Splošna shema bakteriološke diagnostike. Faze bakteriološke raziskovalne metode
20. Značilnosti bakteriološke raziskovalne metode
Kulturna (bakteriološka) raziskovalna metoda - niz metod, namenjenih izolaciji in identifikaciji čistih kultur mikroorganizmov (bakterij) z gojenjem na hranilnih medijih.
Čista kultura je skupek mikroorganizmov iste vrste. Najpogosteje se čista kultura pridobi z izbiro in gojenjem izolirane kolonije (potomca ene mikrobne celice).
Koraki metode:
1. Zbiranje gradiva za raziskavo.
2. Izolacija čiste kulture in njena identifikacija.
3. Zaključek.
Zbiranje gradiva za raziskave. Vrsta preučenega materiala je odvisna od namena študije (diagnoza - od bolnika; epidemiološka analiza - iz okolja, hrane, bolnika in (ali) nosilca bakterije).
Izolacija čiste kulture. Vključuje 3 ali 4 stopnje:
1. Sejanje materiala (po predhodnem mikroskopiranju) na skodelico z gostim hranilnim medijem (po možnosti diferencialno diagnostičnim ali selektivnim), da dobimo izolirane kolonije. Najpogosteje se proizvaja z metodo mehanske separacije. V nekaterih primerih (na primer pri krvi) je material predhodno posejan v tekoči obogatitveni medij, čemur sledi subkultura na plošči z agarnim medijem. Včasih se pred inokulacijo izvede selektivna obdelava materiala (ob upoštevanju lastnosti izoliranega mikroorganizma; na primer obdelava s kislino ali alkalijo za izolacijo odpornih bakterij). Gojene pri temperaturi 37°C 18-24 ur. Čas gojenja za različne vrste bakterij se lahko razlikuje.
2(3): a) proučevanje kolonij na agar plošči (kulturne lastnosti), izbor najbolj tipičnih; b) priprava brisov iz teh kolonij z barvanjem (po Gramu ali drugih metodah); a) presejanje preostale proučevane kolonije na akumulacijskem mediju in gojenje v termostatu pri optimalni temperaturi.
3(4). Študija čistosti kulture, pridobljene na akumulacijskem mediju. S tem
namen je priprava brisa, barvanje (običajno po Gramu), mikroskopska študija
morfološka in tinktorialna homogenost (v različnih vidnih poljih).
4(5). Identifikacija čiste kulture.
Zaključek. Glede na celoto lastnosti v primerjavi z lastnostmi referenčnih (tipičnih) sevov je navedena vrsta mikroorganizma, izoliranega iz materiala.
Ocena metode:
prednosti: relativno visoka občutljivost in natančnost, sposobnost določanja števila mikrobov v testnem materialu, pa tudi občutljivost na antibiotike; omejitve: relativno trajanje, metoda je draga.
21. Hranilna gojišča za aerobne in anaerobne. Zahteve za hranilne medije, razvrstitev.
Zahteve:
gojišča morajo biti hranljiva
mora imeti določen ph
mora biti izotonična, tj. osmotski tlak v mediju mora biti enak kot v celici.
mora biti vlažna in ne preveč tekoča
mora imeti določen redoks potencial
mora biti sterilen
mora biti enoten, tj. vsebujejo stalne količine posameznih sestavin.
Hranilne medije lahko razdelimo na:
A) Izvor
1) naravna - naravna hrana (meso, mleko, krompir);
2) umetna - posebej pripravljena za gojenje mikrobov: - gojišča iz naravnih proizvodov (mesna voda, mesno-peptonska juha (MPB), mesno-peptonski agar (MPA), - nimajo stalne sestave; - sintetična hranilna gojišča - raztopine striktno definirane količine soli, aminokislin, dušikovih baz, vitaminov v destilirani vodi - imajo konstantno sestavo, uporabljajo se za gojenje mikroorganizmov in celičnih kultur pri proizvodnji cepiv, imunskih serumov in antibiotikov;
B) Po dogovoru:
1) splošni namen (MPB, MPA) - večina mikrobov raste na njih;
2) izbirni - selektivno spodbujajo rast ene vrste mikrobov iz mešanice (na primer agar rumenjaka in soli za stafilokoke);
3) diferencialna diagnostika - omogoča razlikovanje ene vrste mikroba glede na videz okolja od drugih (na primer Endo, Levin medij za črevesno skupino mikrobov).
Poleg tega, odvisno od namene uporabe V shemi za izolacijo čistih kultur lahko glede na namen ločimo naslednje medije:
1) obogatitev - zavirajo rast mikrobov, povezanih s patogenom;
2) pridobiti izolirane kolonije;
3) kopičenje čiste kulture;
B) Doslednost:
1) tekočina;
2) poltekoče (z dodatkom agar-agarja v koncentraciji 0,5-0,7%);
3) gosto - nad 1%.
Bistvo bakterioskopske metode: odkrivanje mikrobov v testnem materialu; preučevanje njihovih morfoloških in tinktorialnih lastnosti, narave lokacije v bakteriološkem brisu v vidnem polju.
Tehnika izvedbe. Material od bolnika se vizualno preučuje, izbere se del, v katerem je mogoče z največjo stopnjo verjetnosti odkriti povzročitelja bolezni (grude sluzi, gnojni čepi). Nanese se na predmetno stekelce (včasih je material predhodno emulgiran v fiziološki raztopini, redkeje centrifugiran). Kapljico razporedimo po steklu, posušimo in fiksiramo. Nato bris obarvamo in preparat pogledamo pod mikroskopom. Bris je običajno obarvan po Gramu. Včasih se kot najbolj nežna uporabi ena od preprostih metod barvanja, nato pa se pripravek pobarva z enim barvilom (na primer pri diagnozi meningokokne okužbe, kolere).
Po potrebi se uporabljajo posebne kompleksne metode barvanja, kot je metoda Burri-Gins za dokazovanje kapsularnih mikroorganizmov ali metoda Ziehl-Neelsen za dokazovanje prisotnosti kislinsko obstojnih bakterij. V nekaterih primerih (zlasti pri preučevanju motorične aktivnosti mikroorganizmov) pripravimo pripravke "viseče kapljice" in "zdrobljene kapljice" in mikroskopiramo neobarvane bakterije.
Prednosti bakterioskopske metode: enostavnost izvedbe, možnost hitrega pridobivanja rezultatov, tehnična in ekonomska dostopnost.
Slabosti metode: za določitev vrste mikroorganizmov pogosto ni dovolj določiti njegovih morfoloških lastnosti, saj so enake pri predstavnikih sorodnih vrst. Poleg tega se bakterije z značilno morfologijo pogosto spremenijo, zlasti pod delovanjem antibiotikov, in postanejo neprepoznavne; nazadnje je lahko koncentracija patogenov v testnem materialu izjemno nizka in jih je takrat težko zaznati.
Glede na navedeno se bakterioskopska metoda redko uporablja kot edini in končni način ugotavljanja etiologije bolezni. Pogosteje se uporablja kot indikacija, predhodna in pri diagnozi nekaterih nalezljivih bolezni sploh ni predvidena.
Kako razumeti orientacijo in preliminarno? To velja za zdravnika in bakteriologa. Klinik, ki prejme predhodni odgovor (pozitiven ali negativen), v večji ali manjši meri uporablja prejete informacije v svojih nadaljnjih študijah, dokler ne dobi končnega rezultata bakteriološke diagnostične metode. Ko je prejel približne podatke o domnevnem patogenu, njegovi koncentraciji v uporabljenem materialu in prisotnosti sočasne mikroflore, bakteriolog določi metode za obdelavo materiala in izolacijo čiste kulture patogena, izbere hranilne medije za naknadno gojenje.
Bakteriološka metoda
Bistvo metode je izolacija čiste kulture mikroba - patogena iz patološkega materiala, podrobna študija njegovih morfoloških, tinktorialnih, kulturnih, biokemičnih, seroloških lastnosti z namenom kasnejše identifikacije patogena. Pri izvajanju bakteriološke metode raziskovanja ločimo 4 stopnje.
A. Ob upoštevanju podatkov, pridobljenih med bakterioskopskim pregledom, se izvede izbor najučinkovitejših hranilnih medijev, na katerih bo z največjo stopnjo verjetnosti mogoče pridobiti rast kulture domnevnih mikrobov - patogenov .
B. Preskusni material je posejan na več hranilnih medijih: tekoči in trdni, univerzalni, elektivno-selektivni, diferencialno diagnostični. Istočasno se sejanje na petrijevke z gostim hranilnim medijem izvaja z bakteriološko zanko s potezo, da se zagotovi možnost rasti mikrobnih kolonij, izoliranih drug od drugega (lahko uporabite tudi metodo Drygalsky ali drugo metoda ločevanja kultur mikroorganizmov).
A. Preučujemo kulturne lastnosti mikroorganizmov, gojenih na hranilnih medijih; izbrane so sumljive kolonije. Poudariti je treba, da je izbira sumljivih kolonij najpomembnejša in najtežja faza dela. Temelji predvsem na določanju značilnih lastnosti mikrobnih kolonij, vendar pogosto to ne omogoča razlikovanja mikrobnih kolonij posameznih vrst in je treba dodatno proučevati morfologijo mikrobov v brisih sumljivih kolonij, rastne značilnosti mikroorganizmov na diferencialno diagnostični mediji itd. Izolacijo čistih bakterijskih kultur in njihovo študijo lahko izvedemo s predhodno inokulacijo na tekočem akumulacijskem mediju, vendar se v tem primeru porabi dodaten čas za raziskave.
B. Bakteriološki bris se pripravi iz sumljivih kolonij, obarvanih po Gramu in mikroskopsko (identiteta mikroorganizmov s tistimi, ki so jih proučevali med mikroskopskim pregledom v 1. fazi, se ugotovi). C. Iz preostanka sumljive kolonije kulturo prenesemo na poševni mesno-peptonski agar (lahko uporabimo tudi druge hranilne gojišča, na katerih pričakujemo dobro rast izoliranih mikroorganizmov). Cilj je kopičenje čiste kulture mikroba – domnevnega povzročitelja bolezni, ker. na naslednji stopnji študije bo potrebna velika mikrobna masa.
Predlagani patogen se preučuje glede saharolitičnih lastnosti (inokulacija se izvaja na pestrih gojiščih, medijih Olkenitsky, Ressel itd.), Proteolitično aktivnost (inokulacija na želatino, mleko po Tukaevu, določanje tvorbe indola in vodikovega sulfida med rastjo na mesno-peptonska juha). Proučuje se občutljivost izoliranih kultur na antibiotike (pogosteje z metodo standardnih papirnatih diskov, manj pogosto z metodo serijskih razredčitev). Serotipizacija se izvaja v reakciji aglutinacije na steklu s skupinskimi in tipičnimi diagnostičnimi serumi; fagotipizacijo s standardnimi diagnostičnimi bakteriofagi. V nekaterih primerih se za identifikacijo proučujejo dejavniki patogenosti v bakterijah.
Upoštevajo se rezultati izvedenih raziskav. Na podlagi primerjave lastnosti, ugotovljenih pri mikroorganizmih (morfoloških, tinktorialnih, kulturnih, biokemičnih, seroloških itd.), identificiramo mikrobe. Končni odgovor se izda z rezultati bakteriološke študije, ki kaže na vrsto patogena (včasih njegov serotip, biovar, tip faga) in njegovo občutljivost na antibiotike.
Pogosto se za pridobitev zanesljivih rezultatov pred izdajo odgovora izvedejo biološke, alergološke ali druge raziskovalne metode.
Prednosti bakteriološke diagnostične metode: visoka zanesljivost rezultatov raziskav; možnost pridobivanja dodatnih podatkov o občutljivosti izoliranih patogenov na antibiotike; možnost izvajanja epidemioloških študij.
K slabostim metode lahko vključuje trajanje študije (vsaj 4-5 dni), pa tudi nezmožnost njegove uporabe v primerih, ko povzročitelji okužb (na primer rikecije, klamidije) ne rastejo na umetnih hranilnih medijih.
biološka metoda
V nekaterih primerih se za optimizacijo diagnoze nalezljivih bolezni uporablja biološka metoda (biološki test), ki vključuje okužbo laboratorijskih živali. V tem primeru ima lahko raziskovalec različne cilje:
Reprodukcija klinične in patoanatomske slike bolezni (na primer pri diagnozi tetanusa, leptospiroze);
Izolacija čiste kulture patogena v kratkem času (pri diagnozi pnevmokokne okužbe);
Določanje virulence in patogenosti patogena (pri diagnozi tuberkuloze);
Določanje vrste in vrste toksinov (pri diagnozi botulizma)
Za diagnosticiranje nalezljivih bolezni se uporabljajo različne živali. Njihova izbira je odvisna od dovzetnosti vrste za različne etiološke dejavnike. Na primer, miši so dovzetne za pnevmokokno okužbo, antraks, tetanus; morski prašički - za povzročitelje tuberkuloze, bruceloze, tularemije; kunci - na stafilokoke, streptokoke, botulizem. Za raziskavo so izbrane samo zdrave živali določene starosti in telesne teže.
Pred vnosom materiala so živali fiksirane. Male živali hrani izvajalec poskusov, za velike živali pa se uporabljajo posebne naprave. Mesto injiciranja okuženega materiala se zdravi z alkoholom ali jodom. Okuženi material se injicira, odvisno od patogeneze proučevane bolezni, subkutano, kutano, intravensko, intraperitonealno, intracerebralno itd.
pri kožna metoda okužbe predhodno odrežejo volno, skarificirajo kožo in nato vanjo vtrejo material.
Subkutana metoda: kožo živali zajamemo v gubo, najbolje s pinceto, iglo zabodemo do polovice, po injiciranju uporabimo vatirano palčko z alkoholom in iglo odstranimo.
Intramuskularna metoda: material se vbrizga v mišično tkivo zgornjega dela zadnje okončine.
Intraperitonealna metoda:žival se drži z glavo navzdol, da ne poškoduje črevesja. Injekcija se izvede v spodnjem delu trebuha, na strani srednje črte. Trebušno steno prebodemo s sunkovitim gibom, brizga je pod pravim kotom.
Intravenska metoda: miši, podgane vbrizgajo material - v repno veno ali intrakardialno. Kuncu se injicira - v ušesne žile, ki so površinsko nameščene in jasno vidne (bolje je punktirati zunanjo žilo). Mesto injiciranja po injiciranju stisnemo z vato z alkoholom, da ne pride do krvavitve. Morske prašičke z intrakardialno okužbo injiciramo z iglo na višini "sunka" srca v medrebrni prostor. Če je igla pravilno vstavljena, se bo v brizgi pojavila kri.
Priprava orodja in materiala: brizge, skalpeli, igle se sterilizirajo z vrenjem. V brizgo potegnemo material (malo več, kot ga je potrebno za vnos), obrnemo navpično navzgor, iglo pokrijemo s sterilno vato in z batom potisnemo zračne mehurčke iz brizge. Ta manipulacija se izvaja nad raztopino razkužila.
Pri diagnosticiranju okužb, povzročenih z delovanjem toksina (botulinum, antraks), material, ki domnevno vsebuje povzročitelja in toksine, damo v fiziološko raztopino, nato filtriramo skozi papirnati filter, natrgan s smukcem (dobro absorbira toksin). Občutljive živali se okužijo s filtrirnimi brisi. V nekaterih primerih, ko je patogeneza bolezni posledica patogenih lastnosti samega patogena, se živali okužijo z mikrobno suspenzijo.
Okužene bele miši označimo in damo v posebne steklene kozarce; nalepijo se z oznako z datumom okužbe in vrsto mikroorganizma, s katerim je bilo delo opravljeno. Na enak način so podpisane kletke z okuženimi kunci ali morskimi prašički. Živali so opazovane. V primeru smrti se takoj odprejo.
Pred disekcijo belih miši živali predhodno evtanaziramo z etrnimi hlapi. Miši na kratko potopimo v razkužilno raztopino in jih nato pritrdimo v kiveto s trebuhom navzgor s tačkami. Opažena je prisotnost ali odsotnost zunanjih patoloških sprememb. Kožni rez se naredi vzdolžno od pubisa do spodnje čeljusti in prečno proti okončinam. Opažene so spremembe v kožnem tkivu in stanju bezgavk. Iz slednjega naredite brise-odtise. Za pregled prsne votline odstranimo prsnico tako, da s škarjami zarežemo rebra na obeh straneh. Po zunanjem pregledu se koščki srca odrežejo in položijo v BCH. Setev opravimo neposredno na brise-odtise MPA iz srca, pljuč.
Odpre se trebušna votlina, med zunanjim pregledom se zabeleži stanje notranjih organov (velikost, barva, konsistenca, prisotnost gnojnih žarišč). Naredite posevke jeter, vranice in odtisov brisov.
Delo poteka s sterilnimi instrumenti, po vsakem odvzemu organa se pinceta in škarje spustijo v kozarec alkohola in sežgejo.
Po obdukciji truplo in kiveto, v kateri je bila opravljena obdukcija, za en dan prelijemo z razkužilom.
Pridelki se inkubirajo 24 ur (ali več, če je potrebno) pri
t 37 o C. Nato jih pregledamo, izoliramo čisto kulturo patogena in njegovo identifikacijo izvedemo z bakteriološko metodo.
Prednosti metode: zanesljivost dobljenih rezultatov, ni potrebe po kompleksni opremi.
Napake: visoka cena, omejena uporaba, nevarnost okužbe.
Podobne informacije.
CILJ:
1. Študijske metode za izolacijo čistih bakterijskih kultur
2. Obvladati bakteriološko metodo diagnosticiranja nalezljivih bolezni.
TEORETIČNA REFERENCA
Bakteriološka metoda je glavna metoda za diagnosticiranje nalezljivih bolezni. Njegovo bistvo je določiti vrsto povzročitelja okužbe, zato je na podlagi rezultatov bakteriološke metode mogoče postaviti etiološko (končno) diagnozo. Glavna pomanjkljivost metode je trajanje študije - od 3 do 5 dni, v nekaterih primerih pa tudi več.
Uspeh bakteriološke metode je v veliki meri odvisen od predhodne faze, vključno z vzorčenjem testnega materiala in njegovim transportom ter zasnovo napotitve v bakteriološki laboratorij. V tem primeru je treba upoštevati številna pravila.
1. Ograja testnega materiala je treba opraviti pred začetkom antibiotične terapije ali 8-10 ur po zadnjem odmerku antibiotika. Da bi preprečili kontaminacijo vzorca z mikrofloro okolja, je treba upoštevati najstrožjo asepso. Za to uporabite sterilni material: a) vatirane palčke za odvzem materiala iz rane, iz sluznice (oči, žrelo, nos); b) žična zanka za odvzem materiala iz nožnice, anusa; c) brizga za jemanje krvi, gnoja; d) sterilne posode za neposredno zbiranje urina, sputuma, blata vanj.
2. Prevozništvo Prejeto gradivo je treba izdelati čim prej (2-3 ure) v posebnih biksih ali peresnicah.
3. Smer priložen kliničnemu vzorcu kot spremni dokument. Vsebuje osnovne podatke, potrebne za izvedbo mikrobiološke študije:
Priimek, ime, patronim, starost bolnika;
Predlagana diagnoza bolezni;
Predhodna protimikrobna terapija;
Narava materiala;
Datum in čas odvzema materiala;
Namen študije;
Ime zdravstvene ustanove, številka oddelka, oddelka;
Podpis zdravnika.
Bakteriološka metoda se izvaja v dveh fazah (slika 2.1.):
1. Izolacija čiste kulture patogena (1-2 dni);
2. Identifikacija čiste kulture (1-3 dni).
Na prvi stopnji se preskusni material poseje na trdnem ali tekočem hranilnem mediju, ocenijo lastnosti kulture, izberejo sumljive kolonije in presejejo na poševnem agarju. Stopnja identifikacije vključuje obvezno študijo morfologije, biokemičnih lastnosti in antigenske strukture izolirane čiste kulture ter dodatne študije za določitev občutljivosti na antibiotike, občutljivosti na fage, tipizacije fagov, patogenosti in obstojnih lastnosti.
VPRAŠANJA ZA PRIPRAVO:
1. Pravila za zbiranje in prevoz testnega materiala za bakteriološko preiskavo.
2. Pravila za izdajo napotnice za bakteriološki pregled.
3. Metode izolacije čistih kultur mikroorganizmov.
4. Bakteriološka diagnostična metoda. Tarča. Obdobja. diagnostična vrednost.
NAČRT SAMOSTOJNEGA DELA:
1. Preučite tabele "Metode izolacije čistih bakterijskih kultur" in "Izolacija in identifikacija čistih kultur".
2. Izolirati čisto kulturo iz mešanice bakterij in opraviti njeno identifikacijo - obvladati bakteriološko diagnostično metodo (1. delo)
4.2. BIOLOŠKI IN MIKROBIOLOŠKI DEJAVNIKI
Bakteriološka diagnostika tifusa in paratifusa A, B in C
Datum uvedbe: od trenutka odobritve
1. RAZVIT: FGUN St. Petersburg NIIEM jim. Pasteur Rospotrebnadzor (L.A. Kaftyreva, Z.N. Matveeva, G.F. Trifonova); GOUVPO "Sankt Peterburška državna medicinska akademija po imenu I. I. Mečnikova" Zvezne agencije za zdravje in socialni razvoj (A. G. Boytsov).
3. ODOBRIL vodja Zvezne službe za nadzor varstva pravic potrošnikov in blaginje ljudi, glavni državni sanitarni zdravnik Ruske federacije G.G. Oniščenko 29. decembra 2007 0100/13745-07-34
4. UVELJAVLJENA od trenutka odobritve.
5. PRVIČ PREDSTAVLJENO.
1 področje uporabe
1 področje uporabe
1.1. Smernice podajajo osnovne principe in značilnosti bakteriološke diagnostike trebušnega tifusa in paratifusa A, B in C; vsebuje sodobne informacije o bioloških lastnostih patogenov, odpornosti na antibakterijska zdravila, hranilnih medijih za njihovo izolacijo in značilnostih diferenciacije povzročiteljev tifusa in paratifusa od drugih seroloških variant salmonele.
2. Seznam okrajšav
ABP - antibakterijsko zdravilo
BCA - bizmutov sulfitni agar
MPU - medicinska in preventivna ustanova
MIC - minimalna inhibitorna koncentracija
P - vmesni
U - stabilno
H - občutljivo
RIF - imunofluorescenčna reakcija
CNS - centralni živčni sistem
V tabelah:
"+" - pozitivna reakcija v prvem dnevu;
"-" - negativna reakcija 4-20 dni;
"(+)" - zapoznela pozitivna reakcija za 2-20 dni;
d - različne encimske reakcije.
Možna je diferenciacija na encimske različice.
3. Splošne določbe
3.1. Tifus in paratifus A, B in C so antroponozne črevesne okužbe, ki jih povzročajo Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi B in Salmonella Paratyphi C. redko - paratifus C.
3.2. Za bolezni so značilne ulcerozne lezije limfnega sistema tankega črevesa, bakteriemija, zvišana telesna temperatura, ciklični klinični potek s hudo zastrupitvijo, rozeolni izpuščaj na koži telesa, hepato- in splenomegalija. Zaprtje je pogostejše kot driska. Razjeda Peyerjevih lis ileuma v približno 1% primerov vodi do črevesne krvavitve in perforacije črevesja z najbolj neugodnimi posledicami za bolnika.
3.3. Diagnozo trebušnega tifusa in paratifusa A, B in C postavimo na podlagi kliničnih znakov bolezni ob upoštevanju epidemiološke anamneze in podatkov celovite laboratorijske preiskave, ki vključuje klasične bakteriološke in serološke metode. Bakteriološka diagnostika je prednostnega pomena, saj v tem primeru je mogoče pridobiti najbolj popolne informacije o bioloških lastnostih patogena, vključno z njegovo občutljivostjo na antibakterijska zdravila.
3.4. Uporaba protimikrobnih zdravil za etiotropno zdravljenje trebušnega tifusa in paratifusa je po eni strani zmanjšala umrljivost z 10-20 % na manj kot 1 %, po drugi strani pa otežila laboratorijsko diagnostiko, ker. pogosto se vzorčenje materiala za laboratorijske raziskave izvede po začetku antibiotične terapije. Zaradi tega dejstva je treba bolj skrbno pristopiti k vprašanju izbire materiala za raziskavo, jemanja preučevanega materiala in raziskovalnih tehnik.
3.5. Sodobna značilnost epidemiologije tifusne mrzlice je močno povečanje pogostosti uvoza (prenašanja) okužbe z ozemelj, endemičnih za to bolezen, držav bližnje in daljne tujine, pa tudi okužba prebivalcev Rusije ob odhodu v te države in v procesu migracije znotraj države. Druga značilnost je prisotnost velikega kontingenta visokega epidemiološkega tveganja v obliki oseb brez stalnega prebivališča, med katerimi je zabeležena visoka incidenca tifusne vročice.
3.6. Te smernice so bile sestavljene z namenom poenotenja metod bakteriološke diagnoze tifusa in paratifusa A, B in C ter pravilne interpretacije rezultatov laboratorijske študije ob upoštevanju sodobnih značilnosti klinike, zdravljenja in epidemioloških razmer na posameznih območjih.
4. Indikacije za bakteriološko diagnostiko
Indikacija za bakteriološko preiskavo biološkega materiala za prisotnost patogenov tifusne mrzlice in paratifusne mrzlice A, B in C je potreba po pregledu:
4.1) bolniki s sumom na tifusno vročino, pa tudi z vročino neznane etiologije, ki traja 5 dni ali več;
4.2) osebe, ki so bile v stiku z bolniki s trebušnim tifusom in paratifusom A, B, C;
4.3) zaposleni v določenih poklicih, panogah in organizacijah ob sprejemu na delo in glede na epidemiološke indikacije;
4.4) osebe pred sprejemom v bolnišnice in specializirane sanatorije glede na klinične in epidemiološke indikacije;
4.5) osebe, ki so se prijavile za bolnišnično zdravljenje v bolnišnicah (oddelkih) psihonevrološkega (psihosomatskega) profila, domovih za ostarele, internatih za osebe s kroničnimi duševnimi boleznimi in lezijami centralnega živčnega sistema ter drugih vrstah zaprtih ustanov z 24-urnim ostati;
4.6) bolniki s tifusno vročino in paratifusom po izginotju kliničnih simptomov bolezni pred odpustom iz bolnišnice;
4.7) osebe, ki so med dispanzerskim nadzorom zbolele za tifusom in paratifusom;
4.8) kronični nosilci bakterij, ugotovljeni med delavci določenih poklicev, panog in organizacij, ob ponovni zaposlitvi v teh podjetjih in objektih;
4.9) sekcijski material v primeru suma tifusne mrzlice in paratifusa.
5. Logistika metode
5.1. Standardna testna in pomožna oprema, merilni instrumenti za mikrobiološke laboratorije.
5.2. Hranilni mediji, diagnostični serumi in kemični reagenti za gojenje, izolacijo, identifikacijo in določanje občutljivosti povzročiteljev tifusne mrzlice in paratifusa A, B in C na antibakterijska zdravila.
5.3. Za laboratorijsko diagnozo tifusa in paratifusa ter odkrivanje nosilcev bakterij je treba uporabiti hranilne medije in reagente, odobrene za uporabo na ozemlju Ruske federacije v skladu z ustaljenim postopkom.
6. Laboratorijska diagnostika tifusa in paratifusa
6.1. Princip bakteriološke metode temelji na odkrivanju živih mikroorganizmov v različnih bioloških substratih (kri, urin, blato, žolč, kostni mozeg, roseola) glede na stopnjo bolezni. Da bi to naredili, določeno količino biološkega materiala posejemo na posebne hranilne medije, čemur sledi inkubacija v termostatu in identifikacija zraslih kolonij mikroorganizmov, značilnih za S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B in S. Paratyphi. C, glede na kulturne in encimske lastnosti ter antigenske značilnosti.
6.2. Samo bakteriološka študija lahko zagotovi natančno etiološko diagnozo in nadzor sproščanja telesa iz patogena. V zvezi z diferencialno diagnozo tifusa in paratifusa je edina metoda laboratorijska študija biološkega materiala z izolacijo patogena in njegovo identifikacijo do stopnje serološke variante, ker klinični potek infekcijskega procesa ne omogoča vedno razlikovanja med temi nosološkimi oblikami.
7. Bakteriološki pregled
7.1. Izolacija povzročiteljev tifusne vročice in paratifusov A, B in C poteka po isti shemi bakteriološkega pregleda biomaterialov.
7.2. Postopek zbiranja materiala za laboratorijske preiskave tifusa in paratifusa določa SP 3.1.1.2137-06.
7.3. Tehnika zbiranja in transporta biomaterialov v mikrobiološke laboratorije je opisana v MU 4.2.2039-05.
7.4. Material za bakteriološko preiskavo za diagnosticiranje tifusa in paratifusa je:
kri;
izločki;
urin;
Patogene lahko izoliramo tudi iz:
roseol;
kostni mozeg;
Materino mleko.
Material za bakteriološke raziskave za identifikacijo bakterijskih nosilcev v skladu s SP 3.1.1.2137-06 so:
izločki;
urin;
žolč (vsebina dvanajstnika).
7.5. Za pojasnitev diagnoze se izvede študija sekcijskega materiala.
7.6. Zbiranje biološkega materiala za laboratorijske raziskave se izvaja pred začetkom etiotropnega zdravljenja: zdravstveni delavec, ki sumi na tifusno-paratifusno okužbo; v primeru skupinske in izbruhne obolevnosti - strokovnjaki ustanov Rospotrebnadzor in osebje zdravstvenih ustanov. Od hospitaliziranih bolnikov se material za bakteriološko preiskavo vzame v urgentnem oddelku bolnišnice.
7.7. Od oseb, ki so komunicirale z bolniki ali nosilci (kontakti), zbiranje materiala izvajajo zdravstveni delavci zdravstvenih ustanov in drugih organizacij in ustanov na kraju odkritja bolnikov.
7.8. Biomaterial za laboratorijske raziskave spremlja posebna smer. Dostava gradiva s strani subjektov sama ni dovoljena. Če pravočasna dostava materiala ni mogoča, uporabimo konzervanse in transportna sredstva (tabela 1).
8. Bakteriološki test krvi
Indikacija za preiskavo krvi je sum na tifusno-paratifusno bolezen ali febrilno stanje neznanega izvora (zvišana telesna temperatura neznanega izvora), opazovano 5 ali več dni (SP 3.1.1.2137-06).
Razmerje med krvjo in hranilnim medijem mora biti 1:10-1:60. Število neodvisno odvzetih vzorcev krvi in čas njihovega odvzema določi lečeči zdravnik v skladu z MU 4.2.2039-05 za vročino neznanega izvora ali v skladu z MU 04-723/3 Ministrstva za zdravje ZSSR ( 1984) za sum tifusno-paratifusne bolezni. Pri bolnikih, ki prejemajo antibakterijska zdravila, je treba vzorce odvzeti tik pred vnosom (prejemom) naslednjega odmerka zdravila.
Ob prisotnosti vročine je optimalno vzeti kri v ozadju povišane telesne temperature (vendar ne na vrhuncu temperature!). Sejanje na hranilne medije se izvaja neposredno ob bolnikovi postelji.
Če sumite na tifus in paratifus, lahko za hemokulturo uporabite medij Rapoport, 20% žolčno juho, mesno-peptonsko juho z dodatkom 1% glukoze (v 100 ml vialah). Prej uporabljene hemokulture v sterilni destilirani vodi (iz pipe). Vendar je bolje uporabiti posebna gojišča za hemokulturo.
Količina krvi, posejane na vrhuncu vročine, je lahko 10 ml, pozneje - do 20 ml (pri otrocih - do 5 ml).
Pri povišani telesni temperaturi neznanega izvora, ki traja več kot 5 dni, je treba praviloma pregledati več vzorcev krvi. Vzorčenje krvi iz vene se izvaja v skladu z MU 4.2.2039-05. To je potrebno za razlikovanje prave bakteriemije od nenamerne kontaminacije krvi med venepunkcijo (verjetnost kontaminacije vzorca zaradi nenamerne punkcije žleze lojnice ali znojnice je 3 %). V tem primeru se za hemokulturo uporabljata dve gojišči: 1) gojišče za aerobne in fakultativne anaerobe in 2) gojišče za obligatne anaerobe (npr. "dvojno" gojišče + tioglikolno gojišče po odredbi Ministrstva za zdravje). ZSSR z dne 12.04.85 N 535) ali univerzalni medij za aerobe in anaerobe.
Bolje je, da uporabite industrijsko proizvedene medije, odobrene za uporabo v Rusiji.
Pridelki se inkubirajo pri 37 °C 10 dni z vsakodnevnim pregledovanjem. V tem primeru se viale z "dvojnim" medijem nagnejo, s čimer se opere gost del medija.
Če 10. dan ni znakov rasti, se izda negativen odgovor.
Če obstajajo znaki rasti (motnost, pordelost Rapoportovega medija, pojav vidnih kolonij na gostem delu "dvojnega" medija), se sejanje izvede vzporedno na polikarbohidratnem mediju in gostem mediju v petrijevkah ( krvni agar v primeru vročine neznanega izvora in medij Endo v primeru suma na tifusno paratifusno bolezen).
Neposredno sejanje na polikarbohidratne medije se izvede, da se skrajša čas študije, ki temelji na predpostavki, da bo pri gojenju krvi z veliko verjetnostjo opaziti rast monokulture patogena. Za nadzor te predpostavke in izolacijo čiste kulture z razdelitvijo posameznih kolonij je potrebno vzporedno nanos na medij Endo ali krvni agar.
Če na teh medijih opazimo rast monokulture, lahko upoštevamo biokemične lastnosti polikarbohidratnega medija. Za nadzor čistosti kulture je potrebno opraviti mikroskopijo razmaza iz polikarbohidratnega medija, obarvanega po Gramu. Na tej stopnji je možno postaviti tudi aglutinacijsko reakcijo na steklu z ustreznimi aglutinacijskimi O- in H-salmonelnimi serumi in izdati predhodni odgovor.
Shema bakteriološke preiskave krvi bolnikov s sumom na tifus in paratifus je prikazana na sliki 1.
Slika 1. Shema bakteriološke preiskave krvi bolnikov s sumom na tifus in paratifus
Slika 1. Shema bakteriološke preiskave krvi bolnikov s sumom na tifus in paratifus
Shema bakteriološke preiskave krvi bolnikov z vročino neznanega izvora je prikazana na sliki 2.
Slika 2. Shema bakteriološke preiskave krvi bolnikov z vročino neznanega izvora
Slika 2. Shema bakteriološke preiskave krvi bolnikov z vročino neznanega izvora
Potek nadaljnje identifikacije kulture po kulturno-morfoloških, encimskih lastnostih in seroloških značilnostih je nadalje opisan v ustreznih razdelkih.
9. Bakteriološka preiskava blata
Vzorce blata odvzamemo takoj po defekaciji iz razkužene in temeljito oprane posode, na dno katere smo položili list debelega čistega papirja. Material se zbira z žlico-lopatico, nameščeno v pokrovu sterilne posode. Če posode z lopatico ni, se za odvzem materiala uporabi kateri koli sterilni instrument (sterilna lesena lopatica, žična zanka, žlica itd.). V prisotnosti patoloških nečistoč je treba izbrati območja, ki vsebujejo sluz, gnoj, kosmiče, vendar brez krvi. Vzorce tekočega blata odvzamemo s sterilno plastično Pasteurjevo pipeto z zaprtim rezervoarjem.
Prostornina odvzetega materiala mora biti najmanj 2 g.Optimalni material je vzeti material v primeru okrašenega stola - v količini oreha; v primeru ohlapnega blata mora biti njegova plast v posodi najmanj 1,5-2,0 cm, material, ki se nahaja v sterilni posodi, se dostavi v laboratorij v 2 urah.
Če materiala ni mogoče dostaviti v laboratorij v 2 urah, ga zberemo v konzervansu (transportni sistem z medijem). Prostornina materiala ne sme presegati prostornine medija.
Blato je treba skrbno homogenizirati v mediju. Vzorce lahko shranite pred začetkom študije čez dan v hladilniku (4-6 °C).
Transportna gojišča in konzervansi, ki se uporabljajo za izolacijo povzročiteljev trebušnega tifusa in paratifusa A, B in C ter drugih povzročiteljev akutnih črevesnih okužb, so predstavljeni v tabeli 1.
Tabela 1
Transportna sredstva in konzervansi, ki se najpogosteje uporabljajo za transport fekalij
|
Ime okolja |
Zagotavlja ohranjanje |
|
Sreda Carrie Blair |
vsi enterični patogeni, vključno s Campylobacterjem |
|
Sreda Ames |
vse enterobakterije |
|
Sreda Stewart |
salmonelo in šigelo |
|
mešanica glicerina |
vse enterobakterije razen jersinije; prednostna za shigello |
|
mešanica fosfatnega pufra |
vse enterobakterije |
|
raztopina boratnega pufra |
vse enterobakterije |
|
fiziološka raztopina |
vse enterobakterije, vključno s kampilobakterjem |
Vzorci blata, odvzeti neposredno iz danke z rektalnim brisom, se uporabljajo predvsem za objektivizacijo diagnoze (MU 4.2.2039-05). Material odvzame reševalno osebje. Praviloma je posebna sonda za odvzem brisa del transportnega sistema. Pomembno je upoštevati, da je vdor transportnih medijev na rektalno sluznico nesprejemljiv! Zato je treba rektalni bris potopiti v transportni medij šele po odvzemu materiala. Bolnika prosimo, naj leži na boku z boki, potegnjenimi k trebuhu, zadnjico pa z dlanmi narazen. Sonda za bris se vstavi v anus do globine 4-5 cm in z nežnim vrtenjem okoli osi odvzame material iz anusnih kript. Previdno odstranite sondo za bris in jo potopite v transportni medij. Prevoz tampona brez medija ni dovoljen.
V laboratoriju izvajamo inokulacijo vzorcev blata neposredno na gosta diferencialno diagnostična hranilna gojišča in vzporedno na obogatitveni medij.
Shema bakteriološkega pregleda blata je prikazana na sliki 3.
Slika 3. Shema bakteriološkega pregleda blata
Slika 3. Shema bakteriološkega pregleda blata
Iz nativnega blata pripravimo suspenzijo v 0,9% raztopini natrijevega klorida v razmerju 1:5-1:10, pustimo 30 minut, da se veliki delci usedejo. Nato eno kapljico supernatanta nacepimo v posodice z gostimi hranilnimi gojišči in 1 ml suspenzije nacepimo v obogatitveno gojišče (razmerje material-gojišče naj bo 1:5).
Iztrebke, dostavljene v laboratorij v konzervansu (transportnem gojišču), moramo pred inokulacijo skrbno homogenizirati v gojišču, nato pa material neposredno nacepimo na trdna gojišča in obogatitveno gojišče v enakem razmerju kot nativno blato.
Vzorci blata, odvzeti z rektalnim brisom, se pregledajo na podoben način kot blato, dostavljeno v konzervansu. Ne smemo pozabiti, da rektalni bris vsebuje manj mikroorganizmov v primerjavi z nativnim blatom, zato je treba odmerek inokuluma povečati.
Največjo detekcijo S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B in S. Paratyphi C v blatu dosežemo z obogatitvenimi gojišči, čeprav pri bolnikih v akutnem obdobju bolezni povzročitelja pogosto izoliramo z neposredno inokulacijo. Cepljenje na obogatitvena gojišča vzporedno z neposrednim cepljenjem je obvezno!
Vse inokulacije se inkubirajo pri 37 °C na diferencialno diagnostičnih gojiščih 18-24 ur, na bizmut-sulfitnem agarju 24-48 ur, po 24 urah pa se iz obogatitvenih gojišč poseje na trdna gojišča (bizmut-sulfitni agar ali Endo). srednja). Kolonije, značilne za te patogene, zrasle na gostih gojiščih, presejemo na polikarbohidratno gojišče.
Treba je opozoriti, da mora tehnika širjenja materiala po površini plošče z gostim medijem zagotoviti rast izoliranih kolonij tipičnega tipa, ki jih je mogoče uporabiti za vizualno oceno kulturnih lastnosti mikroorganizma.
Bizmutov sulfitni agar (BCA) je prednostna metoda za izolacijo S. Typhi. Tipične kolonije S. Typhi so črne in obdane s črnim ali rjavim robom s kovinskim leskom. Vendar S. Typhi pogosto ne povzroči značilnega črnenja ICA, ko pride do obilne rasti, zato je treba plošče inokulirati, da se omogoči rast posamezne kolonije.
Fekalne vzorce je mogoče inokulirati na standardnih selektivnih gojiščih za enterobakterije, odobrenih za uporabo v Ruski federaciji. Vendar pa je bizmutov sulfitni agar prednostna metoda za izolacijo S. tymhi. Potek nadaljnje identifikacije kultur po encimskih lastnostih in seroloških značilnostih je nadalje opisan v ustreznih razdelkih.
10. Bakteriološka preiskava urina
Urinska kultura se izvaja za diagnozo od prvih dni bolezni do odpusta bolnika, pa tudi za identifikacijo bakterionosilca. Ker se tifus in paratifus izločajo povzročitelja z urinom občasno in za kratek čas, je treba preiskave urina ponoviti v intervalih 5-7 dni.
Strogo se morate držati splošnih pravil za zbiranje urina, določenih v MU 4.2.2039-05. Ne glede na način pridobivanja urina ga je treba dostaviti v laboratorij v 2 urah, v skrajnem primeru pa lahko urin čez noč hranimo v hladilniku.
Ne smemo pozabiti, da lahko bakterije v urinu med shranjevanjem umrejo in se razmnožujejo, odvisno od kemične sestave urina.
Podaljšanje roka uporabnosti materiala lahko zelo oteži razlago rezultata.
Neposredna inokulacija urina (ali usedline po centrifugiranju) se izvaja brez predhodne obogatitve v skladu z odredbo Ministrstva za zdravje ZSSR N 535 na gostih diferencialno diagnostičnih medijih, priporočenih za salmonelo, vključno s povzročitelji tifusa in paratifusa. Hkrati se v obogatitvena gojišča dvojne koncentracije v razmerju 1 : 1 nacepi nativni urin ali sediment urina v gojišča normalne koncentracije. Inokulacije postavimo v termostat pri 37 °C za 18-24 ur, nato pa obogatitveno gojišče nacepimo na gosto diferencialno diagnostično gojišče. Kolonije, zrasle na trdnih gojiščih, identificiramo po kulturno-encimskih in seroloških lastnostih.
11. Bakteriološka preiskava žolča (duodenalna vsebina)
Žolč se zbere v treh sterilnih epruvetah ali sterilnih posodah za enkratno uporabo ločeno v delih A, B, C v skladu z MU 4.2.2039-05 in dostavi v laboratorij.
Izvedite študijo vsake porcije (A, B, C) posebej ali pripravite mešanico treh porcij. Vzorci so cepljeni:
na gostih diferencialno diagnostičnih medijih (ICA, Endo, EMS itd.) v količini 0,5 ml;
v epruveti (steklenici) s hranilno juho v razmerju 1:10. Žolča ni treba inokulirati na obogatitveni medij, saj sam žolč je dobro gojišče za patogene tifusa in paratifusa.
Inokulirana gojišča se inkubirajo z ostanki žolča pri 37 °C.
Po 18-24 urah pregledamo inokulacije na gostih hranilnih gojiščih (upoštevamo rezultate rasti na ICA po 24 in 48 urah) in ponovno posejemo sumljive kolonije na polikarbohidratno gojišče.
Iz hranilne juhe se seje na gosto diferencialno diagnostično gojišče.
Iz preostalega žolča v primeru negativnega rezultata neposrednega sejanja se po 18-24 urah in 3., 5., 7. in 10. dan izvedejo ponovne setve na gostih diferencialno diagnostičnih medijih.
Gojene mikroorganizme identificiramo po kulturno-morfoloških, encimskih in seroloških lastnostih.
12. Bakteriološka preiskava materiala iz roseole
Bakteriološki pregled ("strganje" z roseolo) se izvaja v prisotnosti dobro definirane roseole. Material zbiramo aseptično. Da bi to naredili, površino kože nad roseolo obdelamo s 70% etilnim alkoholom, nato obrišemo z vatirano palčko, navlaženo s sterilno 0,9% raztopino natrijevega klorida in posušimo s sterilno palčko.
Material za raziskavo (tkivno tekočino) dobimo s skalpelom, ko kožo nad roseolo raztrgamo. 1-2 kapljici žolčne juhe ali izotonične raztopine natrijevega klorida nanesemo na poškodovano kožo, pomešamo s štrlečo tkivno tekočino in zberemo s Pasteurjevo pipeto ali podobno sterilno napravo za enkratno uporabo v epruveti z enim od tekočih obogatitvenih medijev (žolč brozgo, medij Rapoport itd.). V laboratoriju inokulacijo hranimo pri 37 °C 18-24 ur, nato pa cepimo na gosta diferencialno diagnostična gojišča (Endo, EMS, ICA).
13. Bakteriološka preiskava kostnega mozga
Znano je, da je v primeru laboratorijske potrditve diagnoze tifusa najučinkovitejša bakteriološka preiskava kostnega mozga (cepljenost povzročitelja je 90-95%). Tudi pri bolnikih z blagimi in izbrisanimi oblikami tifusa, ki jih je težko klinično prepoznati, pa tudi v ozadju jemanja protimikrobnih zdravil je inokulacija mielokultur bistveno višja od hemokultur.
Vendar pa se v praksi bakteriološka preiskava kostnega mozga izvaja zelo redko, le za posebne klinične indikacije, če ni drugih laboratorijskih podatkov, ki bi potrdili diagnozo tifusa ali paratifusa, tk. ta invazivni postopek je precej travmatičen. Vzorčenje materiala za raziskave se izvaja samo v bolnišnici ob prisotnosti ustreznega specialista.
Material za bakteriološko preiskavo (aspirat) v količini 0,50-0,75 ml aseptično pridobimo s punkcijo prsnice (ročaja ali telesa) in ga nacepimo v epruveto z enim od obogatitvenih gojišč (žolčna juha, gojišče Rapoport itd.).
Če aspirata takoj po punkciji ni mogoče nacepiti v obogatitveno gojišče, ga zberemo v sterilno epruveto in nemudoma pošljemo v laboratorij, kjer izvedemo nacepitev v obogatitveno gojišče. V laboratoriju inokulacije inkubiramo pri 37 °C 18-24 ur, nato pa cepimo na gosta diferencialno diagnostična gojišča.
Nadaljnje raziskave se izvajajo, kot pri bakteriološkem pregledu drugega biološkega materiala.
14. Hranilni mediji in reagenti
Seznam hranilnih medijev za izolacijo in identifikacijo povzročiteljev črevesnih okužb, zlasti enterobakterij, je obsežen in se vztrajno širi. Izbira določenih okolij je v veliki meri odvisna od lokalnih gospodarskih razmer in tradicije. Vendar ga je treba voditi po več osnovnih načelih.
14.1. V opisu gojišča mora biti navedeno, da se lahko uporablja ne samo za odkrivanje salmonele, temveč tudi za salmonelo Typhi in S. Paratyphi A, B in C.
14.2. Prednost imajo dehidrirana gojišča priznanih proizvajalcev pred gojišči, pripravljenimi neposredno v laboratoriju.
14.3. Vsaka serija gojišča v laboratoriju mora biti kontrolirana s testnimi sevi (notranja kontrola kakovosti).
14.4. Za laboratorijsko diagnozo tifusa in paratifusa ter odkrivanje nosilcev bakterij je treba uporabiti hranilne medije in reagente, odobrene za uporabo na ozemlju Ruske federacije v skladu z ustaljenim postopkom.
15. Metode preučevanja encimskih lastnosti
Trenutno so za preučevanje encimske aktivnosti mikroorganizmov iz družine Enterobacteriaceae, vključno s patogeni tifusa in paratifusa, razviti, proizvedeni in registrirani različni domači in tuji diagnostični testni sistemi (od najpreprostejših klasičnih Hissovih medijev v epruvetah in ploščah do avtomatskih analizatorjev) . Če testni sistemi omogočajo identifikacijo mikroorganizma na ravni rodu in prepoznajo značilnosti encimske aktivnosti sevov, jih je mogoče uporabiti za identifikacijo povzročiteljev tifusa in paratifusa. Postopek dela s testnimi sistemi je podrobno opisan v navodilih za uporabo in ga je treba dosledno upoštevati.
16. Biološke lastnosti patogenov
Povzročitelji trebušnega tifusa in paratifusov A, B in C pripadajo družini Enterobacteriaceae, rodu Salmonella, vrsti enterica, podvrsti I (enterica) in imajo morfološke, kulturne in encimske lastnosti, značilne za to podvrsto, vrsto, rod in družino.
Predstavniki rodu Salmonella vrste enterica so v zgodovini razvili situacijo, ko serovarjev niso označevali z antigensko formulo, kot pri drugih bakterijah, temveč z imeni bolezni (človeških ali živalskih), države, mesta ali ulice, kjer so bili izolirani, itd. Napačno je upoštevati ta imena vrst, ker nimajo taksonomskega statusa. Vendar so imena najpogostejših serovarjev salmonele tako poznana, da jih je skoraj nemogoče nadomestiti z antigenskimi formulami. Zato se v sodobni shemi Kaufman-White pri označevanju salmonele le podvrste enterica I namesto oznake vrste uporablja ime serovarja, ki pa se piše z veliko začetnico.
Tako so polna imena povzročiteljev tifusne mrzlice in paratifusne mrzlice naslednja:
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi B;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi C
V običajni praksi je mogoče uporabiti skrajšane različice imen:
Salmonella ser. Typhi ali Salmonella Typhi ali S. Typhi;
Salmonella ser. Paratyphi A ali Salmonella Paratyphi A ali S. Paratyphi A;
Salmonella ser. Paratyphi B ali Salmonella Paratyphi B ali S. Paratyphi B;
Salmonella ser. Paratyphi C ali Salmonella Paratyphi C ali S. Paratyphi C
16.1. Kulturne in morfološke lastnosti
Mobilne gramnegativne palice ne tvorijo spor in kapsul, fakultativni anaerobi dobro rastejo na navadnih hranilnih medijih.
Na preprostem hranilnem agarju - rahlo konveksne z gladkim robom in gladko površino, vlažne kolonije s sijajem več kot 1 mm.
Na diferencialno diagnostičnih medijih (ki vsebujejo laktozo kot diferencialno snov) - prozorno, brezbarvno ali modrikasto, včasih rožnato ali barvno okolje kolonije (Endo, Ploskirev, EMS in drugi podobni mediji).
Na SS-arape srednje obarvane kolonije s črno sredino.
Na bizmut-sulfitnem gojišču so izolirane kolonije S. Typhi, S. Paratyphi B črne z značilnim kovinskim leskom, gojišče pod kolonijo je črno obarvano. Kolonije S. Paratyphi A so zelenkaste, svetle v barvi medija, nežne.
Sevi S. Paratyphi B (povzročitelja paratifusa B) na mesno-peptonskem agarju lahko tvorijo povišano mukoidno steno po obodu kolonij. Sluzna gred se razvije 2-5 dni, ko so pridelki shranjeni pri sobni temperaturi. Ta simptom ni trajen in diagnostičen.
16.2. Encimske lastnosti
Študija encimskih lastnosti se izvaja v zvezi z nizom ogljikovih hidratov, polihidričnih alkoholov, aminokislin in drugih organskih spojin, ki se uporabljajo pri identifikaciji in preučevanju salmonele in drugih enterobakterij. Praviloma se v praktičnih laboratorijih uporablja majhno število testov za identifikacijo glavnih rodov, ki so del družine črevesnih bakterij. Značilnosti encimskih lastnosti salmonele, vključno s povzročitelji trebušnega tifusa in paratifusa A, B in C, so predstavljene v tabeli 2.
tabela 2
Encimske lastnosti povzročiteljev tifusne vročice in paratifusov A, B, C
|
substrat |
S. Paratifi A |
||||
|
Glukoza (plin) |
Bakteriološka metoda preučevanja patološkega materiala za izolacijo in identifikacijo mikobakterij vključuje 3 metode: bakterioskopsko, kulturno in biološko / R.V. Tkzova, 1983; I. I. Rumachik, 1987, 1993; A.S. Dončenko, 1989; Yu.Ya. Kassich, 1990; A. K. Naimanov, 1993; L.P. Khodun, 1997/. Obdobje bakteriološke preiskave ne sme biti daljše od 3 mesecev.
Glede na to, da makroskopske tuberkulozne spremembe v organih in tkivih goveda povzroča povzročitelj goveje tuberkuloze, takega materiala ni smiselno bakteriološko preiskovati. Če je tak material dostavljen v laboratorij za raziskave, se opravi komisijski pregled in sestavi akt. Material je neškodljiv.
Bakterioskopski (mikroskopski) pregled materiala je sestavljen iz priprave iz vsakega organa (ali koščkov organa s sumljivimi spremembami pri tuberkulozi) in bezgavke, dostavljene za pregled, 2 brisov odtisov, sušenje na zraku, fiksiranje nad plamenom alkoholno svetilko, barvanje po Cyl-Nielsenu in ogled obarvanih brisov pod mikroskopom, z najmanj 50 vidnimi polji v vsakem brisu. Pripraviti je treba najmanj 20 brisov-odtisov materiala z enega trupa. Poleg tega se brisi za mikroskopijo pripravijo tudi iz suspenzije materiala, posejanega na hranilnih medijih.
Ziehl-Neelsenovo barvanje brisov je selektivno za odkrivanje mikobakterij: na modrem ozadju obarvanih tkiv ali tuje mikroflore so mikobakterije vidne kot rdeče, rožnate ali rubinasto rdeče paličice. Najbolje je, da si brise ogledate pod binokularnim mikroskopom pri povečavi 1,5 (šoba) x 7 (okular) x 90 ali 100 (objektiv).
Metoda se uporablja kot signal, saj prisotnost ali odsotnost mikobakterij v brisih absolutno ne vpliva na potek nadaljnje raziskave in celo pozitiven rezultat bakterioskopije nima pravnega pomena (razen za ptice). Gradivo je treba dodatno raziskati.
Laboratorijska diagnoza tuberkuloze pri pticah se šteje za potrjeno, če iz testnega materiala izoliramo kulturo ptičjih mikobakterij (iz papig - ljudi ali ptičjih vrst), dobimo pozitiven rezultat biološkega testa in tudi, če odkrijemo mikobakterije v brisih patološkega materiala. med mikroskopskim pregledom (oddelek 7.3.2 navodil).
Pozornost je treba posvetiti tudi dejstvu, da priprava odtisnih brisov, njihova fiksacija in pregledovanje traja zelo dolgo, v njih pa je zelo redko odkriti mikobakterije, tudi v brisih iz posejane suspenzije materiala. Zato, da bi prihranili delovni čas in denar pri preučevanju materiala živali, ki med zakolom niso imele sprememb, je priporočljivo, da se omejimo na pripravo in pregledovanje brisov samo iz suspenzije materiala, posejanega na hranilnih medijih. To ne bo povzročilo škode pri diagnozi tuberkuloze, ker se študija materiala nadaljuje.
Poleg konvencionalne svetlobne mikroskopije je mogoče uporabiti fluorescentno mikroskopijo. Na enak način pripravimo brise, jih fiksiramo in obarvamo z mešanico fluorokromov. Obarvane brise pregledamo pod fluorescenčnim mikroskopom. Metoda je bolj občutljiva, vendar manj specifična, zato ni zelo sprejemljiva, zlasti v praktičnih laboratorijih.
Kulturna izolacija mikobakterij na hranilnih medijih je ena od pomembnih povezav v laboratorijski diagnostiki tuberkuloze na današnji stopnji. Vendar pa imajo hranilni mediji, na katerih je bil material posejan (za 5-10 epruvet v skladu z navodili), v prvih 2-3 tednih praviloma delno ali popolno kalitev zaradi kršitve sterilnosti med inokulacijo materiala. Posevke zavržemo ravno v času, ko je najverjetnejši pojav začetne rasti atipičnih mikobakterij (da ne govorimo o manifestaciji začetne rasti povzročitelja tuberkuloze, ki kaže rast tudi kasneje). V takih primerih kulturna metoda izolacije mikobakterij na hranilnih gojiščih mehansko odpade. To je eden od glavnih razlogov za pridobitev negativnih rezultatov pri bakteriološkem pregledu materiala. Kot rezultat, ker po inokulaciji materiala niso prejeli rasti kolonij mikobakterij na hranilnih medijih in so laboratorijske živali ostale žive 3 mesece, je standardni odgovor laboratorijev naslednji: "Povzročitelj tuberkuloze ni izoliran" ali " Preiskava materiala za tuberkulozo je negativna. Na podlagi rezultatov študij vzrok za reakcijo goveda na tuberkulin ni bil ugotovljen, kar vodi do nadaljnjega neupravičenega zakola znatnega števila živali, ki so se odzvale na tuberkulin, na kmetijah, ki so proste goveje tuberkuloze, kar povzroča velika gospodarska škoda, moti promet in reprodukcijo črede.
Glede na navedeno je treba dati prednost kulturni metodi izolacije mikobakterij iz materiala na hranilnih gojiščih, kot najšibkejšem členu pri bakteriološki diagnostiki tuberkuloze v okrožnih veterinarskih laboratorijih.
Pozitivni rezultati kulturne metode izolacije mikobakterij so odvisni predvsem od dveh okoliščin: povečanja zanesljivosti sejanja mikobakterij iz materiala in skladnosti s pogoji sterilnosti pri delu v škatli.
Povečanje zanesljivosti sejanja mikobakterij iz materiala, vzetega za študijo, je odvisno predvsem od njegove kvalitativne izbire, obdelave pred setvijo in povečanja števila epruvet medija, na katerem se izvaja sejanje.
Glavni pogoji, katerih upoštevanje pri sejanju materiala na hranilne medije zagotavlja rast kolonij mikobakterij:
a) vzamemo material za bakteriološko preiskavo od zaklanih živali, ki med zakolom niso imele sprememb, ločeno od vsakega trupa in vsak vzorec (material vsake živali) cepimo na 10-20 epruvet gojišča po naslednji shemi:
Bezgavke glave (submandibularne, faringealne);
Bronhialne in mediastinalne bezgavke;
Mezenterične (mezenterične) bezgavke;
Druge bezgavke (če obstajajo sumljiva območja);
Organi (tudi po potrebi).
Rezultat je inokulacija materiala ene živali za 30-50 epruvet gojišča. S tem dosežemo povečanje zanesljivosti sejanja mikobakterij za 3-5 krat, saj je brez ločevanja vzorcev (v skladu z navodili) priporočljivo zasejati material samo na 5-10 epruvetah medija iz dveh glav enega medija. kmetija.
b) Neposredno med bakteriološkim inokulacijo materiala izrežite kose z moteno morfološko strukturo bezgavke ali organa (hiperplazija, zatrdlina, pikčasta in progasta krvavitev itd.). Poleg tega je treba izrezati vsa spremenjena področja. Če je v eni malti veliko materiala po volumnu, ga lahko razdelimo na dva.
c) Strogo upoštevajte metodologijo, sprejeto za delo, ne da bi kršili način obdelave in setve materiala.
d) Pri homogenizaciji materiala, predvsem bezgavk, je potrebno uporabiti sterilni pesek ali drobno zdrobljeno sterilno steklo. Material čim bolj zmeljemo (do kremaste konsistence) za boljšo ekstrakcijo mikobakterij iz testnega materiala
e) Homogeniziranemu materialu v možnarju dodamo fiziološko raztopino v količini, ki je potrebna za inokulacijo suspenzije materiala na hranilna gojišča in za biološki test (povprečno do 0,5 cm3 v eni epruveti in 1-2 cm3 za podkožno okužbo en morski prašiček). To količino fiziološke raztopine je mogoče izračunati vnaprej.
f) Pregled pridelkov materiala je treba opraviti po 3, 5, 7, 10, 15 dneh in nato enkrat na teden.
g) Vse kolonije mikroorganizmov, zrasle na gojišču (tipične ali netipične, pigmentirane ali nepigmentirane, sluzaste ali suhe itd.), je treba mikroskopirati s selektivnim barvanjem po Ziehl-Neelsenu.
Pozornost je treba posvetiti stopnji pranja materiala iz kisline (ali alkalije), ki se uporablja za obdelavo materiala pred kontaminacijo s tujo mikrofloro. Preostala kislina bo vedno prisotna v suspenziji iz semenskega materiala, vendar mora biti čim manjša. Indikator tega je obnovitev prvotne barve medija 2.-4. dan po setvi materiala. Če se barva medija ne obnovi, to pomeni povečano količino preostale kisline. Barva medija pridobi modrikast odtenek različne intenzivnosti. Rast (domnevnih) mikobakterij se v tem primeru upočasni ali pa je sploh ne bo, zlasti povzročitelja tuberkuloze, saj je bolj zahteven glede režima gojenja. Preostala količina kisline deluje na mikobakterije do neke mere bakteriostatsko.
Za tesnjenje epruvet po inokulaciji materiala se lahko uporabijo bombažni in vatno-gazni zamaški, nato pa jih napolnijo s parafinskimi, brezgumijastimi in gumijastimi z izrezanim poševnim utorom, pluto in kovinskimi zamaški (zamaški).
Pri ugotavljanju vrstne pripadnosti izolirane kulture mikobakterij je znanih veliko (okoli 300) različnih testov: kulturno-morfološki, biološki, biokemični, serološki, določanje odpornosti na zdravila itd. Vendar pa se v veterinarski praksi uporablja njihov minimum (glej priročnik). Za laboratorije zadostuje določitev izolirane kulture mikobakterij naslednjih vrst: goveda, človeka in ptic, ki se določi z biološkim testom, in razdelitev atipičnih mikobakterij v skupine po Runyonu (1959): I - fotokromogeni (tvorijo pigment pod vplivom svetlobe), II - skotokromogene (tvorijo pigment ne glede na izpostavljenost svetlobi - tako v temi kot na svetlobi), III - nekromogene (ne tvorijo pigmenta) ali jih imenujemo tudi nepigmentirane (to tudi vključuje povzročitelja ptičje tuberkuloze), IV - hitro rastoče mikobakterije in kislinsko odporne saprofite.
Da bi to naredili, je zelo učinkovito in ekonomsko upravičeno preučevati lastnosti izolirane kulture po skrajšani shemi, v kateri je glavna pozornost namenjena času pojava primarne rasti kolonij, tvorbi pigmenta, kulturnim morfološke in tinktorialne lastnosti pri barvanju po Ziehl-Neelsenu. Še posebej pomemben je test za tvorbo vrvi v primarni ali celo subkulturi v kombinaciji z rezultati biološkega testa. Za pripravo brisov iz gojenih kolonij je priporočljivo, da jih hkrati naredite tako iz kolonij kot iz ostankov suspendiranih snovi in kondenzata, tj. iz tekočega dela na dnu cevi.
Poleg tega ima laboratorijsko osebje možnost ne samo izvajati kontrolni zakol živali, ki so reagirale na tuberkulin, in vzeti vzorce materiala za raziskave, temveč tudi vzeti vzorce za bakteriološke raziskave med življenjem živali (bronhialna ali nosna sluz, mleko). , iztrebki, urin, eksudat, kri itd.), kot tudi vzorci krme, vode, okoljskih predmetov za izolacijo mikobakterij in s tem posredno dokazujejo vzrok odziva goveda na tuberkulin. Pri setvi dodatnega materiala in vzorcev iz okoljskih predmetov se uporabljajo dobro znane metode koncentriranja mikobakterij: sedimentacija, flotacija, flotacija-sedimentacija in druge.
Skrajšana shema diferenciacije mikobakterij z uporabo biološkega testa
