende Material (ein durch den Nasopharynx getrennter Stuhlgang usw.);

2) markiertes spezifisches Immunserum, das AT-1a gegen das gewünschte Antigen enthält;

3) isotonische Kochsalzlösung.

Ein Abstrich des Testmaterials wird mit markiertem Antiserum behandelt.

Es findet eine AG-AT-Reaktion statt. Die lumineszenzmikroskopische Untersuchung in dem Bereich, in dem die AG-AT-Komplexe lokalisiert sind, zeigt Fluoreszenz - Lumineszenz.

Indirekte RIF-Komponenten:

1) das untersuchte Material;

2) spezifisches Antiserum;

3) Antiglobulin-Serum (AT-1a gegen Immunglobulin), markiert mit Fluorochrom;

4) Isotonische Kochsalzlösung.

Ein Abstrich des Untersuchungsmaterials wird zunächst mit Immunserum gegen das gewünschte Antigen und anschließend mit markiertem Antiglobulin-Serum behandelt.

Leuchtende AG-AT-Komplexe – markiertes AT werden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops nachgewiesen.

Der Vorteil der indirekten Methode besteht darin, dass keine große Auswahl an fluoreszenzspezifischen Seren hergestellt werden muss und nur ein fluoreszierendes Antiglobulin-Serum verwendet wird.

Eine 4-Komponenten-Variante des indirekten RIF wird ebenfalls isoliert, wenn zusätzlich Komplement (Meerschweinchenserum) eingeführt wird. Bei positiver Reaktion entsteht ein AG-AT-Komplex – markiertes – AT-Komplement.

RIF basiert auf der Kombination von Antigenen von Bakterien, Rickettsien und Viren mit spezifischen Antikörpern, die mit fluoreszierenden Farbstoffen (Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, B-Isothiocyanit, Lyssatinrhodamin B-200, Sulfochlorid usw.) mit reaktiven Gruppen (Sulfochlorid, Isothiocyanit usw.) markiert sind .) . Diese Gruppen verbinden sich mit den freien Aminogruppen von Antikörpermolekülen, die ihre spezifische Affinität zum entsprechenden Antigen bei Behandlung mit einem Fluorochrom nicht verlieren. Die resultierenden AG-AT-Komplexe werden unter einem Fluoreszenzmikroskop zu deutlich sichtbaren, hell leuchtenden Strukturen (Abb. 7). RIF kann kleine Mengen bakterieller und viraler Antigene nachweisen. Die RIF-Methode wird in zwei Versionen verwendet: direkte und indirekte Methode.

Das direkte Verfahren basiert auf der direkten Assoziation eines Antigens mit einem markierten Antikörper. Die indirekte Methode basiert auf dem stufenweisen Nachweis des AG-AT-Komplexes mit Fluoreszenzfarbstoffen. Die erste Stufe besteht in der Bildung von Immunkomplexen eines bestimmten Antigens mit spezifischen Antikörpern. Die zweite Stufe besteht darin, diesen Komplex zu identifizieren, indem er mit markiertem Antigammaglobulin behandelt wird.

Der Vorteil von RIF ist Einfachheit, hohe Empfindlichkeit und Geschwindigkeit beim Erzielen des Ergebnisses. RIF wird als Methode zur schnellen Schnelldiagnose von Grippe, Ruhr, Malaria, Pest, Tularämie, Syphilis usw. verwendet. Zur Durchführung einer solchen Studie wird ein Lumineszenzmikroskop verwendet.

Radioimmunoassay (RIA)

RIA ist eine der empfindlichsten Methoden der Immundiagnostik. Es wird verwendet, um das Antigen des Hepatitis-B-Virus bei Patienten mit viraler Hepatitis nachzuweisen. Dazu wird dem Testserum Referenzserum (Serum mit Antikörpern gegen das Hepatitis-B-Virus) zugesetzt. Das Gemisch wird 1–2 Tage bei einer Temperatur von 40°C inkubiert, dann wird ein Referenzantigen (ein mit dem 125 J-Isotop markiertes Antigen) zugegeben und die Inkubation weitere 24 Stunden fortgesetzt. Dem resultierenden Antigen-Antikörper-Komplex werden präzipitierende Antiimmunglobuline gegen Referenzserumproteine ​​zugesetzt, was zur Bildung eines Präzipitats führt (Abb. 8). Das Ergebnis wird durch das Vorhandensein und die Anzahl der vom Zähler aufgezeichneten Impulse im Niederschlag berücksichtigt. Wenn ein Antigen an spezifische Antikörper im Testserum gebunden ist, binden diese nicht an das markierte Antigen und werden daher nicht im Präzipitat nachgewiesen. RIA basiert also auf dem Prinzip der kompetitiven Wechselwirkung des bestimmten Antigens und einer bekannten Menge des markierten Antigens mit den aktiven Zentren von Antikörpern, wobei radioaktive Isotope als Markierung verwendet werden.

Je nach Stagingtechnik werden zwei Methoden der RIA unterschieden.

1) Technik "Flüssigphase" (klassische RIA). Der Nachteil dieser Inszenierungstechnik ist die Notwendigkeit

spezielle Trennung von freien und gebundenen markierten Antigenen (oder Antikörpern).

2) Technik "Festphase".

AG oder AT bekannter Spezifität binden an Sorptionsmittel (Festphase) - die Wände einer Polystyrolvertiefung oder eines Kunststoffröhrchens. Der Rest der IC-Komponenten wird nacheinander an das immobilisierte AG (AT) sorbiert.

Je nach Art der Reaktion werden folgende Verfahren unterschieden:

1) Wettbewerbsmethode – eine Methode, die auf dem Wettbewerb von AG basiert.

Reaktionskomponenten:

a) nachweisbare AG (Untersuchungsmaterial - Blut, Sputum usw.);

b) ein mit einem Radioisotop markiertes Antigen, das mit dem untersuchten Antigen identisch ist;

c) an das Sorbens gebundene spezifische Antikörper bekannter Konzentration;

d) standard AG (Kontrolle);

e) Pufferlösung.

Zunächst wird das untersuchte AG in die Reaktion eingebracht. Auf der Oberfläche des Sorbens wird ein AG-AT-Komplex gebildet. Das Sorbens wird abgewaschen, dann wird markiertes AG eingeführt.Je höher der Gehalt des untersuchten AGs ist, desto weniger markiertes AG bindet anAT-m auf der Oberfläche des Sorbens. Die Konzentration des markierten Antigens wird durch Messen der Radioaktivität der Reaktion unter Verwendung von Zählern bestimmt. Der Wert der Radioaktivität der Reaktion ist umgekehrt proportional zur AG-Menge in der Testprobe.

2) Nicht kompetitive Methode.

Reaktionskomponenten:

a) bestimmte AG;

b) spezifisches AT-a bekannter Konzentration, gebunden

nye auf dem Sorptionsmittel;

c) Antikörper identisch mit dem gebundenen Antikörper, markiert

Radioisotop;

d) Standard-AG;

e) Pufferlösung.

Das untersuchte AG wird zu den gebundenen Antikörpern hinzugefügt. Während der Inkubation werden auf dem Sorbens AG-AT-Komplexe gebildet. Das Sorbens wird von freien Bestandteilen gewaschen und mit markierten Antikörpern versetzt, die an die freien Valenzen von AG-on im Komplex binden. Die Menge an Radioaktivität ist proportional zur Konzentration der untersuchten AG.

3) "Sandwich-Methode" (indirekte Methode) - die gebräuchlichste Methode.

Komponenten:

a) Testserum (oder Test-AG);

b) an das Sorbens gebundene AGs (oder an das Sorbens gebundenes AT-la bei der Bestimmung von AG-a);

c) diagnostische Antikörper gegen mit Radioisotopen markierte Immunglobuline;

d) Kontrollseren (oder Antigene);

e) Pufferlösungen.

Die zu untersuchenden Antikörper (oder AGs) reagieren mit Festphasen-AGs (ATs), wonach das Inkubat entfernt und markierte Antiglobulin-Antikörper in die Reaktion eingebracht werden, die an spezifische AG-AT-Komplexe auf der Oberfläche des Sorbens binden. Die Größe der Radioaktivität der Reaktion ist direkt proportional zur Menge des untersuchten AT (oder AG).

Vorteile von RIA:

1) hohe Spezifität und Sensitivität;

2) Einfachheit der Fassungstechnik;

3) die Genauigkeit der quantitativen Bewertung der Ergebnisse;

4) einfach zu automatisieren.

Nachteil: Verwendung von radioaktiven Isotopen.

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ELISA-Methode (ELISA)

Das Verfahren dient zum Nachweis von Antigenen unter Verwendung ihrer entsprechenden Antikörper, die mit einem markierten Enzym (Meerrettichperoxidase, b-Galactose oder alkalische Phosphatase) konjugiert sind. Nachdem das Antigen mit dem enzymmarkierten Immunserum kombiniert wurde, werden das Substrat und das Chromogen zu der Mischung gegeben. Das Substrat wird durch das Enzym gespalten und seine Abbauprodukte bewirken eine chemische Modifikation des Chromogens. Dabei ändert das Chromogen seine Farbe – die Farbintensität ist direkt proportional zur Anzahl der gebundenen Antigen- und Antikörpermoleküle (Abb. 9).

Am gebräuchlichsten ist der Festphasen-ELISA, bei dem eine der Komponenten der Immunantwort (Antigen oder Antikörper) an einem festen Träger adsorbiert wird. Als fester Träger werden Mikropaneele aus Polystyrol verwendet. Bei der Bestimmung von Antikörpern werden Blutserum von Patienten, mit einem Enzym markiertes Antiglobulinserum und eine Mischung aus Lösungen des Substrats für das Enzym und Chromogen nacheinander in die Vertiefungen mit dem adsorbierten Antigen gegeben. Nach jeder Zugabe der nächsten Komponente werden ungebundene Reagenzien durch gründliches Waschen aus den Vertiefungen entfernt. Bei einem positiven Ergebnis verändert sich die Farbe der Chromogenlösung. Ein Festphasenträger kann nicht nur mit einem Antigen, sondern auch mit einem Antikörper sensibilisiert werden. Dann wird das gewünschte Antigen in die Vertiefungen mit sorbierten Antikörpern eingebracht, das Immunserum gegen das mit dem Enzym markierte Antigen zugegeben und dann die Mischung aus Substratlösungen für das Enzym und Chromogen zugegeben.

ELISA dient der Diagnose von Krankheiten, die durch virale und bakterielle Erreger verursacht werden Enzyme dienen als Marker: Peroxidase, alkalische Phosphatase etc.

Der Indikator der Reaktion ist die Fähigkeit von Enzymen, Farbreaktionen hervorzurufen, wenn sie dem entsprechenden Substrat ausgesetzt werden. Beispielsweise ist das Substrat für Peroxidase eine Lösung von Orthophenyldiamin.

Der am weitesten verbreitete Festphasen-ELISA. Das Wesen von ELISA ist ähnlich wie bei RIA.

Die Ergebnisse des ELISA können visuell und durch Messung der optischen Dichte auf einem Spektrophotometer beurteilt werden.

Zu den Vorteilen von ELISA gehören:

Kein Kontakt mit radioaktiven Stoffen;

Einfachheit der Antwortauswertungsmethoden;

Stabilität von Konjugaten;

Leicht zugänglich für die Automatisierung.

Im Vergleich zu RIA wird jedoch eine geringere Empfindlichkeit des Verfahrens festgestellt, aber in einigen Fällen ist die Empfindlichkeit RIF und RIM überlegen.

Als Beispiele seien folgende Arten von ELISA genannt:

Wettbewerbstyp.

Geplanter Termin.

Zum Nachweis des Oberflächenantigens des Hepatitis-B-Virus (HB3 Ad) in Serum und Plasma bei der Diagnose einer viralen Hepatitis B und zur Bestimmung des Trägers von HB5 Ad.

Komponenten:

1) Testmaterial Serum oder Blutplasma;

2) Antikörper gegen HB3 Ad, adsorbiert auf der Oberfläche einer Vertiefung einer Polystyrol-Mikroplatte;

3) Konjugat – monoklonale Maus-Antikörper gegen HB3 Ad, markiert mit Peroxidase,

4) Orthophenylendiamin (OPD)-Substrat;

5) phosphatgepufferte Kochsalzlösung;

6) Kontrollseren:

Positiv (Serum mit HBe Ad);

Negativ (Serum ohne HBs Ad). Fortschritt

1) Einführung von Kontroll- und Testseren.

2) Inkubation 1 Stunde bei 37°C.

3) Waschbrunnen.

4) Einführung des Konjugats.

5) Inkubation 1 Stunde bei 37°C.

6) Waschbrunnen.

7) Einführung von OFD. In Anwesenheit von HBs Ad färbt sich die Lösung in den Vertiefungen gelb.

ELISA wird durch die optische Dichte mit einem Photometer berücksichtigt. Der Grad der optischen Dichte ist umgekehrt proportional zur Konzentration des untersuchten HBs Ad.

Mechanismus

Die Reaktion verläuft in drei Phasen:

1) HB3 Der Blutdruck des untersuchten Serums (Plasma) bindet an homologe Antikörper, die auf der Oberfläche der Vertiefung adsorbiert sind. IR AG-AT wird gebildet. (NVz Ad - agl \ NVz AT).

2) Mit Peroxidase markierte HBs Ad-Antikörper binden an die verbleibenden freien HBs Ad-Determinanten des AG-AT-Komplexes. Ein Komplex von AT-AG-markierten Abs (an!1 HBs AT-HBs Ad-ap(1 HBs mit Peroxidase markierter Abs) wird gebildet.

3) OPD interagieren (mit Peroxidase) des AT-AG-AT-Komplexes und es tritt eine Gelbfärbung auf.

indirekter Typ

Es ist die wichtigste Testreaktion zur Diagnose einer HIV-Infektion.

Zweck: serologische Diagnose einer HIV-Infektion - Nachweis von Antikörpern gegen HIV-Antigene, Bestandteile:

1) Testmaterial - Blutserum;

2) synthetisch

Immunfluoreszenzreaktion - RIF (Koons-Methode) Es gibt drei Arten von direkter Methode, indirekte Methode, mit Komplement. Die Koons-Reaktion ist ein schnelles diagnostisches Verfahren zum Nachweis mikrobieller Antigene oder zum Nachweis von Antikörpern.

Die direkte RIF-Methode basiert auf der Tatsache, dass Gewebeantigene oder Mikroben, die mit Immunseren mit Fluorochrom-markierten Antikörpern behandelt wurden, in der UV-Strahlung eines Fluoreszenzmikroskops leuchten können. Bakterien in einem mit einem solchen Lumineszenzserum behandelten Ausstrich leuchten entlang der Zellperipherie in Form eines grünen Randes.

Die indirekte RIF-Methode besteht darin, den Antigen-Antikörper-Komplex zu identifizieren

mit Fluorochrom markiertes Antiglobulin (Anti-Antikörper)-Serum. Dazu werden Abstriche aus einer Keimsuspension mit Antikörpern aus antimikrobiellem Kaninchen-Diagnostikserum behandelt. Anschließend werden die nicht durch mikrobielle Antigene gebundenen Antikörper abgewaschen und die auf den Mikroben verbliebenen Antikörper durch Behandlung des Ausstrichs mit markiertem Antiglobulin (Anti-Kaninchen)-Serum nachgewiesen

Fluorochrome. Als Ergebnis wird ein Komplex Mikrobe + antimikrobielle Kaninchen-Antikörper + mit Fluorochrom markierte Anti-Kaninchen-Antikörper gebildet. Dieser Komplex wird in einem fluoreszierenden beobachtet

Mikroskop, wie bei der direkten Methode.

23. Enzymimmunoassay Inhaltsstoffe, Rezeptur, Abrechnung, Auswertung. Einsatzbereiche.

I Radioimmunoassay.

Die Radioimmunmethode oder -analyse (RIA) ist eine hochempfindliche Methode, die auf der Antigen-Antikörper-Reaktion unter Verwendung von Antigenen oder Antikörpern basiert, die mit einem Radionuklid (125J, 14C, 3H, 51Cr usw.) markiert sind. Nach ihrer Wechselwirkung wird der entstandene radioaktive Immunkomplex abgetrennt und seine Radioaktivität in einem geeigneten Zählgerät (Beta- oder Gammastrahlung) bestimmt. Die Strahlungsintensität ist direkt proportional zur Anzahl der gebundenen Antigen- und Antikörpermoleküle.

fügen Sie das Patientenserum, das mit dem Enzym markierte Antiglobulin-Serum und das Substrat/Chromogen für das Enzym hinzu.

II. Bei der Antigenbestimmung wird das Antigen (z. B. Blutserum mit dem gewünschten Antigen) in die Vertiefungen mit sorbierten Antikörpern eingebracht, diagnostisches Serum dagegen und mit einem Enzym markierte sekundäre Antikörper (gegen diagnostisches Serum) hinzugefügt, Und danach Substrat/Chromogen für das Enzym.

24. Immunlysereaktionen, Anwendung. Komplementbindungsreaktion. Inhaltsstoffe, Rezeptur, Abrechnung, Auswertung. Anwendung.

Die Komplementfixierungsreaktion (RCC) besteht darin, dass Antigene und Antikörper, wenn sie einander entsprechen, einen Immunkomplex bilden, an den das Komplement (C) über das Fc-Fragment der Antikörper gebunden ist und das Komplement vom Antigen-Antikörper gebunden wird Komplex. Wird der Antigen-Antikörper-Komplex nicht gebildet, bleibt das Komplement frei. RSC wird in zwei Phasen durchgeführt: 1. Phase – Inkubation einer Mischung, die Antigen + Antikörper + Komplement enthält, 2. Phase (Indikator) – Nachweis von freiem Komplement in der Mischung durch Zugabe eines hämolytischen Systems bestehend aus Schafserythrozyten und hämolytischem Serum Antikörper gegen sie enthalten. In der 1. Phase der Reaktion, wenn ein Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wird, kommt es zur Komplementbindung, und in der 2. Phase findet keine Hämolyse der durch Antikörper sensibilisierten Erythrozyten statt (die Reaktion ist positiv). Wenn Antigen und Antikörper nicht übereinstimmen (kein Antigen oder Antikörper in der Testprobe), bleibt das Komplement frei und verbindet sich in der 2. Phase mit dem Erythrozyten-Antierythrozyten-Antikörper-Komplex, was eine Hämolyse verursacht (negative Reaktion).

25. Dynamik der Bildung der zellulären Immunantwort, ihre Manifestationen. Immunologisch
Erinnerung.

Die zelluläre Immunantwort (CIR) ist eine komplexe kooperative Mehrkomponentenreaktion des Immunsystems, die durch ein fremdes Antigen (T-Zell-Epitope) induziert wird. Implementiert durch das T-System der Immunität. KIO-Stufen

1. APC-Antigeneinfang

2. Prozessor. AG in Proteasomen.

3. Bildung des Komplexes Peptid + MHC Klasse I und II.

4. Komplementtransport zur APC-Membran.

5. Komplementerkennung durch AG-spezifische T-Helfer 1

6. Aktivierung von APC und T-Helfern1, Freisetzung von IL-2 und Gamma-Interferon durch E-Helfer1. Proliferation und Differenzierung im Bereich AG-abhängiger T-Lymphozyten.

7. Bildung von reifen T-Lymphozyten verschiedener Populationen und Gedächtnis-T-Lymphozyten.

8. Interaktion reifer T-Lymphozyten mit AH und Realisierung des Endeffektors.

Manifestationen von KIO:

Antiinfektiöse KI:

Virostatikum,

antibakteriell (intrazellulär lokalisierte Bakterien);,

Allergien vom Typ IV und I;

Antitumor-IO;

KI-Transplantation;

immunologische Toleranz;

immunologisches Gedächtnis;

autoimmune Prozesse.

26. Charakterisierung von regulatorischen und Effektor-Subpopulationen von T-Lymphozyten. Hauptsächlich
Markierungen. T-Zell-Rezeptor (TCR). Genetische Kontrolle der TCR-Diversität

T-Lymphozyten stellen die zweite wichtige Lymphozytenpopulation dar, deren Vorläufer im Knochenmark gebildet werden und dann zur weiteren Reifung einwandern und

Differenzierung in den Thymus (der Name "T-Lymphozyten" spiegelt die Thymus-Abhängigkeit als Hauptort des frühen Reifungsstadiums wider).

Gemäß dem Spektrum der biologischen Aktivität sind T-Lymphozyten regulatorische und Effektorzellen, die die adaptive Funktion des T-Systems der Immunität bereitstellen. Sie produzieren keine Antikörpermoleküle. TCR ist ein Membranmolekül, das sich von HCR unterscheidet, aber strukturell und funktionell Antikörpern ähnlich ist.

TCR - AG-spezifisch. Rezeptor. Es ist das Hauptmolekül der Ig-Superfamilie. Es besteht aus 3 Teilen: supramembranös, membranös und zytoplasmatisch. Der TCR-Schwanz wird von 2 globulären Alpha- und Beta-Molekülen gebildet, die variable und konstante Domänen (Vα und Vβ, Сα und Сβ) haben.

Vα und Vβ bilden den aktiven TCR-Komplex. Es gibt 3 hypervariable Regionen - konstante deterministische Regionen (CDO). Die Funktion von KDO ist die Erkennung und Bindung von T-Zell-Peptiden, d.h. bestimmende Gruppen von AG. TCR sitzt fest auf der Zelle und sein zytoplasmatischer Schwanz, sein zytoplasmatischer Teil, ist an der Durchführung von inf beteiligt. Im Kern während seiner Wechselwirkung mit AG. Ungefähr 90 % TCR. Sie tragen Alpha- und Beta-Ketten und etwa 10 % tragen Gamma- und Delta-Ketten.

TCR ist genetisch kodiert. α- und γ-Ketten werden in Analogie zu IG-Leichtketten von V-, G- und C-Genen kodiert, und β- und δ-Ketten in Analogie zu IG-Schwerketten von V, G, E. α und γ auf Chromosom 7 und β und δ auf Chromosom 14.

Der CD-3-Rezeptor ist eine komplementäre Struktur, ein Ig-Molekül. Es wird von 3 Transmembranproteinen gebildet: εδ, εγ und Dimer-Zeta., Supramembranous, Vembrane und Cytosol Tail. Sie stellen einen einzigen Komplex mit TCR dar, der für die Weiterleitung von AG-spezifischen Signalen an den Zellkern sorgt.

CD4 und CD8. Sie exprimieren entweder gleichzeitig mit TCR oder getrennt davon. Sie übernehmen die Funktion von Korezeptoren. Sie verstärken die Adhäsion an die AG-präsentierende Zelle. Sie sorgen für die Weiterleitung eines AG-spezifischen Signals zum Zellkern.

T-Lymphozyten werden nach der Art der Erkennung, MOLEKÜLE, eingeteilt:

CD4-Aufnahme Peptid MHC 2. Klasse

CD8-Peptid + MHC 1. Klasse

Merkmale der Hauptsubpopulationen von T-Lymphozyten: Die Population von T-Lymphozyten kann in drei Klassen eingeteilt werden:

A. Helfer, HRT-Effektoren (CD 4+) und zytotoxische Suppressoren (CD 8+);

B. Unstimulierte (CD 45 RA+) und Gedächtniszellen (CD 45 RO+);

C. Typ 1 – (IL-2, INF-gamma, TNF-beta produzierend);
Typ 2 – (Produktion von IL-4, IL-5, IL-6, IL9, IL 10).

Dieses Verfahren nutzt das Phänomen der Lumineszenz.

Das Wesentliche des Lumineszenzphänomens liegt in der Tatsache, dass, wenn verschiedene Arten von Energie (Licht, elektrische usw.) von den Molekülen bestimmter Substanzen absorbiert werden, ihre Atome in einen angeregten Zustand übergehen und dann in ihren ursprünglichen Zustand zurückkehren , geben die absorbierte Energie in Form von Lichtstrahlung ab.

Bei RIF manifestiert sich Lumineszenz in Form von Fluoreszenz - dies ist ein Leuchten, das im Moment der Bestrahlung mit anregendem Licht auftritt und unmittelbar nach dessen Ende aufhört.

Viele Substanzen und lebende Mikroorganismen haben eine eigene Fluoreszenz (die sogenannte Primäre), deren Intensität jedoch sehr gering ist. Substanzen, die eine intensive Primärfluoreszenz aufweisen und verwendet werden, um nicht fluoreszierenden Substanzen fluoreszierende Eigenschaften zu verleihen, werden als Fluorochrome bezeichnet. Eine solche induzierte Fluoreszenz wird als sekundär bezeichnet.

Zur Anregung der Fluoreszenz in der Fluoreszenzmikroskopie wird am häufigsten der ultraviolette oder blauviolette Teil des Spektrums (Wellenlänge 300-460 nm) verwendet. Für diese Zwecke haben Labors Lumineszenzmikroskope verschiedener Modelle - ML-1-ML-4, "Lumam".

In der virologischen Praxis werden zwei Hauptmethoden der Fluoreszenzmikroskopie verwendet: Fluorochromisation und fluoreszierende Antikörper (oder RIF).

Fluorochromisierung- Dies ist die Behandlung von Präparaten mit Fluorochrom, um die Stärke und den Kontrast ihrer Lumineszenz zu erhöhen. Von größtem Interesse ist das Fluorochrom Acridinorange, das eine polychromatische Fluoreszenz von Nukleinsäuren verursacht. Wenn also Präparate mit diesem Fluorochrom behandelt werden, fluoresziert Desoxyribonukleinsäure hell grün und Ribonukleinsäure - rubinrot.

Das RIF-Verfahren besteht darin, dass mit einem Fluorochrom verbundene Antikörper die Fähigkeit behalten, mit einem homologen Antigen eine spezifische Beziehung einzugehen. Der resultierende Antigen + Antikörper-Komplex wird aufgrund des darin enthaltenen Fluorochroms unter einem Fluoreszenzmikroskop durch ein charakteristisches Leuchten nachgewiesen.

Zur Gewinnung von Antikörpern werden hochaktive Hyperimmunseren verwendet, aus denen Antikörper isoliert und mit Fluorochrom markiert werden. Die am häufigsten verwendeten Fluorochrome sind FITC-Fluoresceinisothiocyanat (grünes Licht) und PCX-Rhodaminsulfochlorid (rotes Licht). Ein mit einem Fluorochrom markierter Antikörper wird als Konjugat bezeichnet.

Das Verfahren zur Herstellung und Färbung von Präparaten ist wie folgt:

• bereiten Sie Abstriche, Abdrücke von Organen oder auf Deckgläsern vor - eine infizierte Zellkultur auf Glasobjektträgern; Histosections können ebenfalls verwendet werden;
• Präparate werden an der Luft getrocknet und in gekühltem Aceton bei Raumtemperatur oder minus 15 °C (von 15 Minuten bis 4-16 Stunden) fixiert;
• gefärbt durch direkte oder indirekte Methode; Machen Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop Aufzeichnungen über die Intensität des Glühens, geschätzt in Kreuzen.

Bereiten Sie parallel Präparate von einem gesunden Tier vor und färben Sie sie - Kontrolle.

Es gibt zwei Hauptmethoden zum Auftragen von fluoreszierenden Antikörpern: direkt und indirekt.

Direkte Methode (Einzelschritt). Auf das fixierte Präparat wird ein Konjugat (fluoreszierendes Serum zum verdächtigen Virus) aufgetragen, 30 Minuten bei einer Temperatur von 37 °C in einer Feuchtkammer inkubiert. Anschließend wird der Wirkstoff mit Kochsalzlösung (pH 7,2 - 7,5) vom ungebundenen Konjugat gewaschen, an der Luft getrocknet, nicht fluoreszierendes Öl aufgetragen und mikroskopisch untersucht.

Das direkte Verfahren ermöglicht den Nachweis und die Identifizierung des Antigens. Dazu benötigen Sie für jedes Virus ein fluoreszierendes Serum.

Indirekte Methode (zweistufig). Auf das fixierte Präparat wird ein unmarkiertes Serum mit Antikörpern gegen das verdächtige Virus aufgetragen, 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, ungebundene Antikörper werden abgewaschen. Auf das Präparat wird ein fluoreszierendes Antispezies-Serum aufgetragen, das der Tierart entspricht, die homologe antivirale Antikörper produziert, und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Dann wird das Medikament von ungebundenen markierten Antikörpern gewaschen, an der Luft getrocknet, nicht fluoreszierendes Öl aufgetragen und unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.

Anti-Spezies-Seren werden durch Immunisieren von Tieren mit Globulinen jener Spezies gewonnen, die als Produzenten von antiviralen Antikörpern dienen. Wenn also bei Kaninchen antivirale Antikörper erhalten wurden, wird fluoreszierendes Anti-Kaninchen-Serum verwendet.

Die indirekte Methode ermöglicht nicht nur den Nachweis und die Identifizierung des Antigens, sondern auch den Nachweis und die Bestimmung des Antikörpertiters. Außerdem kann dieses Verfahren Antigene verschiedener Viren mit einem einzigen markierten Serum nachweisen, da es auf der Verwendung von Anti-Spezies-Seren basiert. Anti-Kaninchen-, Anti-Rinder-, Anti-Pferde-Seren und Seren gegen Meerschweinchen-Globuline werden häufiger verwendet.

Es wurden mehrere Modifikationen der indirekten Methode entwickelt. Die Methode, die das Komplement verwendet, verdient die größte Aufmerksamkeit. Das Verfahren besteht darin, inaktiviertes, nicht fluoreszierendes spezifisches Serum und Meerschweinchen-Komplement auf das fixierte Präparat aufzubringen, es 30 Minuten bei 37 °C zu halten, es zu waschen und zum Nachweis des Antigen + Antikörper + Komplement-Komplexes fluoreszierendes Anti-Komplementär-Serum aufzutragen 30 Minuten bei 37 °C gehalten, gewaschen, an der Luft getrocknet und unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.

RIF-Vorteile: hohe Spezifität und Sensitivität; einfache Setztechnik; erfordert eine minimale Anzahl von Komponenten. Dies ist eine schnelle Diagnosemethode, da Sie innerhalb weniger Stunden eine Antwort erhalten können. Zu den Nachteilen gehören die Subjektivität bei der Beurteilung der Lumineszenzintensität und leider sind fluoreszierende Seren manchmal von schlechter Qualität. Derzeit wird RIF weithin bei der Diagnose viraler Tierkrankheiten verwendet.

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Die bereits 1942 von Koons entdeckte Immunfluoreszenzreaktion ist keine neue Forschungsmethode. Das Aufkommen von Hybridomtechnologien, die es ermöglichten, monoklonale Antikörper zu erhalten, gab dieser Reaktion jedoch ein "zweites Leben", da ihre Verwendung es ermöglichte, die Empfindlichkeit dieser Reaktion und ihre Spezifität um ein Vielfaches zu erhöhen.

Und heute erzählen wir Ihnen ausführlich über die Reaktion der direkten und indirekten Immunfluoreszenz (RIF) als Koons-Diagnosemethode für erwachsene Männer und Frauen während der Schwangerschaft.

Was ist eine Immunfluoreszenzreaktion?

Die Immunfluoreszenzreaktion stellt eine ausgezeichnete Möglichkeit dar, schnell eine genaue Diagnose zu erhalten, und ermöglicht Ihnen, das Vorhandensein des Erregers im pathologischen Material zu bestimmen. Dazu wird ein Ausstrich aus einem speziell mit markiertem FITC (Fluorescein-Isothiocyanat) aufbereiteten Material verwendet und als heterogene Analyse untersucht.

Um das Ergebnis zu erhalten, wird ein Fluoreszenzmikroskop verwendet, in dessen optischem System ein Satz Lichtfilter vorhanden ist, um das Präparat mit blauviolettem oder ultraviolettem Licht einer bestimmten Wellenlänge zu versorgen. Diese Bedingung ermöglicht es dem Fluorochrom, in einem bestimmten Bereich zu leuchten. Der Forscher bewertet die Eigenschaften des Leuchtens, seine Art, die Größe von Objekten und ihre relative Position.

Wem ist es zugeordnet

Die Durchführung einer Immunfluoreszenzreaktion kann bei der Diagnose vieler Viruserkrankungen vorgeschrieben werden. Insbesondere ist es für eine umfassende Untersuchung vorgeschrieben, folgende Faktoren zu identifizieren:

• das Vorhandensein eines Virus im Körper;
• Salmonelleninfektion;
• das Vorhandensein bestimmter Antigene im Körper;
• die Wahrscheinlichkeit einer Infektion des Körpers mit Chlamydien, Mykoplasmen und anderen Mikroorganismen, die menschliche Viruserkrankungen auslösen können, wird aufgedeckt;
• Diagnose von Viruserkrankungen bei Tieren.

Diese Indikationen ermöglichen es, die Immunfluoreszenzreaktion zum Nachweis von Viruserkrankungen verschiedener Natur im menschlichen und tierischen Körper zu verwenden.

Ziele der

Da diese diagnostische Methode viele Vorteile hat, zu denen ihre hohe Effizienz, Geschwindigkeit bei der Durchführung und Erzielung von Ergebnissen sowie das Fehlen einer großen Anzahl von Kontraindikationen gehören, wird sie verwendet, um das Vorhandensein von Virusinfektionen im Körper zu bestimmen. Daher kann diese Analyse sowohl zur Erstellung als auch zur Klärung der Diagnose vorgeschrieben werden, auf deren Grundlage ein Behandlungsschema vorgeschrieben wird.

Das Verfahren verursacht keine Beschwerden, da es notwendig ist, Material zur Analyse zu erhalten, das aus jeder Körperflüssigkeit entnommen wird: Speichel, Auswurf, Abschabungen von der Oberfläche der Schleimhäute. Es kann auch Blut zur Analyse entnommen werden. Die Häufigkeit der Immunfluoreszenzreaktion wird vom behandelnden Arzt vorgeschrieben, der Daten über die Dynamik der im Körper ablaufenden Prozesse erhalten muss.

Da diese Analyse sowohl dem Körper als auch dem allgemeinen Wohlbefinden einer Person nicht schadet, kann sie bei Bedarf verordnet werden.

Arten eines solchen Verfahrens

Heutzutage werden mehrere Varianten dieser Analyse verwendet, von denen jede eine Reihe spezifischer Merkmale aufweist und es Ihnen ermöglicht, ein möglichst detailliertes Bild der im Körper ablaufenden Prozesse zu erhalten.

Die Arten von Immunfluoreszenzreaktionen umfassen:

1. - Diese Analyse ist eine der sich am schnellsten entwickelnden Arten der Diagnostik und ermöglicht es, quantitative Daten ohne die Verwendung von Reihenverdünnungen zu erhalten. Durch Verwendung der erhaltenen Messungen der optischen Dichte der Flüssigkeit ist es möglich, das Konzentrationsniveau der gewünschten Komponente genau zu bestimmen. Die breiten Möglichkeiten dieser Art von Analyse werden genutzt, wenn monoklonale Antikörper für ihre Implementierung verwendet werden, was es ermöglicht, die Phase des Infektionsprozesses, seine Schwere zu bestimmen;
2. DNA-Diagnostik- Diese Methode basiert auf der komplementären Bindung von Nukleotiden, für die Flüssigkeiten wie Speichel, Blut, Liquor, Urin, Sputum, Biopsieproben und Blut verwendet werden können. Diese Methode weist das Vorhandensein von Papillomaviren im Körper am effektivsten nach, jedoch können viele moderne Testsysteme gelegentlich falsch positive und falsch negative Ergebnisse liefern. Der Grund dafür kann eine Kontamination von Flüssigkeitsproben zur Analyse spezifischer DNA sein, deren Vorhandensein einen verschachtelten oder vollständigen Charakter haben kann;
3. Immunchromatographie- Die Besonderheit dieser Methode zur Bestimmung des Vorhandenseins einer pathologischen Umgebung und von Viren im Körper ist die Verwendung markierter Antikörper während der Reaktion. Diese diagnostische Methode wird verwendet, um den Grad der Aktivität des Infektionsprozesses mit Streptokokken der Gruppe A sowie Chlamydien der folgenden Typen zu identifizieren: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia von Oxoid. Testsysteme, die auf dieser Forschungsmethodik basieren, besitzen die höchste Empfindlichkeit. dienen in der Regel als Orientierungstest.

Die aufgeführten Sorten weisen Verhaltensmerkmale und spezifische Merkmale der Ergebnisse auf, alle zielen jedoch darauf ab, Daten über das Vorhandensein pathologischer Mikroorganismen und Viren im Körper sowie über den Grad ihrer Vermehrung und Aktivität zu erhalten.

Hinweise zur Durchführung

Eine Immunfluoreszenzreaktion kann verschrieben werden, um jede Art von pathologischer Umgebung im Körper zu erkennen.

Bei dieser Art der Diagnostik werden Chlamydien, Trichomonaden, Gonokokken und sowie Lamblien aller Art bestimmt. und andere Krankheiten erfordern ebenfalls RIF. Die Bestellung eines Arztes für die Durchführung ist obligatorisch.

Kontraindikationen für das Halten

Da für diese Reaktion jede Art von Körperflüssigkeit als Untersuchungsmaterial benötigt wird, ist deren Entnahme in der Regel unproblematisch und es bestehen keine Kontraindikationen für die Durchführung einer Immunfluoreszenzreaktion. Während der Schwangerschaft und bei Kindern unter 6 Monaten wird die Probenahme für Forschungszwecke jedoch mit äußerster Vorsicht durchgeführt.

Das Fehlen von Kontraindikationen ermöglicht es, diese Art der Diagnose durchzuführen, wenn ein Arzt es allen Patienten verschreibt. Seine Sicherheit wird durch die Verwendung eines desinfizierten Instruments und Einwegspritzen gewährleistet.

Vorbereitung auf das Verfahren

Es gibt keine Merkmale für die Entnahme von Material für diese Analyse. Blut wird ihm auf nüchternen Magen entnommen, damit kein hoher Gehalt an Substanzen darin ist, die die wahre Aussage verändern und ein falsches Bild vermitteln können.

Wie ist die Probenahme

Da für die Analyse keine besondere Vorbereitung erforderlich ist, lediglich eine Nahrungsaufnahme 12 Stunden davor und das Fehlen der Einnahme von Drogen ausgeschlossen ist, erfolgt die Entnahme des Untersuchungsmaterials als normaler Prozess der Entnahme von Körperflüssigkeit zur Analyse.

Subjektive Empfindungen während des Eingriffs können je nach Empfindlichkeit variieren.

Entschlüsselung der Ergebnisse

Durch den Einsatz moderner Testsysteme erhalten Sie genaueste Analyseergebnisse. Die folgenden Daten werden verwendet, um das Ergebnis zu entschlüsseln:

• Grad der Fluoreszenzintensität;
• Fluoreszenzfarbton;
• die periphere Natur des Glühprozesses des Objekts;
• Merkmale der Morphologie, der Lokalisation des Erregers im entnommenen Abstrich des Untersuchungsmaterials und seiner Abmessungen.

Bei der Untersuchung großer Objekte (z. B. Gardenerella, Trichomonas, bereits von Viren befallene Zellen) ermöglichen die oben aufgeführten Kriterien, die zuverlässigsten Ergebnisse zu erzielen. Allerdings haben die Elementarkörperchen von Mykoplasmen und Chlamydien Größen, die an der Auflösungsgrenze eines Fluoreszenzmikroskops liegen, was es schwierig macht

macht es schwierig, ein genaues Ergebnis zu erhalten, da das periphere Leuchten an Intensität verliert. Die verbleibenden Kriterien reichen für eine genaue Identifizierung der untersuchten Mikroorganismen nicht mehr aus. Aus diesem Grund werden an Spezialisten, die diese Art von Forschung durchführen, besondere Anforderungen gestellt: Ihr Qualifikationsniveau muss ausreichend sein, um mit den verfügbaren Daten zu arbeiten.

Aus diesem Grund kann sich nur ein entsprechend qualifizierter Arzt mit der Entschlüsselung der gewonnenen Analyse befassen. Lesen Sie unten mehr über den Preis der RIF-Forschung.

Durchschnittskosten

Der Preis eines Immunfluoreszenztests hängt vom Standort und der Ebene der medizinischen Einrichtung sowie von der Qualifikation des Spezialisten ab, der die Analyse durchführt. Heute liegen die Kosten zwischen 1280 und 2160 Rubel.

Im folgenden Video erfahren Sie mehr über immunologische Reaktionen:

Es gibt zwei Möglichkeiten, RIF (Coons-Reaktion) einzustellen – direkte und indirekte Immunfluoreszenzreaktionen.

Direktes RIF ist eine einfache Einstufenreaktion, erfordert aber eine große Menge an

markierte antimikrobielle Seren, dann ist es seltener indirekt, dessen Herstellung durch ein markiertes Antiserum bereitgestellt wird.

Indirekte RIF ist eine zweistufige Reaktion, bei der das Antigen zuerst mit unmarkiertem Speziesserum gebunden wird und dann der gebildete Antigen-Antikörper-Immunkomplex mit FITC-markiertem Antiserum behandelt wird, das Antikörper gegen das Immunglobulin dieses Komplexes enthält. Üblicherweise wird im Stadium I seiner Formulierung als Speziesserum immunisiertes Kaninchenserum verwendet, das durch Immunisierung von Tieren mit dem entsprechenden Mikroorganismus gewonnen wurde, und im Stadium II FITC-markiertes Anti-Kaninchenserum von Eseln oder anderen Tieren, die mit Kaninchen-Gammaglobulinen immunisiert wurden ( Abb. 9).

Direkte RIF-Einstellung. Auf einem fettfreien Glasobjektträger werden dünne Ausstriche vom Untersuchungsmaterial und Ausstrich-Abdrücke von Organen und Geweben gemacht. Die Präparate werden getrocknet, fixiert, Lumineszenzserum in Arbeitsverdünnung aufgetragen und 20-30 Minuten (25-40 Minuten - bei Raumtemperatur) in eine feuchte Kammer bei einer Temperatur von 37 ° C gestellt. Dann wird das Präparat zur Entfernung überschüssiger fluoreszierender Antikörper 10–15 Minuten in gepufferter isotonischer Natriumchloridlösung gewaschen, gefolgt von 10 Minuten Spülen in destilliertem oder fließendem Wasser. Bei Raumtemperatur trocknen und unter einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines Ölimmersionssystems untersuchen.

Zur Beurteilung der Intensität der spezifischen Fluoreszenz von Bakterienzellen wird eine Vier-Plus-Skala verwendet: "++++", "+++" - sehr hell und hell; "++", "+" - ausgeprägte und schwache grüne Kolonfluoreszenz von Zellen. Drei Kontrollen sind obligatorisch: 1) Behandlung mit fluoreszierenden Antikörpern homologer Bakterien (Positivkontrolle); 2) heterologe Kultur (Negativkontrolle); 3) nicht infiziertes Material (Negativkontrolle).

Antikomplementäres RIF. Die Reaktion ist eine Modifikation von CSC, bei der mit FITC markierte antikomplementäre Antikörper als Indikatorsystem dienen (Abb. 10).

Indirektes antikomplementäres RIF wird wie folgt aufgebaut: Das Antigenpräparat wird auf einem Glasobjektträger wie für RIF hergestellt, aber in Stufe I wird es nicht mit einem Immunserum, sondern mit seiner Mischung mit Meerschweinchen-Komplement und in Stufe verarbeitet II mit einem Antiserum, das FITC-markierte Antikörper enthält, um . Die weitverbreitete Verwendung von antikomplementärem RIF ist durch die Schwierigkeit, antikomplementäre Antikörper zu erhalten, und die Art und Weise, wie sie "markiert" werden, begrenzt.