Grebenske neposredne in posredne metode. Laboratorijska diagnostika spolno prenosljivih okužb
Trenutno se široko uporabljajo serološki testi, v katere so vključeni označeni AG ali AT-la. Sem spadajo imunofluorescenčne reakcije, radioimunske in encimske imunske metode.
Uporabljajo se:
1) za serodiagnostiko nalezljivih bolezni, to je za odkrivanje protiteles z uporabo niza znanih konjugiranih (kemično kombiniranih) antigenov z različnimi oznakami (encimi, fluorokromna barvila);
2) določiti mikroorganizem ali njegov serovar s standardno označenimi diagnostičnimi protitelesi (hitra diagnostika).
Serume pripravimo tako, da živali imuniziramo z ustreznimi antigeni, nato izoliramo imunoglobuline in jih konjugiramo s svetlečimi barvili (fluorokromi), encimi in radioizotopi.
Označeni SR po specifičnosti niso slabši od drugih SR, po občutljivosti pa prekašajo vse SR.
Ni sorodne vsebine
Kot oznaka se uporabljajo svetleča fluorokromna barvila (fluoriscein izotiocianat itd.).
Obstajajo različne modifikacije RIF. Za ekspresno diagnostiko nalezljivih bolezni - za odkrivanje mikrobov ali njihovih antigenov v testnem materialu se uporablja RIF po Koonsu.
Po Koonsu obstajata dve metodi RIF: neposredna in posredna.
Neposredne komponente RIF:
1) preučevani material (črevesje, ločeno z nazofarinksom itd.);
2) označen specifični imunski serum, ki vsebuje AT-la na želeni antigen;
3) izotonična raztopina natrijevega klorida.
Bris testnega materiala obdelamo z označenim antiserumom.
Pojavi se reakcija AG-AT. Luminescentni mikroskopski pregled na območju lokalizacije kompleksov AG-AT razkrije fluorescenco - luminiscenco.
Posredne komponente RIF:
1) material, ki se preučuje;
2) specifični antiserum;
3) antiglobulinski serum (AT-la proti imunoglobulinu), označen s fluorokromom;
4) Izotonična raztopina natrijevega klorida.
Bris testiranega materiala najprej obdelamo z imunskim serumom na želeni antigen, nato pa z označenim antiglobulinskim serumom.
Svetleči kompleksi AG-AT - označeni z AT se detektirajo s fluorescenčnim mikroskopom.
Prednost indirektne metode je v tem, da ni treba pripravljati širokega nabora fluorescenčno specifičnih serumov, temveč se uporablja le en fluorescentni antiglobulinski serum.
Izolirana je tudi 4-komponentna različica posrednega RIF, ko se dodatno uvede komplement (serum morskega prašička). Ob pozitivni reakciji nastane kompleks AG-AT - označen - AT-komplement.
RIF temelji na kombinaciji antigenov bakterij, rikecij in virusov s specifičnimi protitelesi, označenimi s fluorescenčnimi barvili (fluorescein izotiocianat, rodamin, B-izotiocianit, lisatinrodamin B-200, sulfoklorid itd.), ki imajo reaktivne skupine (sulfoklorid, izotiocianit itd.). .) . Te skupine se povezujejo s prostimi amino skupinami molekul protiteles, ki ob obdelavi s fluorokromom ne izgubijo svoje specifične afinitete za ustrezni antigen. Nastali kompleksi AG-AT postanejo jasno vidne, svetlo svetleče strukture pod fluorescenčnim mikroskopom (slika 7). RIF lahko zazna majhne količine bakterijskih in virusnih antigenov. Metoda RIF se uporablja v dveh različicah: direktna in indirektna metoda.
Neposredna metoda temelji na neposredni povezavi antigena z označenim protitelesom. Posredna metoda temelji na fazni detekciji kompleksa AG-AT s fluorescenčnimi barvili. Prva faza je tvorba imunskih kompleksov določenega antigena s specifičnimi protitelesi. Druga stopnja je identifikacija tega kompleksa z obdelavo z označenim antigamaglobulinom.
Prednost RIF je enostavnost, visoka občutljivost, hitrost pridobivanja rezultata. RIF se uporablja kot metoda za zgodnjo ekspresno diagnozo gripe, dizenterije, malarije, kuge, tularemije, sifilisa itd. Za izvedbo takšne študije se uporablja luminiscenčni mikroskop.
Radioimunski test (RIA)
RIA je ena najbolj občutljivih metod imunodiagnostike. Uporablja se za odkrivanje antigena virusa hepatitisa B pri bolnikih z virusnim hepatitisom. V ta namen se testnemu serumu doda referenčni serum (serum, ki vsebuje protitelesa proti virusu hepatitisa B). Zmes inkubiramo 1-2 dni pri temperaturi 40°C, nato dodamo referenčni antigen (antigen, označen z izotopom 125 J) in inkubacijo nadaljujemo še 24 ur. Nastalemu kompleksu antigen-protitelo dodamo precipitacijske antiimunoglobuline proti referenčnim serumskim proteinom, kar povzroči nastanek oborine (slika 8). Rezultat se upošteva glede na prisotnost in število impulzov v oborini, ki jih zabeleži števec. Če je v testiranem serumu antigen vezan na specifična protitelesa, se ta ne vežejo na označeni antigen in ga zato v oborini ne zaznamo. RIA torej temelji na principu kompetitivnega medsebojnega delovanja določenega antigena in znane količine označenega antigena z aktivnimi centri protiteles, pri čemer se kot označevalec uporabljajo radioaktivni izotopi.
Glede na tehniko uprizarjanja ločimo dve metodi RIA.
1) Tehnika "tekoča faza" (klasična RIA). Pomanjkljivost te uprizoritvene tehnike je potreba
posebno ločevanje prostih in vezanih označenih antigenov (ali protiteles).
2) Tehnika "trdna faza".
AG ali AT znane specifičnosti se veže na sorbente (trdna faza) - stene polistirenske vdolbinice ali plastične cevi. Preostale komponente IC se zaporedno sorbirajo na imobiliziran AG (AT).
Glede na naravo reakcije se razlikujejo naslednje metode:
1) Konkurenčna metoda - metoda, ki temelji na konkurenci AG.
Reakcijske komponente:
a) zaznavna AG (testni material - kri, sputum itd.);
b) antigen, označen z radioizotopom, identičen proučevanemu antigenu;
c) specifična protitelesa znane koncentracije, vezana na sorbent;
d) standard AG (kontrola);
e) puferska raztopina.
Najprej se v reakcijo vnese proučevani AG. Na površini sorbenta se tvori kompleks AG-AT. Sorbent speremo, nato dodamo označeni AG.Višja kot je vsebnost proučevanega AG, manj označenega AG se veže na AT-m na površini sorbenta. Koncentracijo označenega antigena določimo z merjenjem radioaktivnosti reakcije s števci. Vrednost radioaktivnosti reakcije bo obratno sorazmerna s količino AG v testnem vzorcu.
2) Nekonkurenčna metoda.
Reakcijske komponente:
a) določen AG;
b) specifični AT-a znane koncentracije, vezan
nye na sorbentu;
c) protitelesa, identična vezanemu protitelesu, označena
radioizotop;
d) standard AG;
e) puferska raztopina.
Vezanim protitelesom dodamo proučevani AG. V procesu inkubacije se na sorbentu tvorijo kompleksi AG-AT. Sorbent speremo s prostih komponent in dodamo označena protitelesa, ki se vežejo na proste valence AG-on v kompleksu. Količina radioaktivnosti je sorazmerna s koncentracijo proučevanega AG.
3) "Sendvič metoda" (posredna metoda) - najpogostejša metoda.
Sestavine:
a) testni serum (ali test AG);
b) AG, vezane na sorbent (ali AT-la, vezane na sorbent pri določanju AG-a);
c) diagnostična protitelesa proti imunoglobulinom, označenim z radioizotopi;
d) kontrolni serumi (ali antigeni);
e) puferske raztopine.
Preučevani AB (ali AG) reagirajo s trdnofaznimi AG (AT), nato se odstrani inkubat in v reakcijo vnesejo označeni antiglobulinski AB, ki se vežejo na specifične komplekse AG-AT na površini sorbenta. Velikost radioaktivnosti reakcije je neposredno sorazmerna s količino proučevanega AT (ali AG).
Prednosti RIA:
1) visoka specifičnost in občutljivost;
2) preprostost tehnike nastavitve;
3) točnost kvantitativne ocene rezultatov;
4) enostaven za avtomatizacijo.
Slabost: uporaba radioaktivnih izotopov.
Ni sorodne vsebine
Metoda ELISA (ELISA)
Metoda se uporablja za odkrivanje antigenov z uporabo ustreznih protiteles, konjugiranih z označenim encimom (hrenova peroksidaza, b-galaktoza ali alkalna fosfataza). Ko se antigen združi z encimsko označenim imunskim serumom, se zmesi doda substrat in kromogen. Substrat razcepi encim, njegovi razgradni produkti pa povzročijo kemično modifikacijo kromogena. V tem primeru kromogen spremeni svojo barvo - intenzivnost barve je premo sorazmerna s številom vezanih molekul antigena in protiteles (slika 9).
Najpogostejša je trdnofazna ELISA, pri kateri je ena od komponent imunskega odziva (antigen ali protitelo) adsorbirana na trdnem nosilcu. Polistirenske mikroplošče se uporabljajo kot trden nosilec. Pri določanju protiteles se v vdolbinice z adsorbiranim antigenom zaporedno dodaja krvni serum bolnikov, z encimom označen antiglobulinski serum in mešanica substratnih raztopin za encim in kromogen. Vsakič po dodajanju naslednje komponente se nevezani reagenti odstranijo iz vdolbinic s temeljitim izpiranjem. S pozitivnim rezultatom se spremeni barva raztopine kromogena. Trdnofazni nosilec lahko senzibiliziramo ne samo z antigenom, ampak tudi s protitelesom. Nato v vdolbinice s sorbiranimi protitelesi vnesemo želeni antigen, dodamo imunski serum proti z encimom označenim antigenom in nato dodamo mešanico substratnih raztopin za encim in kromogen.
ELISA se uporablja za diagnosticiranje bolezni, ki jih povzročajo virusni in bakterijski povzročitelji, kot označevalec se uporabljajo encimi: peroksidaza, alkalna fosfataza itd.
Indikator reakcije je sposobnost encimov, da povzročijo barvne reakcije, ko so izpostavljeni ustreznemu substratu. Na primer, substrat za peroksidazo je raztopina ortofenildiamina.
Najbolj razširjena trdnofazna ELISA. Bistvo ELISA je podobno kot RIA.
Rezultate ELISA lahko ocenimo vizualno in z merjenjem optične gostote na spektrofotometru.
Prednosti ELISA vključujejo:
Brez stika z radioaktivnimi snovmi;
Enostavnost metod vrednotenja odgovorov;
Stabilnost konjugatov;
Preprosto podvržen avtomatizaciji.
Vendar pa je v primerjavi z RIA opažena manjša občutljivost metode, vendar je v nekaterih primerih občutljivost boljša od RIF in RIM.
Kot primeri so navedene naslednje vrste ELISA:
tekmovalnega tipa.
Sestanek.
Zasnovan za odkrivanje površinskega antigena virusa hepatitisa B (HB3 Ad) v serumu in plazmi pri diagnozi virusnega hepatitisa B in določanje prenašalstva HB5 Ad.
Sestavine:
1) testni material serum ali krvna plazma;
2) protitelesa proti HB3 Ad, adsorbirana na površini jamice polistirenske mikroplošče;
3) konjugat - mišja monoklonska protitelesa proti HB3 Ad, označena s peroksidazo,
4) ortofenilendiamin (OPD) -substrat;
5) fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom;
6) kontrolni serumi:
Pozitiven (serum s HBe Ad);
Negativno (serum brez HBs Ad). Napredek
1) Uvedba kontrolnih in testnih serumov.
2) Inkubacija 1 uro pri 37 °C.
3) Vodnjaki za pranje.
4) Uvedba konjugata.
5) Inkubacija 1 uro pri 37 °C.
6) Vodnjaki za pranje.
7) Uvedba OFD. V prisotnosti HBs Ad se raztopina v vdolbinicah obarva rumeno.
ELISA se upošteva z optično gostoto s fotometrom. Stopnja optične gostote bo obratno sorazmerna s koncentracijo proučevanih HBs Ad.
Mehanizem
Reakcija poteka v treh fazah:
1) HB3 Krvni tlak proučevanega seruma (plazme) se veže na homologna protitelesa, adsorbirana na površini jamice. Nastane IR AG-AT. (NVz Ad - agl \ NVz AT).
2) S peroksidazo označena protitelesa HBs Ad se vežejo na preostale proste determinante HBs Ad kompleksa AG-AT. Nastane kompleks z AT-AG označenih Abs (an!1 HBs AT-HBs Ad-ap(1 HBs Abs označen s peroksidazo).
3) OPD interagira (s peroksidazo) kompleksa AT-AG-AT in pojavi se rumeno obarvanje.
posredni tip
Je glavna testna reakcija za diagnozo okužbe s HIV.
Namen: serološka diagnostika okužbe s HIV - odkrivanje protiteles proti antigenom HIV, Sestavine:
1) testni material - krvni serum;
2) sintetična
Imunofluorescenčna reakcija – RIF (Koonsova metoda) Poznamo tri vrste direktna metoda, indirektna metoda, s komplementom. Koonsova reakcija je hitra diagnostična metoda za odkrivanje mikrobnih antigenov ali odkrivanje protiteles.
Neposredna metoda RIF temelji na dejstvu, da lahko tkivni antigeni ali mikrobi, obdelani z imunskimi serumi s protitelesi, označenimi s fluorokromi, svetijo v UV žarkih fluorescentnega mikroskopa. Bakterije v brisu, obdelanem s takšnim luminiscenčnim serumom, svetijo po obodu celice v obliki zelene obrobe.
Posredna metoda RIF je sestavljena iz identifikacije kompleksa antigen-protitelo z uporabo
antiglobulinski (protitelesni) serum, označen s fluorokromom. Da bi to naredili, brise iz suspenzije mikrobov obdelamo s protitelesi protimikrobnega kunčjega diagnostičnega seruma. Nato protitelesa, ki niso vezana na mikrobne antigene, speremo, protitelesa, ki ostanejo na mikrobih, pa odkrijemo z obdelavo razmaza z antiglobulinskim (anti-kunčjim) serumom, označenim z
fluorokromi. Posledično nastane kompleks mikroba + protimikrobna kunčja protitelesa + antikunčja protitelesa, označena s fluorokromom. Ta kompleks opazimo v fluorescenčnem
mikroskopom, kot pri direktni metodi.
23. Encimski imunski test Sestavine, formulacija, obračunavanje, vrednotenje. Področja uporabe.
I Radioimunotest.
Radioimunska metoda ali analiza (RIA) je zelo občutljiva metoda, ki temelji na reakciji antigen-protitelo z uporabo antigenov ali protiteles, označenih z radionuklidom (125J, 14C, 3H, 51Cr itd.). Po njunem medsebojnem delovanju nastali radioaktivni imunski kompleks ločimo in mu določimo radioaktivnost v ustreznem števcu (beta ali gama sevanje). Intenzivnost sevanja je premo sorazmerna s številom vezanih molekul antigena in protiteles.
dodajte bolnikov serum, antiglobulinski serum, označen z encimom, in substrat/kromogen za encim.
II. Pri določanju antigena v vdolbinice s sorbiranimi protitelesi vnesemo antigen (npr. krvni serum z želenim antigenom), dodamo diagnostični serum proti njemu in sekundarna protitelesa (proti diagnostičnemu serumu), označena z encimom, in potem substrat/kromogen za encim.
24. Reakcije imunske lize, uporaba. Reakcija vezave komplementa. Sestavine, formulacija, računovodstvo, vrednotenje. Aplikacija.
Reakcija fiksacije komplementa (RCC) je sestavljena iz dejstva, da ko antigeni in protitelesa ustrezajo drug drugemu, tvorijo imunski kompleks, na katerega je komplement (C) pritrjen preko Fc fragmenta protiteles, komplement pa veže antigen-protitelo. kompleksen. Če kompleks antigen-protitelo ne nastane, ostane komplement prost. RSK poteka v dveh fazah 1. faza - inkubacija zmesi, ki vsebuje antigen + protitelo + komplement, 2. faza (indikator) - detekcija prostega komplementa v zmesi z dodatkom hemolitičnega sistema, ki ga sestavljajo ovčji eritrociti in hemolitični serum, ki vsebuje protitelesa. njim. V 1. fazi reakcije, ko nastane kompleks antigen-protitelo, pride do vezave komplementa, nato pa v 2. fazi ne bo prišlo do hemolize s protitelesi senzibiliziranih eritrocitov (reakcija je pozitivna). Če se antigen in protitelo ne ujemata (v testnem vzorcu ni antigena ali protitelesa), ostane komplement prost in se v 2. fazi pridruži kompleksu eritrocit-antieritrocitno protitelo, kar povzroči hemolizo (negativno reakcijo).
25. Dinamika nastajanja celičnega imunskega odziva, njegove manifestacije. Imunološki
spomin.
Imunski celični odziv (CIR) je kompleksna, večkomponentna kooperativna reakcija imunskega sistema, ki jo inducira tuji antigen (epitopi T-celic). Izvaja T-sistem imunosti. KIO stopnje
1. Zajem antigena APC
2. Procesor. AG v proteasomih.
3. Tvorba kompleksa peptid + MHC razreda I in II.
4. Transport komplementa do membrane APC.
5. Prepoznavanje komplementa s pomočjo AG-specifičnih T-pomočnikov 1
6. aktivacija APC in T-helperjev 1, sproščanje IL-2 in gama-interferona s strani E-helperjev1. Proliferacija in diferenciacija na področju AG-odvisnih T-limfocitov.
7. Tvorba zrelih T-limfocitov različnih populacij in spominskih T-limfocitov.
8. Interakcija zrelih T-limfocitov z AH in realizacija končnega efektorja.
Manifestacije KIO:
protiinfektivna umetna inteligenca:
protivirusno,
antibakterijsko (znotrajcelično locirane bakterije);,
alergije IV in I tipa;
protitumorski IO;
presaditev AI;
imunološka toleranca;
imunološki spomin;
avtoimunski procesi.
26. Karakterizacija regulatornih in efektorskih subpopulacij T-limfocitov. Glavni
markerji. T-celični receptor (TCR). Genetski nadzor raznolikosti TCR
Limfociti T predstavljajo drugo pomembno populacijo limfocitov, katerih prekurzorji nastajajo v kostnem mozgu in nato migrirajo za nadaljnje zorenje in
diferenciacija v timus (ime "T-limfocit" odraža odvisnost od timusa kot glavnega mesta zgodnje faze zorenja).
Glede na spekter biološke aktivnosti so T-limfociti regulatorne in efektorske celice, ki zagotavljajo prilagoditveno funkcijo T-sistema imunosti. Ne proizvajajo molekul protiteles. TCR je membranska molekula, ki se razlikuje od HCR, vendar je strukturno in funkcionalno podobna protitelesom.
TCR - specifično za AG. receptor. Je glavna molekula, ki pripada superdružini Ig. Ima 3 dele: nadmembranski, membranski in citoplazemski. Rep TCR tvorita 2 globularni alfa in beta molekuli, ki imata variabilne in konstantne domene (Vα in Vβ, Сα in Сβ).
Vα in Vβ tvorita aktivni kompleks TCR. Obstajajo 3 hipervariabilne regije - konstantne deterministične regije (CDO). Funkcija KDO je prepoznavanje in vezava peptidov T-celic, tj. determinantne skupine AG. TCR se tesno prilega celici in njen citoplazemski rep, njen citoplazemski del, sodeluje pri izvajanju inf. V jedru med interakcijo z AG. Približno 90 % TCR. Nosijo verige alfa in beta, približno 10 % pa jih nosi verige gama in delta.
TCR je genetsko kodiran. Verigi α in γ, po analogiji z lahkimi verigami IG, kodirajo geni V, G in C, β in δ, po analogiji s težkimi verigami IG, pa V, G, E. α in γ na 7. kromosomu ter β in δ na 14. kromosomu.
Receptor CD-3 je komplementarna struktura, molekula Ig. Tvorijo ga 3 transmembranski proteini: εδ, εγ in dimer-zeta., nadmembranski, vembranski in citosolni rep. Predstavljajo en sam kompleks s TCR, ki zagotavlja prevajanje AG-specifičnih signalov do celičnega jedra.
CD4 in CD8. Izražajo se hkrati s TCR ali ločeno od njega. Imajo funkcijo koreceptorjev. Povečajo oprijem na celico, ki predstavlja AG. Zagotavljajo prevajanje AG-specifičnega signala do celičnega jedra.
T-limfocite delimo glede na vrsto prepoznavanja, MOLEKULE:
CD4 rec. Peptid MHC 2. razreda
CD8 peptid + MHC 1. razred
Značilnosti glavnih subpopulacij T-limfocitov: populacijo T-limfocitov lahko razvrstimo v tri razrede:
A. Pomočniki, efektorji HRT (CD 4+) in citotoksični supresorji (CD 8+);
B. Nestimulirane (CD 45 RA+) in spominske celice (CD 45 RO+);
C. Tip 1 - (producira IL-2, INF-gama, TNF-beta);
Tip 2 - (proizvajajo IL-4, IL-5, IL-6, IL9, IL 10).
Ta metoda uporablja pojav luminiscence.
Bistvo pojava luminiscence je v tem, da ko molekule določenih snovi absorbirajo različne vrste energije (svetlobno, električno itd.), Njihovi atomi preidejo v vzbujeno stanje in se nato vrnejo v prvotno stanje. , oddajajo absorbirano energijo v obliki svetlobnega sevanja.
V RIF se luminiscenca manifestira v obliki fluorescence - to je sij, ki se pojavi v trenutku obsevanja z vznemirljivo svetlobo in se ustavi takoj po koncu.
Številne snovi in živi mikroorganizmi imajo lastno fluorescenco (t.i. primarno), vendar je njena jakost zelo nizka. Snovi, ki imajo intenzivno primarno fluorescenco in se uporabljajo za dodajanje fluorescentnih lastnosti nefluorescentnim snovem, imenujemo fluorokromi. Tako inducirano fluorescenco imenujemo sekundarna.
Za vzbujanje fluorescence pri fluorescentni mikroskopiji se najpogosteje uporablja ultravijolični ali modro-vijolični del spektra (valovna dolžina 300-460 nm). Za te namene imajo laboratoriji luminiscenčne mikroskope različnih modelov - ML-1-ML-4, "Lumam".
V virološki praksi se uporabljata dve glavni metodi fluorescentne mikroskopije: fluorokromizacija in fluorescentna protitelesa (ali RIF).
Fluorokromizacija- to je obdelava preparatov s fluorokromom, da se poveča moč in kontrast njihove luminiscence. Najbolj zanimiv je fluorokrom akridin oranžen, ki povzroča polikromatsko fluorescenco nukleinskih kislin. Torej, ko so pripravki obdelani s tem fluorokromom, deoksiribonukleinska kislina fluorescira svetlo zeleno, ribonukleinska kislina pa rubinasto rdeča.
Metoda RIF je sestavljena iz dejstva, da protitelesa, povezana s fluorokromom, ohranijo sposobnost vstopa v specifično razmerje s homolognim antigenom. Nastali kompleks antigen + protitelo se zaradi prisotnosti fluorokroma v njem zazna pod fluorescenčnim mikroskopom z značilnim sijem.
Za pridobivanje protiteles uporabljamo visoko aktivne hiperimunske serume, iz katerih izoliramo protitelesa in jih označimo s fluorokromom. Najpogosteje uporabljena fluorokroma sta FITC-fluorescein izotiocianat (zelena luč) in PCX-rodamin sulfoklorid (rdeča luč). Protitelo, označeno s fluorokromom, se imenuje konjugat.
Način priprave in barvanja preparatov je naslednji:
- pripraviti brise, odtise iz organov ali na pokrovna stekelca - okuženo celično kulturo na stekelcih; Uporabimo lahko tudi historeze;
- pripravke sušimo na zraku in fiksiramo v ohlajenem acetonu pri sobni temperaturi ali pri minus 15 °C (od 15 minut do 4-16 ur);
- obarvano z neposredno ali posredno metodo; vodijo zapise pod fluorescenčnim mikroskopom glede na intenzivnost sijaja, ocenjeno v križcih.
Vzporedno pripravimo in obarvamo preparate zdrave živali – kontrola.
Obstajata dve glavni metodi uporabe fluorescenčnih protiteles: neposredna in posredna.
Neposredna metoda (en korak). Na fiksiran pripravek nanesemo konjugat (fluorescenčni serum na domnevni virus), ki ga inkubiramo 30 minut pri temperaturi 37 °C v vlažni komori. Nato zdravilo speremo z nevezanega konjugata s fiziološko raztopino (pH 7,2 - 7,5), posušimo na zraku, nanesemo nefluorescenčno olje in pregledamo pod mikroskopom.
Direktna metoda omogoča odkrivanje in identifikacijo antigena. Če želite to narediti, morate imeti fluorescentni serum za vsak virus.
Posredna metoda (dvostopenjska). Na fiksiran preparat nanesemo neoznačen serum, ki vsebuje protitelesa proti sumljivemu virusu, inkubiramo 30 minut pri 37 °C, nevezana protitelesa speremo. Na pripravek nanesemo fluorescentni serum proti vrstam, ki ustreza vrsti živali, ki proizvaja homologna protivirusna protitelesa, in inkubiramo 30 minut pri 37 °C. Nato zdravilo speremo z nevezanih označenih protiteles, posušimo na zraku, nanesemo nefluorescentno olje in pregledamo pod fluorescenčnim mikroskopom.
Protivrstne serume pridobimo z imunizacijo živali z globulini tistih vrst, ki služijo kot proizvajalci protivirusnih protiteles. Torej, če so protivirusna protitelesa pridobljena na kuncih, potem se uporabi fluorescentni antikunčji serum.
Posredna metoda omogoča ne le odkrivanje in identifikacijo antigena, temveč tudi odkrivanje in določanje titra protiteles. Poleg tega lahko ta metoda zazna antigene različnih virusov z enim samim označenim serumom, saj temelji na uporabi protivrstnih serumov. Pogosteje se uporabljajo anti-kunčji, anti-goveji, anti-konjski serumi in serumi proti globulinom morskih prašičkov.
Razvitih je bilo več modifikacij posredne metode. Največjo pozornost si zasluži metoda z uporabo komplementa. Metoda je sestavljena iz nanosa inaktiviranega nefluorescenčno specifičnega seruma in komplementa morskega prašička na fiksni pripravek, hranjenja 30 minut pri 37 °C, izpiranja in za odkrivanje kompleksa antigen + protitelo + komplement, nanosa fluorescentnega antikomplementarnega seruma 30 minut pri 37 °C, speremo, posušimo na zraku in pregledamo pod fluorescentnim mikroskopom.
Prednosti RIF: visoka specifičnost in občutljivost; enostavnost tehnike nastavitve; zahteva minimalno število komponent. To je ekspresna diagnostična metoda, saj lahko odgovor dobite v nekaj urah. Pomanjkljivosti vključujejo subjektivnost pri ocenjevanju intenzivnosti luminiscence in na žalost so včasih fluorescentni serumi slabe kakovosti. Trenutno se RIF pogosto uporablja pri diagnozi virusnih bolezni živali.
Če najdete napako, označite del besedila in kliknite Ctrl+Enter.
Imunofluorescenčna reakcija, ki jo je leta 1942 odkril Koons, ni nova raziskovalna metoda. Vendar pa je pojav hibridomskih tehnologij, ki so omogočile pridobivanje monoklonskih protiteles, tej reakciji dal "drugo življenje", saj je njihova uporaba omogočila večkratno povečanje občutljivosti te reakcije in njene specifičnosti.
In danes vam bomo podrobno povedali o reakciji neposredne in posredne imunofluorescence (RIF) kot Koonsove diagnostične metode za odrasle moške in ženske med nosečnostjo.
Kaj je imunofluorescenčna reakcija
Imunofluorescenčna reakcija, ki je odlična priložnost za hitro pridobitev natančne diagnoze, omogoča ugotavljanje prisotnosti povzročitelja v patološkem materialu. Za to se uporabi bris iz materiala, ki je posebej obdelan z označenim FITC (fluorescein izotiocianat) in preučen kot heterogena analiza.
Za pridobitev rezultata se uporablja fluorescenčni mikroskop, v njegovem optičnem sistemu je niz svetlobnih filtrov, ki zagotavljajo pripravek z modro-vijolično ali ultravijolično svetlobo z določeno valovno dolžino. Ta pogoj omogoča, da fluorokrom sveti v določenem območju. Raziskovalec oceni lastnosti sijaja, njegovo naravo, velikost predmetov in njihov relativni položaj.
Komu je dodeljena
Izvajanje imunofluorescenčne reakcije je mogoče predpisati pri diagnozi številnih virusnih bolezni. Zlasti je predpisan celovit pregled za identifikacijo naslednjih dejavnikov:
- prisotnost virusa v telesu;
- okužba s salmonelo;
- obstoj določenih antigenov v telesu;
- razkrita je verjetnost okužbe telesa s klamidijo, mikoplazmami in drugimi mikroorganizmi, ki imajo sposobnost sprožitve človeških virusnih bolezni;
- diagnosticiranje virusnih bolezni pri živalih.
Te indikacije omogočajo uporabo imunofluorescenčne reakcije pri odkrivanju virusnih bolezni različne narave v človeškem in živalskem telesu.
Cilji
Ker ima ta diagnostična metoda številne prednosti, ki vključujejo visoko učinkovitost, hitrost izvajanja in pridobivanje rezultatov ter odsotnost velikega števila kontraindikacij, se uporablja za ugotavljanje prisotnosti virusnih okužb v telesu. Zato se lahko ta analiza predpiše tako za postavitev kot za razjasnitev diagnoze, na podlagi katere je predpisan režim zdravljenja.
Postopek ne povzroča nelagodja, zanj je potrebno pridobiti material za analizo, ki se vzame iz katere koli telesne tekočine: sline, sputuma, strganja s površine sluznice. Za analizo se lahko vzame tudi kri. Pogostost reakcije imunofluorescence predpiše lečeči zdravnik, ki mora pridobiti podatke o dinamiki procesov, ki se pojavljajo v telesu.
Ker ta analiza ne škoduje telesu in splošnemu dobremu počutju osebe, se lahko po potrebi predpiše.
Vrste takega postopka
Danes se uporablja več vrst te analize, od katerih ima vsaka številne posebne značilnosti in vam omogoča, da dobite najbolj podrobno sliko procesov, ki se pojavljajo v telesu.
Vrste imunofluorescenčnih reakcij vključujejo:
- - ena najhitreje razvijajočih se vrst diagnostike, ta analiza omogoča pridobivanje kvantitativnih podatkov brez uporabe serijskih razredčitev. Z uporabo pridobljenih meritev optične gostote tekočine je mogoče natančno določiti nivo koncentracije želene komponente. Široke možnosti te vrste analize se uporabljajo, ko se za njeno izvajanje uporabljajo monoklonska protitelesa, kar omogoča določitev faze infekcijskega procesa, njegove resnosti;
- DNK diagnostika- ta metoda temelji na komplementarni vezavi nukleotidov, za kar lahko uporabimo tekočine, kot so slina, kri, cerebrospinalna tekočina, urin, sputum, biopsijski vzorci in kri. Ta metoda najučinkoviteje zazna prisotnost papiloma virusov v telesu, vendar pa lahko številni sodobni testni sistemi občasno dajejo lažno pozitivne in lažno negativne rezultate. Razlog zanje je lahko kontaminacija vzorcev tekočine za analizo specifične DNK, katere prisotnost je lahko ugnezdena ali popolna;
- imunokromatografija- specifičnost te metode za določanje prisotnosti patološkega okolja in virusov v telesu je uporaba označenih protiteles med reakcijo. Ta diagnostična metoda se uporablja za identifikacijo in stopnjo aktivnosti procesa okužbe s streptokoki skupine A, pa tudi s klamidijo naslednjih vrst: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia iz Oxoid. Testni sistemi, ki temeljijo na tej raziskovalni metodologiji, imajo najvišjo občutljivost. običajno uporabljajo kot orientacijski test.
Naštete sorte imajo značilnosti vedenja in posebne značilnosti rezultatov, vendar so vsi namenjeni pridobivanju podatkov o prisotnosti patoloških mikroorganizmov in virusov v telesu, pa tudi o stopnji njihovega razmnoževanja in aktivnosti.
Indikacije za izvedbo
Za odkrivanje kakršnega koli patološkega okolja v telesu je mogoče predpisati reakcijo imunofluorescence.
Med to vrsto diagnoze se določijo klamidija, trihomonadi, gonokoki in lamblije vseh vrst. in druge bolezni zahtevajo tudi RIF. Za njegovo izvajanje je obvezno imenovanje zdravnika.
Kontraindikacije za držanje
Ker je za to reakcijo potrebna katera koli telesna tekočina, njihovo jemanje običajno ni težavno in ni kontraindikacij za izvedbo reakcije imunofluorescence. Vendar pa se med nosečnostjo in pri otrocih, mlajših od 6 mesecev, vzorčenje za raziskave izvaja z največjimi previdnostnimi ukrepi.
Odsotnost kontraindikacij omogoča izvedbo te vrste diagnoze, ko zdravnik predpiše vsem bolnikom. Njegova varnost je zagotovljena z uporabo razkuženega instrumenta in brizg za enkratno uporabo.
Priprava na postopek
Ni značilnosti jemanja materiala za to analizo. Kri zanj se vzame na prazen želodec, tako da v njej ni visoke vsebnosti snovi, ki bi lahko spremenile resnično pričevanje in dale lažno sliko.
Kako je z vzorčenjem
Ker za analizo ni potrebna posebna priprava, le jesti 12 ur pred njo in je izključena odsotnost uporabe zdravil, se testni material vzame kot običajen postopek odvzema telesne tekočine za analizo.
Subjektivni občutki med postopkom se lahko razlikujejo glede na občutljivost.
Dešifriranje rezultatov
Uporaba sodobnih testnih sistemov vam omogoča, da dobite najbolj natančne rezultate analize. Za dešifriranje rezultata se uporabljajo naslednji podatki:
- stopnja intenzivnosti fluorescence;
- fluorescenčni odtenek;
- periferna narava žarenja predmeta;
- značilnosti morfologije, lokacijo povzročitelja v odvzetem razmazu testnega materiala in njegove dimenzije.
Pri preučevanju velikih predmetov (na primer Gardenerella, Trichomonas, celice, ki so že prizadete z virusi), zgoraj navedena merila omogočajo pridobitev najbolj zanesljivih rezultatov. Vendar pa imajo osnovna telesca mikoplazme in klamidije velikosti, ki ležijo na meji ločljivosti fluorescenčnega mikroskopa, kar otežuje
otežuje doseganje natančnega rezultata, saj periferni sij izgubi del svoje intenzivnosti. Preostali kriteriji ne zadoščajo več za natančno identifikacijo proučevanih mikroorganizmov. Zato so za strokovnjake, ki izvajajo tovrstne raziskave, naložene posebne zahteve: stopnja njihove usposobljenosti mora biti zadostna za delo z razpoložljivimi podatki.
Zaradi tega se lahko z dekodiranjem pridobljene analize ukvarja le zdravnik z ustrezno stopnjo kvalifikacije. O ceni raziskave RIF preberite spodaj.
povprečni stroški
Cena imunofluorescenčnega testa je odvisna od lokacije in stopnje zdravstvene ustanove ter od usposobljenosti specialista, ki izvaja analizo. Danes se stroški gibljejo od 1280 do 2160 rubljev.
Spodnji videoposnetek vam bo povedal več o imunoloških reakcijah:
Obstajata dve možnosti za nastavitev RIF (Coonsova reakcija) - direktna in indirektna imunofluorescenčna reakcija.
Direct RIF je preprosta reakcija v enem koraku, a ker zahteva veliko količino
označeni protimikrobni serumi, potem je manj pogosto posreden, katerega proizvodnjo zagotavlja en označeni antiserum.
Indirektni RIF je dvostopenjska reakcija, pri kateri se antigen najprej veže s serumom neoznačene vrste, nato pa nastali imunski kompleks antigen-protitelo obdelamo s FITC-označenim antiserumom, ki vsebuje protitelesa proti imunoglobulinu tega kompleksa. Običajno se na stopnji I njegove formulacije kot serum vrste uporablja imunski kunčji serum, pridobljen z imunizacijo živali z ustreznim mikroorganizmom, na stopnji II pa s FITC označen anti-kunčji serum oslov ali drugih živali, imuniziranih s kunčjimi gama globulini ( Slika 9).
Neposredna nastavitev RIF. Na nemastnem predmetnem stekelcu se naredijo tanki brisi iz preiskovanega materiala, brisi-odtisi pa iz organov in tkiv. Pripravke posušimo, fiksiramo, nanje nanesemo luminiscenčni serum, vzet v delovni razredčini, in postavimo v vlažno komoro pri temperaturi 37 ° C za 20-30 minut (za 25-40 minut - pri sobni temperaturi). Nato za odstranitev odvečnih fluorescenčnih protiteles pripravek 10-15 minut speremo v pufrirani izotonični raztopini natrijevega klorida, čemur sledi 10-minutno izpiranje v destilirani ali tekoči vodi. Posušite pri sobni temperaturi in preglejte pod fluorescenčnim mikroskopom z oljnim potopnim sistemom.
Za oceno intenzivnosti specifične fluorescence bakterijskih celic se uporablja lestvica s štirimi plusi: "++++", "+++" - zelo svetlo in svetlo; "++", "+" - izrazita in šibka debela zelena fluorescenca celic. Obvezne so tri kontrole: 1) tretiranje s fluorescentnimi protitelesi homolognih bakterij (pozitivna kontrola); 2) heterologna kultura (negativna kontrola); 3) neokužen material (negativna kontrola).
Antikomplementarni RIF. Reakcija je modifikacija CSC, pri kateri antikomplementarna protitelesa, označena s FITC, služijo kot indikatorski sistem (slika 10).
Posredni anti-komplementarni RIF je nastavljen na naslednji način: pripravek antigena pripravimo na stekelcu, kot pri RIF, vendar na stopnji I ne obdelamo z enim imunskim serumom, temveč z njegovo mešanico s komplementom morskega prašička, na stopnji II. z antiserumom, ki vsebuje s FITC označena protitelesa za komplement. Razširjena uporaba anti-komplementarnih RIF je omejena zaradi težav pri pridobivanju anti-komplementarnih protiteles in načina njihovega "označevanja".