Opća shema bakteriološke dijagnostike. Faze metode bakteriološkog istraživanja
20. Karakteristike metode bakteriološkog istraživanja
Kulturološka (bakteriološka) metoda istraživanja - skup metoda usmjerenih na izolaciju i identifikaciju čistih kultura mikroorganizama (bakterija) uzgojem na hranljivim podlogama.
Čista kultura je skup mikroorganizama iste vrste. Najčešće se čista kultura dobiva odabirom i uzgojem izolirane kolonije (potomak jedne mikrobne ćelije).
Koraci metode:
1. Zbirka materijala za istraživanje.
2. Izolacija čiste kulture i njena identifikacija.
3. Zaključak.
Zbirka materijala za istraživanje. Vrsta materijala koji se proučava zavisi od svrhe studije (dijagnoza - od pacijenta; epidemiološka analiza - od okoline, hrane, pacijenta i (ili) nosioca bakterije).
Izolacija čiste kulture. Uključuje 3 ili 4 faze:
1. Zasijavanje materijala (nakon preliminarne mikroskopije) na čašu sa gustom hranljivom podlogom (po mogućnosti diferencijalno dijagnostičkom ili selektivnom) kako bi se dobile izolovane kolonije. Proizvodi se najčešće metodom mehaničke separacije. U nekim slučajevima (na primjer, krv), materijal je prethodno zasijan u tečnom mediju za obogaćivanje, nakon čega slijedi subkultura na ploči s agar podlogom. Ponekad se prije inokulacije provodi selektivna obrada materijala (uzimajući u obzir svojstva izoliranog mikroorganizma; na primjer, tretman kiselinom ili alkalijom za izolaciju rezistentnih bakterija). Uzgaja se na temperaturi od 37°C 18-24 sata. Vrijeme kultivacije za različite vrste bakterija može varirati.
2(3): a) proučavanje kolonija na agar ploči (kulturne osobine), odabir najtipičnijih; b) priprema briseva iz ovih kolonija bojenjem (prema Gramu ili drugim metodama); a) odstranjivanje ostatka proučavane kolonije na akumulacionom mediju i uzgoj u termostatu na optimalnoj temperaturi.
3(4). Ispitivanje čistoće kulture dobijene na akumulacionom mediju. S ovim
svrha je priprema razmaza, mrlja (obično po Gramu), mikroskopsko proučavanje
morfološka i tinktorijalna homogenost (u različitim vidnim poljima).
4(5). Identifikacija čiste kulture.
Zaključak. Prema ukupnosti osobina u poređenju sa svojstvima referentnih (tipičnih) sojeva, naznačena je vrsta mikroorganizma izolovanog iz materijala.
Metoda evaluacije:
prednosti: relativno visoka osjetljivost i tačnost, sposobnost određivanja broja mikroba u ispitivanom materijalu, kao i osjetljivost na antibiotike; ograničenja: relativnog trajanja, metoda je skupa.
21. Hranjive podloge za aerobe i anaerobe. Zahtjevi za hranljive podloge, klasifikacija.
Zahtjevi:
mediji moraju biti hranljivi
mora imati određeni ph
mora biti izotoničan, tj. osmotski pritisak u medijumu mora biti isti kao u ćeliji.
treba biti vlažan i ne previše tekući
mora imati određeni redoks potencijal
mora biti sterilna
moraju biti ujedinjeni, tj. sadrže konstantne količine pojedinačnih sastojaka.
Hranljive podloge se mogu podijeliti na:
A) Poreklo
1) prirodna - prirodna hrana (meso, mleko, krompir);
2) umjetni - posebno pripremljeni za uzgoj mikroba: - podloge od prirodnih proizvoda (mesna voda, mesno-peptonski bujon (MPB), mesno-peptonski agar (MPA), - bez stalnog sastava; - sintetičke hranljive podloge - rastvori strogo određene količine soli, aminokiselina, azotnih baza, vitamina u destilovanoj vodi - imaju konstantan sastav, koriste se za uzgoj mikroorganizama i ćelijskih kultura u proizvodnji vakcina, imunoloških seruma i antibiotika;
B) Po dogovoru:
1) opšte namene (MPB, MPA) - većina mikroba raste na njima;
2) elektivni - selektivno podstiču rast jedne vrste mikroba iz mješavine (na primjer, žumančano-solni agar za stafilokoke);
3) diferencijalna dijagnostika - omogućavaju da se jedna vrsta mikroba razlikuje po izgledu okoline od drugih (na primjer, Endo, Levin medij za crijevnu grupu mikroba).
Osim toga, ovisno o svrhe upotrebe U shemi za izolaciju čistih kultura, prema namjeni se mogu razlikovati sljedeći mediji:
1) obogaćivanje - inhibiraju rast mikroba povezanih sa patogenom;
2) dobijanje izolovanih kolonija;
3) akumulacija čiste kulture;
B) Konzistentnost:
1) tečnost;
2) polutečni (sa dodatkom agar-agara u koncentraciji 0,5-0,7%);
3) gusta - iznad 1%.
Suština bakterioskopske metode: otkrivanje mikroba u ispitivanom materijalu; proučavanje njihovih morfoloških i tinktorijalnih svojstava, prirode lokacije u bakteriološkom razmazu u vidnom polju.
Tehnika izvođenja. Materijal od pacijenta se vizualno proučava, odabire se dio u kojem se uzročnik bolesti (grudice sluzi, gnojni čepovi) može otkriti s najvećim stupnjem vjerovatnoće. Nanosi se na predmetno staklo (ponekad se materijal prethodno emulgira u fiziološkom rastvoru, rjeđe centrifugira). Kap se raširi po staklu, osuši i fiksira. Nakon toga, bris se boji i preparat se posmatra pod mikroskopom. Bris je obično obojen po Gramu. Ponekad se, kao najnježnija, koristi jedna od jednostavnih metoda bojenja, tada se preparat boji jednom bojom (na primjer, u dijagnostici meningokokne infekcije, kolere).
Po potrebi se koriste posebne kompleksne metode bojenja, kao što je Burri-Gins metoda za detekciju kapsularnih mikroorganizama ili Ziehl-Neelsen metoda za detekciju prisutnosti bakterija otpornih na kiselinu. U nekim slučajevima (posebno pri proučavanju motoričke aktivnosti mikroorganizama) pripremaju se preparati "viseće kapi" i "zgnječene kapi" i mikroskopiraju neobojene bakterije.
Prednosti bakterioskopske metode: jednostavnost izvođenja, mogućnost brzog dobijanja rezultata, tehnička i ekonomska dostupnost.
Nedostaci metode: za određivanje vrste mikroorganizama često nije dovoljno odrediti njegove morfološke osobine, jer su identične kod predstavnika srodnih vrsta. Osim toga, bakterije karakteristične morfologije često prolaze kroz promjene, posebno pod djelovanjem antibiotika, i postaju neprepoznatljive; Konačno, koncentracija patogena u ispitivanom materijalu može biti izuzetno niska i tada ih je teško otkriti.
S obzirom na navedeno, bakterioskopska metoda se rijetko koristi kao jedini i konačni način utvrđivanja etiologije bolesti. Češće se koristi kao indikativno, preliminarno, au dijagnostici nekih zaraznih bolesti uopće nije predviđeno.
Kako razumjeti orijentaciju i preliminarno? Ovo se odnosi na kliničara i bakteriologa. Kliničar, dobivši preliminarni odgovor (pozitivan ili negativan), u većoj ili manjoj mjeri koristi dobijene informacije u svojim daljim studijama dok se ne dobije konačni rezultat bakteriološke dijagnostičke metode. Dobivši približne informacije o sumnjivom patogenu, njegovoj koncentraciji u korištenom materijalu i prisutnosti prateće mikroflore, bakteriolog određuje metode obrade materijala i izolacije čiste kulture patogena, odabire hranjive podloge za naknadnu kultivaciju.
Bakteriološka metoda
Suština metode je izolacija čiste kulture mikroba - patogena iz patološkog materijala, detaljno proučavanje njegovih morfoloških, tinktorijalnih, kulturnih, biohemijskih, seroloških svojstava s ciljem naknadne identifikacije patogena. Prilikom primjene bakteriološke metode istraživanja razlikuju se 4 faze.
A. Uzimajući u obzir podatke dobijene tokom bakterioskopskog pregleda, vrši se odabir najefikasnijih hranljivih podloga na kojima će se, sa najvećim stepenom verovatnoće, moći dobiti rast kulture navodnih mikroba - patogena. .
B. Ispitni materijal se sije na brojne hranljive podloge: tečne i čvrste, univerzalne, elektivno-selektivne, diferencijalno dijagnostičke. Istovremeno, sjetva na Petrijeve posude s gustim hranjivim podlogama vrši se bakteriološkom petljom s potezom kako bi se osigurala mogućnost rasta kolonija mikroba izoliranih jedna od druge (možete koristiti i metodu Drygalsky ili neku drugu metoda odvajanja kultura mikroorganizama).
A. Proučavaju se kulturološka svojstva mikroorganizama uzgojenih na hranljivim podlogama; odabiru se sumnjive kolonije. Treba naglasiti da je odabir sumnjivih kolonija najvažnija i najteža faza rada. Temelji se prvenstveno na određivanju karakterističnih osobina kolonija mikroba, ali često to ne omogućava razlikovanje kolonija mikroba pojedinih vrsta te je potrebno dodatno proučavati morfologiju mikroba u razmazima iz sumnjivih kolonija, karakteristike rasta mikroorganizama na diferencijalno dijagnostički mediji itd. Izolacija čistih kultura bakterija i njihovo proučavanje može se provesti preliminarnom inokulacijom na tekućim akumulacijskim podlogama, ali se u tom slučaju troši dodatno vrijeme istraživanja.
B. Od sumnjivih kolonija se priprema bakteriološki bris, obojen po Gramu i mikroskopski (utvrđuje se identitet mikroorganizama sa ispitanima mikroskopskim pregledom u 1. fazi). C. Iz ostatka sumnjive kolonije, kultura se prenosi na mesno-peptonski agar (mogu se koristiti i druge hranljive podloge na kojima se očekuje dobar rast izolovanih mikroorganizama). Cilj je akumulacija čiste kulture mikroba - navodnog uzročnika bolesti, jer. u sljedećoj fazi studije bit će potrebno mnogo mikrobne mase.
Predloženi patogen se proučava saharolitičkim svojstvima (inokulacija se vrši na šarenim podlogama, Olkenitsky, Ressel, itd.), proteolitičkom aktivnošću (inokulacija na želatinu, mlijeko prema Tukaevu, određivanje stvaranja indola i sumporovodika tokom rasta na mesno-peptonski bujon). Proučava se osjetljivost izoliranih kultura na antibiotike (češće metodom standardnih papirnih diskova, rjeđe metodom serijskih razrjeđenja). Serotipizacija se vrši u reakciji aglutinacije na staklu sa grupnim i tipičnim dijagnostičkim serumima; tipizacija faga standardnim dijagnostičkim bakteriofagima. U nekim slučajevima, faktori patogenosti u bakterijama se proučavaju radi identifikacije.
Rezultati sprovedenog istraživanja se uzimaju u obzir. Na osnovu poređenja svojstava identifikovanih kod mikroorganizama (morfoloških, tinktorijalnih, kulturnih, biohemijskih, seroloških, itd.), mikrobi se identifikuju. Konačan odgovor daje se rezultatima bakteriološke studije, koja ukazuje na vrstu patogena (ponekad njegov serotip, biovar, tip faga) i njegovu osjetljivost na antibiotike.
Vrlo često, da bi se dobili pouzdani rezultati, izdavanju odgovora prethode biološke, alergološke ili druge metode istraživanja.
Prednosti bakteriološke dijagnostičke metode: visoka pouzdanost rezultata istraživanja; mogućnost dobivanja dodatnih podataka o osjetljivosti izoliranih patogena na antibiotike; mogućnost izvođenja epidemioloških studija.
Na nedostatke metode može uključiti trajanje studije (najmanje 4-5 dana), kao i nemogućnost njegove upotrebe u slučajevima kada patogeni (na primjer, rikecije, klamidija) infekcije ne rastu na umjetnim hranjivim podlogama.
biološka metoda
U nekim slučajevima, radi optimizacije dijagnoze zaraznih bolesti, koristi se biološka metoda (biotest) koja uključuje inficiranje laboratorijskih životinja. U ovom slučaju, istraživač može imati različite ciljeve:
Reprodukcija kliničke i patoanatomske slike bolesti (na primjer, u dijagnozi tetanusa, leptospiroze);
Izolacija u kratkom vremenu čiste kulture patogena (u dijagnozi pneumokokne infekcije);
Određivanje virulencije i patogenosti patogena (u dijagnostici tuberkuloze);
Određivanje vrste i vrste toksina (u dijagnozi botulizma)
Za dijagnosticiranje zaraznih bolesti koriste se razne životinje. Njihov izbor je određen osjetljivošću vrste na različite etiološke agense. Na primjer, miševi su osjetljivi na pneumokoknu infekciju, antraks, tetanus; zamorci - uzročnicima tuberkuloze, bruceloze, tularemije; zečevi - do stafilokoka, streptokoka, botulizma. Za istraživanje su odabrane samo zdrave životinje određene starosti i tjelesne težine.
Prije uvođenja materijala životinje se fiksiraju. Male životinje drži eksperimentator, za velike životinje koriste se posebni uređaji. Mjesto ubrizgavanja inficiranog materijala tretira se alkoholom ili jodom. Inficirani materijal se ubrizgava, ovisno o patogenezi bolesti koja se proučava, subkutano, kožno, intravenozno, intraperitonealno, intracerebralno itd.
At kožna metoda infekcije prethodno režu vunu, skarifikuju kožu, a zatim utrljaju materijal u nju.
Subkutana metoda: koža životinja se uhvati u nabor, najbolje pincetom, igla se zabode do pola, nakon injekcije se nanese pamučni štapić sa alkoholom i igla se izvadi.
Intramuskularna metoda: materijal se ubrizgava u mišićno tkivo gornjeg dijela stražnjeg ekstremiteta.
Intraperitonealna metoda:životinja se drži naopačke kako ne bi ozlijedila crijeva. Injekcija se vrši u donji deo stomaka, sa strane srednje linije. Trbušni zid je probušen naglim pokretom, špric je pod pravim uglom.
Intravenska metoda: miševima, pacovima se ubrizgava materijal - u repnu venu ili intrakardijalno. Zecu se ubrizgava - u ušne vene, koje su površno locirane i jasno vidljive (bolje je probušiti vanjsku venu). Mjesto uboda nakon injekcije stegne se vatom sa alkoholom kako ne bi došlo do krvarenja. Zamorčićima sa intrakardijalnom infekcijom ubrizgava se igla u visini "šok" srca u interkostalni prostor. Ako je igla pravilno umetnuta, u špricu će se pojaviti krv.
Priprema alata i materijala: špricevi, skalpeli, igle steriliziraju se kuhanjem. Materijal se uvuče u špric (malo više nego što je potrebno za ulazak), okrene se okomito prema gore, iglu prekrije sterilnom vatom i klipom izgura mjehuriće zraka iz šprica. Ova manipulacija se izvodi preko dezinfekcionog rastvora.
Prilikom dijagnosticiranja infekcija uzrokovanih djelovanjem toksina (botulinum, antraks), materijal koji vjerojatno sadrži uzročnik i toksine stavlja se u fiziološki rastvor, a zatim filtrira kroz papirni filter natrljan talkom (dobro adsorbira toksin). Osetljive životinje se inficiraju brisevima filtera. U nekim slučajevima, kada je patogeneza bolesti uzrokovana patogenim svojstvima samog patogena, životinje su zaražene mikrobnom suspenzijom.
Zaraženi bijeli miševi se označavaju i stavljaju u posebne staklene tegle; zalijepljene su etiketom na kojoj je naznačen datum zaraze i vrsta mikroorganizma s kojim je obavljen posao. Na isti način se potpisuju kavezi sa zaraženim zečevima ili zamorcima. Životinje se posmatraju. U slučaju smrti, odmah se otvaraju.
Prije seciranja bijelih miševa, životinje se prethodno eutanaziraju eterskim parama. Miševi se nakratko urone u otopinu za dezinfekciju, a zatim fiksiraju u kivetu sa trbuhom nagore uz šape. Uočava se prisustvo ili odsustvo vanjskih patoloških promjena. Rez kože se vrši uzdužno od pubisa do donje vilice i poprečno prema ekstremitetima. Primjećuju se promjene u tkivu kože i stanju limfnih čvorova. Od potonjeg napravite mrlje-otiske. Da bi se pregledala grudna šupljina, grudna kost se uklanja tako što se makazama zarezuju rebra s obje strane. Nakon eksternog pregleda, komadići srca se odrežu i stavljaju u BCH. Setva se vrši direktno na MPA bris-otiske iz srca, pluća.
Otvara se trbušna šupljina, eksternim pregledom se konstatuje stanje unutrašnjih organa (veličina, boja, konzistencija, prisustvo gnojnih žarišta). Uradite useve jetre, slezine i otiske mrlja.
Rad se obavlja sterilnim instrumentima, nakon svakog uzimanja organa pinceta i makaze se spuštaju u čašu alkohola i spaljuju.
Nakon obdukcije, leš i kiveta u kojoj je obavljena obdukcija se jedan dan prelije dezinfekcijskim sredstvom.
Usjevi se inkubiraju 24 sata (ili više ako je potrebno) na
t 37 oko C. Zatim se pregledavaju, izoluje se čista kultura patogena i vrši se njena identifikacija bakteriološkom metodom.
Prednosti metode: pouzdanost dobijenih rezultata, nema potrebe za složenom opremom.
Nedostaci: visoka cijena, ograničena upotreba, rizik od infekcije.
Slične informacije.
CILJ:
1. Metode istraživanja za izolaciju čistih kultura bakterija
2. Savladati bakteriološku metodu dijagnostike zaraznih bolesti.
TEORIJSKA REFERENCA
Bakteriološka metoda je glavna metoda za dijagnosticiranje zaraznih bolesti. Njegova suština je određivanje vrste infektivnog agensa, pa se na osnovu rezultata bakteriološke metode može postaviti etiološka (konačna) dijagnoza. Glavni nedostatak metode je trajanje studije - od 3 do 5 dana, au nekim slučajevima i više.
Uspjeh bakteriološke metode u velikoj mjeri ovisi o preliminarnoj fazi, uključujući uzimanje uzorka materijala za ispitivanje i njegov transport, te osmišljavanje upućivanja u bakteriološku laboratoriju. U tom slučaju se moraju poštovati brojna pravila.
1. Ograda test materijala mora se izvršiti prije početka antibiotske terapije ili 8-10 sati nakon posljednje doze antibiotika. Da bi se izbjegla kontaminacija uzorka mikroflorom okoline, potrebno je pridržavati se najstrože asepse. Za to koristite sterilni materijal: a) pamučne štapiće za uzimanje materijala iz rane, sa sluzokože (oči, ždrijelo, nos); b) žičana omča za vađenje materijala iz vagine, anusa; c) špric za vađenje krvi, gnoja; d) sterilne posude za direktno sakupljanje urina, sputuma, fecesa u njega.
2. Prijevoz Primljeni materijal treba proizvesti što je prije moguće (2-3 sata) u posebnim biciklima ili pernicama.
3. Smjer priložen uz klinički uzorak kao prateći dokument. Sadrži osnovne informacije potrebne za provođenje mikrobiološke studije:
Prezime, ime, patronim, starost pacijenta;
Predložena dijagnoza bolesti;
Prethodna antimikrobna terapija;
Priroda materijala;
Datum i vrijeme preuzimanja materijala;
Svrha studije;
Naziv zdravstvene ustanove, broj odjeljenja, odjeljenja;
Potpis ljekara.
Bakteriološka metoda se izvodi u dvije faze (slika 2.1.):
1. Izolacija čiste kulture patogena (1-2 dana);
2. Identifikacija čiste kulture (1-3 dana).
U prvoj fazi, ispitni materijal se sije na čvrstu ili tečnu hranljivu podlogu, procjenjuju se kulturna svojstva, odabiru sumnjive kolonije i pregledavaju na kosom agaru. Faza identifikacije uključuje obavezno proučavanje morfologije, biohemijskih svojstava i antigenske strukture izolirane čiste kulture, kao i dodatne studije za određivanje osjetljivosti na antibiotike, osjetljivosti na fage, tipizaciju faga, patogenosti i perzistentnih svojstava.
PITANJA ZA PRIPREMU:
1. Pravila prikupljanja i transporta test materijala za bakteriološko ispitivanje.
2. Pravila za izdavanje uputa za bakteriološko ispitivanje.
3. Metode izolacije čistih kultura mikroorganizama.
4. Bakteriološka dijagnostička metoda. Target. Faze. dijagnostička vrijednost.
SAMOSTALNI PLAN RADA:
1. Proučiti tabele "Metode izolacije čistih kultura bakterija" i "Izolacija i identifikacija čistih kultura".
2. Izolirati čistu kulturu iz mješavine bakterija i izvršiti njenu identifikaciju - savladati bakteriološku dijagnostičku metodu (1. rad)
4.2. BIOLOŠKI I MIKROBIOLOŠKI FAKTORI
Bakteriološka dijagnostika trbušnog tifusa i paratifusa A, B i C
Datum uvođenja: od trenutka odobrenja
1. RAZVIJENO: FGUN St. Petersburg NIIEM im. Pasteur iz Rospotrebnadzora (L.A. Kaftyreva, Z.N. Matveeva, G.F. Trifonova); GOUVPO "Državna medicinska akademija Sankt Peterburga po imenu I.I. Mečnikova" Federalne agencije za zdravstvo i socijalni razvoj (A.G. Boytsov).
3. ODOBRENO od strane šefa Federalne službe za nadzor zaštite prava potrošača i dobrobiti ljudi, glavnog državnog sanitarnog doktora Ruske Federacije G.G. Oniščenko 29. decembra 2007. 0100/13745-07-34
4. UVEDENO od trenutka odobrenja.
5. PREDSTAVLJENO PRVI PUT.
1 područje upotrebe
1 područje upotrebe
1.1. Smjernice utvrđuju osnovne principe i karakteristike bakteriološke dijagnoze trbušnog tifusa i paratifusa A, B i C; sadrži savremene informacije o biološkim svojstvima patogena, otpornosti na antibakterijske lijekove, hranjivim podlogama za njihovu izolaciju i karakteristikama diferencijacije tifusnih i paratifusnih patogena od drugih seroloških varijanti salmonele.
2. Spisak skraćenica
ABP - antibakterijski lijek
BCA - bizmut sulfit agar
MPU - medicinsko-preventivna ustanova
MIC - minimalna inhibitorna koncentracija
P - srednji
U - stabilan
H - osetljiv
RIF - reakcija imunofluorescencije
CNS - centralni nervni sistem
u tabelama:
"+" - pozitivna reakcija prvog dana;
"-" - negativna reakcija 4-20 dana;
"(+)" - odgođena pozitivna reakcija 2-20 dana;
d - razne enzimske reakcije.
Moguća je diferencijacija u enzimske varijante.
3. Opće odredbe
3.1. Trbušni tifus i paratifus A, B i C su antroponotske crijevne infekcije uzrokovane Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi B i Salmonella Paratyphi C. rijetko - paratifusom C.
3.2. Bolesti karakterišu ulcerozne lezije limfnog sistema tankog creva, bakterijemija, groznica, ciklični klinički tok sa teškom intoksikacijom, rozeolozni osip na koži tela, hepato- i splenomegalija. Zatvor je češći od dijareje. Ulceracija Peyerovih zakrpa ileuma u oko 1% slučajeva dovodi do crijevnog krvarenja i perforacije crijeva sa najnepovoljnijim posljedicama za pacijenta.
3.3. Dijagnoza trbušnog tifusa i paratifusa A, B i C postavlja se na osnovu kliničkih znakova bolesti, uzimajući u obzir epidemiološku anamnezu i podatke iz sveobuhvatnog laboratorijskog pregleda, koji uključuje klasične bakteriološke i serološke metode. Bakteriološka dijagnostika je od prioritetnog značaja, jer u ovom slučaju moguće je dobiti najpotpunije informacije o biološkim svojstvima patogena, uključujući njegovu osjetljivost na antibakterijske lijekove.
3.4. Upotreba antimikrobnih lijekova za etiotropnu terapiju trbušnog tifusa i paratifusa, s jedne strane, smanjila je mortalitet sa 10-20% na manje od 1%, a s druge strane, otežala laboratorijsku dijagnostiku, jer. često se uzorkovanje materijala za laboratorijska istraživanja provodi nakon početka antibiotske terapije. Zbog ove činjenice potrebno je pažljivije pristupiti pitanju odabira materijala za istraživanje, uzimanja materijala koji se proučava i tehnika istraživanja.
3.5. Moderna karakteristika epidemiologije trbušnog tifusa je naglo povećanje učestalosti uvoza (prenošenja) infekcije sa teritorija endemskih za ovu bolest, zemalja bližeg i daljeg inostranstva, kao i infekcija ruskih stanovnika pri odlasku u ove zemlje i u procesu migracije unutar zemlje. Druga karakteristika je prisustvo velikog kontingenta visokog epidemiološkog rizika u vidu osoba bez određenog mjesta stanovanja, među kojima je zabilježena visoka učestalost trbušnog tifusa.
3.6. Ove smjernice su sastavljene u cilju objedinjavanja metoda bakteriološke dijagnostike trbušnog tifusa i paratifusa A, B i C, kao i ispravnog tumačenja rezultata laboratorijskog istraživanja, uzimajući u obzir savremene karakteristike klinike, tretman i epidemiološka situacija u pojedinim područjima.
4. Indikacije za bakteriološku dijagnostiku
Indikacija za bakteriološko ispitivanje biološkog materijala na prisustvo uzročnika trbušnog tifusa i paratifusa A, B i C je potreba za pregledom:
4.1) pacijenti sa sumnjom na trbušni tifus, kao i sa groznicom nepoznate etiologije, koja traje 5 i više dana;
4.2) lica koja su imala kontakt sa bolesnicima od trbušnog tifusa i paratifusa A, B, C;
4.3) zaposleni u određenim strukama, industrijama i organizacijama po prijemu na posao i prema epidemiološkim indikacijama;
4.4) lica prije prijema u bolnice i specijalizirane sanatorije prema kliničkim i epidemiološkim indikacijama;
4.5) lica po prijavi za stacionarno liječenje u bolnicama (odjelima) psihoneurološkog (psihosomatskog) profila, domovima za starije osobe, internatima za osobe sa hroničnim mentalnim bolestima i lezijama CNS-a i drugim vrstama ustanova zatvorenog tipa sa danonoćnim ostati;
4.6) bolesnici sa trbušnim tifusom i paratifusom nakon nestanka kliničkih simptoma bolesti prije otpusta iz bolnice;
4.7) lica koja su oboljela od trbušnog tifusa i paratifusa tokom dispanzerskog pregleda;
4.8) hronični nosioci bakterija identifikovani kod zaposlenih u određenim profesijama, delatnostima i organizacijama, pri ponovnom zapošljavanju u tim preduzećima i objektima;
4.9) materijal za presjek u slučaju sumnje na trbušni tifus i paratifus.
5. Logistika metode
5.1. Standardna ispitna i pomoćna oprema, mjerni instrumenti za mikrobiološke laboratorije.
5.2. Hranjive podloge, dijagnostički serumi i hemijski reagensi za uzgoj, izolaciju, identifikaciju i određivanje osjetljivosti na antibakterijske lijekove uzročnika trbušnog tifusa i paratifusa A, B i C.
5.3. Za laboratorijsku dijagnostiku bolesti tifusa i paratifusa i otkrivanje nosilaca bakterija treba koristiti hranjive podloge i reagense odobrene za upotrebu na teritoriji Ruske Federacije u skladu sa utvrđenom procedurom.
6. Laboratorijska dijagnostika tifusa i paratifusa
6.1. Princip bakteriološke metode zasniva se na otkrivanju živih mikroorganizama u različitim biološkim supstratima (krv, urin, feces, žuč, koštana srž, rozeola) u zavisnosti od stadijuma bolesti. Da bi se to postiglo, određena količina biološkog materijala se sije na posebne hranljive podloge, nakon čega slijedi inkubacija u termostatu i identifikacija uzgojenih kolonija mikroorganizama karakterističnih za S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B i S. Paratyphi C, prema kulturnim i enzimskim svojstvima i antigenskim karakteristikama.
6.2. Samo bakteriološka studija može dati tačnu etiološku dijagnozu i kontrolu oslobađanja organizma od patogena. Što se tiče diferencijalne dijagnoze trbušnog tifusa i paratifusa, jedina metoda je laboratorijsko ispitivanje biološkog materijala sa izolacijom uzročnika i njegovom identifikacijom do nivoa serološke varijante, jer klinički tok infektivnog procesa ne omogućava uvijek razlikovanje ovih nozoloških oblika.
7. Bakteriološki pregled
7.1. Izolacija uzročnika trbušnog tifusa i paratifusa A, B i C vrši se prema istoj shemi bakteriološkog ispitivanja biomaterijala.
7.2. Postupak prikupljanja materijala za laboratorijske pretrage na bolesti tifusa i paratifusa određen je SP 3.1.1.2137-06.
7.3. Tehnika prikupljanja i transporta biomaterijala u mikrobiološke laboratorije opisana je u MU 4.2.2039-05.
7.4. Materijal za bakteriološko ispitivanje u svrhu dijagnosticiranja trbušnog tifusa i paratifusa su:
krv;
excreta;
urin;
Patogeni se takođe mogu izolovati iz:
roseol;
koštana srž;
majčino mleko.
Materijal za bakteriološka istraživanja u cilju identifikacije nosilaca bakterija, prema SP 3.1.1.2137-06, su:
excreta;
urin;
žuč (duodenalni sadržaj).
7.5. Proučavanje sekcionog materijala provodi se kako bi se razjasnila dijagnoza.
7.6. Prikupljanje biološkog materijala za laboratorijska istraživanja vrši se prije početka etiotropnog liječenja: od strane medicinskog radnika koji sumnja na tifusno-paratifusnu infekciju; u slučaju grupnog i epidemijskog morbiditeta - od strane stručnjaka institucija Rospotrebnadzora i osoblja zdravstvenih ustanova. Od hospitalizovanih pacijenata uzima se materijal za bakteriološko ispitivanje u Hitnoj pomoći bolnice.
7.7. Od lica koja su komunicirala sa pacijentima ili nosiocima (kontakti), prikupljanje materijala vrše medicinski radnici zdravstvenih ustanova i drugih organizacija i ustanova na mjestu identifikovanja pacijenata.
7.8. Biomaterijal za laboratorijska istraživanja prati poseban smjer. Nije dozvoljena dostava materijala od strane samih subjekata. Ako je pravovremena dostava materijala nemoguća, koriste se konzervansi i transportna sredstva (tabela 1).
8. Bakteriološki test krvi
Indikacija za analizu krvi je sumnja na tifusno-paratifusnu bolest ili febrilno stanje nepoznatog porekla (groznica nepoznatog porekla), posmatrano 5 ili više dana (SP 3.1.1.2137-06).
Odnos krv - hranljiva podloga treba da bude 1:10-1:60. Broj samostalno uzetih uzoraka krvi i vrijeme njihovog uzimanja određuje ljekar prema MU 4.2.2039-05 za groznicu nepoznatog porijekla ili prema MU 04-723/3 Ministarstva zdravlja SSSR-a ( 1984) za sumnju na tifusno-paratifusnu bolest. Kod pacijenata koji primaju antibakterijske lijekove, uzorke treba uzeti neposredno prije uvođenja (prijema) sljedeće doze lijeka.
U prisustvu groznice, optimalno je vaditi krv na pozadini povećanja tjelesne temperature (ali ne na vrhuncu temperature!). Sjetva na hranljive podloge vrši se direktno uz bolesnikov krevet.
Ako se sumnja na tifusno-paratifusnu bolest, za hemokulturu se može koristiti Rapoport medijum, 20% žučni bujon, mesno-peptonski bujon sa dodatkom 1% glukoze (u bočicama od 100 ml). Ranije korištene hemokulture u sterilnoj destilovanoj (česmovoj) vodi. Međutim, poželjno je koristiti posebne podloge za hemokulturu.
Količina posijane krvi na visini groznice može biti 10 ml, kasnije - do 20 ml (kod djece - do 5 ml).
Za povišenu temperaturu nepoznatog porijekla koja traje duže od 5 dana, po pravilu treba pregledati više uzoraka krvi. Uzimanje krvi iz vene vrši se prema MU 4.2.2039-05. Ovo je neophodno kako bi se razlikovala prava bakteriemija od slučajne kontaminacije krvi tokom punkcije vene (vjerovatnoća kontaminacije uzorka zbog slučajnog uboda lojne ili znojne žlijezde je 3%). U ovom slučaju za hemokulturu se koriste dvije podloge: 1) podloga za aerobne i fakultativne anaerobne i 2) podloga za obavezne anaerobne (npr. "dupla" podloga + tioglikolna podloga prema naredbi Ministarstva zdravlja SSSR-a od 12.04.85 N 535) ili univerzalni medij za aerobe i anaerobe.
Poželjno je koristiti industrijski proizvedene medije odobrene za upotrebu u Rusiji.
Usjevi se inkubiraju na 37 °C 10 dana uz svakodnevnu kontrolu. U ovom slučaju, bočice sa "dupli" medijumom se naginju, ispirajući gusti deo medijuma.
U nedostatku znakova rasta 10. dana, daje se negativan odgovor.
Ako postoje znaci rasta (zamućenje, crvenilo Rapoportove podloge, pojava vidljivih kolonija na gustom dijelu "duple" podloge), sjetva se vrši paralelno na polikarbohidratnu podlogu i gustu podlogu u Petrijeve zdjelice ( krvni agar u slučaju groznice nepoznatog porijekla i Endo podloga u slučaju sumnje na bolest tifusnog paratifusa).
Direktno zasijavanje na polikarbohidratnu podlogu provodi se kako bi se smanjilo vrijeme istraživanja, na temelju pretpostavke da će se, kada se uzgaja krv, s velikom vjerojatnošću uočiti rast monokulture patogena. Paralelno postavljanje na Endo podlogu ili krvni agar je neophodno za kontrolu ove pretpostavke i izolaciju čiste kulture cijepanjem pojedinačnih kolonija.
Ako se na ovim podlogama uoči rast monokulture, tada se mogu uzeti u obzir biohemijska svojstva polikarbohidratne podloge. Za kontrolu čistoće kulture potrebno je napraviti mikroskopiju razmaza iz polikarbohidratne podloge obojene po Gramu. U ovoj fazi je također moguće postaviti reakciju aglutinacije na staklu s odgovarajućim aglutinirajućim serumima O- i H-salmonele i dati preliminarni odgovor.
Shema bakteriološkog pregleda krvi pacijenata sa sumnjom na trbušni tifus i paratifus prikazana je na Sl.1.
Fig.1. Shema bakteriološkog pregleda krvi pacijenata sa sumnjom na tifus i paratifus
Fig.1. Shema bakteriološkog pregleda krvi pacijenata sa sumnjom na tifus i paratifus
Shema bakteriološkog pregleda krvi bolesnika s groznicom nepoznatog porijekla prikazana je na slici 2.
Fig.2. Šema bakteriološkog pregleda krvi pacijenata sa groznicom nepoznatog porekla
Fig.2. Šema bakteriološkog pregleda krvi pacijenata sa groznicom nepoznatog porekla
Tok dalje identifikacije kulture po kulturno-morfološkim, enzimskim svojstvima i serološkim karakteristikama opisan je dalje u odgovarajućim odjeljcima.
9. Bakteriološki pregled fecesa
Uzorci stolice uzimaju se odmah nakon defekacije iz dezinficirane i dobro oprane posude, na čije je dno stavljen list debelog čistog papira. Materijal se prikuplja pomoću kašike-lopatice postavljene na poklopac sterilne posude. U nedostatku posude sa lopaticom, za uzimanje materijala koristi se bilo koji sterilni instrument (sterilna drvena lopatica, žičana omča, kašika itd.). U prisustvu patoloških nečistoća potrebno je odabrati područja koja sadrže sluz, gnoj, ljuspice, ali bez krvi. Uzorci tečne stolice uzimaju se sterilnom plastičnom Pasteur pipetom sa zatvorenim rezervoarom.
Zapremina uzetog materijala mora biti najmanje 2 g. Optimalan materijal je uzeti materijal u slučaju ukrašene stolice - u količini oraha; u slučaju labave stolice, njen sloj u posudi treba da bude najmanje 1,5-2,0 cm.Materijal stavljen u sterilnu posudu dostavlja se u laboratoriju u roku od 2 sata.
Ukoliko se materijal ne može dostaviti u laboratoriju u roku od 2 sata, sakuplja se u konzervans (transportni sistem sa medijumom). Zapremina materijala ne smije biti veća od zapremine medija.
Stolica se mora pažljivo homogenizirati u mediju. Uzorci se mogu čuvati prije početka studije u toku dana u frižideru (4-6 °C).
Transportni mediji i konzervansi koji se koriste za izolaciju uzročnika trbušnog tifusa i paratifusa A, B i C, kao i drugih uzročnika akutnih crijevnih infekcija, prikazani su u tabeli 1.
Tabela 1
Transportni mediji i konzervansi koji se najčešće koriste za transport fekalija
|
Naziv okruženja |
Omogućava očuvanje |
|
Srijeda Carrie Blair |
svi enterički patogeni, uključujući Campylobacter |
|
Wednesday Ames |
sve enterobakterije |
|
Wednesday Stewart |
salmonela i šigela |
|
mješavina glicerina |
sve enterobakterije osim yersinia; preferirano za šigelu |
|
smjesa fosfatnog pufera |
sve enterobakterije |
|
rastvor boratnog pufera |
sve enterobakterije |
|
fiziološki rastvor |
sve enterobakterije, uključujući campylobacter |
Uzorci stolice uzeti direktno iz rektuma pomoću rektalnog brisa koriste se prvenstveno za objektivizaciju dijagnoze (MU 4.2.2039-05). Materijal preuzima paramedicinsko osoblje. Po pravilu, posebna sonda za uzimanje brisa je dio transportnog sistema. Važno je napomenuti da je prodiranje transportnih medija na sluznicu rektuma neprihvatljivo! Stoga, rektalni bris treba uroniti u transportni medij tek nakon uzimanja materijala. Od pacijenta se traži da legne na bok sa kukovima privučenim stomaku i razdvojenom stražnjicom s dlanovima ruku. Sonda za bris se ubacuje u anus do dubine od 4-5 cm i, lagano rotirajući oko ose, prikuplja se materijal iz kripti anusa. Pažljivo uklonite sondu za bris i uronite je u transportni medijum. Transport tampona bez medijuma nije dozvoljen.
U laboratoriji se inokulacija uzoraka stolice vrši direktno na guste diferencijalno dijagnostičke hranljive podloge i paralelno na podlogu za obogaćivanje.
Šema bakteriološkog pregleda fecesa prikazana je na sl.3.
Fig.3. Šema bakteriološkog pregleda fecesa
Fig.3. Šema bakteriološkog pregleda fecesa
Od prirodnog fecesa priprema se suspenzija u 0,9% rastvoru natrijum hlorida u omjeru 1:5-1:10, ostavlja se 30 minuta da se slegnu krupne čestice. Nakon toga, jedna kap supernatanta se inokulira u posude s gustim hranjivim podlogama i 1 ml suspenzije se inokulira u podlogu za obogaćivanje (omjer materijal-medij treba biti 1:5).
Izmet koji se dostavlja u laboratoriju u konzervansu (transportnom mediju) mora se pažljivo homogenizirati u mediju prije inokulacije, nakon čega se materijal direktno inokulira na čvrstu podlogu i podlogu za obogaćivanje u istim omjerima kao nativni izmet.
Uzorci stolice prikupljeni rektalnim brisom ispituju se na sličan način kao i stolica isporučena u konzervansu. Treba imati na umu da rektalni bris sadrži manje mikroorganizama u odnosu na nativnu stolicu, pa je potrebno povećati dozu inokuluma.
Maksimalna detekcija S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B i S. Paratyphi C u fecesu postiže se korišćenjem medija za obogaćivanje, iako se kod pacijenata u akutnom periodu bolesti patogen često izoluje direktnom inokulacijom. Inokulacija na podloge za obogaćivanje paralelno sa direktnom inokulacijom je obavezna!
Sve inokulacije se inkubiraju na 37 °C na diferencijalnoj dijagnostičkoj podlozi 18-24 sata, na bizmut-sulfitnom agaru 24-48 sati.Nakon 24 sata vrši se zasijavanje iz medija za obogaćivanje na čvrste podloge (bizmut-sulfitni agar ili Endo). srednje). Kolonije karakteristične za ove patogene, uzgojene na gustim podlogama, seku se na polikarbohidratnoj podlozi.
Treba napomenuti da tehnika širenja materijala po površini ploče s gustom podlogom treba osigurati rast izoliranih kolonija tipičnog tipa, koje se mogu koristiti za vizualnu procjenu kulturnih svojstava mikroorganizma.
Bizmut sulfitni agar (BCA) je poželjna metoda za izolaciju S. Typhi. Tipične kolonije S. Typhi su crne i okružene crnim ili smeđim obodom s metalnim sjajem. Međutim, S. Typhi često ne proizvodi karakteristično crnjenje ICA kada dođe do obilnog rasta, tako da ploče treba inokulirati kako bi se omogućio rast jedne kolonije.
Uzorci fekalija mogu se inokulirati na standardnim selektivnim podlogama za enterobakterije odobrene za upotrebu u Ruskoj Federaciji. Međutim, bizmut sulfit agar je poželjna metoda za izolaciju S. tymhi. Tok dalje identifikacije kultura prema enzimskim svojstvima i serološkim karakteristikama opisan je dalje u relevantnim odjeljcima.
10. Bakteriološki pregled urina
Urinokultura se radi za dijagnostiku od prvih dana bolesti pa do otpusta pacijenta, kao i radi identifikacije bakterionosioca. S obzirom na to da se tifus i paratifus izlučivanje patogena u urinu javlja periodično i na kratko, analize urina se moraju ponavljati u intervalima od 5-7 dana.
Morate se striktno pridržavati općih pravila za prikupljanje urina, navedenih u MU 4.2.2039-05. Bez obzira na način dobijanja urina, u laboratoriju se mora dostaviti u roku od 2 sata, au ekstremnim slučajevima urin se može čuvati preko noći u frižideru.
Treba imati na umu da, ovisno o kemijskom sastavu urina, bakterije u njemu mogu i umrijeti tijekom skladištenja i razmnožavati se.
Povećanje roka trajanja materijala može otežati tumačenje rezultata.
Direktna inokulacija urina (ili sedimenta nakon centrifugiranja) izvodi se bez prethodnog obogaćivanja prema naredbi Ministarstva zdravlja SSSR-a N 535 na gustim diferencijalnim dijagnostičkim medijima preporučenim za salmonelu, uključujući patogene tifusa i paratifusa. Istovremeno, nativni urin se inokulira u podloge za obogaćivanje dvostruke koncentracije u omjeru 1:1, ili se sediment urina inokulira u medij normalne koncentracije. Inokulacije se stavljaju u termostat na 37 °C 18-24 sata, a zatim se medij za obogaćivanje inokulira na gustu diferencijalnu dijagnostičku podlogu. Kolonije uzgojene na čvrstim podlogama identificirane su kulturno-enzimskim i serološkim svojstvima.
11. Bakteriološki pregled žuči (duodenalni sadržaj)
Žuč se sakuplja u tri sterilne epruvete ili sterilne jednokratne posude odvojeno u porcijama A, B, C prema MU 4.2.2039-05 i dostavlja u laboratoriju.
Provedite proučavanje svakog dijela (A, B, C) posebno ili pripremite mješavinu od tri porcije. Uzorci se inokuliraju:
na gustim diferencijalno dijagnostičkim medijima (ICA, Endo, EMS, itd.) u količini od 0,5 ml;
u epruvetu (bocu) sa hranljivom supom u omjeru 1:10. Nema potrebe za inokulacijom žuči na podloge za obogaćivanje, kao sama žuč je dobro leglo za patogene tifusa i paratifusa.
Inokulirani medij se inkubira sa ostacima žuči na 37°C.
Nakon 18-24 sata, inokulacije se ispituju na gustim hranljivim podlogama (rezultati rasta na ICA se uzimaju u obzir nakon 24 i 48 sati) i vrši se ponovno zasijavanje sumnjivih kolonija na polikarbohidratnu podlogu.
Od hranjivog bujona seje se na guste diferencijalno dijagnostičke podloge.
Iz preostale žuči u slučaju negativnog rezultata direktnog zasijavanja, ponavljaju se zasijavanje na guste diferencijalno dijagnostičke podloge nakon 18-24 sata i 3., 5., 7. i 10. dana.
Uzrasli mikroorganizmi se identifikuju po kulturno-morfološkim, enzimskim i serološkim svojstvima.
12. Bakteriološko ispitivanje materijala iz rozeole
Bakteriološki pregled („struganje“ sa rozeolom) vrši se u prisustvu dobro izražene rozeole. Materijal se sakuplja aseptično. Da biste to učinili, područje kože iznad rozeole tretira se 70% etil alkoholom, zatim se obriše pamučnim štapićem navlaženim sterilnom 0,9% otopinom natrijum hlorida i osuši sterilnim tamponom.
Materijal za istraživanje (tkivna tečnost) dobija se skarifikacijom kože preko rozeole skalpelom. Na oštećenu kožu se nanose 1-2 kapi žučne juhe ili izotonične otopine natrijevog hlorida, pomiješaju se s izbočenom tkivnom tekućinom i skupe se Pasterovom pipetom ili sličnim sterilnim uređajem za jednokratnu upotrebu u epruvetu s jednim od tekućih medija za obogaćivanje (žuč bujon, Rapoport medijum, itd.). U laboratoriji se inokulacija drži na 37 °C 18-24 sata, nakon čega slijedi inokulacija na guste diferencijalno dijagnostičke podloge (Endo, EMS, ICA).
13. Bakteriološki pregled koštane srži
Poznato je da je u slučaju laboratorijske potvrde dijagnoze trbušnog tifusa najefikasniji bakteriološki pregled koštane srži (inokulacija uzročnika je 90-95%). Čak i kod pacijenata sa blagim i izbrisanim oblicima trbušnog tifusa, teškom za kliničko prepoznavanje, kao iu pozadini uzimanja antimikrobnih lijekova, inokulacija mijelokultura je značajno veća od hemokulture.
Međutim, u praksi se bakteriološki pregled koštane srži provodi vrlo rijetko, samo za posebne kliničke indikacije, u nedostatku drugih laboratorijskih podataka koji potvrđuju dijagnozu trbušnog tifusa ili paratifusa, tk. ova invazivna procedura je prilično traumatična. Uzorkovanje materijala za istraživanje vrši se samo u bolnici uz prisustvo odgovarajućeg specijaliste.
Materijal za bakteriološko ispitivanje (aspirat) u količini od 0,50-0,75 ml dobija se aseptički punkcijom sternuma (ručke ili tela) i inokulira u epruvetu sa jednim od obogaćivača (žučni bujon, Rapoport medijum i dr.).
Ako se aspirat ne može inokulirati u podlogu za obogaćivanje odmah nakon punkcije, sakuplja se u sterilnu epruvetu i odmah šalje u laboratoriju, gdje se vrši inokulacija u podlogu za obogaćivanje. U laboratoriji se inokulacije inkubiraju na 37 °C 18-24 sata, nakon čega slijedi inokulacija na gustim diferencijalno dijagnostičkim podlogama.
Dalja istraživanja se provode, kao i kod bakteriološkog pregleda drugog biološkog materijala.
14. Hranljivi mediji i reagensi
Lista hranjivih podloga za izolaciju i identifikaciju uzročnika crijevnih infekcija, posebno enterobakterija, opsežna je i stalno se širi. Izbor specifičnih sredina je u velikoj mjeri određen lokalnim ekonomskim uslovima i tradicijom. Međutim, trebalo bi da se rukovodi nekoliko osnovnih principa.
14.1. Opis podloge za kulturu treba da naznači da se može koristiti ne samo za otkrivanje salmonele, već i za Salmonella Typhi i S. Paratyphi A, B i C.
14.2. Treba dati prednost dehidriranim podlogama za uzgoj renomiranih proizvođača u odnosu na podloge pripremljene direktno u laboratoriji.
14.3. Svaka serija podloge za kulturu u laboratoriji mora biti kontrolisana test sojevima (interna kontrola kvaliteta).
14.4. Za laboratorijsku dijagnostiku bolesti tifusa i paratifusa i otkrivanje nosilaca bakterija treba koristiti hranjive podloge i reagense odobrene za upotrebu na teritoriji Ruske Federacije u skladu sa utvrđenom procedurom.
15. Metode za proučavanje enzimskih svojstava
Trenutno, za proučavanje enzimske aktivnosti mikroorganizama iz porodice Enterobacteriaceae, uključujući patogene tifusa i paratifusa, razvijeni su, proizvedeni i registrovani različiti domaći i strani dijagnostički test sistemi (od najjednostavnijih klasičnih Hiss medija u epruvetama i pločama do automatskih analizatora). . Ako test sistemi omogućavaju identifikaciju mikroorganizma do nivoa roda i utvrđivanje karakteristika enzimske aktivnosti sojeva, onda se mogu koristiti za identifikaciju patogena tifusa i paratifusa. Procedura za rad sa test sistemima je detaljno opisana u uputstvima za upotrebu i treba je striktno poštovati.
16. Biološka svojstva patogena
Uzročnici trbušnog tifusa i paratifusa A, B i C pripadaju porodici Enterobacteriaceae, rodu Salmonella, enterica vrstama, podvrsti I (enterica) i imaju morfološka, kulturološka i enzimska svojstva karakteristična za ovu podvrstu, vrstu, rod i porodicu.
Predstavnici roda Salmonella species enterica su istorijski razvili situaciju kada serovari nisu označavani antigenskom formulom, kao kod drugih bakterija, već nazivima bolesti (ljudske ili životinjske), zemljom, gradom ili ulicom u kojoj su izolovani, itd. Pogrešno je uzeti u obzir imena ovih vrsta, jer nemaju taksonomski status. Međutim, imena najčešćih serovara salmonele toliko su poznata da ih je gotovo nemoguće zamijeniti antigenskim formulama. Stoga se u modernoj Kaufman-White shemi, kada se označava Salmonella samo podvrste enterica I, umjesto oznake vrste koristi se naziv serovara, ali se piše velikim slovom.
Dakle, puni nazivi uzročnika trbušnog tifusa i paratifusa su sljedeći:
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi B;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi C
U uobičajenoj praksi moguće je koristiti skraćene verzije imena:
Salmonella ser. Typhi ili Salmonella Typhi ili S. Typhi;
Salmonella ser. Paratyphi A ili Salmonella Paratyphi A ili S. Paratyphi A;
Salmonella ser. Paratyphi B ili Salmonella Paratyphi B ili S. Paratyphi B;
Salmonella ser. Paratyphi C ili Salmonella Paratyphi C ili S. Paratyphi C
16.1. Kulturna i morfološka svojstva
Mobilni gram-negativni štapići ne stvaraju spore i kapsule, fakultativni anaerobi dobro rastu na običnim hranjivim podlogama.
Na jednostavnom hranljivom agaru - kolonije blago konveksne sa glatkim rubom i glatkom površinom, vlažne sa sjajem većim od 1 mm.
Na diferencijalno dijagnostičkim podlogama (sadrže laktozu kao diferencirajuću tvar) - prozirna, bezbojna ili plavkasta, a ponekad i ružičasta ili boja okoline kolonije (Endo, Ploskirev, EMS i drugi slični mediji).
Na SS-arape, kolonije srednje boje sa crnim središtem.
Na bizmut-sulfitnoj podlozi izolovane kolonije S. Typhi, S. Paratyphi B su crne sa karakterističnim metalnim sjajem, podloga ispod kolonije je obojena u crno. Kolonije S. Paratyphi A su zelenkaste, svijetle boje podloge, nježne.
Sojevi S. Paratyphi B (uzročnik paratifusa B) na mesno-peptonskom agaru mogu formirati povišeni mukoidni zid duž periferije kolonija. Sluznica se razvija 2-5 dana kada se usjevi čuvaju na sobnoj temperaturi. Ovaj simptom nije trajan i dijagnostički.
16.2. Enzimska svojstva
Proučavanje enzimskih svojstava provodi se u odnosu na skup ugljikohidrata, polihidričnih alkohola, aminokiselina i drugih organskih spojeva koji se koriste u identifikaciji i proučavanju salmonele i drugih enterobakterija. U pravilu se u praktičnim laboratorijama koristi mali broj testova za identifikaciju glavnih rodova koji su dio porodice crijevnih bakterija. Karakteristike enzimskih svojstava salmonele, uključujući uzročnike trbušnog tifusa i paratifusa A, B i C, prikazane su u tabeli 2.
tabela 2
Enzimska svojstva uzročnika trbušnog tifusa i paratifusa A, B, C
|
supstrat |
S. Paratyphi A |
||||
|
glukoza (gas) |
Bakteriološka metoda proučavanja patološkog materijala za izolaciju i identifikaciju mikobakterija uključuje 3 metode: bakterioskopsku, kulturalnu i biološku / R.V. Tkzova, 1983; I.I.Rumačik, 1987, 1993; A.S. Dončenko, 1989; Yu.Ya. Kassich, 1990; A.Kh.Naimanov, 1993; L.P. Khodun, 1997/. Period bakteriološkog pregleda ne bi trebao biti duži od 3 mjeseca.
S obzirom da su makroskopske tuberkulozne promjene na organima i tkivima goveda uzrokovane uzročnikom tuberkuloze goveda, nema smisla takav materijal ispitivati bakteriološki. Ako se takav materijal dostavi u laboratorij na istraživanje, onda se vrši komisijski pregled i sastavlja se akt. Materijal je bezopasan.
Bakterioskopski (mikroskopski) pregled materijala sastoji se u tome da se iz svakog organa (ili komada organa sa sumnjivim promjenama na tuberkulozu) i limfnog čvora koji se predaju na pregled pripremaju 2 mrlja otiska, suše se na zraku, fiksiraju nad plamenom alkoholna lampa, bojenje prema Cyl-Nielsenu i pregled obojenih mrlja pod mikroskopom, sa najmanje 50 vidnih polja u svakom razmazu. Potrebno je pripremiti najmanje 20 mrlja-otisaka od materijala sa jednog trupa. Osim toga, razmazi za mikroskopiju se pripremaju i od suspenzije materijala posijanog na hranljive podloge.
Ziehl-Neelsenovo bojenje razmaza je selektivno za detekciju mikobakterija: na plavoj pozadini obojenih tkiva ili strane mikroflore, mikobakterije se vide kao crvene, ružičaste ili rubin-crvene štapiće. Najbolje je pregledati mrlje pod binokularnim mikroskopom pri uvećanju od 1,5 (mlaznica) x 7 (okular) x 90 ili 100 (objektivno).
Metoda se koristi kao signal, jer prisustvo ili odsustvo mikobakterija u brisevima apsolutno ne utiče na tok daljih istraživanja, a čak ni pozitivan bakterioskopski zaključak nema pravni značaj (osim za ptice). Materijal treba dalje istražiti.
Laboratorijska dijagnoza tuberkuloze kod ptica smatra se utvrđenom ako se iz testnog materijala izoluje kultura ptičjih mikobakterija (od papagaja - ljudske ili ptičje vrste), dobije se pozitivan rezultat biotesta, kao i ako se mikobakterije otkriju u brisevima iz patološkog materijala. tokom mikroskopskog pregleda (tačka 7.3 .2 uputstva).
Također je potrebno obratiti pažnju na to da je potrebno dosta vremena za pripremu otisaka otisaka, njihovu fiksaciju i pregled, te je vrlo rijetko u njima otkriti mikobakterije, čak i u brisevima iz suspenzije sjemenskog materijala. Stoga, da bismo uštedjeli radno vrijeme i novac u proučavanju materijala od životinja koje nisu imale promjene tokom klanja, preporučljivo je ograničiti se na pripremu i pregled mrlja samo od suspenzije materijala posijanog na hranljive podloge. To neće dovesti do oštećenja u dijagnozi tuberkuloze, jer se proučavanje materijala nastavlja dalje.
Osim konvencionalne svjetlosne mikroskopije, može se koristiti i fluorescentna mikroskopija. Na isti način se pripremaju brisevi, fiksiraju se i boje se mješavinom fluorohroma. Obojeni razmazi se posmatraju pod fluorescentnim mikroskopom. Metoda je osjetljivija, ali manje specifična, pa stoga nije baš prihvatljiva, posebno u praktičnim laboratorijama.
Kulturna izolacija mikobakterija na hranjivim podlogama jedna je od važnih karika u laboratorijskoj dijagnostici tuberkuloze u sadašnjoj fazi. Međutim, hranjive podloge na koje je posijan materijal (za 5-10 epruveta prema uputstvu) u prve 2-3 sedmice imaju djelomičnu ili potpunu klijavost, po pravilu, zbog kršenja sterilnosti tokom inokulacije. materijala. Usjevi se odbacuju upravo u vrijeme kada je najvjerovatnija pojava inicijalnog rasta atipičnih mikobakterija (da ne govorimo o ispoljavanju početnog rasta uzročnika tuberkuloze, koji raste i kasnije). U takvim slučajevima kulturološka metoda izolacije mikobakterija na hranjivim podlogama mehanički ispada. Ovo je jedan od glavnih razloga za dobijanje negativnih rezultata bakteriološkog pregleda materijala. Kao rezultat toga, pošto nisu primile rast kolonija mikobakterija na hranljivim podlogama nakon inokulacije materijala, a laboratorijske životinje su ostale žive 3 mjeseca, slijedi standardni odgovor laboratorija: “Uzročnik tuberkuloze nije izoliran” ili “ Pregled materijala na tuberkulozu je negativan”. Na osnovu rezultata istraživanja nije utvrđen razlog reakcije goveda na tuberkulin, a to dovodi do daljeg neopravdanog klanja značajnog broja životinja koje su reagovale na tuberkulin na farmama koje su slobodne od tuberkuloze goveda, što uzrokuje velika ekonomska šteta, remeti promet i reprodukciju stada.
S obzirom na navedeno, potrebno je dati prednost kulturološkoj metodi izolacije mikobakterija iz materijala na hranljivim podlogama, kao najslabijoj karici u bakteriološkoj dijagnostici tuberkuloze u okružnim veterinarskim laboratorijama.
Pozitivni rezultati kulturološke metode izolacije mikobakterija uglavnom ovise o dvije okolnosti: povećanju pouzdanosti sjemenja mikobakterija iz materijala i usklađenosti sa uvjetima sterilnosti pri radu u kutiji.
Povećanje pouzdanosti sjetve mikobakterija iz materijala uzetog za ispitivanje ovisi prije svega o njegovom kvalitativnom odabiru, predsjetvenom tretmanu i povećanju broja epruveta podloge na kojoj se vrši sjetva.
Glavni uvjeti, čije poštivanje, prilikom sjetve materijala na hranjive podloge, jamči rast kolonija mikobakterija:
a) uzeti materijal za bakteriološko ispitivanje od zaklanih životinja koje nisu imale promjene tokom klanja, odvojeno od svakog trupa i inokulirati svaki uzorak (materijal od svake životinje) na 10-20 epruveta podloge prema sljedećoj shemi:
Limfni čvorovi glave (submandibularni, faringealni);
Bronhijalni i medijastinalni limfni čvorovi;
Mezenterični (mezenterični) limfni čvorovi;
Ostali limfni čvorovi (ako postoje sumnjiva područja);
Organi (također ako je potrebno).
Rezultat je inokulacija materijala od jedne životinje za 30-50 epruveta podloge. Time se postiže povećanje pouzdanosti sijanja mikobakterija za 3-5 puta, jer se bez odvajanja uzoraka (prema uputstvu) preporučuje sejanje materijala na samo 5-10 epruveta podloge iz dvije glavice jedne farma.
b) Neposredno prilikom bakteriološke inokulacije materijala izrezati komade sa poremećenom morfološkom strukturom limfnog čvora ili organa (hiperplazija, induracija, tačkasta i prugasta krvarenja itd.). Štaviše, potrebno je izrezati sva promijenjena područja. Ako u jednom malteru ima puno materijala po zapremini, onda se može podijeliti na dva.
c) Striktno se pridržavati metodologije rada, ne narušavajući način obrade i sjetve materijala.
d) Prilikom homogenizacije materijala, posebno limfnih čvorova, potrebno je koristiti sterilni pijesak ili fino razbijeno sterilno staklo. Samljeti materijal što je više moguće (do kremaste konzistencije) radi bolje ekstrakcije mikobakterija iz ispitivanog materijala
e) U homogenizovani materijal u malteru dodati fiziološki rastvor u količini potrebnoj za inokulaciju suspenzije materijala na hranljive podloge i za biotest (u proseku do 0,5 cm3 u jednoj epruveti i 1-2 cm3 za potkožnu infekciju jedan zamorac). Ova količina fiziološke otopine može se unaprijed izračunati.
f) Pregled usjeva materijala vršiti nakon 3, 5, 7, 10, 15 dana, a zatim jednom sedmično.
g) Svaka kolonija mikroorganizama uzgojena na podlozi (tipična ili atipična, pigmentirana ili nepigmentirana, sluzava ili suha, itd.) mora biti mikroskopirana sa selektivnim bojenjem prema Ziehl-Neelsenu.
Treba obratiti pažnju na stepen ispiranja materijala od kiseline (ili lužine) koji se koristi za tretiranje materijala od kontaminacije stranom mikroflorom. Preostala kiselina će uvijek biti prisutna u suspenziji sjemenskog materijala, ali treba je svesti na minimum. Pokazatelj toga je vraćanje izvorne boje podloge 2.-4. dana nakon sjetve materijala. Ako se boja medija ne vrati, to ukazuje na povećanu količinu preostale kiseline. Boja medija poprima plavičastu nijansu različitog intenziteta. Rast (pretpostavljenih) mikobakterija u ovom slučaju usporava, ili ih uopšte neće postojati, posebno uzročnika tuberkuloze, jer je zahtjevnija za režim uzgoja. Preostala količina kiseline djeluje na mikobakterije u određenoj mjeri bakteriostatski.
Za zatvaranje epruveta nakon inokulacije materijala mogu se koristiti pamučni i pamučno-gazni čepovi, nakon čega se popunjavaju parafinski, bezgumeni i gumeni sa izrezanim kosim žljebom, kortikalni i metalni čepovi (zatvarači).
Prilikom utvrđivanja vrste izolovane kulture mikobakterija poznati su brojni (oko 300) različitih testova: kulturno-morfološki, biološki, biohemijski, serološki, određivanje rezistencije na lekove itd. Međutim, u veterinarskoj praksi se koristi njihov minimum (vidi priručnik). Za laboratorije je dovoljno odrediti izolovanu kulturu mikobakterija sljedećih vrsta: goveđe, ljudske i ptičje, koja se utvrđuje biološkim testom, i podijeliti atipične mikobakterije u grupe prema Runyonu (1959): I - fotohromogene (tvoreći pigment pod uticajem svetlosti), II - skotokromogeni (formiraju pigment bez obzira na izlaganje svetlosti - i u mraku i na svetlu), III - nehromogeni (ne stvaraju pigment) ili se nazivaju i nepigmentirani (ovo takođe uključuje uzročnika tuberkuloze ptica), IV - brzorastuće mikobakterije i saprofite otporne na kiseline.
Da bi se to postiglo, prilično je učinkovito i ekonomski opravdano proučavati svojstva izolirane kulture prema skraćenoj shemi, u kojoj se glavna pažnja posvećuje vremenu pojavljivanja primarnog rasta kolonija, formiranju pigmenta, kulturnim- morfološka i tinktorijalna svojstva kada se boje po Ziehl-Neelsenu. Posebno je značajan test za formiranje pupčane vrpce u primarnoj ili čak subkulturi u kombinaciji sa rezultatima biološke analize. Za pripremu razmaza iz uzgojenih kolonija preporučljivo je istovremeno ih napraviti i od kolonija i od ostataka suspendirane tvari i kondenzata, tj. iz tečnog dijela na dnu cijevi.
Osim toga, osoblje laboratorije ima mogućnost ne samo da vrši kontrolno klanje životinja koje su reagovale na tuberkulin i uzimaju uzorke materijala za istraživanje, već i da uzimaju uzorke za bakteriološka istraživanja tokom života životinja (bronhijalna ili nazalna sluz, mlijeko). , izmet, urin, eksudat, krv i dr.), kao i uzorci hrane, vode, objekata iz okoline za izolaciju mikobakterija i na taj način posredno dokazuju uzrok odgovora goveda na tuberkulin. Prilikom sjetve dodatnog materijala i uzoraka sa objekata okoliša koriste se poznate metode koncentriranja mikobakterija: sedimentacija, flotacija, flotacija-sedimentacija i dr.
Skraćena shema diferencijacije mikobakterija biološkim testom
