Rekombináns szöveti plazminogén aktivátor. Szövetekből és biológiai folyadékokból izolált plazminogén aktivátorok

A plazminogén aktivátorok (AP) nagyon specifikus szabályozó típusú szerin proteázok. Számos ismert AP van izolálva vérből és más biológiai folyadékokból és emberi szövetekből. Fiziológiás aktivátorokra oszthatók, amelyek a termelés forrásától függően lehetnek szöveti (szervi), vaszkuláris (szöveti plazminogén aktivátor), plazma, vér, vizelet (urokináz) stb. és mikroorganizmusokból izolált (sztreptokináz). Szinte az összes AP proenzimek (plazminogén proaktivátorok) formájában képződik.

A plazminogén aktiválása lehet:

külső - a szövetek, a vér, az érfal aktivátorainak hatására, amelyek különböző tényezők hatására a vérbe kerülnek;

belső - plazmafehérjék részvételével - a Hageman-faktor, prekallikrein, nagy molekulatömegű kininogén;

exogén - plazminogén aktivátorok (sztreptokináz és az alapján létrehozott gyógyszerek, urokináz, streptokinase-lys-plazminogén komplex; géntechnológiával nyert szöveti plazminogén aktivátor és egyéb gyógyszerek) szervezetbe történő bejuttatása után terápiás célból.

A fibrinolízis belső aktivációs útvonala(Hageman-függő fibrinolízis) a vérplazma Hageman-faktora (XP-faktor) indítja be. A XII-es faktor és a nagy molekulatömegű kininogén-prekallikrein komplex idegen vagy megváltozott felületen (kollagén vagy egyéb) történő rögzítése után korlátozott proteolízissel aktív kallikrein képződik, amely katalizálja a XII-es faktor átalakulását aktív formává, a XIIa faktorba. . Ez utóbbi elősegíti a plazminogén plazminná történő átalakulását. A szabad kallikrein egyben közvetlen plazminogén aktivátor is.

A Hageman-függő fibrinolízis egyidejűleg aktiválódik a protrombináz belső mechanizmus általi képződésére szolgáló reakciókaszkád bevonásával, és fő célja az érrendszer megtisztítása az intravaszkuláris véralvadás során keletkező fibrinrögöktől. A Hageman-függő fibrinolízis aktiválásában a vérsejtekben található APH részt vehet.

Külső plazminogén aktivációs útvonal- a szövetkárosodás vezető útja, amelyet különféle szöveti plazminogén aktivátorok stimulálnak. Ezek közül a legfontosabb a szöveti plazminogén aktivátor (tPA) , amelyet az erek endothel sejtjei szintetizálnak, és szükség szerint a fibrinolízis aktiválására fordítják (13.15. ábra).

13.15 ábra A csap felépítésének vázlata

Az ő imája. 70 kDa tömegű, egy, az EGF-hez szerkezetileg hasonló doménje, 2 kringle és egy ujj alakú doménje van, amely a plazmin szerkezetére hasonlít. A tPA endotheliociták általi szekréciója nemcsak vaszkuláris trombózis során, hanem mandzsetta összenyomásakor, fizikai megterheléskor, vazoaktív anyagok (adrenalin, noradrenalin) és bizonyos gyógyszerek hatására is megtörténik. Ez az aktivátor és inhibitorai biztosítják a fibrinolitikus aktivitás folyamatos szabályozását. A tPA a vér külső fibrinolitikus aktivitásának 85%-át teszi ki.

Felépítését és hatásmechanizmusát tekintve a tPA hasonló a különböző szövetekben található egyéb fibrinolízis aktivátorokhoz, amelyek a szövetek károsodásakor (trauma, szövetpusztulás, szülészeti patológia stb.) kerülnek a vérbe. A fibrinolízis szöveti (szervi) tényezői között különleges helyet foglal el a veseszövet és a húgyúti hám által termelt fibrinolízis. urokináz, amelyek nagy része a vizelettel ürül. Az urokináz a vér külső fibrinolitikus aktivitásának körülbelül 10-15%-át biztosítja. Képes behatolni a thrombusba, és ott katalizálni a plazminogén plazminná való átalakulását, így nemcsak kívülről, hanem belülről is tönkreteszi a trombust.

Vérplazminogén aktivátorok a vérsejtek (eritrociták, vérlemezkék és leukociták) tartalmazzák, és felszabadulnak, amikor aktiválódnak és elpusztulnak, valamint trombózis során, különösen az endotoxin által kiváltott trombózis során.

Az exogén aktivátorok közül a legtöbbet tanulmányozott sztreptokináz - nem enzimatikus fehérje (móltömeg 47 kDa), amelyet β-hemolitikus streptococcus termel, és normál körülmények között nincs jelen a vérben. A sztreptokinázok, mint a decase, celiase, avelizin és mások, nem rendelkeznek független enzimaktivitással a plazminhoz képest, de plazminogénnel kombinálva komplexet képeznek, amely elindítja a plazminogén plazminná történő átalakulását. Így a sztreptokináz aktiválja a fibrinröghöz kötött plazminogént, valamint az oldható fázisban lévő plazminogént, amihez szabad plazmin képződik. Streptococcus fertőzés esetén lehetséges a streptokináz nagy mennyiségben történő képződése, ami fokozott fibrinolízishez (fibrinogenolízis) és hemorrhagiás diathesis kialakulásához vezethet. A plazminogén plazminná történő átalakulása, valamint a fibrinrögök lízisének folyamata ezeknek a vérrögöknek a felületén megy végbe. A fibrinrögök szelektíven adszorbeálják és megtartják a plazminogént. A fibrin(ogén)a molekula központi részében található lizinben gazdag helyek (LN-ek) a plazminogén kringle doménekhez kötődnek, egy plazminogén molekula pedig több fibrin(ogén)a molekulához kötődik, ami lehetővé teszi a plazmin molekula számára, hogy új sértetlenekre tudjon hatni. fibrin molekulák, amelyek kapcsolatban maradnak a szubsztráttal, és elkerülik az oldatba való átmenetet és az a2-antiplazminnal való érintkezéskor történő inaktivációt. A fibrinrög a plazminogénnel együtt specifikusan megköti a plazminogén aktivátorokat. A szöveti plazminogén aktivátorok alacsony katalitikus aktivitással rendelkeznek fibrin hiányában, és akkor aktiválódnak, amikor ahhoz kötődnek. A szöveti típusú aktivátorok – az urokináz kivételével – nagyobb affinitással rendelkeznek a fibrin iránt, mint a fibrinogén, ez magyarázza a túlnyomórészt fibrinolízist és nagyon alacsony mértékben a fibrinogenolízist. A plazminogén és aktivátorainak egyidejű jelenléte a fibrin felületén biztosítja a plazmin természetes képződését, a fibrin pedig oldható fragmentumokra hasad, ún. fibrin bomlástermékek(PDF).

Különféle PDP-k antikoaguláns, antipolimerizációs, antiaggregációs és egyéb tulajdonságokat mutatnak. A korai és késői PDF-ek meghatározását a fibrinolitikus aktivitás változásainak korai diagnosztizálására, a DIC stádiumaira, az elsődleges és másodlagos fibrinolízis megkülönböztetésére végzik. Sem a plazmin, sem a plazminogén aktivátor nem kötődik a PDP-hez, és ahogy a vérrög feloldódik, bejut a plazmába, ahol a természetes inhibitorok inaktiválják őket.

A találmány tárgya egy új, javított szövetaktív plazminogén (javított TAP), amelynek meghosszabbított felezési ideje a szervezetben és megnövekedett hő- és savakkal szembeni stabilitása, amely felhasználható a gyulladás visszaszorítására a trombusképződés környékén. A találmány tárgya továbbá eljárás az említett szöveti plazminogén aktivátor előállítására rekombináns DNS-technológiával, valamint az ennek megvalósításához használt eszközök. Ismeretes, hogy a humán szöveti plazminogén aktivátor (TPA) jótékony fibrinolitikus hatással rendelkezik, és rendkívül hatékony a fibrinhez kötött plazminogénnel szemben, miközben a szervezetben a szabad keringési fázisban nem aktiválja olyan hatékonyan a plazminogént, mint a hagyományos trombolitikus szerek, a sztreptokináz (SK). és urokináz (UK). A humán TSA aminosavszekvenciája és a humán TSA-t kódoló cDNS nukleotidszekvenciája ismert (Pennica. D. és munkatársai, Nature, 301, 214-221, 1983). Az is ismert, hogy az emberi TSA feloldja a vénás és artériás vérrögöket. Nagyszabású klinikai vizsgálatok során az intravénás humán csapda hatékonynak bizonyult az elzáródott koszorúér reperfúziójában akut szívinfarktusban szenvedő betegeknél. Ennek a gyógyszernek a trombózissal összefüggő betegség kezelésében való alkalmazásának hátránya azonban az enzimaktivitás rendkívül rövid felezési ideje a vérben (Rijken, D.C. et al., Thromb. Heamost. 54 (1), 61). 1985, Hubert, E. F. és munkatársai, Blood, 65, 539, 1985). Ha kezelésre használják, az emberi csapdát folyamatos intravénás injekcióként kell beadni, nagy dózisban. Ismeretes, hogy a természetben előforduló humán t-PA egy doménszerkezettel rendelkezik, amely a molekula N-terminálisától kezdődik, ezt követi egy ujjdomén, egy EGF (epidermális növekedési faktor) domén, két kringle 1 és kringle 2 domén, valamint egy szerin. proteáz dómer. Rijken és munkatársai megjegyezték (Rijken D.C. és munkatársai, Thromb. Heamost., 54 (1), 61, 1985), hogy a humán TSA rövid biológiai felezési ideje összefügghet a humán TSA összes tartományával, kivéve a szerin domén -proteázok. Zonneveld et al. (Zonneveld, A.J.V. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. USA., 83, 4670, 1986) azt is megjegyzik, hogy az ujj domén, az EDF domén és a kringle 2 domén fontos lehet a fibrinkötő aktivitás szempontjából. a természetben előforduló humán t-PA, valamint az APT fibrinfüggő aktiválásának fenntartása. Azonban még nem dolgoztak ki specifikus intézkedéseket a természetben előforduló humán t-PA fibrinkötő aktivitásának és fibrinfüggő aktivitásának fenntartására, valamint a biológiai felezési idő meghosszabbítására. A 48378/1987. számú japán közzétett szabadalmi bejelentésben egy TPB-t írnak le, amelyet egy természetben előforduló humán TPB 87-175 aminosavának törlésével nyernek, és amelyben a "kringle 1" ki van törölve. Ezt a csapdát egy további indukált pontmutáció jellemzi az epidermális növekedési faktor régióban. A japán szabadalmi bejelentés leírja, hogy a módosított t-PA képes fibrinhez kötődni, de a szöveti plazminogén aktivátor inhibitorral való kölcsönhatás gyenge. A 241208 számú európai szabadalmi leírás olyan TSA-t ír le, amelyet egy természetes előfordulású humán TSA 92-179 aminosavának törlésével nyernek, amelyből a "kringle 1" is törölve van. Ez a cikk megemlíti, hogy ennek a t-PA-nak fibrinolitikus aktivitása van. Ezen túlmenően az N 231624 számú európai szabadalmi leírás egy módosított TAP-t ismertet meghosszabbított felezési idővel. Az F-EGFK2-A szekvenciát tartalmazó módosított csapdából hiányzik a kringle 1 domén, azonban nem mutattak ki konkrét utat az elkészítésére. A fentiek fényében egyértelmű, hogy a találmány szerinti módosított TSA-nak a belső domének régiójában lévő aminosavszekvenciában kell különböznie a természetben előforduló TSA-tól. Kiterjedt kutatás eredményeként a kérelmező egy továbbfejlesztett TSA-t kapott, amely tartalmaz egy ujj domént, egy EDF domént, egy kringle 2 domént és egy szerin proteáz domént, de az első "kringle 1" domént egy adott helyen törölték, és a doménkötő helyen a "kringle 2" és a szerin proteáz mutációt eredményez, ami javított t-PA-t eredményez, amely kiválóan ellenáll a hőnek és a savaknak, jelentősen meghosszabbodik a biológiai felezési ideje és erős gyulladáscsökkentő hatással rendelkezik, miközben megtartja a kívánt tulajdonságokat. a természetben előforduló emberi t-PA. A találmány továbbfejlesztett APT-re vonatkozik. A találmány szerinti TSA kémiai szerkezetében jelentősen eltér a természetben előforduló emberi TSA-tól, és jobb tulajdonságokat mutat. A találmány szerinti javított TSA egy olyan polipeptid, amelynek aminosav-szekvenciája az 1. ábrán bemutatott általános képletnek felel meg. 28-29. ábrák, ahol R jelentése közvetlen kapcsolat, Y jelentése A-Ile-B (A jelentése Arg vagy Glu és B jelentése lys vagy Ile), előnyösen Glu-Jle-Lys. H 2 N az amino-terminális és -COOH a karboxi-terminális). A találmányban a "javított TSA" kifejezést a TSA analógjára használjuk, ahol A és B az alábbiakban leírt aminosavak:

Továbbfejlesztett APT (II): Arg, Lys;

Továbbfejlesztett APT (V): Arg, Ile;

Továbbfejlesztett APT (VI): Glu, Lys;

Továbbfejlesztett APT (VIII): Glu, Ile. A találmány tárgya továbbá a javasolt TSA analóg expressziója rekombináns DNS technikák alkalmazásával. Ehhez kapcsolódnak a javított tPA-t kódoló új DNS és a rekombináns DNS expressziós vektorok. Az 1. és 2. ábra egy javított (II) csapdát kódoló szintetikus génfragmens megalkotásához használt 16 oligodezoxinukleotid szekvenciáját mutatja be; 3-4. ábra: a találmány szerinti javított taktus (II) létrehozására szolgáló szintetikus gén fragmense, amely tartalmazza a Bge 11 és Eco R1 restrikciós enzimek végeit, amelyet az 1-2. ábrán látható 16 oligodezoxinukleotid felhasználásával állítottunk elő; 5. ábra - egy javított csapda (II) létrehozására szolgáló technika (az ábrán a fekete terület, az árnyékolt terület és a kitöltetlen terület jelzi az érett taktusfehérjét, a proproppeptidet kódoló régiót és a nem transzlált régiót; 6. ábra - módszer a IV. blokk szintetikus génfragmentum ellenőrzésére a DNS bázisszekvencia dideoxi módszerrel és 7-DEAZA módszerrel történő meghatározásával A 7. ábra a pVY1 expressziós vektor létrehozására szolgáló eljárást mutat állati sejtekben és a javított csapda DNS integrálását 8-13. ábra a javított taktust (II) és javított TPA-t (V) kódoló DNS-szekvenciák, 14-19. ábra - a javított APT-t (II) és javított APT-t (V) kódoló DNS-szekvenciákból származó aminosav-szekvenciák 20. ábra - restrikciós enzimek és a pTPA2 plazmid funkcionális térképe, amely a természetes APT gén Eco R1-Xho fragmentumát (körülbelül 1000 bázispár) tartalmazza a pBR322 vektorba integrálva az Eco R1 és Bam H1 hasítási helyeken; 21. ábra - mp9 (javított csapda (II), amely a gén BgL11-Xho 11 fragmentumát (körülbelül 1500 bázispár) tartalmazza, javított tapintat (II) integrálva az M13 mp9 kettős szálú DNS-be a BamH1 hasítási helyén; 22. ábra - függőség "dózis-hatás" a javított TSA (VI) és a természetben előforduló TSA aktivitására az S-2251 módszerrel fibrin szubsztituens jelenlétében (+Fb) és hiányában (-Fb); a 23. ábra mutatja a változást a javított TSA (VI) és a natív aktivitásában A 24. ábra a javított TSA (VI) reziduális aktivitásának változását mutatja hőkezelés után, a 25. ábra a limfocitaaktiváló faktor (LAF) gátlását mutatja a javított faktor által. A 26. ábra TSA (VI) denaturált fehérje, javított tapintat (VI) alkalmazásával végzett aktiválást mutatja az 1. ábrán. 27 - a denaturált fehérje lebomlása a javított TSA (VI) hatására. A rekombináns DNS és transzformált sejtek előállításának módszerét az alábbiakban részletezzük. Módszer javított APT elérésére. A természetes csapdát kódoló gént, amely alapján a jelen találmány szerinti taktust kapjuk, Bowes humán melanoma sejtekből készült cDNS-bankból izoláltuk. Poli A + RNS-t izoláltunk Bowes humán melanoma sejtekből, és szacharóz sűrűséggradiens centrifugálással frakcionáltuk. Ezután kis mennyiségű frakcionált poli(A)+RNS-t veszünk, és a TP gént kódoló mRNS-frakciót ponthibridizációval azonosítjuk egy oligonukleotid próba felhasználásával, amely képes felismerni a specifikus TP mRNS szekvenciát. Ezt a TP mRNS-ben gazdag frakciót kiindulási anyagként használva cDNS-bankot állítottunk elő, és a fent leírt TP mRNS azonosító próbával szűrtük. Mivel egyetlen olyan klónt sem izoláltak, amely az APT gén teljes szekvenciájával rendelkezne, a hiányzó bázisszekvenciát egy DNS-szintetizátor szintetizálja, hogy megkapja a kívánt gént. A kívánt gént ezután helyspecifikus mutációs indukcióval állítjuk elő. Az Eco R1-Xho 11 fragmentum természetesen előfordul az AT génben (körülbelül 1000 bázispár), amelynek egy része az N = végén deletált, bekerült a pBR332 vektorba az Eco R1 és BamH1 hasítási helyeken, és pTPA2-t kaptunk. . Az E. coli HB 101/pTPA2 törzset, amelyet E. colinak ezzel a plazmiddal való transzformálásával kaptunk, letétbe helyeztük a Japán Ipartudományi és Technológiai Ügynökség Fermentációs Kutatóintézeténél P-9649 letéti számon (FERM BP-2107). A pTPA2 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a 20. ábra mutatja. A javított tPA gént beépítjük a pVY1 plazmidba. A pVY1 plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pRSV10 plazmid (gyártó: Fine Chemical Pharmacy) BamH1-Kpn1 fragmentumát (körülbelül 2900 bp) ligáltuk a pAdD26SV (A) N 3 (N) plazmid Eco R1 emésztéséből származó fragmenssel (a Dr. Hiroshi Handa, a Tokiói Egyetem munkatársa (miután mindkét tompa végét megkaptuk. Ennek megfelelően ez a vektor az egér dihidrofolát-reduktáz gén cDNS-ét tartalmazza a fő adenovírus késői promoter (Ad2) transzkripciós szabályozása alatt, az SV 40 korai promoter a javított csapdától felfelé. gén inszerciós helye és intronja, valamint egy poliadenilációs szekvencia a találmány szerinti géntől lefelé, beépíthető más megfelelő expressziós vektorokba. Az expressziós vektort tovább juttatjuk egy megfelelő gazdasejtbe, hogy transzformánsokat kapjunk. Gazdasejtekként prokarióta sejtek, például E. coli, Bacillus subtilis stb., eukarióta mikroorganizmusok, például élesztő stb., valamint magasabb rendű állati sejtek használhatók. Az E. coli képviselőjeként általában a K12 törzshez tartozó JM109 törzset, W3110 törzset, Q törzset stb. használják, a Bacillus subtilis képviselőjeként pedig a BD170 törzset, BR151 törzset stb. Élesztőhöz RH218 törzs, SHY1 törzs stb. használható. élesztő Saccharomyces cerevisiae. Az expresszióhoz általában plazmidvektort vagy fágvektort használnak, amely a gazdasejtekkel kompatibilis fajból származó replikont és egy szabályozó szekvenciát tartalmaz. Az E. coli vektoraira példák például a pBR322, pUC18, pUC19 stb. plazmidok, fágok, például qt, Charon 4A stb., M13 fág stb. A Bacillus subtilis vektoraként a pUB110 lehet használt , pSA2100 stb., valamint YRp7, YEp61 stb. használható élesztővektorként. A vektornak olyan promotert kell hordoznia, amely képes kifejezni a kérdéses fehérjét. Egy E. coli gén vagy egy fággén promotereként például Lae, trp, tac, trc, pL stb. Gazdaként tenyésztett állati sejtek, például rhesus majom vesesejtek, szúnyoglárvasejtek, afrikai zöldmajom vesesejtek, egérmagzati fibroblaszt, kínai hörcsög petefészeksejtek, emberi magzati vesesejtek, lepketojás szövetsejtek, humán nyakhámszerű sejtek sejtek, humán mielóma sejtek, egér fibroblasztok és így tovább. SV40 korai promoter, SV40 késői promoter, eukarióta génből származó promotert hordozó SV40 (pl. ösztrogénnel indukálható madár ovalbumin gén, interferon gén, glükokortikoiddal indukálható tirozin aminotranszferáz gén, timidin kináz gén, adenovírus) korai és késői génként használható vektor, foszfoglicerát kináz gén, faktor gén stb.), szarvasmarha papillomavírus vagy ezekből származó vektorok. Ezenkívül ismert, hogy a sejtek által szekretált és termelt TP-k N-terminálisa eltérő a hasítási helyek különbségétől függően. A tenyésztő sejteket gazdaként használó TP szekréciója és termelése esetén a szignálpeptidáz vagy proteáz hasítási módszer a sejttípustól függően változik, így különböző N-terminálisokkal rendelkező TP fajok nyerhetők. Ez a jelenség nem csak a tenyésztett sejtek szekréciójára és termelésére alkalmas, mivel feltételezhető, hogy hasonló jelenség előfordulhat az E. coli, a Bacillus sublitis, az élesztő és más speciálisan módosított sejtek TSA-termelésében is. Hanahan, Hanahan, D. J. Mol. módszere használható egy gazdaszervezet transzformálására E. coli esetében integrált, javított tact gént tartalmazó expressziós vektor alkalmazásával. Biol., 166, 557, 1983), állati sejtek manipulálása esetén a kalcium-foszfát módszer használható (Vander Eb, A. J. és Graham, F. L., Method in Enrymoloqy, 65, 826, 1980, Academic Press) és így tovább tovább. Amint fentebb leírtuk, a javított ART felhasználható különféle szerzett betegségek kezelésében, beleértve a vaszkuláris koagulációt (még a mélyvénát is), a tüdőembóliát, a perifériás artériás trombózist, a szív- vagy perifériás artériás embóliát, az akut szívinfarktust és a trombotikus rohamot. A természetesen előforduló humán PTCA-hoz hasonlóan a továbbfejlesztett PTCA is különösen hasznos az akut miokardiális infarktus kezelésében. A természetben előforduló humán ART a közelmúltban hatékonynak bizonyult a koszorúér-elzáró trombus feloldásában, a szívizom perfúzió regenerálásában és az ischaemiás szívizomréteg legtöbb részének helyreállításában, ha intravénásan adják be 30-70 mg-os dózisban 1-3 óra alatt. A továbbfejlesztett csapda biológiai felezési ideje meghosszabbodik a vérben, ezért ugyanolyan hatékony, mint a természetes emberi tapintat. A továbbfejlesztett csapda várhatóan a természetes emberi tapintathoz hasonló klinikai hatást tud kifejteni a természetes emberi tapintat alkalmazásakor javasolt dózis körülbelül 10%-ának megfelelő dózisban, akár egyetlen adaggal is. Ezenkívül a találmány szerinti javított csapda a következő értékes tulajdonságokkal rendelkezik, amelyek a natív emberi tapintattal és a módosított tapintattal kapcsolatban még nem ismertek. a) Gyulladáscsökkentő hatás. A trombus helyén nemcsak magának a thrombusnak a képződését észlelik, hanem fibrin bomlástermékek vagy nyomokban kinin képződését is. Ezekről az anyagokról ismert, hogy gyulladást kiváltó hatásuk van, és így gyulladást okoznak a trombus területén. Emiatt kívánatos, hogy a trombózis kezelésére használt szer ne csak trombolitikus, hanem gyulladásgátló hatású is legyen. Az elvégzett vizsgálatok eredményeként a kérelmezőnek sikerült két funkció alapján gyulladáscsökkentő hatást tulajdonítania a javított TAP-nak. Ezek egyike, hogy a továbbfejlesztett csapda gátolja az interleukin 1 (IL-1) biológiai aktivitását, amely a gyulladásos válasz egyik mediátora. Úgy gondolják, hogy a makrofágok által termelt IL-1 részt vesz a gyulladásos válaszban a hipertermia, a fibroblasztok növekedésének felgyorsítása, a kollagenáz termelődése az ízületi sejtmembránban és így tovább, vagy a prosztaciklin szintézisének felgyorsítása révén az erek endothel sejtjeiben. Az IL-1 a májsejtekre is hat azáltal, hogy az akut fázisban felgyorsítja a fehérjék (szérum amiloid fehérje, fibrinogén stb.) termelődését, ami a gyulladással fokozódik. A bejelentő azt találta, hogy a javított csapda gátolja az egér timocita mitogén reaktivitásának növelésének aktivitását (LAF-aktivitás), amely az IL-1 egyik biológiai aktivitása. Egy másik funkciója az, hogy a javított csapda affinitással rendelkezik egy denaturált fehérjéhez (denaturált immunglobulin G, denaturált albumin stb.), amely a trombus helyén fellépő gyulladás eredménye, és emellett rendelkezik azzal a tulajdonsággal, hogy ez a denaturált fehérje aktiválja. Ennek az aktivitásnak köszönhetően a továbbfejlesztett csapda csak a denaturált fehérjét bontja le a gyulladás területén, és a gyulladás átmenetileg csökkenthető. A kérelmező nátrium-dodecil-szulfát gélelektroforézissel megerősítette, hogy a javított TSA csak a denaturált fehérjét bontja le. ábrán látható módon. A 26. ábrán látható, hogy a javított csapda aktiválása és szelektivitása a denaturált fehérje által nyilvánvaló. HCl-dal kezelt immunglobulin G-vel többször alacsonyabb koncentrációban ugyanazt az aktivitást mutatták ki, mint a BrCN-nel kezelt fibrinogénnél. Másrészt a normál immunglobulin C még 500 µg/ml koncentrációban sem mutat aktiváló hatást a jobb csapdára. Újbóli elzáródás megelőzése az elzáródott ér reperfúziója után. Ismeretes, hogy a trombózis természetes gyulladáscsökkentő gyógyszerekkel történő kezelésében az eltömődött véredény véráramlásának helyreállítása után nagy gyakorisággal figyelhető meg az újraelzáródás. Emiatt vérlemezke-alvadásgátlóval vagy antikoagulánssal kombinált terápiát végeznek. A kombinált terápia azonban magában foglalja a gyógyszerkölcsönhatások, a dózisszabályozás, a hasonló hatások stb. problémáit. Előnyösen maga a TSA is rendelkezik az újraelzáródást megelőző aktivitással. A jelen találmány szerinti javított APT képes megakadályozni az újbóli elzáródást kétféle aktivitás miatt. Az első típus a t-PA koncentrációjának gyors csökkenésének megelőzése egy javított t-PA bevezetése után a hosszabb hatástartam miatt, ami a Stuart-Holmes tünet megszűnéséhez vezet, és így megakadályozza annak előfordulását. az újraelzáródásról. A második típus az, hogy a vaszkuláris endothel sejtek IL-1 által okozott károsodásának megakadályozásával közvetett módon gátolja a vérlemezke koagulációt, ami megakadályozza az újbóli elzáródást. c) Megnövelt stabilitás. A fehérjekészítmények általában instabilak, ezért kívánatos a készítményeket fagyasztott száraz állapotban vagy alacsony hőmérsékleten oldat formájában tárolni. Ha akut szívinfarktusban szenvedő betegnek plazminogén aktivátort adnak be, a mortalitás csökkentése érdekében a roham kezdete után néhány órán belül el kell végezni az eljárást. Ebben az esetben kívánatosak a stabil, szobahőmérsékleten tárolható készítmények. Ezenkívül a megnövelt stabilitás lehetővé teszi a hőkezelést, savas kezelést és hasonlókat. a gyógyszerek elkészítése során. Közelebbről, ami a találmány szerinti javított TSA-t illeti, amelyet sejttenyészetekkel állítanak elő, lehetővé válik egy sejt eredetű retrovírus eltávolítása, amelyről ismert, hogy hő hatására instabil. Az alábbiakban a találmányt részletesebben, példákra hivatkozva ismertetjük, de nem korlátozódik azokra. Hacsak másképp nem jelezzük, a rekombináns DNS-t a laboratóriumi irányelvek szerint állítják elő. Maniatis T és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1982). 1. példa Klónozás tAT DNS-be. Bowes humán melanoma sejteket (a Dr. Roblin, R., National Cancer Research Institute, USA-tól vásároltunk) Opdenakker és munkatársai módszere szerint tenyésztettük. [Opdenakker, G. és munkatársai, Eur. J. Biochem, 131, 481-487 (1983)]. A tRNS mRNS indukálása érdekében TFA-t (12-O-tetradekanoil-forbol-13-acetát) adunk a tenyészelegyhez 100 ng/ml végső koncentrációban, majd 16 órán át tenyésztjük. A teljes sejt-RNS-t ezután a tenyésztett sejtekből Freeman és munkatársai által módosított módszer szerint extraháljuk. ((Okayama) Berqa DNA Manual, 3. o., 1985, Fine Chemicals Pharmacy). Oligo-dT cellulózoszlop segítségével (gyártó: Pharmacia Fine Chemicals) a poli(A)+RNS-t elválasztják az összes celluláris RNS-től. Ennek eredményeként körülbelül 10 o sejtből körülbelül 400 μg poli(A) + RNS nyerhető. Ezt a poli(A)+RNS-t szacharóz sűrűséggradiens centrifugálással frakcionáljuk a hagyományos módon. A frakcionált poli(A)+RNS egy részét vesszük, és dot-blot hibridizációt végzünk (Perbal, B., Apractical Gube to Molecular Cloninq, 410, 1984, John Wiley and Sons, Inc.) tBA-ra specifikus oligonukleotid próbával. mRNS. Az itt használt próba (Y próba) bázisszekvenciája 5'-GCNNGGCAAAGATGGCA-3', amely komplementer a Pennicaetal által leírt TPA szekvencia +291-től +297-ig terjedő aminosavait kódoló mRNS-régióval, és szintetizálta α-cianofoszfamidát módszer a 380A modell DNS-szintetizátorral (gyártó: Applied Biosystems). A DNS-oligomer szintézisét, a védőcsoport lehasítását, a gyantáról való lehasítást és a tisztítást a DNS-szintetizátor (Model 380A) használati utasítása szerint hajtjuk végre. Az Y próba 5' végén lévő radioaktív jelölését a laboratóriumi kézikönyv szerint végeztük, T4 polinukleotid kinázt (gyártó: Taka-Ra Shuzo Co., Ltd.) t-vel és -(32 P) ATP-vel. Az Y próba hibridizált erősen, főleg 20-30S poli(A) + RNS-sel (ezt a frakciót M frakciónak nevezik) Templát segítségével 10 μg poli(A) + RNS-t készítünk az M frakcióból, 3 μg kétszálú cDNS-t kapunk. reverz transzkriptázzal (gyártó: Biochemical Industry Co., Ltd.) szintetizáltuk Gubler-Hoffman módszere szerint (Gubler, U. és Hoffman, B. J., Gene 25, 263, 1983), és hozzáadtuk a kétszálú cDNS-hez a A dezoxi-C lánc 3' vége Denq-Wu módszere szerint [Denq, G. R. és Wu, R., Nucleic Acids Res., 9, 4173, 1981). A dezoxi-C lánccal meghosszabbított kétszálú cDNS-t ezután gélszűrésnek vetjük alá Sepharose CL 4B-n (gyártó: Fine Chemicals Pharmacy), hogy eltávolítsuk az 500 bázispárnál kisebb molekulatömegű nukleinsavakat. Ezt követően a cDNS-t pBR322-vel (gyártó: Bethesda Research) kapcsoltuk össze, amely a Pst 1 helyen tartalmazta a dezoxi-G-láncot, hagyományos technikával. A lágyítás után kapott keveréket E. coli HB101 kompetens sejtekbe transzformáltuk (gyártó: Takara Shuzo Co. , Ltd.). Az eredmény egy körülbelül 4000 független transzformánsból álló cDNS-bank. Ezt a cDNS-t telephibridizációnak vetettük alá a fent leírt Y próbával a Woods-módszer szerint (Woods, D., Focus, 6 (3), 1, 1984, gyártó: Bethesda Research Lab.), hogy Y-próbával kölcsönhatásba lépő klónokat kapjunk. A klónok közül a leghosszabb TPA cDNS-t tartalmazó pTPA1 klónt azonosították. Ezután a didezoxi-módszert hajtják végre (Carlson, J. és munkatársai, J. Biotechnoloqy, 1, 253, 1984) az M13 fágvektor és a 7-DEAZA módszer alkalmazásával (Mizusawa S. és munkatársai, Nucleis Acids Res. ., 14, 1319, 1986). Ennek eredményeként azt találtuk, hogy a pTPA1 plazmid tartalmazza a Pennicaetal által leírt TPA gén T y+441-től A y+2544-ig terjedő bázisszekvenciáját. 2. példa Egy továbbfejlesztett APT (II) tervezése. Az 1. példában bemutatott pTPA1 plazmidban az N-terminális régió nem elegendő egy javított TPA (II) létrehozásához, amelyből hiányzik a kringle 1 domén. Ezért egy hiányos DNS-szegmenst szintetizáltunk a fent leírtak szerint 380A DNS-szintetizátorral (gyártó: Applied Biosystems). A szintetizált oligomer bázisszekvenciáját és a teljes szintetizált szekvenciát az 1. ábra mutatja. 1-4. A javított TSA (II) ezen oligomerek felhasználásával történő előállításának specifikus technikáit az 1. ábra mutatja be. 5-6. 2-1). Blokk IV konstrukció (Bql II-Eco R1 fragmentum, körülbelül 480 bp). ábra IV. blokkjának töredéke. Az 5. ábrát a következő módon kapjuk meg. Először is, a laboratóriumi útmutatások szerint, 40 pmol a 2., 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9., 10., 11., 12., 13., 14. és 15. számú szintetikus oligonukleotidok mindegyikéből. Az 1-2. vegyületet 10 egység T4 polinukleotid kinázzal (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.) foszforileztük 37 °C-on 1 órán át 50 µl reakcióoldatban. A reakcióoldatot fenollal kezeljük. Etanollal történő kicsapás után a csapadékot csökkentett nyomáson szárítjuk és steril desztillált vízben feloldjuk. Miután mindegyik oligomerből 40 pmol-t 150 µl 6 mM Tris-HCl-t (pH 7,5), 20 mM NaCl-t, 7 mM MgCl 2-t és 0,1 mM EDTA-t tartalmazó oldatban ülepítettünk 80 o C-on 5 percig, hőmérsékleten. 60 o C-on 5 percig és szobahőmérsékleten egy órán át, az I. blokk (1., 2., 3. és 4. oligomer), a II. blokk (5., 6., 7., 8., 9. és 10. oligomerek) ill. A III. blokk (11., 12., 13., 14., 15. és 16. oligomer) etanollal történő kicsapást és csökkentett nyomáson történő szárítást végez. A maradékot 40 µl steril desztillált vízben oldjuk. A reakciót 400 µl reakcióoldatban 4 °C-on 15 órán át végeztük DNS-ligációs kit (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.) alkalmazásával. Etanollal történő kicsapás és csökkentett nyomáson történő szárítás után a csapadékot steril desztillált vízben oldjuk fel: az I. blokk (1) esetén gélelektroforézist 5%-os poliakrilamidban (laboratóriumi kézikönyv) végezzük, elválasztjuk és hagyományos módon tisztítjuk. (laboratóriumi kézikönyv), egy körülbelül 100 bázispár méretű töredéket, a II (2) és a III. blokk (3) esetében pedig a gélelektroforézist 3%-os agaróz gélben (LMP agaróz, gyártó: BRL) végezzük ( laboratóriumi kézikönyv) és körülbelül 190 pár darabjait izoláljuk és elektroelucióval tisztítjuk (laboratóriumi kézikönyv). Ezután 0,1 µg, 0,2 µg és 0,2 µg I. blokk, II. blokk és III. blokk fragmentumot ligálunk a fenti DNS ligációs kit segítségével. Végezzen gélelektroforézist 1,5% agaróz koncentrációban a körülbelül 480 bázispárból álló Bgl II-Eco R1 fragmentum (IV. blokk) izolálásához. A DNS-t ezután elektroeluálással izoláljuk az agaróz gélből. Ezt a DNS-t ezután 100 µl reakcióoldatban 37 °C-on 1 órán át foszforilezzük 10 egység fenti T4 polinukleotid kináz felhasználásával, majd fenollal kezeljük, etanollal kicsapjuk és csökkentett nyomáson szárítjuk. Ezt a szintetikus génfragmenst és blokk IV bázisszekvenciát bázisszekvenálással igazoltuk didezoxi-módszer szerint, M13 fágvektort használva. A speciális technikákat az ábra mutatja. 6. A fenti Bgl II-Eco R1 blokk IV fragmentumot a BamH1 restrikciós enzimekkel emésztett M13 mp18 DNS-sel (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) ligáljuk (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) és Az Eco R1 (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) bázisszekvenciáját az M13 szekvenáló készlettel (gyártó: Taraka Shuzo K., Ltd.) és a 7-DEAZA szekvenáló készlettel (gyártó: Takara Shuzo Co.) határoztuk meg. , Ltd.). A Bgl11 restrikciós enzim hasítási helye és a BamH1 restrikciós enzim hasítási helye izoszkizomer elrendezésben ligálódik (BamH1 - Bgl11 hasítási vég - hasítási hely), és a ligált fragmentum Xho 11 restrikciós enzimmel hasítható, így természetes Bgl 11 ill. Bamh1 hasítási végek, ill. A pontosabb bázisszekvenálás érdekében az M 13mp18 fágot (amely a IV. blokk fragmensét tartalmazza) E. cjli JM109-cel fertőzzük meg Messing/Messing J. módszere szerint: Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983), ami után kettős szálú DNS-t kapunk (replikatív típus). Miután ezt a DNS-t (50 μg) Xho 11 (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co) és Eco R1 restrikciós enzimekkel emésztettük, gélelektroforézist hajtottunk végre 1,5%-os agarózgélen a körülbelül 480 bázispárból álló fragmentum (IV. blokk) izolálására. . Ezt a DNS-t elektroelúcióval extraháljuk. Miután az extrahált DNS-t M13mp19 DNS-sel (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) ligáltuk, Eco R1 és BamH1 restrikciós enzimekkel hasítottuk a fent leírt módon, DNS ligációs kit segítségével, meghatároztuk az bázisszekvenciát. A fent leírtak szerint ez a szekvencia pontosabban ellenőrizhető mindkét DNS szekvenálásával M13mP18 és M13mp19 alkalmazásával. Ezenkívül a leírt módszerrel kétszálú replikatív M13mp19 DNS-t kapunk (IV blokkkal). Ezt a DNS-t (50 μg) Eco R1 és Xho 11 restrikciós enzimekkel emésztjük, gélelektroforézist hajtunk végre 1,5%-os agarózban, miközben izolálunk egy körülbelül 480 bázispárból álló fragmentumot (IV. blokk). 2-2). V blokk izolálás (Eco R1-Bal1 fragmentum, körülbelül 1250 bp). Az 1. példában kapott pTRA1 klónból a plazmid DNS-t nagy mennyiségben izoláltuk a laboratóriumi kézikönyvben leírt módszer szerint, amint az a 2. ábrán látható. 5. Miután ebből a DNS-ből 70 μg-ot Bal1 (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.) és Nar1 (gyártó: Nirro Gen Co., Ltd.) restrikciós enzimekkel emésztettünk, 0,8%-os agaróz gélelektroforézist végeztünk a Nar1- izolálására. Bal1 fragmentum (kb. 1540 bázispár). A DNS-t elektroelúcióval izoláljuk. Ennek a DNS-nek az Eco R1 restrikciós enzimmel történő további részleges emésztése után elektroforézist hajtottunk végre 0,7%-os agarózgélen, kiemelve az Eco R1-Bal1 fragmentumot (körülbelül 1250 bázispár). A DNS-t elektroelúcióval izoláljuk. 2-3). A javított tAM(II) gén megalkotása a IV. és V. blokkból. Amint az a 3. ábrán látható. Az 5. ábrán a javított tPA gént az alábbiak szerint kapjuk. A 2-1. példában kapott IV blokk (Bgl11-Eco R1 fragmens, körülbelül 480 bp) a 2-2. példában kapott V blokkkal (Eco R1-Bal1 fragmentum, körülbelül 1250 bp) a 2-2. A fentiekben az adalékolt terméket etanolos kicsapásnak vetjük alá. Csökkentett nyomáson történő szárítás után a csapadékot Xho 11 restrikciós enzimmel emésztjük a szokásos módon. Ezután 0,8%-os agaróz gélelektroforézist hajtunk végre a Bgl 11-Xho 11 fragmentum izolálására (körülbelül 1500 bázispár, a javított tPA gént tartalmazza). A DNS-t ezután elektroelúcióval izoláljuk. Az így kapott javított tPA(II) gén teljes bázisszekvenciáját az 1. ábra mutatja. 8-13. A kikövetkeztetett aminosavszekvenciát az 1. ábra is mutatja. 14-19. 3. példa A javított tact V, VI és VIII gén megalkotása. A javított tact V, VI vagy VIII gén megalkotása a (II) javított tact génen alapul, hivatkozással a következő publikációkra. A genetikai konverziót helyspecifikus mutációindukció módszerével hajtják végre. Publikációk: Zoller M. J. és Smith. M., Method in fermentology, 100, 468-500 (1983), Zoller M. J. és Smith. M. DNA, 3, 479-488 (1984), Morinaga, Y. és munkatársai, Biotechnology, 636-630 (1984. július), Adelman J. P. és munkatársai, DNA, 2, 183-193. 1983), 6. M13 Sequencing Manual (puC), kiadó: Jean Sayens Room Co., Ltd.). 3-1). A javított trap gén (V) felépítése. A) M13mp19 (apt/p/) generálása mutációhoz. A 2. példa 2-3. pontjában részletesen leírt javított (II) tapintatgén-fragmenst BamH1 restrikciós enzimmel és alkalikus foszfatázzal (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.) kezelt M13mp9 kettős szálú DNS-hez ligáljuk. A ligációs terméket E. cjli JM109 kompetens sejtekbe transzfektáltuk (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.). Mindegyik színtelen steril foltot termelő klónt E. coli JM109 fertőzésre használtuk. Az egyszálú DNS-t a tenyészet felülúszójából, a kétszálú (replikatív) DNS-t pedig az E. cjli sejtekből a Messing-módszer szerint izoláljuk (Messing, J., Methods in Enzymology, 101, 20-78, 1983). ). Ezeknek a kettős szálú DNS-eknek a Pst1 restrikciós enzimmel agaróz gélelektroforézissel történő emésztést követően történő jellemzése egy mp9 klónt eredményez (javított TPA(II), amelyben a TPA(II) gén a kívánt irányban beépül az mp9 DNS-be, amint az az 1. ábrán látható. 21. Ezen DNS-ek egy részének Pst restrikciós enzimmel történő hasítása után 0,8%-os agaróz gélelektroforézist végeztünk, ahol az mp9 klón (javított TAP(II)) egyszerű sávot mutatott a 7300 bp, 840 bp, 430 bp és 80 bp pozíciókban. Ennek a klónnak az egyszálú DNS-ét használták fel egy következő helyspecifikus mutációs indukciós kísérletben. B) Helyspecifikus mutációt indukálni képes primer szintézise. A javított tPA(II) gén helyspecifikus mutációjának indukálására használt szintetikus oligonukleotidot a β-ciano-etil-foszfoamidát módszerrel szintetizálták egy 380 A típusú DNS-szintetizátor (gyártó: Applied Biosystems) alkalmazásával. A DNS-oligomer szintézisét, a védőcsoport eltávolítását, a gyantáról való lehasítást és a tisztítást a 380 A DNS-szintetizátor használati utasításának megfelelően hajtjuk végre. Egy adott helyen mutáció indukálásához egy primert (1), amely képes helyspecifikus mutációt indukáló vegyületet és egy primert (2) készítünk a didezoxiszekvenáláshoz az M13 fágvektort használva (Carlson, J. és munkatársai, Journal of Biotechnology, 1, 253, 1984). A javított TSA (II) aminosav- és nukleotidszekvenciáját megadjuk. A mutációt indukálni képes primer (1) az aláhúzott bázissal különbözik a javított (II) csapda génszekvenciájától (lásd az 1. táblázatot). C) Helyspecifikus mutáció indukálása. Az alábbiakban bemutatunk egy eljárást az (1) primer bázisszekvenciáját tartalmazó klón létrehozására, amely képes mutációt előidézni, nevezetesen a javított tPA (IV) génjét. A 3. példa 3-1. pontjában leírt egyszálú DNS annealizálása (renaturálása), A) mp9 klón (javított TPA (II) és primer (1) után a renaturációs terméket kétszálú DNS-vé alakítottuk, amely Ezután E. coli JM109-be transzformálják. Ezután egy szekvenáló primer segítségével a DNS-szekvenciákat átvizsgálják, hogy izolálják a fág klónját, amely mutáns javított tAM(II) gént, azaz javított TAT(V) gént hordoz. 5'- a szintetikus oligomer végfoszforilációja. A helyspecifikus mutáció indukálására szolgáló DNS-primert (1) a 2.2-1. példában leírt módszerrel foszforilezzük.)) és 1,5 µg M13mp9 kettős szálú DNS-t, amelyet BamH1 restrikciós enzimmel emésztünk. 30 µg 2 pmol foszforilált primert (1), 10 mM Tris-HCl-t (pH 7,5), 0,1 mM EDTA-t és 50 mM NaCl-t tartalmazó oldatban melegítünk 90 °C-on (2 perc), 50 °C-on. 5 perc), 37 °C (5 perc) és szobahőmérsékleten (10 perc). Az oldathoz 36 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) oldatot adunk, amely 4 egység Klenow enzimet, 7 egység T4 DNS ligázt, 0,1 mM EDTA-t, 12 mM MgCl 2-t, 10 mM ditiotreitolt, 0,7 mM ATP-t tartalmaz. 0,07 dATP és egyenként 0,2 mM dGTP, dTTP és dCTP, hogy serkentsük a primer megnyúlását. A keveréket 20 o C hőmérsékleten 2 órán át, 4 o C hőmérsékleten 15 órán át kölcsönhatásnak vetjük alá. A transzformációt a fent leírt oldattal és E. coli JM109 kompetens sejtekkel (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.) hajtottuk végre, amíg lízisfoltok nem keletkeztek. A színtelen folt elválasztása után a fágot E. coli JN109-cel fertőzzük, hogy szaporodjon. Ezután mindegyik klónhoz egyszálú templát DNS-t nyerünk a tenyészet felülúszójából. Ezeket az egyszálú DNS-eket csak a didezoxi-módszer „T” reakciójának (a 3-2. példában „A” és „T” reakció) vetettük alá a (2) szekvenáló primer alkalmazásával, majd poliakrilamid gélelektroforézissel. Szárítás után a gélt autoradiográfiával analizáltuk. Az eredmények alapján azonosítjuk a kívánt mutáns szekvenciával rendelkező klónt. A klón tenyészet felülúszóját használtuk az E. coli JM109 sejtek megfertőzésére, és újra beoltottuk a lemezre úgy, hogy egyetlen foltot izoláljunk. A kapott egyetlen festésből egyszálú DNS-t izolálunk a fenti módszer szerint. Ezeknek a DNS-eknek a felhasználásával először a DNS bázisszekvenciáját határoztuk meg didezoxi-módszerrel a (2) szekvenáló primer segítségével, hogy a kívánt bázisszekvenciára mutált klónt kapjunk. Miután ezt a fágklónt E. coli JM-109 sejtekkel megfertőztük a 2. példában leírt messing módszerrel, kettős szálú DNS-t kapunk. Ezt a kettős szálú DNS-t Xho 11 restrikciós enzimmel emésztjük, majd 0,8%-os agaróz gélben elektroforézist hajtottunk végre a fragmens izolálására (kb. 1500 bázispár javított tact génje (V), amely a javított tact gént tartalmazza. Ezután a DNS-t extraháltuk Ezen túlmenően a didezoxi módszerrel meghatározzuk az így kapott DNS teljes bázisszekvenciáját, amiből kiderül, hogy a DNS a javított tAM(V) gén. gén (bár -35 és -1 közötti szignálpeptidet tartalmaz) a 11-13. ábrákon látható. Az ebből származó aminosavszekvencia a 17-19. ábrákon is látható. 3-2) Javított TPA-k (VI) készítése és (VIII). A technikák hasonlóak a 3. példában leírtakhoz, 3-1). Először az M13mp3-at (javított TAP(II)) állítják elő, majd primereket szintetizálnak, hogy helyspecifikus mutációt indukáljanak. Ezeknek a primereknek a bázisszekvenciáját fentebb leírtuk, azonban az 5'-foszforilált primert (3) és az 5'-foszforilált primert (5) használjuk a javított tAM-gén (VI) és a javított tact-gén (VIII) létrehozására. , illetve (lásd az ábrát. lapon. 2). Helyspecifikus mutáció indukálását követően a teljes bázisszekvenciát didezoxi-módszerrel határozzuk meg. Megerősítették, hogy rendelkeznek a kívánt bázisszekvenciákkal. Így megkapjuk a javított tapintat (VI) és javított tapintat (VIII) génjeit. Ezeket a géneket azután a 4. és 5. példában leírt eljárás szerint integráljuk a pVY1 vektorba. 4. példa A javított tPA(II) gén integrálása a pVY1 vektorba. 4-1) A pVY1 vektor megalkotása. A pVY1 vektort az 1. ábrán látható módon állítjuk elő. 7. A) A pAdD26SV (A) N3 (N) előállítása és az Eco R1 hasítási hely tompítása. Először is, a pAdD26SV(A) N3 DNS-t (amelyet Dr. Hiroshi Handa-tól vásároltak a Tokiói Egyetemen, Mo1, Ce 11. Biol, 2 (11, 1982)) leválasztják a Bgl11 restrikciós enzimmel (gyártó: Boehringer). Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) hagyományos módon.A DNS-t hagyományos módon, Klenow enzim segítségével (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) tompa végűvé teszik. Csökkentett nyomáson szárítjuk, majd a csapadékot steril desztillált vízben feloldjuk, majd a reakciókeverékkel kompetens E. coli HB101 sejtekbe transzformáljuk (gyártó: Takra Shuzo, Co. Ltd.) Tetraciklinrezisztens transzformánsokból plazmid DNS-eket állítottunk elő. a szokásos módon Miután ezeknek a DNS-eknek egy részét BgL1 restrikciós enzimmel emésztettük, 0,7%-os elektroforézist hajtunk végre. Fenollas kezelés, etanolos kicsapás és csökkentett nyomáson történő szárítás után a csapadékot desztillált steril vízben feloldjuk. B) A Kpn 1-BamH1 fragmentum (körülbelül 2900 bp) izolálása pKSV10-ből és tompa végek kialakítása. Miután a pKSV10 DNS-t (gyártó: Fine Chemicals Pharmacy) hagyományos módon Kpn1 és BamH1 restrikciós enzimekkel emésztettük, a DNS-t T4 DNS polimeráz segítségével tompa végűvé alakítottuk (laboratóriumi kézikönyv, 114-121. oldal). Ezután végezzünk elektroforézist 0,7%-os agaróz gélben, körülbelül 2900 bázispár méretű fragmens kiosztásával. A fragmentumot ezután elektroliutizálják a DNS kivonására.

C) A pVY1 megalkotása. Az A) lépésben kapott DNS-fragmens és a B-ben kapott DNS-fragmens ligálása után kompetens E. coli HB101 sejteket transzformálunk (lásd fent). A tetraciklinre rezisztens transzformánsokból a plazmid DNS-t hagyományos módon nyerik ki. A plazmid DNS-ek egy részének Pst1 restrikciós enzimmel (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) történő hasítása után 1,0%-os agaróz gélelektroforézist hajtottunk végre. Az eredmény egy klón (pVY1 plazmid), amelyet körülbelül 3400 bázispár, körülbelül 3200 bázispár és körülbelül 1400 bázispár hosszúságú sávok jellemeznek. Ez az E/coli HB101 klón (a pVY1 a Japán Ipartudományi és Technológiai Ügynökség Fermentációs Kutatóintézeténél van letétbe helyezve P-9625 (FEPM BP 2106) regisztrációs szám alatt. 4-2) A továbbfejlesztett tPA integrálása (II) gént a pVY1 vektorba. A 4-1. példában kapott pVY1 plazmid DNS-ét a BgL 11 restrikciós enzimmel a szokásos módon hasítjuk, majd alkalikus foszfatázzal (gyártó: Takara Shuzo. Co. Ltd.) defoszforilációt hajtunk végre. Ezután háromszor végezze el a fenolos kezelést. Etanollal történő kicsapás és csökkentett nyomáson történő szárítás után a csapadékot steril desztillált vízben oldjuk. Miután ezt a DNS-t a 3., 3-1. példákban kapott BgL 11-Xho 11 fragmenshez (körülbelül 1500 bázispár) ligáltuk, és kompetens E. coli HB101 sejteket transzformáltunk a ligációs termékkel a fent leírt módszer szerint. A tetraciklinnel szemben rezisztens transzporánsokból a hagyományos módon plazmid DNS-t kapjunk. Ezeknek a DNS-eknek a restrikciós enzimekkel (BqL 11, Pst 1) történő hasítása után kiválasztunk egy klónt, amely a pVY1 vektorban a kívánt irányban integrált javított tPA(II) gént tartalmaz, és a szelekció az agaróz gél elemzése alapján történik. elektroforézis minta. Először ezeknek a DNS-eknek egy részét BqL 11 restrikciós enzimmel emésztjük, majd 0,8%-os agaróz gélelektroforézist követünk, hogy olyan klónt kapjunk, amelynek fragmenssávja körülbelül 1500 bp, amikor a BqL 11-Xho 11 fragmentumot a BqL fragmenshez ligáljuk. 11 pVY1 plazmidot, az Xho 11 és BqL 11 ligált része a BqL 11 restrikciós enzimmel hasítható. Ezen klónok plazmid DNS-ének egy részét tovább emésztjük a Pst1 restrikciós enzimmel, és a DNS-t elektroforézisnek vetjük alá 0,8% agaróz gélt, hogy olyan klónt kapjunk, amelynek egyetlen sávja körülbelül 3400 bp, két körülbelül 2300 bp sáv, egy körülbelül 1400 bp sáv és egy körülbelül 80 bp méretű sáv van. Ennek a klónnak a felhasználásával (a laboratóriumi kézikönyv szerint a pVY1-TPA (II) plazmidok plazmid DNS-eket kaptunk a 4-1. példában) a BqL 11 restrikciós enzimet hagyományos módon defoszforileztük alkalikus foszfatázzal (gyártó: Takara Shuzo, Co., Ltd.). , majd háromszor fenollal kezeljük, etanollal kicsapjuk, és csökkentett nyomáson szárítjuk. A csapadékot ezután steril desztillált vízben oldjuk. Miután ezt a DNS-t a 2., 2-3. példákban kapott, körülbelül 1500 bázispár méretű BqLII-Xho 11 fragmenssel ligáltuk, a ligálási terméket a fenti kompetens E. coli HB101 sejtekbe transzformáltuk. A plazmid DNS-t a tetraciklinre rezisztens transzformánsokból nyerjük ki a hagyományos módszerrel. Ezeknek a DNS-eknek a BqL11 és Pstl restrikciós enzimekkel történő emésztése után agaróz gélelektroforézist hajtunk végre. Az agaróz gél elválasztási mintájának elemzésével olyan klónokat választunk ki, amelyekben a javított tPA (V) gént a kívánt irányban a pVYI vektorba inszertáljuk. Először is, miután ezeknek a DNS-eknek egy részét a BqL11 restrikciós enzimmel hasítottuk, 0,8%-os agaróz gélelektroforézist végeztünk klónok előállítására, és körülbelül 1500 bázispár hosszúságú sávot kaptunk. Ha a BqL11-Xholl fragmenst a pVYI vektor BqL11 fragmentumához kapcsoljuk, az Xholl és BqL11 egy része a BqL11 restrikciós enzimmel lehasítható a fent említett izoskizomer konfiguráció miatt. E klónok plazma DNS-einek egy részének Pstl restrikciós enzimmel történő további emésztése után elektroforézist hajtottunk végre 0,8%-os agarózgél-koncentráció mellett, így kaptunk egy klónt, amely körülbelül 3400 bp sávot, körülbelül 2300 bp sávot és két sávot eredményezett. körülbelül 1400 bp, egy körülbelül 800 bp sáv és egy körülbelül 80 bp sáv. Egy klón (pVYI-TAP(V) plazmid) segítségével nagy mennyiségben plazmid DNS-t nyertünk a laboratóriumi kézikönyv alapján. Hasonló módon a javított tPA-k (VI) és (VIII) génjei integrálódnak a pVYI vektorba. 6. példa Javított tPA expressziója CHO-sejtekben. A pVYI - javított t-PA(VI), t-PA(II), t-PA(V) vagy t-PA-(VIII) plazmidot DHFR-deficiens CHO-sejtekbe transzfektáljuk [Urlaub és munkatársai, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 77(7), 4216-4224, 1980) kalcium-foszfátos módszerrel [Graham és mtsai. Viroloqy, 52, 456, 1973). A metotrexát (MTX) jelenlétében szelektív táptalajon (MEM A LPHA (-), GIBCO) előállított transzformált klón 50-100 egység/ml TAP aktivitást mutat (az értéket a fibrin/agaróz lemez határozta meg alább ismertetett módszer). Ezt a klónt további kutatásokhoz használják. Gyártóközegként 20 nemzetközi egység/ml (SIGMA) aprotininnel dúsított GIT táptalajt (gyártó: Waco Pue Chemical Industry Co., Ltd.) használtunk. 7. példa A javított TSA tisztítása a CHO-sejtek tenyészet felülúszójából. A 6. példában kapott tenyészet felülúszóját részlegesen tisztítottuk anti-TGA monoklonális antitest affinitási oszlopon. A humán melanomasejtekből származó t-PA-hoz monoklonális antitesteket termelő hibridet állítanak elő hagyományos módon. Az antitest-termelő hibridet egerekbe oltottuk, majd az ascitesben kifejlesztett monoklonális antitestet (alosztály: IgGM1) Cellulofin Protein A (gyártó: Biochemical Industry Co., Ltd.) és MAPS pufferrendszerrel extraháltuk és tisztítottuk a monoklonális tisztításhoz. a Biorad Laboratories által gyártott antitest. Az antitestet CN3r-aktivált Sepharose-hoz (gyártó: Pharmacia Fine Chemicals) kapcsoljuk 4 mg/ml gél sebességgel a hagyományos módon. Az antitestgélt (24 ml) összekeverjük 4 liter tenyészet felülúszójával. Egy éjszakán át 4 °C-on enyhe rázatás után a gélt egy oszlopra (1,5 cm x 20 cm átmérőjű) visszük fel. A gélt ezután egymás után 125 ml-rel mossuk az alábbi oldatok mindegyikével (1) Tris-HCl puffer pH 7,4 (A puffer), amely 25 NE/ml aprotinint (gyártó: SIGMA) és 0,01 tömeg/térfogat% Tween 80-at tartalmaz. , (2) 0,5 M NaCl-t tartalmazó A puffer, (3) 4 M karbamidot tartalmazó A puffer és (4) A puffer. A javított gélhez kötött TSA-t 0,2 M glicin-HCl pufferrel eluáltuk, pH 2, 5, amely 25 nemzetközi egység/ml aprotinint és 0,01% (w/v) Tween 80-at. Az aktív frakciókat kinyerjük és egyesítjük. 10 mM Tris-HCl pufferrel (pH 7,4), amely 25 nemzetközi egység/ml aprotinint és 0,01% (w/v) Tween 80-at tartalmazott, a dializátumot egy éjszakán át 20-30-szor koncentráltuk vákuum centrifugális koncentrátummal (Speed ​​VAC, gyártott). SAVANT Inc.). A koncentrátumot ismét 10 mM Tris-HCl pufferrel (pH 7,4), amely 0,15 M NaCl-ot, 25 IU/ml aprotinint és 0,01% (w/v) Tween 80-at tartalmaz, egy éjszakán át dializáljuk, majd a következő in vitro és in vivo értékelésekhez használjuk. . Végül a fajlagos aktivitás 3700-5000-szeresére nő, és a hozam a TAP aktivitásának 36-42%-a (fibrin/agaróz csésze módszerrel meghatározva). Ezt az aktív frakciót nátrium-dodecil-szulfát elektroforézissel és ezüstfestéssel analizáljuk. Csökkentő körülmények között egy nagyon erős sáv figyelhető meg 54 kilodaltonnál, számos más sáv mellett. Az elektroforézisgélt ezután 2,5 tömeg/térfogat%-os Triton X-100-zal kezeljük, és fibrin/agaróz lemezre helyezzük, hogy 37 °C-on leírjuk a fibrin autogramját, miáltal körülbelül 50 kilodaltonnál oldott sávot észlelünk. Ugyanazon a csészén a természetes TPA körülbelül 60 kilodaltonnal jelenik meg. Az eredmények azt mutatják, hogy az antitest-affinitás oszlopon abszorbeált és ezzel a módszerrel eluált TAP megfelel a javított TPT-nek, amelynek molekulatömege körülbelül 10 000-rel kisebb, mint a természetben előforduló típusé. 8. példa: A javított tapintat fajlagos aktivitásának mérése. A részben tisztított javított TSA-ban lévő fehérje mennyiségét a Bradford-módszer szerinti összfehérje méréssel határozzuk meg [Bradford, Anal. Bochem., 72, 248 (1976)], referenciafehérjeként marhaszérumalbumint használva. A TAP antigén mennyiségét enzim immunoassay (ELISA) segítségével mérjük. A fibrinolitikus aktivitást a fibrin/agaróz lemez módszerrel és az 1-jelzett fibrin 125 filmes oldódási módszerével határozzuk meg. A fibrin/agaróz lemezt úgy készítjük el, hogy agart adunk 95%-os koagulált fibrinogénhez. A film 125 1-gyel jelölt fibrin oldódási módszerét Hoyraeerts és munkatársai leírásának megfelelően hajtjuk végre. (J. Biol. Chem. 257, 2912, 1982) referenciaként a Bioscott Inc. által gyártott humán melanoma sejt TBA-t használva. és a nemzetközi APT szabvány szerint standardizáltuk (Gaffuey és Curtis, Thromb. Haemostas, 53, 34, 1985). Az 1-fibrin 125 filmes kioldódási módszerével meghatározott aktivitási értékből és az enzim immunoassay-vel (ELISA) meghatározott antigén mennyiségéből számított fajlagos aktivitási érték 300 000 és 420 000 egység/mg antigén között volt. 9. példa Fibrin affinitás és fibrin aktiválása a javított TAP esetében

Verheijen et al./EMBOJ, 5, 3525, 1986) munkájával összhangban vizsgálják a javított TSA fibrin iránti affinitását. Fokozott vagy természetesen előforduló TAP-ot (1000 egység/ml) adnak a fibrinogénhez különböző koncentrációkban, majd egy egység harsonát, majd szobahőmérsékleten 3 percig reagáltatják. A képződött fibrinrögöt centrifugálással 16 000 fordulat/perc mellett 8 percig kicsapják, és a fibrin/agaróz aktivitás mérésével fibrin/agaróz lemez módszerrel határozzák meg a fibrinhez nem kötődő TSA mennyiségét. Ennek eredményeként azt találtuk, hogy a javított TAP (VI) ugyanolyan affinitást mutat a fibrin iránt, mint a természetes forma. A javított csapda által fibrin jelenlétében vagy hiányában történő plazminogén aktiválás mértékének vizsgálatára a következő kísérletet végeztük. Titrálólemez segítségével a természetben előforduló vagy javított TSA-t adjuk 0,1 M Tris-HCl pufferhez (pH 7,5), amely 0,3 mM szintetikus szubsztrát p-niroanilid tripeptid S-2251 (H-D-Val-leulys-pNA HCl, gyártó Kabi Inc.) ), 0,13 μM plazminogén plazmin nélkül, 120 μg/ml DESAFIB TM (gyártó: American Diagnostics Inc.) és 0,1% Tween 80, így a teljes térfogat 200 μl. A rendszert 37 °C-on tartjuk. Egy bizonyos idő elteltével az abszorbanciát (optikai sűrűséget) 405 nm-en mérjük a Titertech Multiscan 310 modell segítségével. A javított csapda (VI) és a természetesen előforduló tapintat amidolítikus aktivitásának dózis-válasz görbéjét a 1. ábra mutatja. 22. A dózis-válasz görbe eltolódása a DESAFIB TM hozzáadásával a természetben előforduló t-PA esetében 158-szoros értéknek felel meg, míg a javított t-PA esetében eléri a 100-szorost. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy a javított TSA (VI) aktivitása DESAFIB TM hiányában alacsonyabb, körülbelül 1/20-ával, mint a természetes TSA aktivitása. 10. példa A javított csapda fibrinolitikus aktivitásának elemzése nyúl véráramában. Farmakinetika a természetben előforduló t-PA (n-t-PA) és a jelen találmány szerinti javított t-PA aktivitásának összehasonlításával nyúlban. Amint az a 3. ábrából látható. A 23. ábrán látható, hogy a javított csapda a biológiai felezési idő jelentős meghosszabbodását mutatja aktív állapotban (a természetes tapintat felezési ideje 1-2 perc, míg a javított tapintat 8-15 percig biológiailag aktív). Ezen túlmenően jól látható, hogy az 5%-os aktivitási érték (a beadást követő 30 másodperces érték 100%) még 60 perccel a beadás után is megmarad a javított TAP-ban (a természetes TAP 60 perc után 0,1%-os aktivitást mutat a kezdeti). Ezt a kísérletet a következőképpen hajtjuk végre

A vizsgálathoz egy 2,4 kg súlyú japán fehér nyulat választanak ki. Pentobarbitállal végzett érzéstelenítés alatt az ART-t perifériás fülvénán keresztül adják be. Az adag nyúlonként 15400 egység (0,8 ml) javított csapda és nyúlonként 5400 egység (0,8 ml) n-trac (az értékeket fibrinlemezes módszerrel határozták meg). Ezután különböző időközönként (0,5-60 percenként) katéter segítségével 2,5 ml vért veszünk a femorális artériából, és hozzáadjuk 1/9 térfogatú nátrium-citráthoz (3,8%). A vérvétel után 30 percen belül kis sebességgel centrifugáljuk, elválasztva a plazmát. Az elválasztott plazma segítségével mérjük meg a t-PA aktivitását a vérben. (1) Az APT aktivitás mérése. Miután 0,2 ml plazmát 3 mM jégecettel 16-szor hígítottunk, a hígított terméket alacsony sebességgel centrifugáljuk, hogy csapadékot kapjunk. A csapadékot 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) és 140 mM NaCl oldatban oldjuk fel plazmával egyenértékű térfogatban, hogy euglobulin-frakciót kapjunk. A tPA-aktivitást úgy határozzuk meg, hogy ezt az euglobulin-frakciót fibrin/agaróz edényhez adjuk. A lemez 37 o C-on 16 órás inkubálása után a t-PA aktivitása plakk formájában figyelhető meg. A fibrin/agaróz lemez módszer standard görbéjét úgy készítjük el, hogy az állatnak beadott TSA-t 0,1-10 000 egység/ml-re hígítjuk. A vércsapda így meghatározott aktivitását százalékban fejezzük ki, a beadás után 30 másodperccel vett vérvétel során kapott tapintatos aktivitást 100%-nak véve. 11. példa A javított TAP (VI) hővel és savakkal szembeni ellenállása. A hőtűrés meghatározásához a javított csapdát (VI) és a természetes csapdát 100 mM NaCl-t és 0,01% Tween 80-at (pH 7,4) tartalmazó 50 mM Tris pufferrel hígítjuk 100 μg/ml koncentrációra. Mindegyik oldatot forrásban lévő vízben (98 o C-os) tartjuk 2-60 percig. Lehűlés után a maradék aktivitást fibrin csésze módszerrel határozzuk meg. ábrán látható módon. A 24. ábra szerint a javított csapda (VI) aktivitásának csökkenése elenyésző a természetes tapintat aktivitásának csökkenéséhez képest. Például 2 perces hőkezelés után a természetes tapintat aktivitása 25%-ra csökken, míg a javított tapintat (VI) továbbra is megtartja 71%-os aktivitását. A savállóság vizsgálatához a javított TAP-ot (VI) és a természetes TAP-ot 0,5 N-ben oldjuk. HCl-oldatot 100 µg/ml koncentrációban, majd szobahőmérsékleten 30 percig ülepítjük. A semlegesítés után az aktivitást fibrin-kupa módszerrel határozzuk meg. A továbbfejlesztett TP nem észlel aktivitásváltozást, míg a természetes TP aktivitása 50%-kal csökken. 12. példa: Az aktív limfocita-stimuláló faktor gátlása javított TSA-val (VI)

A javított TSA-t (VI) és a természetes TPA-t megfelelően hígítjuk PPM1 1640 szövettenyésztő tápközegben, amely 7% magzati borjúszérumot és 58 μM 2-merkaptoetanolt tartalmaz. A hígításból 100 µl-t egy 96 lyukú szövettenyésztő lemezre töltünk, majd hozzáadunk 50 µl timocitákat (210 7 sejt/ml) tartalmazó sejtszuszpenziót 4-6 hetes C3H/He J hím egerekből, concanavalin A ( 1,2 μg/ml), valamint 50 μl IL-1-et (4 egység/ml, Aenzyme Inc), majd 48 órán át tenyésztjük inkubátorban 37 o C hőmérsékleten, 5% szén-dioxid tartalommal. Ezután adjunk hozzá H 3 -timidint 0,5 mikron koncentrációban. kocka hüvelyk /20 µl/lyuk. 18 órás tenyésztést követően a sejteket üvegszálas szűrőn gyűjtöttük össze, és folyadékszcintillációs számlálóval mértük a sejtekbe injektált3H-timidin mennyiségét, hogy meghatározzuk a limfocita-stimuláló faktor aktivitását. Amint a 25. ábrán látható, a természetes csapda nem gátolja a limfocita stimuláló faktor aktivitását, míg a jobb tapintat jelentősen elnyomja azt. Ha csak oldószerrel tesztelték, nem észleltek hatást. 13. példa Denaturált fehérjére kifejtett hatáson alapuló gyulladásgátló hatás. 1) Denaturált fehérje kinyerése. A fehérjeoldat (5 mg/ml) 0,1 N-ben történő inkubálása után. HCl-oldat vagy 0,1 N. NaOH-oldatot 37 o C-on 2-3 órán át, a fehérjeoldatot azonos mennyiségű NaOH-val vagy HCl-lel semlegesítjük. 2) A javított csapda (VI) affinitása a denaturált fehérjéhez. Módszer: Az alábbi eljárás szerint a denaturált fehérjét egy nitrocellulóz filmhez "kötik". Ezután megmérjük a fehérje- és nitrocellulóz filmmel végzett kezeléshez kapcsolódó javított TSA mennyiségét, így értékeljük a javított TSA affinitását a denaturált fehérjéhez. Egy darab nitrocellulóz filmet merítünk 20 mM Tris-HCl pufferoldatba (pH 7,5), amely 140 mM NaCl-ot tartalmaz. Szárítás. A denaturált fehérjét (50 µg/10 µl) csepegtetjük egy darab nitrocellulóz filmre. Szárítás. Blokkolás 3%-os zselatin oldattal. Öblítés. Egy darab nitrocellulóz filmet bemerítünk javított TSA /1 mcg/ml/ oldatba. Öblítés. Adjunk hozzá plazminogént és szintetikus S-2251 szubsztrátot, majd inkubáljuk 37 o C-on (az abszorbeált javított TBA kvantitatív elemzése). Abszorbanciamérés 405 nm-en. Eredmények: Amint a 3. táblázat mutatja, a javított tPA affinitást mutat a HCl-lel kezelt IgG, a HCl-lel kezelt albumin és a NaOH-val kezelt albumin iránt. Másrészt a javított csapda nem mutat affinitást az érintetlen immunglobulin G és albumin iránt. 3) A javított APT (VI) aktiválása denaturált fehérjével. Módszer: Plazminogént (0,0078 egység 10 µl-ben), 100 µl 3 mM S-2251 szintetikus szubsztrátot és különböző mennyiségű TBS puffert adunk egy fejlett TBA aktivátor (denaturált fehérje, BrCN-nel kezelt fibrinogén stb.) reakcióoldatához. ) különböző koncentrációkban, így 0,275 ml reakcióoldatot kapunk. A javított TSA-t (2,5 n/g 25 µl-ben) adjuk a reakcióoldathoz a reakció megindítására. Egy bizonyos ideig tartó reakció után 2%-os nátrium-dodecil-szulfátot (ekvimoláris mennyiségben) adunk a reakcióelegyhez, hogy a reakciót leállítsuk. Az optikai sűrűség (OD 405) mérésével határozzuk meg a javított tapintat aktivitását. Eredmények: Amint a 26. ábrán látható, a NaOH-val kezelt albumin és a HCl-kezelt immunglobulin G a javított csapda kifejezett aktiváló hatását mutatja. Különösen a HCl-lel kezelt IgG-ben az aktiválás erős, és a HCl-lel kezelt IgG aktivitása megközelítőleg megegyezik a BrCN-vel kezelt fibrinogén aktivitásával, és többszörösen alacsonyabb koncentrációban. Az érintetlen albumin és immunglobulin G nem mutat aktivációt. 4) A denaturált fehérje lebontása javított csapda (VI) hatására. Módszer: miután a denaturált fehérjét a javított TSA-val ugyanolyan körülmények között reagáltattuk, mint az előző albekezdésben leírt módszernél, azzal az eltéréssel, hogy az S-2251 szintetikus szubsztrátot nem adjuk a reakciórendszerhez, és a denaturált fehérje mennyisége 133 µg /ml, végezzünk elektroforézist poliakrilamid gélben nátrium-dodecil-szulfáttal α-merkaptoetanol jelenlétében. Eredmények: A 27. ábrán látható módon a NaOH-kezeléssel vagy HCL-kezeléssel denaturált fehérje a mintázatban az ef-fehérje sávok eltűnését és bomlástermékek képződését eredményezte, jelezve a degradációt. Másrészt, ép albumin használatakor nem találtunk változást az ef-mintázatban a javított csapdával való interakció után, így a denaturált fehérje degradációját sem tapasztaltuk.

KÖVETELÉS

1. Rekombináns szöveti plazminogén aktivátor, amelynek aminosav-szekvenciája a p. ahol Y jelentése Glu-Ile-Lys;

H2N-amino;

COOH - karboxi vég;

R egy közvetlen kapcsolat vagy egy hozzá hasonló szekvencia, amely olyan szubsztitúciókat és/vagy deléciókat és/vagy inszerciókat tartalmaz, amelyek nem kapcsolódnak az aktivitás változásaihoz,

A következő tulajdonságokkal rendelkezik: fibrinolitikus aktivitás, amelyet a film 1 2 5 I-fibrin feloldásának módszere határoz meg, a fibrin általi aktiválódás képessége és a fibrin hiányában javított tpA aktivitása, amely alacsonyabb, mint a fibrin aktivitása. természetes tpA, megnövekedett a természetes formához képest, felezési idő, megnövekedett a természetes tpA-hoz képest, savakkal és hővel szembeni ellenállás, a limfocita aktiváló faktor gátlásának képessége, denaturált fehérje általi aktiválódás képessége. 2. Eljárás rekombináns szöveti plazminogén aktivátor előállítására, beleértve a tpA analógot kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-sel transzformált gazdasejtek tenyésztését és a céltermék ezt követő tisztítását, azzal jellemezve, hogy a gazdasejteket tpA analógot kódoló rekombináns vektorral transzformálva tenyésztjük. A tpA-t kódoló DNS-szekvencia az 1. tételnél.

És fontos eleme a fibrinolízis rendszernek. A plazminogén aktivátor az egyik leggyakrabban részt vevő enzim az alapmembrán, az extracelluláris mátrix elpusztításában és a sejtinvázióban. Az endotélium termeli, és az érfalban lokalizálódik [Loscalso, ea 1988]. A szöveti faktor egy foszfolipoprotein. Ennek a komplexnek az apoproteinje egy integrált membránglikoprotein molekulákkal. körülbelül 46 kDa tömegű, amely erősen kapcsolódik az endothel, simaizomsejtek, monociták membránjainak foszfolipidjéhez. A TPA-t in vivo egyláncú polipeptidként szintetizálják (72 kDa molekulatömeg), amelyet különböző proteinázok, köztük plazmin, szöveti kallikrein és aktivált X-faktor proteolízissel kettős láncú formává alakítanak. A tPA kétszálú formája aktívabb, mint az egyszálú prekurzor. Az enzim pH-optimuma az angiotenzinogén Ang II-vé történő átalakulása során a savas régióban van. Lásd a tPA-t ang II-képző enzimként. A vérből származó tPA egy endothel aktivátor, amely különféle ingerekre válaszul kerül a véráramba. A tPA koncentrációja a vérben 6,6+/-2,9 ng/ml.

A szöveti faktor, egy transzmembrán glikoprotein, a II. osztályú citokinreceptor-család tagja, két mechanizmussal képes sejtaktivációt indukálni.

A szöveti faktor, a külső véralvadási mechanizmus aktiválásának kezdeményezője, az endothel és simaizomsejtekben lokalizálódik, amikor azok károsodnak, érintkezésbe kerülnek a vérrel, ami végső soron hozzájárul a trombin képződéséhez és a vér elindításához. koagulációs mechanizmus. Nagy affinitása van a vérben keringő F.VII-hez. Ca++ ionok jelenlétében az apoprotein T.f. sztöchiometrikus komplexet képez az f.VII-vel, konformációs változásait okozva, és az utóbbit az Arg-152-Ile peptidkötés hasításával f.VIIa szerin proteinázzá alakítja. A reakciót nyomokban a vérben keringő proteinázok (f.Xa, trombin, f.VIIa, f.IXa) stimulálják. A kapott komplex (f.VIIa-T.f.) az f.X-et f.Xa szerin proteinázzá alakítja. A szöveti faktor-VII-es faktor komplex képes mind az X-es, mind a IX-es faktort aktiválni, ami végső soron hozzájárul a trombin a képződéséhez [Boyle, E.M., Verrier, E.D., ea., (1996)].

A fehérje szerkezetében a T.f. Három domén létezik: a fő, a sejtmembrán felszínén található, a transzmembrán és a citoplazmatikus. A receptorfunkciók felszíni doménje 219 Ser-1-Glu-219 aminosavból áll. A 23 tagú transzmembrán domént egy citoplazmatikus "farok" követi, amelyen keresztül a fehérje a membránhoz rögzítődik. Itt megvalósul annak a lehetősége, hogy e domén egyetlen Cys-maradéka tioéterkötést hozzon létre a membránlipidekkel (palmitáttal vagy sztearáttal). Bizonyos szerepet kapnak az alifás aminosavak maradékai, amelyek segítségével a fehérje beépül a membrán belső rétegébe, ezzel is fokozva a szöveti faktor molekula „lehorgonyzódását”. A felszíni domén három treonincsoportnál glikozilált (Thr-13, Thr-126, Thr-139). 4 Cys-maradékot tartalmaz, amelyek két diszulfidkötést képeznek, az egyik a domén N-terminálisán, a másik a C-terminális régióban. Ezek a kötések stabilizálják a megfelelő peptid hurkokat. Kimutattuk, hogy a C-terminális régióban található diszulfidkötés funkcionálisan szignifikáns, ennek részvétele szükséges a szöveti faktor kofaktor funkcióinak megnyilvánulásához a VII és VIIa faktorral szemben. Az elsődleges szerkezet elemzése, a diszulfid kötések elhelyezkedése és a funkcionális jellemzők vizsgálata alapján feltárták a II. osztályú citokin receptorcsaládba tartozó Ifn-alphaR és Ifn-gammaR interferonokkal való homológiát. A véralvadási rendszerben a VII/VIIa faktor kölcsönhatása a receptor - kofaktor - szöveti faktorral több ezerszeresére gyorsítja a hemokoaguláció külső mechanizmusának aktiválódását. Ez a gyorsulás érhető el:

Először is, a proteolitikus mechanizmus, amelyet a véralvadás VII/VIIa faktorral (VII aktív) szöveti faktor komplex képződése indít el, amelyben a szöveti faktor a VII/VIIa faktor kofaktoraként és modulátoraként működik. A VIIa faktor szöveti faktorhoz való kötődése fokozza a mitogén által aktivált protein kinázok (MAP kinázok) - Erk-1, Erk-2, p38, Jnk intracelluláris Ca2+ foszforilációját, és az Egr-1 gén transzkripciójához vezet (korai növekedési válasz) rendszerint citokinek és faktorok növekedése indukálja.

Másodszor, egy nem proteolitikus mechanizmus révén, amelyben maga a szöveti faktor citoplazmatikus doménje vesz részt az intracelluláris jelátvitelben, ami

Tartalmazza a gyógyszereket

Szerepel a listán (az Orosz Föderáció kormányának 2014. december 30-i 2782-r számú rendelete):

VED

ATH:

B.01.A.D.02 Alteplase

Farmakodinamika:

Humán szöveti plazminogén aktivátor (rekombináns): plazminogén aktiválása, plazminogén plazminná alakítása, fibrin, fibrinogén, V. és VIII. véralvadási faktorok elpusztítása.

Farmakológiai hatások

Trombolitikus.

Farmakokinetika:

A biotranszformáció a májban történik. T1/2 - 35 perc. Kiürülés a veséken keresztül (80% - metabolitok formájában).

Javallatok:

Szívinfarktus (az első 6-12 órában), akut masszív tüdőembólia, akut ischaemiás stroke,az alsó végtagok perifériás artériáinak trombózisa

IX.I20-I25.I21 Akut miokardiális infarktus

IX.I26-I28.I26 Tüdőembólia

Ellenjavallatok:

Hemorrhagiás vasculitis, vérzéses retinopátia, indirekt antikoagulánsok egyidejű alkalmazása. Súlyos vagy veszélyes vérzés (folyamatban vagy közelmúltban), cerebrovascularis baleset (intrakraniális vérzés, hemorrhagiás stroke), beleértve az elmúlt 6 hónapot. A központi idegrendszer daganatai és más lokalizáció, fokozott vérzési kockázattal, aneurizmával, koponyaűri műtéttel vagy gerincműtéttel (az elmúlt 2 hónap kórtörténetében). Súlyos trauma (az elmúlt tíz napon belül), traumás nyitott szívmasszázs (az elmúlt 10 napon belül). Szülészeti szülés (az elmúlt 10 napon belül). Műtéti beavatkozások, alacsony nyomású erek szúrása: például a szubklavia vagy a jugularis véna (az elmúlt 10 napon belül). Súlyos, ellenőrizetlen magas vérnyomás. Bakteriális endocarditis, pericarditis. Gyomor- és nyombélfekély (az exacerbáció kezdete után 3 hónapon belül), akut hasnyálmirigy-gyulladás.

Artériás vagy vénás malformációk Májelégtelenség, májcirrhosis, portális hipertónia, aktív hepatitis. A nyelőcső visszér. A beteg 70 év feletti.

Gondosan:

Biopsziából, érszúrásból, intramuszkuláris injekcióból, szívmasszázsból és egyéb vérzésveszélyes állapotokból eredő, közelmúltbeli kisebb sérülések.

Terhesség és szoptatás:

Terhesség

Az FDA ajánlásainak kategóriája nincs meghatározva. Embereken és állatokon nem végeztek kontrollált vizsgálatokat. Úgy gondolják, hogy a terhesség első 18 hetében adott trombolitikumok növelik a méhlepény idő előtti elválásának kockázatát, mivel az túlnyomórészt fibrin révén kötődik a méhhez.

Szoptatás

Nincs információ az anyatejbe való behatolásról és a szövődményekről. Tekintettel arra, hogy számos gyógyszer kiválasztódik az anyatejbe, a trombolitikus szereket óvatosan kell adni szoptató nőknek.

Adagolás és adminisztráció:

Az első 6 órában - intravénás bolus 15 mg-os dózisban 1-2 perc alatt, majd - 50 mg-os infúzió beadása 30 perc alatt és 35 mg - 60 perccel a maximális dózis (100 mg) elérése előtt ). 65 kg-nál kisebb testtömegű betegek - intravénásan bolusként 15 mg és 0,75 mg / kg dózisban 30 percen keresztül (maximum - 50 mg); majd - 0,5 mg / kg infúzió 60 percig (maximum - 35 mg). A tünetek megjelenése után 6-12 órával a gyógyszert intravénásan adják be bolusban 10 mg-os adagban, majd az első órában 50 mg-os infúzióban, majd 10 mg-os adagban 30 perc alatt (max. maximális adag 100 mg 3 órán keresztül). A 65 kg-nál kisebb testtömegű betegeknél a gyógyszert legfeljebb 1,5 mg / kg dózisban írják fel.

Ezzel egyidejűleg acetilszalicilsavat és. Acetilszalicilsav - 160-300 mg / nap a tünetek megjelenése után több hónapig; - a trombolitikus terápia megkezdése előtt intravénásan bolusként 5 ezer NE dózisban, majd - 1 ezer NE / h, figyelembe véve az APTT-t (aktivált parciális tromboplasztin idő), többször mérve (értékeket kell). 1,5-2,5-szer nagyobb legyen, mint az eredeti).

Akut masszív tüdőembólia instabil hemodinamikával kombinálva. Intravénás bolus 10 mg-os dózisban 1-2 perc alatt, majd 90 mg intravénásan 2 órán keresztül.A gyógyszer teljes dózisa 65 kg-nál kisebb testtömegű betegeknél nem haladhatja meg az 1,5 mg / kg-ot. Ha a PV kevesebb, mint 2-szeresével haladja meg a kezdeti értéket, akkor egyidejűleg előírják (APTT irányítása alatt). Instabil hemodinamikával járó masszív tüdőembólia esetén a gyógyszer ugyanúgy hat, mint. Az altepláz összesen 100 mg-os dózisban 2 órán keresztül történő beadása összehasonlítható a reteplaz, a sztreptokináz 1,5 millió NE dózisban 2 órán át, az urokináz 1 millió NE dózisban bólusként 10 percig tartó hatásával (majd - 2 millió NE intravénásan 2 órán át) és hatékonyabb, mint a nátrium-heparin intravénás csepegtetése 1750 NE/óra sebességgel. Ez utóbbi esetben nagyobb valószínűséggel jelentkeznek mellékhatások.

Akut ischaemiás stroke - trombolízis (beleértve az alteplázt 0,9 mg / kg-ig 90 mg-ig 100 ml 0,9% -os nátrium-kloridban. Az adag 10% -a bolusban, a többi - intravénásan 1 órán keresztül; altepláz 0,85 mg / nap kg intravénásan keresztül 60 perccel az első 90 percben és 91-180 perccel a betegség kezdete után); altepláz (rekombináns szöveti plazminogén aktivátor) 1,1 mg/kg-100 mg IV, a dózis 10%-a bolusként, a többi IV 1 órán át;

Az alsó végtagok perifériás artériáinak trombózisa esetén helyileg alkalmazva az altepláz jobb, mint az urokináz. Agyi artériás trombózisban 2 millió E/nap altepláz adagolása előnyökkel jár a 60 ezer E/nap urokináz intravénás adagolásával szemben 7 napon keresztül.

Használata gyermekeknél

A hatékonyságot és a biztonságosságot nem vizsgálták.

Intravascularis trombózis esetén a gyógyszert intravénásan írják fel (steril injekcióhoz való vízben, amíg 1 mg / ml koncentrációjú oldatot nem kapnak) vagy csepegtetve (0,9% -os nátrium-klorid oldatban, amíg a koncentráció el nem éri a 200 μg / ml-t). . Ne hígítsa a gyógyszert dextróz oldattal. Újszülötteknél a gyógyszert 100-500 mcg / kg óránként 3-6 órán keresztül adják be; 1 hónap és 18 év közötti gyermekek - 100-500 mcg / kg óránként 3-6 órán keresztül (maximális napi adag - 100 mg). A második kúra felírása előtt ultrahanggal ellenőrizni kell az első kezelésre adott választ.

Az 1 hónapos és 18 éves kor közötti gyermekek arteriovénás söntjei vagy katétereinek elzáródása esetén a gyógyszert közvetlenül a katéterbe fecskendezik legfeljebb 2 ml-es dózisban (a katéter típusától függően) oldatban, amelynek koncentrációja 1 mg/ml; a lizátumot 4 óra múlva leszívjuk, majd a katétert 0,9%-os nátrium-klorid-oldattal mossuk. Nincs információ a gyógyszer újszülöttek artériák vagy vénák trombózisára történő alkalmazásáról.

Mellékhatások:

Hematológiai: vérzés, végzetes koponyaűri vérzés (ischaemiás stroke akut periódusában alkalmazva) A szív- és érrendszer oldaláról: mellkasi fájdalom, aritmiák, vérzéssel nem járó hipotenzió vagy aritmiák. Túlérzékenység: allergiás reakciók Egyéb: láz.

Túladagolás:

Vérzés. Kezelés: frissen fagyasztott plazma, teljes vér transzfúziója, plazmapótló oldatok, szintetikus fibrinolízis gátlók.

Kölcsönhatás:

A vérzés kockázata növekszik a kumarin-származékok, a vérlemezke-gátló szerek, a heparin és más, véralvadást gátló gyógyszerek egyidejű alkalmazása esetén.

Különleges utasítások:

Akut koronária szindróma esetén trombolízis javasolt. Segít csökkenteni a halálozást és költséghatékony. Nem volt különbség a túlélésben a szöveti plazminogén aktivátor, sztreptokináz és anizolt plazminogén-sztreptokináz komplex beadása után; a trombolitikus terápia időtartamát és kezelési rendjét tárgyalják. Az antikoagulánsokkal és thrombocyta-aggregációt gátló szerekkel végzett további kezelés valószínűleg növeli a trombolitikus terápia hatékonyságát.

Minél korábban történik a trombolízis, annál hatékonyabb. Éppen ezért a trombolízist be kell vezetni az egészségügyi intézmények mindennapi gyakorlatába. Figyelembe kell venni a trombolízissel összefüggő újraélesztés szükségességének kockázatát.

A járóbeteg-gyakorlatban az urokinázt tekintik a választott gyógyszernek (tenektepláz vagy retepláz bolus beadása), stacionárius körülmények között - sztreptokináz (kivéve, ha a betegek korábban kapták). Az újabb szerek (altepláz) drágábbak, ezért nem lehetnek első vonalbeli gyógyszerek. A szöveti tromboplasztin aktivátor inhibitorát alkalmazó beteg kezelésének hozzávetőleges költsége 2900 dollár, sztreptokinázzal - 400 dollár, anizolt plazminogén-sztreptokináz komplexszel - 1900 dollárral és urokinázzal - 775 dollárral.

Az egészségügyi ellátás vezetői és adminisztrátorai, a kórházak kardiológusai segítsék elő a thrombolysis háziorvosok általi végrehajtását.

Koagulogram (APTT, fibrinogén, fibrin bomlástermékek, trombin idő), hematokrit, hemoglobin koncentráció, thrombocytaszám, elektrokardiogram (koszorúér trombózissal) monitorozása; agyi erek trombózisával - a mentális és neurológiai állapot ellenőrzése (a kezelés megkezdése előtt és időszakosan a gyógyszer szedése közben). Egy vagy több kritériumot használnak a kezelés időbeli értékelésére; a vérnyomást, a pulzust és a légzésszámot rendszeresen meghatározzák.

A vérzéses szövődmények kialakulásának kockázata növekszik a 100 mg-ot meghaladó adagok alkalmazása esetén.

Az altepláz alkalmazásának lehetséges kockázatait és előnyeit mérlegelni kell a közelmúltban bekövetkezett kisebb sérülésekkel (biopszia, érszúrás, intramuszkuláris injekciók, szívmasszázs) és más olyan állapotokkal, amelyek a terhesség alatti vérzés kockázatával kapcsolatosak, a szülés utáni időszak első 10 napjában (fokozott). vérzés kockázata) szoptatás alatt, időseknél és gyermekeknél.

A heparin-nátriumot a trombolitikus terápia előtt törölték; a következő bevezetés a trombolízis és a trombinidő és/vagy APTT visszaállítása után lehetséges a kontrollértékek kétszeresére vagy alacsonyabbra (általában 2-4 óra elteltével).

Útmutató Az "Eozinofilek. Monociták. Vérlemezkék. Vérzéscsillapítás. Véralvadási rendszer. Antikoaguláns vérrendszer" témakör tartalomjegyzéke:
1. Eozinofilek. Az eozinofilek funkciói. Az eozinofil leukociták funkciói. Eozinofília.
2. Monociták. makrofágok. A monociták - makrofágok funkciói. A monociták normál száma - makrofágok.
3. Granulocitopoiesis és monocitopoiesis szabályozása. Granulocyta kolónia stimuláló faktorok. Keylons.
4. Vérlemezkék. A vérlemezkék szerkezete. A vérlemezkék funkciói. A glikoproteinek funkciói. A hialoplazma szol-gél zónája.
5. Thrombocytopoiesis. a thrombocytopoiesis szabályozása. Thrombopoetin (thrombocytopoetin). Megakariociták. thrombocytopenia.
6. Vérzéscsillapítás. A véralvadás mechanizmusai. Thrombocyta hemosztázis. vérlemezke reakció. elsődleges hemosztázis.
7. Véralvadási rendszer. A véralvadás aktiválásának külső módja. véralvadási faktorok.
8. A véralvadás belső aktiválásának módja. Thrombin.
9. Antikoaguláns vérrendszer. A vér antikoaguláns mechanizmusai. Antitrombin. Heparin. Fehérjék. Prosztaciklin. Thrombomodulin.
10. Szöveti plazminogén aktivátor. Ektoenzimek. Az endotélium szerepe az antikoaguláns rendszerben. szöveti faktor. Plazminogén aktivátor inhibitor. Willebrand-faktor. Antikoagulánsok.

Szöveti plazminogén aktivátor. Ektoenzimek. Az endotélium szerepe az antikoaguláns rendszerben. szöveti faktor. Plazminogén aktivátor inhibitor. Willebrand-faktor. Antikoagulánsok.

Szöveti plazminogén aktivátor egy olyan fehérje, amely reprodukálható és folyamatosan szekretálódik a vaszkuláris endotélium által. Közvetlen lokális trombolitikus aktivitást biztosít a kialakult trombus ellen. Ennek a faktornak a szintje állandó marad a vérben, ami biztosítja a vér szisztémás trombolitikus aktivitását.

Ektoenzimek- ezek az ADPáz, ATPáz és az endotélium által alkotott adenozin-konvertáló enzim. Az endoteliális ADPáz gyorsan hasítja az aktivált vérlemezkék által kiválasztott proaggregáns ADP-t.

Vaszkuláris endoteliális sejtek szintetizálni és protrombotikus faktorok: szöveti faktor, plazminogén aktivátor inhibitorok, von Willebrand faktor.

Rizs. 7.11. Az ér endotéliumának szerepe a véralvadásban. Az "Anticoagulants" felirat alatt olyan endoteliális faktorok találhatók, amelyek véralvadásgátló hatást fejtenek ki a vérlemezke-aggregáció gátlása, a fibrinrög képződése és a fibrinolízis aktiválása miatt. "Prokoagulánsok" néven azokat az endothel faktorokat jelölik, amelyek részt vesznek a vérlemezke trombusának, a fibrinrög kialakulásában és a fibrinolízis elnyomásában.

szöveti faktor egy összetett sejtmembrán fehérje, amelynek tömege 46 kDa. Molekulájának egy része, amikor a sejt károsodik, szorosan kötődik a Vila alvadási faktorhoz, megőrzi gyorsító funkcióját a külső véralvadási útvonalban.

Plazminogén aktivátor inhibitor-Az I egy 52 kDa-os fehérje, amely a keringő vérben található. A plazminogén aktivátorhoz szorosan kötve inaktiválja azt, így részt vesz a fibrinolízis szabályozásában a szervezetben.

Willebrand-faktor egy többdimenziós, 1-20 millió Da tömegű molekula, amelyet az endotélium szintetizál és endothel szekréciós granulumokban tárol. Felszabadulva belőlük a vérlemezkék tapadó molekula funkcióját tölti be, támogatja azok aggregációját. A von Willebrand faktor fokozott felszabadulását az endotéliumból a trombin indukálja.

Véralvadás egy edényben az endotélium sima felülete megakadályozza az aktív protrombináz képződésének belső útját is. Az endotélium felszínén adszorbeált monomolekuláris fehérjeréteg taszítja a véralvadási faktorokat és a vérlemezkéket, valamint megakadályozza a véralvadást.

Antikoagulánsok használják a klinikai gyakorlatban. Például szívkoszorúér-betegségben szenvedő betegek fokozott véralvadásának csökkentésére, szív-tüdő gép használatakor a vér folyékony állapotának fenntartására, vérsejtek traumáját okozva, aminek következtében a véralvadás belső útja aktiválódik.