Terapija s citokini. Citokini in vnetje Funkcionalna aktivnost citokinov se kaže

Citokini so približno 100 kompleksnih beljakovin, ki sodelujejo pri številnih imunskih in vnetnih procesih v človeškem telesu. Ne kopičijo se v celicah, ki jih proizvajajo, in se hitro sintetizirajo in izločajo.

Pravilno delujoči citokini skrbijo za nemoteno in učinkovito delovanje imunskega sistema. Njihova značilnost je vsestranskost delovanja. V večini primerov izkazujejo kaskadni učinek, ki temelji na medsebojni neodvisni sintezi drugih citokinov. Nastajajoči vnetni proces nadzorujejo med seboj povezani provnetni citokini.

Kaj so citokini

Citokini so velika skupina regulatornih proteinov z molekulsko maso od 15 do 25 kDa (kilodalton je atomska masna enota). Delujejo kot posredniki medcelične signalizacije. Njihova značilnost je prenos informacij med celicami na kratke razdalje. Sodelujejo pri nadzoru ključnih življenjskih procesov v telesu. Odgovorni so za začetek širjenje, tj. proces razmnoževanja celic, ki mu sledi njihova diferenciacija, rast, aktivnost in apoptoza. Citokini določajo humoralno in celično fazo imunskega odziva.

Citokine lahko obravnavamo kot neke vrste hormoni imunskega sistema. Med drugimi lastnostmi teh beljakovin se razlikujejo zlasti sposobnost vplivanja na energijsko ravnovesje telesa s spremembami apetita in metabolizma, vpliva na razpoloženje, funkcije in strukture kardiovaskularnega sistema ter povečana zaspanost.

Posebno pozornost je treba posvetiti provnetnih in protivnetnih citokinov. Prevlada prvega povzroči vnetno reakcijo s povišano telesno temperaturo, pospešenim dihanjem in levkocitozo. Prednost drugih je, da povzročijo protivnetni odziv.

Značilnosti citokinov

Glavne značilnosti citokinov:

• odvečnost- sposobnost ustvarjanja enakega učinka
• pliotropija- sposobnost vplivanja na različne tipe celic in povzročanja različnih učinkov v njih
• sinergijo- interakcija
• indukcija pozitivne in negativne povratne informacije
• antagonizem– Medsebojno blokiranje akcijskih učinkov

Citokini in njihov učinek na druge celice

Citokini delujejo zlasti na:

• Limfociti B so celice imunskega sistema, odgovorne za humoralni imunski odziv, tj. proizvodnja protiteles;
• T-limfociti - celice imunskega sistema, odgovorne za celični imunski odziv; proizvajajo zlasti limfocite Th1 in Th2, med katerimi opazimo antagonizem; Th1 podpira odziv celic in Th2 humoralni odziv; Citokini Th1 negativno vplivajo na razvoj Th2 in obratno;
• NK celice - skupina celic imunskega sistema, ki je odgovorna za pojave naravne citotoksičnosti (toksični učinki na citokine, ki ne zahtevajo stimulacije specifičnih mehanizmov v obliki protiteles);
• Monociti so morfološki elementi krvi, imenujemo jih bele krvničke;
• Makrofagi so populacija celic v imunskem sistemu, ki izhaja iz prekurzorjev krvnih monocitov; delujejo tako v procesih prirojene imunosti kot pridobljene (adaptivne);
• Granulociti so vrsta belih krvničk, ki izkazujejo lastnosti fagocitov, kar je treba razumeti kot sposobnost absorbiranja in uničevanja bakterij, odmrlih celic in nekaterih virusov.

Provnetni citokini

Provnetni citokini sodelujejo pri uravnavanju imunskega odziva in hematopoeze (proces nastajanja in diferenciacije morfotičnih krvnih elementov) ter sprožijo razvoj vnetne reakcije. Pogosto jih imenujemo imunotransmiterji.

Glavni protivnetni citokini vključujejo:

• TNF ali faktor tumorske nekroze, prej imenovan kekcin. Pod tem imenom je skupina beljakovin, ki določajo aktivnost limfocitov. Lahko sprožijo apoptozo, naravni proces programirane smrti rakavih celic. Izolirana sta TNF-α in TNF-β.
• IL-1, tj. interlevkin 1. Je eden glavnih regulatorjev vnetnega imunskega odziva. Še posebej aktivno sodeluje pri vnetnih reakcijah črevesja. Med njegovimi 10 sortami se razlikujejo IL-1α, IL-1β, IL-1γ. Trenutno je opisan kot interlevkin 18.
• IL-6, to je interlevkin 6, ki deluje pleiotropno ali večsmerno. Njegova koncentracija se poveča v serumu bolnikov z ulceroznim kolitisom. Spodbuja hematopoezo, kaže sinergijo z interlevkinom 3. Spodbuja diferenciacijo B-limfocitov v plazemske celice.

Protivnetni citokini

Protivnetni citokini zmanjšajo vnetni odziv tako, da zavirajo proizvodnjo provnetnih citokinov v monocitih in makrofagih, zlasti IL-1, IL-6, IL-8.

Med glavnimi protivnetnimi citokini se omenjajo zlasti IL-10, to je interlevkin 10 (faktor, ki zavira sintezo citokinov), IL 13, IL 4, ki kot posledica indukcije izločanja citokinov ki vpliva na hematopoezo, pozitivno vpliva na proizvodnjo krvnih celic.

Aktivacija celic vnetnega območja se kaže v tem, da začnejo celice sintetizirati in izločati številne citokine, ki vplivajo na bližnje celice in celice oddaljenih organov. Med vsemi temi citokini so tisti, ki spodbujajo (provnetni) in tisti, ki preprečujejo razvoj vnetnega procesa (protivnetni). Citokini povzročajo učinke, podobne manifestacijam akutnih in kroničnih nalezljivih bolezni.

Provnetni citokini

90 % limfocitov (vrsta levkocitov), ​​60 % tkivnih makrofagov (celic, ki so sposobne loviti in prebavljati bakterije) je sposobnih izločati provnetne citokine. Povzročitelji okužb in sami citokini (ali drugi vnetni dejavniki) so stimulatorji proizvodnje citokinov.

Lokalno sproščanje vnetnih citokinov povzroči nastanek vnetnega žarišča. S pomočjo specifičnih receptorjev se provnetni citokini vežejo in v proces vključijo druge vrste celic: kožo, vezivno tkivo, notranjo steno krvnih žil, epitelne celice. Vse te celice tudi začnejo proizvajati provnetne citokine.

Najpomembnejša provnetna citokina sta IL-1 (interlevkin-1) in TNF-alfa (faktor tumorske nekroze-alfa). Povzročajo nastanek žarišč adhezije (lepljenja) na notranji lupini žilne stene: najprej se levkociti prilepijo na endotelij in nato prodrejo v žilno steno.

Ti provnetni citokini spodbujajo sintezo in sproščanje drugih protivnetnih citokinov (IL-8 in drugih) v levkocitih in endotelijskih celicah ter s tem aktivirajo celice za tvorbo vnetnih mediatorjev (levkotrieni, histamin, prostaglandini, dušikov oksid in drugi).

Ko okužba vstopi v telo, se na mestu vnosa mikroorganizma (v celicah sluznice, kože, regionalne limfe) začne proizvodnja in sproščanje IL-1, IL-8, IL-6, TNF-alfa. vozlišča) – torej citokini aktivirajo lokalne obrambne reakcije.

Tako TNF-alfa kot IL-1 imata poleg lokalnega delovanja tudi sistemski učinek: aktivirata imunski, endokrini, živčni in hematopoetski sistem. Provnetni citokini lahko povzročijo približno 50 različnih bioloških učinkov. Skoraj vsa tkiva in organi so lahko njihova tarča.

Na primer, anemija pri akutnih in kroničnih nalezljivih boleznih je posledica izpostavljenosti telesu provnetnih citokinov (interlevkin-1, interferon-beta, interferon-gama, TNF, neopterin). Zavirajo rast eritroidnega klica, sproščanje železa iz celic makrofagov in zavirajo nastajanje eritropoetina v ledvicah. Citokini delujejo zelo učinkovito in hitro.

Protivnetni citokini

Nadzor nad delovanjem protivnetnih citokinov izvajajo protivnetni citokini, ki vključujejo IL-4, IL-13, IL-10, TGF-beta. Ne morejo samo zavirati sinteze pro-vnetnih citokinov, ampak tudi spodbujati sintezo antagonistov interlevkinskih receptorjev (RAIL ali RAIL).

Razmerje med protivnetnimi in provnetnimi citokini je pomembna točka pri uravnavanju nastanka in razvoja vnetnega procesa. Od tega ravnovesja sta odvisna tako potek bolezni kot njen izid. Prav citokini spodbujajo nastajanje faktorjev strjevanja krvi v vaskularnih endotelijskih celicah, nastajanje hondrolitičnih encimov in prispevajo k nastanku brazgotin.

Citokini in imunski odziv

Vse celice v imunskem sistemu imajo določene različne funkcije. Njihovo usklajeno interakcijo izvajajo citokini - regulatorji imunskih odzivov. Prav oni zagotavljajo izmenjavo informacij med celicami imunskega sistema in usklajevanje njihovih dejanj.

Nabor in količina citokinov je matrika signalov (pogosto spremenljivih), ki delujejo na celične receptorje. Kompleksna narava teh signalov je razložena z dejstvom, da lahko vsak citokin zavira ali aktivira več procesov (vključno s sintezo lastnih ali drugih citokinov), tvorbo receptorjev na celični površini.

Citokini zagotavljajo medsebojno povezavo v imunskem sistemu med specifično imunostjo in nespecifično zaščitno reakcijo telesa, med humoralno in celično imunostjo. Citokini so tisti, ki komunicirajo med fagociti (zagotavljajo celično imunost) in limfociti (celice humoralne imunosti), pa tudi med limfociti različnih funkcij.

Preko citokinov T-pomočniki (limfociti, ki »prepoznavajo« tuje proteine ​​mikroorganizmov) posredujejo ukaz T-killerjem (celicam, ki uničujejo tuje proteine). Podobno s pomočjo citokinov T-supresorji (vrsta limfocitov) nadzorujejo delovanje T-killerjev in jim posredujejo informacije, da ustavijo uničenje celic.

Če se takšna povezava prekine, se bo nadaljevala smrt celic (že lastnih za telo in ne tujih). Tako se razvijejo avtoimunske bolezni: sinteza IL-12 ni nadzorovana, celično posredovani imunski odziv bo preveč aktiven.

Potek in izid nalezljive bolezni je odvisen od sposobnosti povzročitelja (ali njegovih sestavin), da inducira sintezo citokina IL-12. Na primer, vrsta glive Candida albicans lahko inducira sintezo IL-12, ki prispeva k razvoju učinkovite celične obrambe pred tem patogenom. Leishmania zavira sintezo IL-12 - razvije se kronična okužba. HIV zavira sintezo IL-12, kar vodi do okvar celične imunosti pri aidsu.

Citokini uravnavajo tudi specifični imunski odziv telesa na vnos povzročitelja. Če so lokalne obrambne reakcije neučinkovite, potem citokini delujejo na sistemski ravni, to pomeni, da vplivajo na vse sisteme in organe, ki sodelujejo pri vzdrževanju homeostaze.

Ko delujejo na centralni živčni sistem, se spremeni celoten kompleks vedenjskih reakcij, spremeni se sinteza večine hormonov, sinteza beljakovin in sestava plazme. Toda vse spremembe, ki se zgodijo, niso naključne: potrebne so za povečanje zaščitnih reakcij ali pa pomagajo preusmeriti energijo telesa v boj proti patogenim učinkom.

Citokini, ki povezujejo endokrini, živčni, hematopoetski in imunski sistem, vključujejo vse te sisteme pri oblikovanju kompleksne zaščitne reakcije telesa na vnos patogena.

Makrofag zajame bakterije in sprošča citokine (3D model) - video

Analiza polimorfizma citokinskih genov

Analiza polimorfizma gena za citokine je genetska študija na molekularni ravni. Takšne študije zagotavljajo širok spekter informacij, ki omogočajo ugotavljanje prisotnosti polimorfnih genov (proinflamatornih variant) pri pregledani osebi, napovedovanje nagnjenosti k različnim boleznim, razvoj programa za preprečevanje teh bolezni za to osebo, itd.

Za razliko od posameznih (sporadičnih) mutacij najdemo polimorfne gene pri približno 10 % populacije. Nosilci takšnih polimorfnih genov imajo povečano aktivnost imunskega sistema med kirurškimi posegi, nalezljivimi boleznimi in mehanskimi učinki na tkiva. V imunogramu takih posameznikov se pogosto odkrije visoka koncentracija citotoksičnih celic (celic ubijalk). Takšni bolniki pogosto razvijejo septične, gnojne zaplete bolezni.

Toda v nekaterih situacijah lahko tako povečana aktivnost imunskega sistema moti: na primer pri oploditvi in ​​vitro in presajanju zarodkov. In kombinacija pro-vnetnih genov interlevkina-1 ali IL-1 (IL-1), antagonista receptorja interlevkina-1 (RAIL-1), tumor nekrotizirajočega faktorja alfa (TNF-alfa) je dejavnik predispozicije za spontani splav med nosečnost. Če preiskava odkrije prisotnost provnetnih citokinskih genov, je potrebna posebna priprava na nosečnost ali IVF (in vitro oploditev).

Analiza citokinskega profila vključuje odkrivanje 4 polimorfnih genskih različic:

• 
  interlevkin 1-beta (IL-beta);
• 
  antagonist receptorja interlevkina-1 (ILRA-1);
• 
  interlevkin-4 (IL-4);
• 
  tumor nekrotizirajoči faktor-alfa (TNF-alfa).

Za dostavo analize ni potrebna posebna priprava. Material za študijo je strganje iz ustne sluznice.

Sodobne študije so pokazale, da pri običajnem spontanem splavu v telesu žensk pogosto najdemo genetske dejavnike trombofilije (nagnjenost k trombozi). Ti geni lahko povzročijo ne samo spontani splav, ampak tudi placentno insuficienco, zastoj rasti ploda in pozno toksikozo.

V nekaterih primerih je polimorfizem gena za trombofilijo pri plodu bolj izrazit kot pri materi, saj plod prejme gene tudi od očeta. Mutacije gena za protrombin povzročijo skoraj stoodstotno intrauterino smrt ploda. Zato posebej težki primeri spontanega splava zahtevajo pregled in moža.

Imunološki pregled moža bo pomagal ne le določiti prognozo nosečnosti, temveč tudi prepoznati dejavnike tveganja za njegovo zdravje in možnost uporabe preventivnih ukrepov. Če se pri materi odkrijejo dejavniki tveganja, je priporočljivo opraviti pregled otroka - to bo pomagalo razviti individualni program za preprečevanje bolezni pri otroku.

Pri neplodnosti je priporočljivo identificirati vse trenutno znane dejavnike, ki lahko vodijo do nje. Popolna genetska študija genskega polimorfizma vključuje 11 indikatorjev. Pregled lahko pomaga ugotoviti nagnjenost k disfunkciji placente, visokemu krvnemu tlaku, preeklampsiji. Natančna diagnoza vzrokov neplodnosti bo omogočila potrebno zdravljenje in bo omogočila ohranitev nosečnosti.

Razširjeni hemostaziogram lahko zagotovi informacije ne le za porodniško prakso. S študijo genskega polimorfizma je mogoče identificirati dejavnike genetske predispozicije za razvoj ateroskleroze, koronarne srčne bolezni, napovedati njen potek in verjetnost razvoja miokardnega infarkta. Tudi verjetnost nenadne smrti je mogoče izračunati z genetskimi raziskavami.

Proučevali so tudi vpliv genskih polimorfizmov na hitrost razvoja fibroze pri bolnikih s kroničnim hepatitisom C, s pomočjo katerega lahko napovemo potek in izid kroničnega hepatitisa.

Molekularno genetske študije večfaktorskih bolezni pomagajo ne le pri ustvarjanju individualne prognoze zdravstvenega stanja in preventivnih ukrepov, temveč tudi pri razvoju novih terapevtskih metod z uporabo anticitokinskih in citokinskih zdravil.

Terapija s citokini

Zdravljenje tumorskih bolezni

Zdravljenje s citokini se lahko uporablja v kateri koli (tudi IV) fazi maligne bolezni, ob prisotnosti hude sočasne patologije (jetrno-ledvična ali kardiovaskularna insuficienca). Citokini selektivno uničujejo samo maligne tumorske celice in ne vplivajo na zdrave. Terapija s citokini se lahko uporablja kot samostojna metoda zdravljenja ali kot del kompleksne terapije.

Imunološke študije pri bolnikih z rakom so pokazale, da večino malignih bolezni spremlja oslabljen imunološki odziv. Stopnja njegovega zatiranja je odvisna od velikosti tumorja in zdravljenja (radioterapija in kemoterapija). Pridobljeni so bili podatki o bioloških učinkih citokinov (interlevkin-2, interferoni, faktor tumorske nekroze in drugi).

Zdravljenje s citokini se v onkologiji uporablja že več desetletij. Toda prej sta bila v glavnem uporabljena interlevkin-2 (IL-2) in interferon-alfa (IFN-alfa), ki sta bila učinkovita le pri kožnem melanomu in raku ledvic. V zadnjih letih so bila ustvarjena nova zdravila, indikacije za njihovo učinkovito uporabo so se razširile.

Eden od citokinskih pripravkov - faktor tumorske nekroze (TNF-alfa) - deluje preko receptorjev, ki se nahajajo na maligni celici. Ta citokin v človeškem telesu proizvajajo monociti in makrofagi. Pri interakciji z receptorji maligne celice citokin začne program smrti te celice.

TNF-alfa so v onkološki praksi v ZDA in Evropi začeli uporabljati že v osemdesetih letih prejšnjega stoletja. V uporabi je še danes. Toda visoka toksičnost zdravila omejuje njegovo uporabo le v primerih, ko je mogoče izolirati organ s tumorskim procesom iz splošnega pretoka krvi (ledvice, okončine). Zdravilo v tem primeru kroži s pomočjo srčno-pljučnega aparata samo v prizadetem organu in ne vstopi v splošni krvni obtok.

V Rusiji je bil Refnot (TNF-T) ustvarjen leta 1990 kot rezultat združitve genov za timozin-alfa in faktor tumorske nekroze. Je 100-krat manj strupen kot TNF, prestal je klinična preskušanja in od leta 2009 odobren za uporabo pri zdravljenju različnih vrst in lokalizacij malignih tumorjev.

Glede na zmanjšanje toksičnosti zdravila se lahko daje intramuskularno ali subkutano. Zdravilo deluje tako na primarno žarišče tumorja kot tudi na metastaze (vključno z oddaljenimi), v nasprotju s TNF-alfa, ki lahko vpliva le na primarno žarišče.

Drugo obetavno citokinsko zdravilo je interferon gama (IFN-gama). Na njegovi podlagi je bilo leta 1990 v Rusiji ustvarjeno zdravilo Ingaron. Deluje neposredno na tumorske celice oziroma sproži program apoptoze (celica sama programira in izvede svojo smrt), poveča učinkovitost imunskih celic.

Zdravilo je prestalo tudi klinična preskušanja in je od leta 2005 odobreno za uporabo pri zdravljenju malignih tumorjev. Zdravilo aktivira tiste receptorje na maligni celici, s katerimi Refnot nato sodeluje. Zato se najpogosteje citokinoterapija z Refnotom kombinira z uporabo Ingarona.

Način dajanja teh zdravil (intramuskularno ali subkutano) omogoča ambulantno zdravljenje. Citokinoterapija je kontraindicirana le med nosečnostjo in avtoimunskimi boleznimi. Poleg neposrednega učinka na maligno celico imata Ingaron in Refnot posreden učinek - aktivirata lastne celice imunskega sistema (T-limfocite in fagocite), povečata splošno imunost.

Na žalost je učinkovitost citokinske terapije le 30-60%, odvisno od stopnje in lokacije tumorja, vrste maligne neoplazme, razširjenosti procesa in splošnega stanja bolnika. Višja kot je stopnja bolezni, manj izrazit je učinek zdravljenja.

Toda tudi v prisotnosti večkratnih in oddaljenih metastaz ter nezmožnosti kemoterapije (zaradi resnosti splošnega stanja bolnika) so pozitivni rezultati opaženi v obliki izboljšanja splošnega počutja in zaustavitve nadaljnjega razvoja. bolezni.

Glavne smeri delovanja sodobnih zdravil-citokinov:

• 
  neposreden vpliv na celice samega tumorja in metastaz;
• 
  povečanje protitumorskega učinka kemoterapije;
• 
  preprečevanje metastaz in ponovitve tumorja;
• 
  zmanjšanje neželenih učinkov kemoterapije z zaviranjem hematopoeze in imunosupresijo;
• 
  zdravljenje in preprečevanje nalezljivih zapletov med zdravljenjem.

Možni rezultati uporabe citokinske terapije:

• 
  popolno izginotje tumorja ali zmanjšanje njegove velikosti (zaradi sprožitve apoptoze - programirane smrti tumorskih celic);
• 
  stabilizacija procesa ali delna regresija tumorja (ko je celični cikel ustavljen v tumorskih celicah);
• 
  pomanjkanje učinka - rast in metastaze tumorja se nadaljujejo (z neobčutljivostjo tumorskih celic na zdravilo zaradi mutacij).

Iz zgoraj navedenega je razvidno, da je klinični rezultat uporabe citokinske terapije odvisen od značilnosti tumorskih celic pri bolniku samem. Za oceno učinkovitosti uporabe citokinov se izvede 1-2 tečaja zdravljenja in oceni dinamika procesa z uporabo različnih instrumentalnih metod pregleda.

Možnost uporabe citokinske terapije ne pomeni opustitve drugih načinov zdravljenja (kirurgija, kemoterapija ali obsevanje). Vsak od njih ima svoje prednosti vplivanja na tumor. V vsakem posameznem primeru je treba uporabiti vsa navedena in razpoložljiva zdravljenja.

Citokini močno olajšajo prenašanje obsevanja in kemoterapije, preprečujejo pojav nevtropenije (zmanjšanje števila levkocitov) in razvoj okužb med kemoradioterapijo. Poleg tega Refnot poveča učinkovitost večine kemoterapevtskih zdravil. Če ga uporabljate v kombinaciji z Ingaronom teden dni pred začetkom kemoterapije in nadaljujete z uporabo citokina po kemoterapiji, boste zaščitili pred okužbami ali jih pozdravili brez antibiotikov.

Shema citokinske terapije je dodeljena vsakemu bolniku posebej. Obe zdravili praktično nimata toksičnosti (za razliko od zdravil za kemoterapijo), nimata stranskih učinkov in ju bolniki dobro prenašajo, nimata zaviralnega učinka na hematopoezo in povečujeta specifično protitumorsko imunost.

Zdravljenje shizofrenije

Študije so pokazale, da citokini sodelujejo pri psihonevroimunskih reakcijah in zagotavljajo konjugirano delovanje živčnega in imunskega sistema. Ravnovesje citokinov uravnava proces regeneracije okvarjenih ali poškodovanih nevronov. To je osnova za uporabo novih metod zdravljenja shizofrenije - citokinske terapije: uporaba imunotropnih zdravil, ki vsebujejo citokine.

Eden od načinov je uporaba protiteles proti TNF-alfa in proti IFN-gama (protitelesa proti tumorsko nekroznemu faktorju-alfa in interferon-gama). Zdravilo se daje intramuskularno 5 dni, 2 r. v enem dnevu.

Obstaja tudi tehnika za uporabo sestavljene raztopine citokinov. Daje se v obliki inhalacij z nebulatorjem, 10 ml na 1 injekcijo. Odvisno od bolnikovega stanja se zdravilo daje vsakih 8 ur prvih 3-5 dni, nato 5-10 dni - 1-2 rublja / dan, nato pa se odmerek zmanjša na 1 r. v 3 dneh za dolgo časa (do 3 mesece) s popolno ukinitvijo psihotropnih zdravil.

Intranazalna uporaba raztopine citokinov (vsebuje IL-2, IL-3, GM-CSF, IL-1beta, IFN-gama, TNF-alfa, eritropoetin) izboljša učinkovitost zdravljenja bolnikov s shizofrenijo (tudi ob prvem napadu). bolezni), daljša in stabilnejša remisija. Te metode se uporabljajo v klinikah v Izraelu in Rusiji.

Več o shizofreniji

Citokini so po svoji naravi beljakovine, ki jih proizvajajo celice imunskega sistema (v literaturi jih pogosto imenujemo "dejavniki"). Sodelujejo pri diferenciaciji novorojenih celic imunskega sistema, ki jim dajejo določene lastnosti, ki so vir raznolikosti imunskih celic, in zagotavljajo tudi medcelično interakcijo. Za lažje razumevanje tega procesa lahko primerjamo proizvodnjo imunskih celic s tovarno. Na prvi stopnji identične slepe celice zapustijo tekoči trak, nato pa na drugi stopnji s pomočjo različnih skupin citokinov vsaka celica obdari posebne funkcije in jih razvrsti v skupine za kasnejše sodelovanje v imunskih procesih. Tako se iz enakih celic pridobijo T-limfociti, B-limfociti, nevtrofilci, bazofilci, eozinofili, monociti.

Za znanost je zanimiva posebnost vpliva citokina na celico, ki povzroči proizvodnjo drugih citokinov v tej celici. To pomeni, da en citokin sproži proizvodnjo drugih citokini.

Citokine glede na učinek na imunske celice delimo v šest skupin:

• interferoni
• interlevkini
• kolonije stimulirajoči dejavniki
• rastni dejavniki
• Kemokini
• Faktorji tumorske nekroze

interferoni so citokini, ki jih proizvajajo celice kot odziv na virusno okužbo ali druge možnosti dražljaja. Ti proteini (citokini) blokirajo razmnoževanje virusa v drugih celicah in sodelujejo pri imunski medcelični interakciji.

Prva vrsta (ima protivirusne in protitumorske učinke):

interferon-alfa

interferon-beta

Interferon-gama

Interferoni alfa in beta imajo podoben mehanizem delovanja, vendar jih proizvajajo različne celice.

Interferon alfa proizvajajo mononuklearni fagociti. Iz tega sledi njegovo ime - " levkocitni interferon».

Interferon beta proizvajajo fibroblasti. Od tod tudi njegovo ime - fibroblastni interferon».

Interferoni prve vrste imajo svoje naloge:

• Povečanje proizvodnje interlevkinov (IL1)
• Z zvišanjem temperature znižajte pH v medceličnem okolju
• Veže se na zdrave celice in jih ščiti pred virusi
• Sposoben zavirati celično proliferacijo (rast) z blokiranjem sinteze aminokislin
• Skupaj z naravnimi celicami ubijalkami inducirajo ali zavirajo (odvisno od situacije) tvorbo antigenov.

Interferon gama proizvajajo T-limfociti in naravne celice ubijalke. Nosi ime - imunski interferon»

Interferon druge vrste ima tudi naloge:

• Aktivira T-limfocite, B-limfocite, makrofage, nevtrofilce,
• Zavira proliferacijo timocitov,
• Krepi celično imunost in avtoimunost,
• Uravnava apoptozo normalnih in okuženih celic.

interlevkini(skrajšano IL) so citokini, ki uravnavajo interakcijo med levkociti. Znanost je identificirala 27 interlevkinov.

kolonije stimulirajoči dejavniki so citokini, ki uravnavajo delitev in diferenciacijo matičnih celic kostnega mozga in prekurzorjev krvnih celic. Ti citokini so odgovorni za sposobnost limfocitov za kloniranje in so sposobni tudi stimulirati delovanje celic zunaj kostnega mozga.

Rastni faktorji – uravnavajo rast, diferenciacijo in funkcionalnost celic v različnih tkivih

Do danes so odkrili naslednje dejavnike rasti:

• transformirajoči rastni faktorji alfa in beta
• epidermalni rastni faktor
• rastni faktor fibroblastov
• faktor rasti trombocitov
• živčni rastni faktor
• inzulinu podoben rastni faktor
• rastni faktor, ki veže heparin
• faktor rasti endotelijskih celic

Najbolj raziskane so funkcije transformacijskega rastnega faktorja beta. Odgovoren je za zatiranje rasti in aktivnosti T-limfocitov, zavira nekatere funkcije makrofagov, nevtrofilcev, B-limfocitov. Čeprav se ta dejavnik nanaša na rastne dejavnike, je v resnici vključen v obratne procese, to je, da zavira imunski odziv (zavira funkcije celic, ki sodelujejo pri imunski obrambi), ko se okužba odpravi in ​​delo imunskih celic ni več potrebno. Pod vplivom tega dejavnika se med celjenjem ran povečata sinteza kolagena in proizvodnja imunoglobulina IgA ter nastanejo spominske celice.

Kemokini so citokini z nizko molekulsko maso. Njihova glavna naloga je pritegniti levkocite iz krvnega obtoka v žarišče vnetja, pa tudi uravnavati mobilnost levkocitov.

Faktorji tumorske nekroze(skrajšano kot TNF) sta dve vrsti citokinov (TNF-alfa in TNF-beta). Rezultati njihovega delovanja: razvoj kaheksije (ekstremna izčrpanost telesa, zaradi česar se upočasni aktivnost encima, ki prispeva k kopičenju maščob v telesu); razvoj toksičnega šoka; zaviranje apoptoze (celične smrti) celic imunskega sistema, indukcija apoptoze tumorskih in drugih celic; aktivacija trombocitov in celjenje ran; zaviranje angiogeneze (proliferacija krvnih žil) in fibrogeneze (degeneracija tkiva v vezivno tkivo), granulomatoze (nastanek granulomov – proliferacija in transformacija fagocitov) in številni drugi rezultati.

V tem poglavju bomo obravnavali celosten pristop k vrednotenju citokinskega sistema z uporabo predhodno opisanih sodobnih raziskovalnih metod.

Najprej opišemo osnovne koncepte citokinskega sistema.

Citokini se trenutno obravnavajo kot proteinsko-peptidne molekule, ki jih proizvajajo različne celice telesa in izvajajo medcelične in medsistemske interakcije. Citokini so univerzalni regulatorji življenjskega cikla celice, nadzorujejo procese diferenciacije, proliferacije, funkcionalne aktivacije in apoptoze le-teh.

Citokini, ki jih proizvajajo celice imunskega sistema, se imenujejo imunocitokini; predstavljajo razred topnih peptidnih mediatorjev imunskega sistema, ki so potrebni za njegov razvoj, delovanje in interakcijo z drugimi telesnimi sistemi (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Kot regulatorne molekule imajo citokini pomembno vlogo pri izvajanju reakcij prirojene in adaptivne imunosti, zagotavljajo njihovo medsebojno povezovanje, nadzorujejo hematopoezo, vnetja, celjenje ran, nastajanje novih krvnih žil (angiogeneza) in številne druge vitalne procese.

Trenutno obstaja več različnih klasifikacij citokinov, ki upoštevajo njihovo strukturo, funkcionalno aktivnost, izvor in vrsto citokinskih receptorjev. Tradicionalno je v skladu z biološkimi učinki običajno razlikovati naslednje skupine citokinov.

1. interlevkini(IL-1-IL-33) - sekretorni regulativni proteini imunskega sistema, ki zagotavljajo interakcije mediatorjev v imunskem sistemu in njegovo povezavo z drugimi telesnimi sistemi. Interlevkine delimo glede na funkcionalno aktivnost na pro- in protivnetne citokine, rastne faktorje limfocitov, regulatorne citokine itd.

3. Faktorji tumorske nekroze (TNF)- citokini s citotoksičnim in regulatornim delovanjem: TNFa in limfotoksini (LT).

4. Faktorji rasti hematopoetskih celic- faktor rasti matičnih celic (Kit - ligand), IL-3, IL-7, IL-11, eritropoetin, trobopoetin, granulocitno-makrofagni kolonije stimulirajoči faktor - GM-CSF, granulocitni CSF - G-CSF, makrofagi-

ny KSF - M-CSF).

5. Kemokini- С, СС, СХС (IL-8), СХ3С - regulatorji kemotaksije različnih vrst celic.

6. Rastni faktorji nelimfoidnih celic- regulatorji rasti, diferenciacije in funkcionalne aktivnosti celic različnih tkivnih pripadnosti (fibroblastni rastni faktor - FGF, rastni faktor endotelijskih celic, epidermalni rastni faktor - epidermalni EGF) in transformirajoči rastni faktorji (TGFβ, TGFα).

Med drugim so v zadnjih letih aktivno preučevali dejavnik, ki zavira migracijo makrofagov (inhibicijski faktor migracije - MIF), ki velja za nevrohormon s citokinsko in encimsko aktivnostjo (Suslov A.P., 2003; Kovalchuk L.V. et al. ,

Citokini se razlikujejo po strukturi, biološki aktivnosti in drugih lastnostih. Vendar pa imajo citokini poleg razlik splošne lastnosti, značilnost tega razreda bioregulacijskih molekul.

1. Citokini so praviloma glikozilirani polipeptidi srednje molekulske mase (manj kot 30 kD).

2. Citokine proizvajajo celice imunskega sistema in druge celice (na primer endotel, fibroblasti itd.) kot odgovor na aktivacijski dražljaj (s patogenom povezane molekularne strukture, antigeni, citokini itd.) in sodelujejo v reakcijah prirojene in adaptivne imunosti, ki uravnava njihovo moč in trajanje. Nekateri citokini se sintetizirajo konstitutivno.

3. Izločanje citokinov je kratek proces. Citokini ne vztrajajo kot predhodno oblikovane molekule, temveč

sinteza se vedno začne s prepisovanjem genov. Celice proizvajajo citokine v nizkih koncentracijah (pikogramov na mililiter).

4. V večini primerov se citokini proizvajajo in delujejo na tarčne celice, ki so v neposredni bližini (delovanje kratkega dosega). Glavno mesto delovanja citokinov je medcelična sinapsa.

5. Redundanca Citokinski sistem se kaže v tem, da je vsak tip celice sposoben proizvesti več citokinov, vsak citokin pa lahko izločajo različne celice.

6. Opisani so vsi citokini pleiotropija, ali večnamenskost delovanja. Tako je manifestacija znakov vnetja posledica vpliva IL-1, TNFα, IL-6, IL-8. Podvajanje funkcij zagotavlja zanesljivost citokinskega sistema.

7. Delovanje citokinov na tarčne celice posredujejo visoko specifični membranski receptorji z visoko afiniteto, ki so transmembranski glikoproteini, običajno sestavljeni iz več kot ene podenote. Zunajcelični del receptorjev je odgovoren za vezavo citokinov. Obstajajo receptorji, ki izločajo odvečne citokine v patološkem žarišču. To so tako imenovani vabni receptorji. Topni receptorji so zunajcelična domena membranskega receptorja, ločena z encimom. Topni receptorji lahko nevtralizirajo citokine, sodelujejo pri njihovem transportu do žarišča vnetja in pri izločanju iz telesa.

8. Citokini deluje kot mreža. Lahko delujejo usklajeno. Zdi se, da so številne funkcije, prvotno pripisane enemu citokinu, posledica usklajenega delovanja več citokinov. (sinergizem dejanja). Primeri sinergistične interakcije citokinov so stimulacija vnetnih reakcij (IL-1, IL-6 in TNFa), pa tudi sinteza IgE.

(IL-4, IL-5 in IL-13).

Nekateri citokini inducirajo sintezo drugih citokinov (kaskada). Kaskadno delovanje citokinov je potrebno za razvoj vnetnih in imunskih odzivov. Sposobnost nekaterih citokinov, da povečajo ali zmanjšajo proizvodnjo drugih, določa pomembne pozitivne in negativne regulativne mehanizme.

Antagonistični učinek citokinov je znan, na primer, proizvodnja IL-6 kot odgovor na povečanje koncentracije TNF-a je lahko

negativni regulatorni mehanizem za nadzor proizvodnje tega mediatorja med vnetjem.

Citokinska regulacija funkcij tarčne celice se izvaja z avtokrinimi, parakrinimi ali endokrinimi mehanizmi. Nekateri citokini (IL-1, IL-6, TNFα itd.) so sposobni sodelovati pri izvajanju vseh naštetih mehanizmov.

Odziv celice na vpliv citokina je odvisen od več dejavnikov:

Od vrste celic in njihove začetne funkcionalne aktivnosti;

Iz lokalne koncentracije citokina;

Zaradi prisotnosti drugih mediatorskih molekul.

Tako celice proizvajalke, citokini in njihovi specifični receptorji na tarčnih celicah tvorijo eno samo mediatorsko mrežo. Gre za niz regulatornih peptidov in ne posameznih citokinov, ki določajo končni odziv celice. Trenutno se citokinski sistem obravnava kot univerzalni sistem regulacije na ravni celotnega organizma, ki zagotavlja razvoj zaščitnih reakcij (na primer med okužbo).

V zadnjih letih se je pojavila ideja o sistemu citokinov, ki združuje:

1) proizvajalke celic;

2) topni citokini in njihovi antagonisti;

3) tarčne celice in njihovi receptorji (slika 7.1).

Kršitve različnih komponent citokinskega sistema vodijo do razvoja številnih patoloških procesov, zato je odkrivanje napak v tem regulativnem sistemu pomembno za pravilno diagnozo in predpisovanje ustrezne terapije.

Najprej razmislimo o glavnih komponentah citokinskega sistema.

Celice, ki proizvajajo citokine

I. Glavna skupina celic, ki proizvajajo citokine v adaptivnem imunskem odzivu, so limfociti. Mirujoče celice ne izločajo citokinov. Po prepoznavi antigena in ob sodelovanju receptorskih interakcij (CD28-CD80/86 za T-limfocite in CD40-CD40L za B-limfocite) pride do aktivacije celic, kar vodi do transkripcije citokinskih genov, translacije in izločanja glikoziliranih peptidov. v zunajcelični prostor.

riž. 7.1. Citokinski sistem

CD4 T-pomočniki so predstavljeni s subpopulacijami: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, ki se med seboj razlikujejo po spektru izločenih citokinov kot odgovor na različne antigene.

Th0 proizvaja širok spekter citokinov v zelo nizkih koncentracijah.

Smer diferenciacije Th0 določa razvoj dveh oblik imunskega odziva s prevlado humoralnih ali celičnih mehanizmov.

Narava antigena, njegova koncentracija, lokalizacija v celici, vrsta celic, ki predstavljajo antigen, in določen niz citokinov uravnavajo smer diferenciacije Th0.

Dendritične celice po zajemu in obdelavi antigena predstavijo antigenske peptide celicam Th0 in proizvajajo citokine, ki uravnavajo smer njihove diferenciacije v efektorske celice. Vloga posameznih citokinov v tem procesu je prikazana na sl. 7.2. IL-12 inducira sintezo IFNγ s T-limfociti in ]ChGK. IFNu poskrbi za diferenciacijo Th1, ki začnejo izločati citokine (IL-2, IFNu, IL-3, TNFa, limfotoksine), ki uravnavajo razvoj reakcij na intracelularne patogene

(zapoznela preobčutljivost (DTH) in različne vrste celične citotoksičnosti).

IL-4 zagotavlja diferenciacijo Th0 v Th2. Aktivirani Th2 proizvajajo citokine (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 itd.), ki določajo proliferacijo B-limfocitov, njihovo nadaljnjo diferenciacijo v plazemske celice in razvoj protitelesnih odzivov, predvsem na zunajcelični patogeni.

IFNy negativno uravnava delovanje celic Th2 in, nasprotno, IL-4, IL-10, ki ju izloča Th2, zavirata delovanje Th1 (slika 7.3). Molekularni mehanizem te regulacije je povezan s transkripcijskimi faktorji. Ekspresija T-bet in STAT4, določena z IFNy, usmerja diferenciacijo celic T po poti Th1 in zavira razvoj Th2. IL-4 inducira izražanje GATA-3 in STAT6, kar v skladu s tem zagotavlja pretvorbo naivnih Th0 v Th2 celice (slika 7.2).

V zadnjih letih je bila opisana izrazita subpopulacija celic T pomočnic (Th17), ki proizvajajo IL-17. Člani družine IL-17 se lahko izražajo z aktiviranimi spominskimi celicami (CD4CD45RO), celicami y5T, NKT celicami, nevtrofilci, monociti pod vplivom IL-23, IL-6, TGFβ, ki ga proizvajajo makrofagi in dendritične celice. ROR-C je glavni dejavnik diferenciacije pri ljudeh in ROR-γ pri miših. l Prikazana je bila kardinalna vloga IL-17 pri razvoju kroničnega vnetja in avtoimunske patologije (glej sliko 7.2).

Poleg tega se lahko limfociti T v timusu diferencirajo v naravne regulatorne celice (Treg), ki izražajo CD4+ CD25+ površinske markerje in transkripcijski faktor FOXP3. Te celice lahko zavirajo imunski odziv, ki ga posredujejo celice Th1 in Th2 z neposrednim medceličnim stikom in sintezo TGFβ in IL-10.

Sheme diferenciacije klonov Th0 in citokinov, ki jih izločajo, so prikazane na sl. 7.2 in 7.3 (glej tudi barvni vložek).

T-citotoksične celice (CD8 +), naravni ubijalci - šibki proizvajalci citokinov, kot so interferoni, TNFa in limfotoksini.

Prekomerna aktivacija ene od subpopulacij Th lahko povzroči razvoj ene od variant imunskega odziva. Kronično neravnovesje aktivacije Th lahko povzroči nastanek imunopatoloških stanj, povezanih z manifestacijami

mi alergije, avtoimunske patologije, kronični vnetni procesi itd.

riž. 7.2. Različne subpopulacije T-limfocitov, ki proizvajajo citokine

II. V prirojenem imunskem sistemu so glavni proizvajalci citokinov mieloidne celice. Z uporabo Toll-like receptorjev (TLR) prepoznajo podobne molekularne strukture različnih patogenov, tako imenovane s patogenom povezane molekularne vzorce (PAMP), npr. ponavljanja itd.

Ta interakcija s TLR sproži kaskado transdukcije znotrajceličnega signala, ki vodi do izražanja genov za dve veliki skupini citokinov: provnetnega in IFN tipa 1 (slika 7.4, glejte tudi barvni vstavek). Večinoma ti citokini (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, kemokini itd.) inducirajo razvoj vnetja in sodelujejo pri zaščiti telesa pred bakterijskimi in virusnimi okužbami.

riž. 7.3. Spekter citokinov, ki jih izločajo celice Th1 in Th12

III. Celice, ki niso del imunskega sistema (celice vezivnega tkiva, epitelija, endotelija), konstitutivno izločajo avtokrine rastne faktorje (GGF, EGF, TGFr itd.). in citokini, ki podpirajo proliferacijo hematopoetskih celic.

Citokini in njihovi antagonisti so podrobno opisani v številnih monografijah (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

riž. 7.4. TLR-posredovana indukcija proizvodnje citokinov s prirojenimi imunskimi celicami

Prekomerno izražanje citokinov ni varno za telo in lahko privede do razvoja čezmerne vnetne reakcije, odziva akutne faze. Pri uravnavanju nastajanja provnetnih citokinov sodelujejo različni zaviralci. Tako so opisane številne snovi, ki nespecifično vežejo citokin IL-1 in preprečujejo manifestacijo njegovega biološkega delovanja (a2-makroglobulin, C3-komponenta komplementa, uromodulin). Specifični zaviralci IL-1 so lahko topni vabni receptorji, protitelesa in antagonist receptorja IL-1 (IL-1RA). Z razvojem vnetja se poveča izražanje gena IL-1RA. Toda tudi običajno je ta antagonist v krvi prisoten v visoki koncentraciji (do 1 ng / ml ali več), kar blokira delovanje endogenega IL-1.

ciljne celice

Delovanje citokinov na tarčne celice poteka preko specifičnih receptorjev, ki vežejo citokine z zelo visoko afiniteto, posamezni citokini pa lahko uporabljajo

skupne receptorske podenote. Vsak citokin se veže na svoj specifični receptor.

Citokinski receptorji so transmembranski proteini in jih delimo na 5 glavnih vrst. Najpogostejši je tako imenovani hematopoetski tip receptorjev, ki ima dve ekstracelularni domeni, od katerih ena vsebuje skupno zaporedje aminokislinskih ostankov dveh ponovitev triptofana in serina, ločenih s poljubno aminokislino (motiv WSXWS). Drugi tip receptorja ima lahko dve zunajcelični domeni z velikim številom ohranjenih cisteinov. To so receptorji družine IL-10 in IFN. Tretjo vrsto predstavljajo citokinski receptorji, ki pripadajo skupini TNF. Četrta vrsta citokinskih receptorjev spada v naddružino imunoglobulinskih receptorjev, ki imajo zunajcelične domene, podobne zgradbi kot imunoglobulinske molekule. Peto vrsto receptorjev, ki vežejo molekule družine kemokinov, predstavljajo transmembranski proteini, ki prečkajo celično membrano na 7 mestih. Citokinski receptorji lahko obstajajo v topni obliki in ohranijo sposobnost vezave ligandov (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Citokini lahko vplivajo na proliferacijo, diferenciacijo, funkcionalno aktivnost in apoptozo ciljnih celic (glej sliko 7.1). Manifestacija biološke aktivnosti citokinov v ciljnih celicah je odvisna od sodelovanja različnih znotrajceličnih sistemov pri prenosu signala iz receptorja, kar je povezano z značilnostmi ciljnih celic. Signal za apoptozo se izvaja med drugim s pomočjo določene regije družine receptorjev TNF, tako imenovane domene »smrti« (slika 7.5, glej barvni vstavek). Diferenciacijski in aktivacijski signali se prenašajo preko intracelularnih Jak-STAT proteinov - signalnih pretvornikov in transkripcijskih aktivatorjev (slika 7.6, glej barvni vstavek). G-proteini sodelujejo pri prenosu signala iz kemokinov, kar vodi do povečane celične migracije in adhezije.

Kompleksna analiza citokinskega sistema vključuje naslednje.

I. Vrednotenje celic proizvajalk.

1. Definicija izraza:

Receptorji, ki prepoznajo patogen ali antigen TCR, TLR) na ravni genov in proteinskih molekul (PCR, metoda pretočne citometrije);

Adapterske molekule, ki prevajajo signal, ki sproži transkripcijo citokinskih genov (PCR itd.);

riž. 7.5. Transdukcija signala iz receptorja TNF

riž. 7.6. Jak-STAT - signalna pot citokinskega receptorja tipa 1

Citokinski geni (PCR); proteinske molekule citokinov (ocena citokinsko sintetizirajoče funkcije človeških mononuklearnih celic).

2. Kvantitativno določanje celičnih subpopulacij, ki vsebujejo določene citokine: Th1, Th2 Th17 (metoda intracelularnega barvanja citokinov); določitev števila celic, ki izločajo določene citokine (metoda ELISPOT, glej 4. poglavje).

II. Vrednotenje citokinov in njihovih antagonistov v bioloških medijih telesa.

1. Testiranje biološke aktivnosti citokinov.

2. Kvantitativno določanje citokinov z ELISA testom.

3. Imunohistokemijsko barvanje citokinov v tkivih.

4. Določitev razmerja nasprotnih citokinov (pro- in protivnetnih), citokinov in antagonistov citokinskih receptorjev.

III. Ocena ciljne celice.

1. Določanje izražanja citokinskih receptorjev na ravni genov in proteinskih molekul (PCR, metoda pretočne citometrije).

2. Določanje signalnih molekul v znotrajcelični vsebini.

3. Določanje funkcionalne aktivnosti tarčnih celic.

Za zagotavljanje raznolikih informacij so bile razvite številne metode za vrednotenje citokinskega sistema. Med njimi se razlikujejo:

1) molekularno biološke metode;

2) metode za kvantitativno določanje citokinov z uporabo imunskega testa;

3) testiranje biološke aktivnosti citokinov;

4) znotrajcelično obarvanje citokinov;

5) metoda ELISPOT, ki omogoča detekcijo citokinov okoli posamezne celice, ki proizvaja citokine;

6) imunofluorescenca.

Podajamo kratek opis teh metod.

Z uporabo molekularno biološke metode mogoče je preučevati izražanje genov citokinov, njihovih receptorjev, signalnih molekul, preučevati polimorfizem teh genov. V zadnjih letih je bilo izvedenih veliko število študij, ki so razkrile povezave med alelnimi različicami molekul geni citokinskega sistema in predispozicijo.

na številne bolezni. Preučevanje alelnih variant citokinskih genov lahko zagotovi informacije o genetsko programirani proizvodnji določenega citokina. Najbolj občutljiva je verižna reakcija s polimerazo v realnem času - PCR-RT (glej pogl. 6). metoda hibridizacije in situ vam omogoča, da razjasnite tkivno in celično lokalizacijo izražanja citokinskih genov.

Kvantitativno določanje citokinov v bioloških tekočinah in kulturah mononuklearnih celic periferne krvi z ELISA lahko označimo na naslednji način. Ker so citokini lokalni mediatorji, je primerneje meriti njihove ravni v posameznih tkivih po ekstrakciji tkivnih beljakovin ali v naravnih tekočinah, kot so solze, ustni izpirki, urin, amnijska tekočina, cerebrospinalna tekočina itd. Ravni citokinov v serumu ali drugih telesnih tekočinah odražajo trenutno stanje imunskega sistema, tj. sintezo citokinov v telesnih celicah in vivo.

Določanje ravni proizvodnje citokinov z mononuklearnimi celicami periferne krvi (PBMC) pokaže funkcionalno stanje celic. Spontana proizvodnja citokinov MNC v kulturi kaže, da so celice že aktivirane. in vivo. Inducirana (z različnimi stimulansi, mitogeni) sinteza citokinov odraža potencialno, rezervno sposobnost celic, da se odzovejo na antigenski dražljaj (zlasti na delovanje zdravil). Zmanjšana inducirana proizvodnja citokinov je lahko eden od znakov stanja imunske pomanjkljivosti. Citokini niso specifični za določen antigen. Zato je specifična diagnoza infekcijskih, avtoimunskih in alergijskih bolezni z določanjem ravni določenih citokinov nemogoča. Hkrati je z oceno ravni citokinov mogoče pridobiti podatke o resnosti vnetnega procesa, njegovem prehodu na sistemsko raven in prognozi, funkcionalni aktivnosti celic imunskega sistema, razmerju celic Th1 in Th2, kar je zelo pomembno pri diferencialni diagnozi številnih infekcijskih in imunopatoloških procesov.

V bioloških medijih je mogoče citokine kvantificirati z uporabo niza imunske metode, z uporabo poliklonskih in monoklonskih protiteles (glejte 4. poglavje). ELISA vam omogoča, da ugotovite, kakšne so natančne koncentracije citokinov v bio-

logične telesne tekočine. ELISA detekcija citokinov ima vrsto prednosti pred drugimi metodami (visoka občutljivost, specifičnost, neodvisnost od prisotnosti antagonistov, možnost natančnega avtomatiziranega obračunavanja, standardizacija računovodstva). Vendar pa ima ta metoda tudi svoje omejitve: ELISA ne označuje biološke aktivnosti citokinov in lahko daje napačne rezultate zaradi navzkrižno reagirajočih epitopov.

biološko testiranje izvedemo na podlagi poznavanja osnovnih lastnosti citokinov, njihovega delovanja na tarčne celice. Študija bioloških učinkov citokinov je vodila do razvoja štirih vrst testiranja citokinov:

1) z indukcijo proliferacije ciljnih celic;

2) s citotoksičnim učinkom;

3) z indukcijo diferenciacije progenitorjev kostnega mozga;

4) s protivirusnim delovanjem.

IL-1 določa stimulativni učinek na proliferacijo mišjih timocitov, ki jih aktivira mitogen in vitro; IL-2 - glede na sposobnost stimulacije proliferativne aktivnosti limfoblastov; za citotoksične učinke na mišje fibroblaste (L929) testiramo TNFa in limfotoksine. Dejavniki, ki spodbujajo kolonije, se ocenjujejo glede na njihovo sposobnost podpiranja rasti potomcev kostnega mozga kot kolonij na agarju. Protivirusno delovanje IFN ugotavljamo z inhibicijo citopatskega delovanja virusov v kulturi diploidnih človeških fibroblastov in tumorske linije mišjih fibroblastov L-929.

Ustvarile so se celične linije, katerih rast je odvisna od prisotnosti določenih citokinov. V tabeli. 7.1 je seznam celičnih linij, ki se uporabljajo za testiranje citokinov. Glede na sposobnost induciranja proliferacije občutljivih tarčnih celic se izvaja biotestiranje IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 itd.. Vendar te metode testiranja niso zelo občutljivi in ​​informativni. Molekule zaviralcev in antagonistov lahko prikrijejo biološko aktivnost citokinov. Nekateri citokini kažejo splošno biološko aktivnost. Kljub temu so te metode idealne za testiranje specifične aktivnosti rekombinantnih citokinov.

Tabela 7.1. Celične linije, ki se uporabljajo za testiranje biološke aktivnosti citokinov

Konec mize. 7.1

Lab 7-1

Določanje biološke aktivnosti IL-1 z njegovim komitogenim učinkom na proliferacijo mišjih timocitov

Metoda biološkega testiranja IL-1 temelji na sposobnosti citokina, da stimulira proliferacijo mišjih timocitov.

IL-1 lahko določimo v kulturi monocitov, stimuliranih z LPS, kot tudi v katerikoli telesni tekočini. Treba je biti pozoren na številne podrobnosti.

1. Za testiranje uporabimo timocite miši C3H/HeJ, stimulirane na proliferacijo z mitogeni (konkanavalinom A - ConA in fitohemaglutininom - PHA). Timociti C3H/HeJ niso bili izbrani naključno: miši te samooplodne linije se ne odzivajo na LPS, ki je lahko prisoten v testnem materialu in povzroči proizvodnjo IL-1.

2. Timociti se odzivajo na IL-2 in mitogene, zato je treba v preparatih testiranih na IL-1 določiti tudi prisotnost IL-2 in mitogenov.

Postopek delovanja

1. Pridobite suspenzijo timocitov v koncentraciji 12×10 6 /ml medija RPMI 1640, ki vsebuje 10% seruma fetalnih krav in 2-merkaptoetanol (5×10 -5 M).

2. Pripravi se niz zaporednih dvakratnih razredčitev eksperimentalnih (telesnih tekočin) in kontrolnih vzorcev. Za kontrolo uporabimo biološke tekočine, ki vsebujejo IL-1, ali vzorce, pridobljene z inkubacijo mononuklearnih celic brez LPS in laboratorijski standardni pripravek, ki vsebuje IL-1. V ploščah z okroglim dnom s 96 vdolbinicami se 50 µl vsake razredčine prenese v 6 vdolbinic.

3. Dodajte 50 µl prečiščenega PHA (Wellcome), raztopljenega v celotnem mediju v koncentraciji 3 µg/ml v tri vdolbinice vsake razredčitve, in 50 µl medija v druge 3 vdolbinice.

4. Dodajte 50 µl suspenzije timocitov v vsako vdolbinico in inkubirajte 48 ur pri 37 °C.

6. Pred zaključkom gojenja se v jamice doda 50 μl raztopine (1 μCi / ml) [" 3 H]-timidina in inkubira še nadaljnjih 20 ur.

7. Za določitev stopnje radioaktivnosti se celice kulture prenesejo na filtrirni papir z avtomatskim zbiralnikom celic, filtri se posušijo in vključitev oznake se določi s tekočim scintilacijskim števcem.

8. Rezultati so izraženi kot koeficient stimulacije.

kjer je m cp povprečno število impulzov v 3 luknjah.

Če se timociti odzovejo na stimulacijo s standardnim IL-1, potem indeks stimulacije testnega vzorca, ki presega 3, zanesljivo kaže na aktivnost IL-1.

Biološki test je edina metoda za ocenjevanje delovanja citokina, vendar je treba to metodo dopolniti z različnimi vrstami ustreznih kontrol za specifičnost z uporabo monoklonskih protiteles. Dodatek določenih monoklonskih protiteles citokinu v kulturi blokira biološko aktivnost citokina, kar dokazuje, da je signal za proliferacijo celične linije določen citokin.

Uporaba biološkega testa za odkrivanje interferona. Načelo ocenjevanja biološke aktivnosti IFN temelji na njegovem protivirusnem učinku, ki je določen s stopnjo inhibicije razmnoževanja testnega virusa v celični kulturi.

Pri delu lahko uporabimo celice, občutljive na delovanje IFN: prvotno tripsinizirane celice fibroblastov piščanca in človeškega zarodka, presajene celice diploidnih človeških fibroblastov in celične kulture miši (L929).

Pri ocenjevanju protivirusnega učinka IFN je priporočljivo uporabiti viruse s kratkim razmnoževalnim ciklusom, visoko občutljivostjo na delovanje IFN: virus mišjega encefalomielitisa, mišjega vezikularnega stomatitisa itd.

Lab 7-2

Določitev aktivnosti interferona

1. Suspenzijo diploidnih človeških fetalnih fibroblastov na gojišču z 10% serumom govejih zarodkov (celična koncentracija - 15-20×10 6 /ml) vlijemo v sterilne plošče z ravnim dnom s 96 vdolbinicami, 100 μl na vdolbinico in postavimo. v CO 2 -inkubatorju pri temperaturi 37 °C.

2. Po oblikovanju popolne monosloja se rastni medij odstrani iz vdolbinic in v vsako vdolbinico doda 100 µl vzdrževalnega medija.

3. Titracijo aktivnosti IFN v testnih vzorcih izvajamo z metodo dvojnih razredčin na monosloju fibroblastov.

Hkrati z vzorci v vdolbinice vnesemo virus mišjega encefalomielitisa (VEM) v odmerku, ki povzroči 100 % poškodbo celic 48 ur po okužbi.

4. Vdolbinice z nepoškodovanimi (neobdelanimi) z virusom okuženimi celicami se uporabijo kot kontrole.

V vsaki študiji se kot referenčni pripravki uporabljajo referenčni vzorci IFN z znano aktivnostjo.

5. Plošče za redčenje vzorcev se inkubirajo 24 ur pri 37 °C v atmosferi 5 % CO 2 .

6. Stopnja aktivnosti IFN je določena z recipročno vrednostjo največje razredčitve testnega vzorca, ki zakasni citopatski učinek virusa za 50 %, in je izražena v enotah aktivnosti na 1 ml.

7. Za določitev vrste IFN se v sistem doda antiserum proti IFNα, IFNβ ali IFNγ. Antiserum izniči delovanje ustreznega citokina, kar omogoča identifikacijo vrste IFN.

Določanje biološke aktivnosti migracije inhibitornega faktorja. Trenutno so se oblikovale popolnoma nove predstave o naravi in ​​lastnostih MYTH-a, odkritega v 60. letih prejšnjega stoletja kot posrednika celične imunosti in dolga leta puščenega brez ustrezne pozornosti (Bloom B.R., Bennet B., 1966; David J.R. , 1966). Šele v zadnjih 10–15 letih je postalo jasno, da je MYTH eden najpomembnejših bioloških mediatorjev v telesu s širokim spektrom bioloških funkcij citokina, hormona in encima. Delovanje MIF na ciljne celice se izvaja preko CD74 - receptorja ali preko neklasične poti endocitoze.

MYTH velja za pomembnega vnetnega mediatorja, ki aktivira delovanje makrofagov (produkcija citokinov, fagocitoza, citotoksičnost itd.), pa tudi kot endogeni imunoregulacijski hormon, ki modulira glukokortikoidno aktivnost.

Vse več informacij se zbira o vlogi MYTH v patogenezi številnih vnetnih bolezni, vključno s sepso, revmatoidnim artritisom (RA), glomerulonefritisom itd. Pri RA je koncentracija MYTH v tekočini prizadetih sklepov znatno povečana. , kar je v korelaciji z resnostjo bolezni. Pod vplivom MIF se poveča produkcija vnetnih citokinov s strani makrofagov in sinovialnih celic.

Obstajajo različne metode testiranja aktivnosti MIF, ko se selitvene celice (tarčne celice za MIF) dajo v stekleno kapilaro (kapilarni test), v kapljico agaroze ali v agarozno vdolbinico.

Predstavljamo razmeroma preprosto presejalno metodo, ki temelji na tvorbi celičnih mikrokultur (levkocitov ali makrofagov) standardnih po površini in številu celic na dnu vdolbinic plošče z ravnim dnom s 96 vdolbinicami, ki jim sledi gojenje v hranilnem mediju. in določitev spremembe območja teh mikrokultur pod delovanjem MIF (Suslov A.P., 1989).

Lab 7-3

Opredelitev aktivnosti MYTH

Določanje biološke aktivnosti MIF se izvaja z napravo za tvorbo celičnih mikrokultur (slika 7.7) - MIGROSCRIN (Raziskovalni inštitut za epidemiologijo in mikrobiologijo po imenu N.F. Gamaleya Ruske akademije medicinskih znanosti).

1. V vdolbinice plošče s 96 vdolbinicami (Flow, UK ali podobno) dodamo 100 µl vzorca, razredčenega v gojišču, v katerem določimo aktivnost MIF (vsaka razredčitev v 4 paralele, poskusni vzorci). Gojišče vključuje RPMI 1640, 2 mM L-glutamina, 5 % fetalni goveji serum, 40 μg/ml gentamicina.

2. V kontrolne vdolbinice dodajte gojišče (v 4 paralele) 100 µl.

3. Pripravimo celično suspenzijo peritonealnih makrofagov, za katero 2 hibridnima mišima (CBAxC57B1 / 6) F1 intraperitonealno injiciramo 10 ml Hankove raztopine s heparinom (10 U / ml), trebuh nežno masiramo 2-3 minute. . Nato žival zakoljejo z dekapitacijo, trebušno steno previdno preluknjajo v predelu dimelj in skozi iglo z brizgo aspirirajo eksudat. Celice peritonealnega eksudata dvakrat speremo s Hankovo ​​raztopino in jih centrifugiramo 10-15 minut pri 200 g. Nato pripravimo celično suspenzijo s koncentracijo 10±1 milijon/ml medija RPMI 1640. Štetje izvedemo v komori Goryaev.

4. Sestavljen je sistem MIGROSCRIN, ki je stojalo za usmerjeno in standardno fiksiranje konic s celičnimi kulturami v strogo navpičnem položaju na določeni višini nad središčem vdolbinice plošče s 96 vdolbinicami in vključuje tudi 92 konic za avtomatsko pipeto proizvajalca Costar, ZDA (slika .7.7).

Noge stojala vstavite v kotne vdolbinice plošče. Suspenzijo celic zberemo z avtomatsko pipeto v konice - po 5 μl, jih z enkratnim potopitvijo v medij speremo z odvečnih celic in navpično vstavimo v vtičnice sistemskega stojala. Napolnjeno stojalo s konicami hranimo pri sobni temperaturi 1 uro na strogo vodoravni površini. V tem času se celice suspenzije usedejo na dno vdolbinic, kjer nastanejo standardne celične mikrokulture.

5. Previdno odstranite stojalo za konice s plošče. Ploščo z mikrokulturo celic postavimo v strogo vodoraven položaj v CO 2 inkubator, kjer jo gojimo 20 ur.Med kultivacijo celice migrirajo po dnu jamice.

6. Kvantifikacija rezultatov po inkubaciji se izvede na binokularni lupi, pri čemer se vizualno oceni velikost kolonije na lestvici znotraj okularja. Mikrokulture so oblikovane kot krog. Raziskovalci nato določijo povprečni premer kolonije iz rezultatov meritev kolonije v 4 testnih ali kontrolnih vdolbinicah. Merilna napaka je ±1 mm.

Migracijski indeks (MI) se izračuna po formuli:

Vzorec ima aktivnost MYTH, če so vrednosti MI enake

Za konvencionalno enoto (U) aktivnosti MYTH se vzame inverzna vrednost enaka vrednosti največje razredčitve vzorca (vzorca), pri kateri je indeks migracije 0,6 ± 0,2.

Biološka aktivnost PEOα je ocenjen z njegovim citotoksičnim učinkom na linijo transformiranih fibroblastov L-929. Rekombinantni TNFa se uporablja kot pozitivna kontrola, celice v gojišču pa kot negativna kontrola.

Citotoksični indeks (CI) se izračuna:

kje a- število živih celic v kontroli; b- število živih celic v poskusu.

riž. 7.7. Shema MIGROSCRIN - naprave za kvantitativno oceno migracije celičnih kultur

Celice se obarvajo z barvilom (metilensko modro), ki je vključeno le v odmrle celice.

Za konvencionalno enoto aktivnosti TNF se vzame vrednost reverzne razredčitve vzorca, ki je potrebna za pridobitev 50 % celične citotoksičnosti. Specifična aktivnost vzorca je razmerje med aktivnostjo v poljubnih enotah na 1 ml in koncentracijo beljakovine v vzorcu.

Intracelularno barvanje citokinov. Sprememba razmerja celic, ki proizvajajo različne citokine, lahko odraža patogenezo bolezni in služi kot merilo za prognozo bolezni in oceno terapije.

Metoda intracelularnega barvanja določa izražanje citokina na ravni ene celice. Pretočna citometrija vam omogoča štetje števila celic, ki izražajo določen citokin.

Naj naštejemo glavne korake pri določanju znotrajceličnih citokinov.

Nestimulirane celice proizvajajo majhne količine citokinov, ki se praviloma ne odlagajo, zato je pomemben korak pri oceni intracelularnih citokinov stimulacija limfocitov in blokada sproščanja teh produktov iz celic.

Kot induktor citokinov se največkrat uporablja aktivator protein kinaze C forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) v kombinaciji s kalcijevim ionoforjem ionomicinom (IN). Uporaba te kombinacije povzroči sintezo širokega spektra citokinov: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. Slabost uporabe FMA-IN je težava detekcije molekul CD4 na površini limfocitov po takšni aktivaciji. Prav tako se proizvodnja citokinov s T-limfociti inducira z uporabo mitogenov (PGA). B celice in monociti stimulirajo

Mononuklearne celice inkubiramo 2-6 ur v prisotnosti induktorjev nastajanja citokinov in blokatorja njihovega intracelularnega transporta brefeldina A ali monenzina.

Celice se nato resuspendirajo v pufrski raztopini. Za fiksacijo dodamo 2 % formaldehida, inkubiramo 10-15 minut pri sobni temperaturi.

Nato celice obdelamo s saponinom, ki poveča prepustnost celične membrane, in jih obarvamo z monoklonskimi protitelesi, specifičnimi za citokine, ki jih določamo. Predhodno barvanje površinskih markerjev (CD4, CD8) poveča količino pridobljenih informacij o celici in omogoča natančnejšo določitev njene populacijske pripadnosti.

Pri uporabi zgoraj opisanih metod obstajajo nekatere omejitve. Tako je z njihovo pomočjo nemogoče analizirati sintezo citokinov v posamezni celici, nemogoče je določiti število celic, ki proizvajajo citokine, v subpopulaciji, ni mogoče ugotoviti, ali celice, ki proizvajajo citokine, izražajo edinstvene markerje, ali različne citokine sintetizirajo različne celice ali iste. Odgovor na ta vprašanja dobimo z drugimi raziskovalnimi metodami. Za določitev pogostnosti celic, ki proizvajajo citokine, v populaciji se uporablja metoda omejujočega redčenja in različica encimskega imunskega testa ELISPOT (glejte poglavje 4).

Metoda in situ hibridizacije. Metoda vključuje:

2) fiksacija s paraformaldehidom;

3) detekcija mRNA z uporabo označene cDNA. V nekaterih primerih se citokinska mRNA določi na rezih z uporabo radioizotopne PCR.

Imunofluorescenca. Metoda vključuje:

1) zamrzovanje organa in priprava odsekov kriostata;

2) fiksacija;

3) obdelava odsekov s fluoresceinom označenimi protitelesi proti citokinom;

4) vizualno opazovanje fluorescence.

Te tehnike (hibridizacija in situ in imunofluorescenca) so hitri in niso odvisni od mejnih koncentracij izločenega produkta. Vendar pa ne določajo količine izločenega citokina in so lahko tehnično zapleteni. Potrebno je različno skrbno spremljanje nespecifičnih reakcij.

S predstavljenimi metodami za oceno citokinov so identificirali patološke procese, povezane z motnjami v citokinskem sistemu na različnih ravneh.

Tako je ocena citokinskega sistema izjemno pomembna za karakterizacijo stanja imunskega sistema telesa. Študija različnih ravni citokinskega sistema omogoča pridobivanje informacij o funkcionalni aktivnosti različnih vrst imunokompetentnih celic, resnosti vnetnega procesa, njegovem prehodu na sistemsko raven in prognozi bolezni.

Vprašanja in naloge

1. Naštejte splošne lastnosti citokinov.

2. Podajte klasifikacijo citokinov.

3. Naštejte glavne sestavine citokinskega sistema.

4. Naštejte celice, ki proizvajajo citokine.

5. Opišite družine citokinskih receptorjev.

6. Kakšni so mehanizmi delovanja citokinske mreže?

7. Povejte nam o nastajanju citokinov v prirojenem imunskem sistemu.

8. Kateri so glavni pristopi k kompleksni oceni citokinskega sistema?

9. Kakšne so metode za testiranje citokinov v telesnih tekočinah?

10. Kakšne so okvare citokinskega sistema pri različnih patologijah?

11. Katere so glavne metode biološkega testiranja IL-1, IFN, MIF, TNFa v bioloških tekočinah?

12. Opišite postopek določanja znotrajcelične vsebnosti citokinov.

13. Opišite postopek določanja citokinov, ki jih izloča posamezna celica.

14. Opišite zaporedje metod za odkrivanje napake na ravni citokinskega receptorja.

15. Opišite zaporedje metod za odkrivanje okvare na ravni celic, ki proizvajajo citokine.

16. Katere podatke lahko pridobimo s preučevanjem proizvodnje citokinov v kulturi mononuklearnih celic v krvnem serumu?

Med citokine spadajo različne beljakovine z molekulsko maso 15-40 kDa, ki jih sintetizirajo različne celice v telesu. Citokini so molekule, ki zagotavljajo interakcijo celic imunskega sistema, vaskularnega endotelija, živčnega sistema in jeter. Trenutno je znanih več kot 200 citokinov.

Iste citokine lahko sintetizirajo celice različnih tipov - imunski sistem, vranica, timus, vezivno tkivo. Po drugi strani pa je določena celica sposobna proizvesti veliko različnih citokinov. Največjo raznolikost citokinov tvorijo limfociti, zaradi česar limfocitna imunost sodeluje z drugimi imunskimi mehanizmi in s telesom kot celoto.

Bistvena lastnost citokinov, za razliko od hormonov in drugih signalnih molekul, je enak, različen ali celo nasproten rezultat njihovega delovanja za različne celice. Tisti. Končni rezultat vpliva citokina ni odvisen od njegove vrste, temveč od notranjega programa tarčne celice, od njenih posameznih nalog!

Funkcije citokinov

Vlogo citokinov pri uravnavanju telesnih funkcij lahko razdelimo na 4 glavne komponente:

1. Regulacija embriogeneze, polaganja in razvoja organov, vključno z organi imunskega sistema.

2. Regulacija procesov rasti tkiv:

3. Regulacija posameznih fizioloških funkcij:

• zagotavljanje funkcionalne aktivnosti celic,
• usklajevanje reakcij endokrinega, imunskega in živčnega sistema,
• vzdrževanje homeostaze (dinamične konstantnosti) telesa.

4. Regulacija zaščitnih reakcij telesa na lokalni in sistemski ravni:

• spremembe v trajanju in intenzivnosti imunskih odzivov (protitumorska in protivirusna zaščita telesa),
• modulacija vnetnih odzivov,
• sodelovanje pri razvoju avtoimunskih reakcij.
• stimulacija ali zaviranje celične rasti,
• sodelovanje v procesu hematopoeze.