Rekombinantinis audinių plazminogeno aktyvatorius. Plazminogeno aktyvatoriai, išskirti iš audinių ir biologinių skysčių
Plazminogeno aktyvatoriai (AP) yra labai specifinės reguliavimo tipo serino proteazės. Yra daug žinomų AP, išskirtų iš kraujo ir kitų biologinių skysčių bei žmogaus audinių. Jie skirstomi į fiziologinius aktyvatorius, kurie, priklausomai nuo gamybos šaltinio, gali būti audinių (organų), kraujagyslių (audinių plazminogeno aktyvatorius), plazmos, kraujo, šlapimo (urokinazė) ir kt. ir išskirtas iš mikroorganizmų (streptokinazės). Beveik visi AP susidaro profermentų (plazminogeno proaktyvatorių) pavidalu.
Plazminogeno aktyvinimas gali būti:
išorinis - veikiant audinių, kraujo, kraujagyslių sienelių aktyvatoriams, kurie patenka į kraują veikiami įvairių veiksnių;
vidinis - dalyvaujant plazmos baltymams - Hageman faktorius, prekallikreinas, didelės molekulinės masės kininogenas;
egzogeninis - įvedus į organizmą plazminogeno aktyvatorius (streptokinazę ir jos pagrindu sukurtus vaistus, urokinazę, streptokinazės-liz-plazminogeno kompleksą; audinių plazminogeno aktyvatorių, gautą genų inžinerijos būdu, ir kitus vaistus) gydymo tikslais.
Vidinis fibrinolizės aktyvacijos kelias(nuo Hagemano priklausoma fibrinolizė) inicijuoja kraujo plazmos Hageman faktorius (XP faktorius). XII faktoriui ir didelės molekulinės masės kininogeno-prekallikreino kompleksui fiksavus ant svetimo ar pakitusio paviršiaus (kolageno ar kito), ribotos proteolizės būdu susidaro aktyvus kallikreinas, kuris katalizuoja XII faktoriaus pavertimą aktyvia forma – XIIa faktoriumi. . Pastarasis skatina plazminogeno pavertimą plazminu. Laisvas kallikreinas taip pat yra tiesioginis plazminogeno aktyvatorius.
Nuo Hagemano priklausoma fibrinolizė suaktyvinama kartu su reakcijų kaskados įtraukimu į protrombinazės susidarymą vidiniu mechanizmu, o jos pagrindinis tikslas yra išvalyti kraujagyslių dugną nuo fibrino krešulių, susidarančių intravaskulinio kraujo krešėjimo metu. Aktyvinant nuo Hagemano priklausomą fibrinolizę, gali dalyvauti kraujo ląstelėse esanti APH.
Išorinis plazminogeno aktyvacijos kelias- pagrindinis audinių pažeidimo būdas, skatinamas įvairių audinių plazminogeno aktyvatorių. Svarbiausias iš jų yra audinių plazminogeno aktyvatorius (tPA). , kurią sintetina kraujagyslių endotelio ląstelės ir pagal poreikį išleidžiama fibrinolizės aktyvinimui (13.15 pav.).
13.15 pav.Šiepo konstrukcijos schema
Jo malda. masė 70 kDa, turi vieną domeną, struktūriškai panašų į EGF, 2 kringles ir piršto formos domeną, kuris primena plazmino struktūrą. Endoteliocitai tPA išskiria ne tik kraujagyslių trombozės metu, bet ir manžetės suspaudimo metu, fizinio krūvio metu, veikiant vazoaktyvioms medžiagoms (adrenalinui, norepinefrinui) ir tam tikriems vaistams. Šis aktyvatorius ir jo inhibitoriai užtikrina nuolatinį fibrinolizinio aktyvumo reguliavimą. tPA sudaro 85% išorinio fibrinolizinio kraujo aktyvumo.
Savo struktūra ir veikimo mechanizmu tPA yra panašus į kitus skirtinguose audiniuose esančius fibrinolizės aktyvatorius, kurie patenka į kraują, kai audiniai pažeidžiami (traumos, audinių destrukcija, akušerinė patologija ir kt.). Ypatingą vietą tarp fibrinolizės audinių (organų) faktorių užima fibrinolizė, kurią gamina inkstų audinys ir šlapimo takų epitelis. urokinazė, kurių didžioji dalis išsiskiria su šlapimu. Urokinazė suteikia apie 10-15% išorinio fibrinolizinio kraujo aktyvumo. Jis gali prasiskverbti į trombą ir ten katalizuoti plazminogeno pavertimą plazminu, taip sunaikindamas trombą ne tik iš išorės, bet ir iš vidaus.
Kraujo plazminogeno aktyvatoriai yra kraujo ląstelėse (eritrocituose, trombocituose ir leukocituose) ir išsiskiria, kai jie aktyvuojami ir sunaikinami, taip pat trombozės, ypač sukeltos endotoksino, metu.
Iš egzogeninių aktyvatorių labiausiai ištirta streptokinazė - nefermentinis baltymas (mol. masė 47 kDa), kurį gamina β-hemolizinis streptokokas ir normaliomis sąlygomis kraujyje nėra. Streptokinazė, kaip ir dekaze, celiazė, avelizinas ir kt., neturi savarankiško fermentinio aktyvumo plazmino atžvilgiu, tačiau kartu su plazminogenu sudaro kompleksą, kuris inicijuoja plazminogeno pavertimą plazminu. Taigi streptokinazė aktyvuoja plazminogeną, susijungusį su fibrino krešuliu, taip pat plazminogeną tirpioje fazėje, kurią lydi laisvo plazmino susidarymas. Su streptokokine infekcija gali susidaryti dideli streptokinazės kiekiai, dėl kurių gali padidėti fibrinolizė (fibrinogenolizė) ir išsivystyti hemoraginė diatezė. Plazminogeno transformacija į plazminą, taip pat fibrino krešulių lizės procesas vyksta šių krešulių paviršiuje. Fibrino krešuliai selektyviai adsorbuoja ir sulaiko plazminogeną. Lizino turtingos vietos (LN), esančios centrinėje fibrino(ogen)a molekulės dalyje, jungiasi su plazminogeno kringle domenais, o viena plazminogeno molekulė jungiasi prie kelių fibrino(ogen)a molekulių, todėl plazmino molekulė gali veikti naujus nepažeistus. fibrino molekulės, liekančios susijusios su substratu ir išvengiančios perėjimo į tirpalą bei inaktyvavimo po sąlyčio su a2-antiplazminu. Kartu su plazminogenu fibrino krešulys specifiškai suriša plazminogeno aktyvatorius. Audinių plazminogeno aktyvatoriai turi mažą katalizinį aktyvumą, kai nėra fibrino, ir aktyvuojami, kai prie jo prisijungia. Audinių tipo aktyvatoriai, išskyrus urokinazę, turi didesnį afinitetą fibrinui nei fibrinogenas, o tai paaiškina vyraujančią fibrinolizę ir labai mažą fibrinogenolizę. Vienu metu plazminogeno ir jo aktyvatorių buvimas fibrino paviršiuje užtikrina natūralų plazmino susidarymą, o fibrinas suskaidomas į tirpius fragmentus, vadinamus. fibrino skilimo produktai(PDF).
Įvairūs PDP pasižymi antikoaguliacinėmis, antipolimerizacinėmis, antiagregacinėmis ir kitomis savybėmis. Ankstyvųjų ir vėlyvųjų PDF nustatymas atliekamas siekiant anksti diagnozuoti fibrinolizinio aktyvumo pokyčius, DIC stadijas, diferencijuoti pirminę ir antrinę fibrinolizę. Nei plazminas, nei plazminogeno aktyvatorius nesijungia su PDP ir, krešuliui ištirpus, patenka į plazmą, kur juos inaktyvuoja natūralūs inhibitoriai.
Išradimas susijęs su nauju patobulintu audinių aktyviu plazminogenu (patobulintu TAP), turinčiu pailgintą pusinės eliminacijos laiką organizme ir padidintą stabilumą karščiui ir rūgštims, kuris gali būti naudojamas uždegimui slopinti trombų susidarymo srityje. Išradimas taip pat yra susijęs su minėto audinio plazminogeno aktyvatoriaus gamybos būdu, naudojant rekombinantinės DNR technologiją, ir priemones, naudojamas jai įgyvendinti. Yra žinoma, kad žmogaus audinių plazminogeno aktyvatorius (TPA) turi teigiamą fibrinolizinį aktyvumą ir yra itin veiksmingas prieš su fibrinu susietą plazminogeną, o plazminogeno laisvos cirkuliacijos fazėje organizme neaktyvina taip efektyviai kaip įprasti tromboliziniai preparatai, streptokinazė (SK). ir urokinazė (JK). Žmogaus TSA aminorūgščių seka ir žmogaus TSA koduojančios cDNR nukleotidų seka yra žinomos (Pennica. D. ir kt., Nature, 301, 214-221, 1983). Taip pat žinoma, kad žmogaus TSA tirpdo veninius ir arterinius kraujo krešulius. Didelio masto klinikinių tyrimų metu buvo įrodyta, kad į veną leidžiami žmogaus spąstai veiksmingai reperfuzuoja užsikimšusią vainikinę arteriją pacientui, patyrusiam ūminį miokardo infarktą. Tačiau šio vaisto vartojimo trūkumas gydant ligą, susijusią su tromboze, yra itin trumpas jo fermentinio aktyvumo pusinės eliminacijos laikas kraujyje (Rijken, D.C. ir kt., Thromb. Heamost. 54 (1), 61 , 1985, Hubert, E. F. ir kt., Blood, 65, 539, 1985). Gydymui naudojamas žmogaus gaudyklė turi būti nuolat švirkščiama į veną didelėmis dozėmis. Yra žinoma, kad natūraliai atsirandantis žmogaus t-PA turi domeno struktūrą, pradedant nuo molekulės N-galo, po kurio yra pirštų domenas, EGF (epiderminio augimo faktoriaus) domenas, du kringle 1 ir kringle 2 domenai ir serinas. proteazės domeris. Rijken ir kt., pažymėjo (Rijken D.C. ir kt., Thromb. Heamost., 54 (1), 61, 1985), kad trumpas žmogaus TSA biologinis pusinės eliminacijos laikas gali būti susijęs su visomis žmogaus TSA sritimis, išskyrus serino domenas.-proteazės. Zonneveldas ir kt. (Zonneveld, A.J.V. ir kt., Proc. Natl. Acad. USA., 83, 4670, 1986) taip pat pažymima, kad pirštų domenas, EDF domenas ir kringle 2 domenas gali būti svarbūs fibrino surišimo veiklai. natūraliai atsirandančio žmogaus t-PA, taip pat palaikyti nuo fibrino priklausomą APT aktyvaciją. Tačiau kol kas nėra sukurtos jokios specialios priemonės, skirtos palaikyti fibrino surišimo aktyvumą, kurį turi natūraliai atsirandantis žmogaus t-PA, ir jo priklausomą nuo fibrino aktyvumą, taip pat pailginti biologinį pusinės eliminacijos periodą. Japonijos paskelbtoje patentinėje paraiškoje Nr. 48378/1987 aprašomas TPB, gautas ištrinant 87-175 aminorūgštis iš natūraliai atsirandančio žmogaus TPB, kuriame yra išbrauktas "kringle 1". Ši spąstai išsiskiria papildoma sukelta taškine mutacija epidermio augimo faktoriaus srityje. Japonijos patentinėje paraiškoje atskleidžiama, kad modifikuotas t-PA gali jungtis prie fibrino, tačiau sąveika su audinių plazminogeno aktyvatoriaus inhibitoriumi yra silpna. Europos patente Nr. 241208 aprašomas TSA, gautas ištrinant 92-179 aminorūgštis iš natūraliai atsirandančio žmogaus TSA, iš kurios taip pat pašalinta "kringle 1". Šiame dokumente minima, kad šis t-PA turi fibrinolizinį aktyvumą. Be to, Europos patentas N 231624 atskleidžia modifikuotą TAP su pailgintu pusinės eliminacijos periodu. Modifikuotame spąstelyje, turinčiame F-EGFK2-A seką, trūksta kringle 1 domeno, tačiau nebuvo parodytas konkretus jo paruošimo būdas. Atsižvelgiant į tai, kas išdėstyta aukščiau, aišku, kad modifikuota TSA pagal išradimą turi skirtis nuo natūraliai esančios TSA aminorūgščių seka vidinių domenų srityje. Atlikus išsamius tyrimus, pareiškėjas gavo patobulintą TSA, kurioje yra pirštų domenas, EDF domenas, kringle 2 domenas ir serino proteazės domenas, tačiau pirmasis "kringle 1" domenas yra ištrintas konkrečioje vietoje ir domeno surišimo vietoje "kringle 2" ir serino proteazė mutuoja, todėl pagerėjo t-PA, pasižymintis puikiu atsparumu karščiui ir rūgštims, pasižymintis žymiai pailgintu biologiniu pusinės eliminacijos periodu ir stipriu priešuždegiminiu aktyvumu, kartu išlaikantis pageidaujamas savybes. natūraliai atsirandančio žmogaus t-PA. Išradimas yra susijęs su patobulintu APT. TSA pagal išradimą savo chemine struktūra labai skiriasi nuo natūraliai žmogaus TSA ir pasižymi geresnėmis savybėmis. Patobulintas TSA pagal išradimą yra polipeptidas, turintis aminorūgščių seką, pavaizduotą pagal bendrą formulę, parodytą Fig. 28-29, kur R yra tiesioginė jungtis, Y yra A-Ile-B (A yra Arg arba Glu ir B yra lys arba Ile), geriau Glu-Jle-Lys. H 2 N yra amino galas, o -COOH yra karboksi galas). Išradime terminas „patobulintas TSA“ vartojamas nurodant TSA analogą, kur A ir B yra atitinkamai toliau aprašytos aminorūgštys:
Patobulintas APT (II): Arg, Lys;
Patobulintas APT (V): Arg, Ile;
Patobulintas APT (VI): Glu, Lys;
Patobulintas APT (VIII): Glu, Ile. Išradimas taip pat skirtas siūlomo TSA analogo ekspresijai naudojant rekombinantinės DNR metodus. Su tuo susijusios naujos DNR, koduojančios patobulintą tPA ir rekombinantinės DNR ekspresijos vektorius. 1, 2 paveiksluose parodyta 16 oligodeoksinukleotidų seka, panaudota konstruojant sintetinį geno fragmentą, koduojantį patobulintą spąstą (II); 3-4 paveikslas - sintetinio geno, skirto patobulintam taktui (II) konstruoti pagal išradimą, fragmentas, turintis restrikcijos fermentų Bge 11 ir Eco R1 galus, kuris yra sukonstruotas naudojant 16 oligodeoksinukleotidų, parodytų 1-2 paveiksluose; 5 paveikslas – patobulinto gaudyklės (II) konstravimo technika (paveiksle juoda sritis, užtamsinta sritis ir neužpildyta sritis atitinkamai nurodo sritį, koduojančią subrendusią taktinį baltymą, sritį, koduojančią propropeptidą, ir netransliuotą sritį); 6 paveikslas – metodas, skirtas patikrinti sintetinio geno fragmento IV bloką, nustatant DNR bazių seką dideoksi metodu ir 7-DEAZA metodu; 7 pav. parodytas pVY1 ekspresijos vektoriaus konstravimo gyvūnų ląstelėse ir patobulintos gaudyklės DNR integravimo metodas. 8 - 13 DNR sekos, koduojančios patobulintą taktą (II) ir patobulintą TPA (V), 14 - 19 pav. - aminorūgščių sekos, gautos iš DNR sekų, koduojančių patobulintą APT (II) ir patobulintą APT (V). ), Fig.20 - restrikcijos fermentai ir plazmidės pTPA2, turinčios Eco R1-Xho fragmentą (apie 1000 bazinių porų), natūralaus APT geno, integruoto į pBR322 vektorių Eco R1 ir Bam H1 skilimo vietose, funkcinis žemėlapis; 21 paveikslas – mp9 (patobulintas spąstai (II), turintis geno fragmentą BgL11-Xho 11 (apie 1500 bazinių porų), patobulintą taktą (II), integruotą į dvigrandę DNR M13 mp9 BamH1 skilimo vietoje; 22 pav. priklausomybė „dozės efektas“ pagerinto TSA (VI) ir natūraliai atsiradusio TSA aktyvumui S-2251 metodu, kai yra (+Fb) ir nėra (-Fb) fibrino pakaitalo; 23 pav. patobulinto TSA (VI) ir natūralaus aktyvumo 24 pav. parodytas pagerėjusio TSA (VI) liekamojo aktyvumo pokytis po terminio apdorojimo, 25 pav. parodytas limfocitus aktyvuojančio faktoriaus (LAF) slopinimas pagerėjusiu. TSA (VI), 26 pav. parodyta aktyvacija naudojant denatūruotą baltymą, pagerintą taktą (VI), Fig. 27 - denatūruoto baltymo skilimas veikiant pagerintam TSA (VI). Rekombinantinės DNR ir transformuotų ląstelių gavimo būdas išsamiai aprašytas toliau. Metodas, kaip gauti patobulintą APT. Natūralų spąstą koduojantis genas, kurio pagrindu gaunamas šio išradimo taktas, buvo išskirtas iš cDNR banko, pagaminto iš Bowes žmogaus melanomos ląstelių. Poli A + RNR buvo išskirta iš Bowes žmogaus melanomos ląstelių ir frakcionuota centrifuguojant sacharozės tankio gradientu. Tada paimamas nedidelis kiekis frakcionuotos poli(A) + RNR ir TP geną koduojanti mRNR frakcija identifikuojama taškinės hibridizacijos būdu, naudojant oligonukleotidinį zondą, galintį atpažinti specifinę TP mRNR seką. Naudojant šią TP mRNR turtingą frakciją kaip pradinę medžiagą, buvo paruoštas cDNR bankas ir patikrintas aukščiau aprašytu TP mRNR identifikavimo zondu. Kadangi nebuvo išskirtas nei vienas klonas, turintis visą APT geno seką, trūkstama bazinė seka sintezuojama DNR sintezatoriumi, kad būtų gautas norimas genas. Tada norimas genas yra sukonstruotas specifinės mutacijos indukcijos būdu. Eco R1-Xho 11 fragmentas natūraliai randamas AT gene (apie 1000 bazinių porų), kurio dalis N = gale pašalinta, buvo įvestas į pBR332 vektorių Eco R1 ir BamH1 skilimo vietose ir buvo gautas pTPA2. . Padermė (E. coli HB 101/pTPA2), gauta transformuojant E. coli šia plazmide, buvo deponuota Japonijos pramonės mokslo ir technologijų agentūros Fermentacijos tyrimų institute, registracijos Nr. P-9649 (FERM BP-2107). Plazmidės pTPA2 apribojimas ir funkcinis žemėlapis parodytas 20 pav. Patobulintas tPA genas įterpiamas į pVY1 plazmidę. Plazmidė pVY1 buvo paruošta liguojant plazmidės pRSV10 (gaminta Fine Chemical Pharmacy) BamH1-Kpn1 fragmentą (apie 2900 bp) su pAdD26SV (A) N 3 (N) plazmidės Eco R1 virškinimo fragmentu (gautas iš Dr. Hiroshi Handa iš Tokijo universiteto (gavus abu bukus galus. Atitinkamai, šiame vektoriuje yra pelės dihidrofolato reduktazės geno cDNR, transkripcijos kontroliuojant pagrindiniam adenoviruso vėlyvajam promotoriui (Ad2), SV 40 ankstyvajam promotoriui prieš pagerintą spąstą. geno įterpimo vieta ir intronas bei poliadenilinimo seka pasroviui nuo šio išradimo geno gali būti įtraukta į kitus tinkamus ekspresijos vektorius. Ekspresijos vektorius įvedamas toliau į tinkamą ląstelę šeimininką, kad būtų gauti transformantai. Kaip ląstelės šeimininkės gali būti naudojamos prokariotinės ląstelės, tokios kaip E. coli, Bacillus subtilis ir kt., eukariotinės mikroorganizmai, tokie kaip mielės ir kt., taip pat aukštesniųjų gyvūnų ląstelės. Kaip E. coli atstovas dažniausiai naudojamas JM109 padermė, W3110 padermė, Q padermė ir kt., priklausanti K12 padermei, o kaip Bacillus subtilis padermė – BD170 padermė, BR151 padermė ir kt. Mielėms galima naudoti RH218 padermę, SHY1 padermę ir kt. mielės Saccharomyces cerevisiae. Ekspresijai paprastai naudojamas plazmidinis vektorius arba fago vektorius, turintis replikoną, gautą iš rūšies, suderinamos su ląstelėmis šeimininkėmis, ir reguliuojančią seką. E. coli vektoriaus pavyzdžiai yra, pavyzdžiui, plazmidės pBR322, pUC18, pUC19 ir kt., fagai, tokie kaip qt , Charon 4A ir kt., fagas M13 ir tt Kaip Bacillus subtilis vektorius, pUB110 gali būti naudojamas , pSA2100 ir kt., o YRp7, YEp61 ir kt. gali būti naudojami kaip mielių vektorius. Vektorius turi turėti promotorių, galintį ekspresuoti dominantį baltymą. Kaip E. coli geno arba fago geno promotorius gali būti naudojamas, pavyzdžiui, Lae, trp, tac, trc, pL ir kt. Kaip šeimininkas, auginamos gyvūnų ląstelės, tokios kaip rezus beždžionės inkstų ląstelės, uodų lervų ląstelės, afrikinės žaliosios beždžionės inkstų ląstelės, pelės vaisiaus fibroblastai, kininio žiurkėnų kiaušidžių ląstelės, žmogaus vaisiaus inkstų ląstelės, drugelio kiaušinėlio audinio ląstelės, žmogaus gimdos kaklelio epitelio ląstelės. ląstelės, žmogaus mielomos ląstelės, pelių fibroblastai ir pan. Ankstyvasis SV40 promotorius, SV40 vėlyvasis promotorius, SV40, turintis promotorių iš eukariotų geno (pvz., estrogenų indukuojamas paukščių ovalbumino genas, interferono genas, gliukokortikoidų indukuojamas tirozino aminotransferazės genas, timidinkinazės genas, adenovirusas) gali būti naudojami kaip genai. vektorius, fosfogliceratkinazės genas, faktoriaus genas ir kt.), galvijų papilomos virusas arba iš jų gauti vektoriai. Be to, žinoma, kad ląstelių išskiriami ir gaminami TP turi skirtingus N-galus, priklausomai nuo skilimo vietų skirtumo. TP sekrecijos ir gamybos atveju naudojant kultūros ląsteles kaip šeimininką, signalo peptidazės arba proteazės skilimo metodas skiriasi priklausomai nuo ląstelės tipo, todėl galima gauti TP rūšis, turinčias skirtingus N-galus. Šis reiškinys tinka ne tik kultivuojamų ląstelių sekrecijai ir gamybai, nes manoma, kad panašus reiškinys gali pasireikšti ir E. coli, Bacillus sublitis, mielių ir kitų specialiai modifikuotų ląstelių gaminant TSA. Hanahan, Hanahan, D.J. Mol. metodas gali būti naudojamas transformuoti šeimininką, naudojant ekspresijos vektorių su integruotu patobulintu takto genu E. coli atveju. Biol., 166, 557, 1983), manipuliuojant gyvūnų ląstelėmis, gali būti naudojamas kalcio fosfato metodas (Vander Eb, A.J. ir Graham, F.L., Method in Enrymoloqy, 65, 826, 1980, Academic Press) ir kt. įjungta. Kaip aprašyta aukščiau, patobulintas ART yra naudingas gydant įvairias įgytas ligas, įskaitant kraujagyslių krešėjimą (netgi giliųjų venų), plaučių emboliją, periferinių arterijų trombozę, širdies ar periferinių arterijų emboliją, ūminį miokardo infarktą ir trombozės priepuolį. Kaip ir natūraliai atsirandanti žmogaus PTCA, patobulinta PTCA ypač naudinga gydant ūminį miokardo infarktą. Neseniai buvo įrodyta, kad natūraliai žmogaus ART veiksmingai ištirpdo vainikinių arterijų užsikimšusį trombą, atkuria miokardo perfuziją ir atkuria daugumą išeminio miokardo sluoksnio dalių, kai 30–70 mg dozė suleidžiama į veną per 1–3 valandas. Patobulintų spąstų biologinis pusinės eliminacijos laikas kraujyje pailgėja, todėl yra veiksmingas tais pačiais atvejais, kaip ir natūraliai atsirandantis žmogaus taktas. Tikimasi, kad patobulinti spąstai gali suteikti klinikinį efektą, panašų į natūralų žmogaus taktą, kai dozė sudaro apie 10 % rekomenduojamos dozės, kai naudojamas natūraliai atsirandantis žmogaus taktas, net ir naudojant vieną dozę. Be to, šio išradimo patobulinti spąstai pasižymi šiomis vertingomis savybėmis, kurios dar nebuvo žinomos, atsižvelgiant į vietinį žmogaus taktą ir modifikuotą taktą. a) Priešuždegiminis aktyvumas. Trombo atsiradimo vietoje nustatomas ne tik paties trombo susidarymas, bet ir fibrino skilimo produktų ar kinino pėdsakų susidarymas. Yra žinoma, kad šios medžiagos turi uždegimą sukeliantį aktyvumą ir todėl sukelia uždegimą trombų srityje. Dėl šios priežasties pageidautina, kad preparatas, naudojamas trombozei gydyti, turėtų ne tik trombolizinį, bet ir priešuždegiminį poveikį. Atlikus tyrimus, Pareiškėjui pavyko patobulintam TAP suteikti priešuždegiminį poveikį, remiantis dviem funkcijomis. Vienas iš jų – patobulinti spąstai slopina interleukino 1 (IL-1), kuris yra vienas iš uždegiminio atsako tarpininkų, biologinį aktyvumą. Manoma, kad makrofagų gaminamas IL-1 dalyvauja uždegiminiame atsake per hipertermiją, spartinant fibroblastų augimą, gaminant kolagenazę sinovinių ląstelių membranoje ir pan., arba pagreitinant prostaciklino sintezę kraujagyslių endotelio ląstelėse. Taip pat žinoma, kad IL-1 veikia kepenų ląsteles, pagreitindamas baltymų (serumo amiloido baltymo, fibrinogeno ir kt.) gamybą ūminėje fazėje, kuri didėja esant uždegimui. Pareiškėjas nustatė, kad patobulinti spąstai slopina pelės timocitų mitogeninio reaktyvumo didinimo aktyvumą (LAF aktyvumą), kuris yra vienas iš biologinių IL-1 veiklų. Kita funkcija yra ta, kad patobulintas gaudyklė turi afinitetą denatūruotam baltymui (denatūruotam imunoglobulinui G, denatūruotam albuminui ir kt.), atsirandančiam dėl uždegimo trombo vietoje, ir papildomai turi savybę būti aktyvuotam šio denatūruoto baltymo. Dėl šios veiklos patobulinti spąstai tik skaido denatūruotą baltymą uždegimo srityje, o uždegimą galima laikinai sumažinti. Pareiškėjas natrio dodecilsulfato gelio elektroforeze patvirtino, kad pagerintas TSA skaido tik denatūruotus baltymus. Kaip parodyta Fig. 26, denatūruoto baltymo patobulinto spąstų aktyvavimas ir selektyvumas yra akivaizdus. Kai imunoglobulinas G buvo apdorotas HCl ir kelis kartus mažesnės koncentracijos, buvo parodytas toks pat aktyvumas kaip ir fibrinogeno, apdoroto BrCN. Kita vertus, normalus imunoglobulinas C nerodo aktyvuojamojo poveikio patobulintam spąstam net esant 500 µg/ml koncentracijai. Užkimštos kraujagyslės pakartotinio okliuzijos profilaktika. Yra žinoma, kad trombozę gydant natūraliais priešuždegiminiais vaistais, atstačius užsikimšusios kraujagyslės kraujotaką, dažnai stebimas pakartotinis okliuzija. Dėl šios priežasties atliekamas kombinuotas gydymas su trombocitų krešėjimo inhibitoriumi arba antikoaguliantais. Tačiau kombinuota terapija apima vaistų sąveikos, dozių kontrolės, panašaus poveikio ir pan. Pageidautina, kad pati TSA papildomai veiktų pakartotinio okliuzijos prevencijos veikla. Šio išradimo patobulintas APT turi galimybę užkirsti kelią pakartotinei okliuzijai dėl dviejų aktyvumo tipų. Pirmasis tipas yra greito t-PA koncentracijos sumažėjimo prevencija po patobulinto t-PA įvedimo dėl ilgesnės veikimo trukmės, dėl kurios išnyksta Stuart-Holmes simptomas ir taip užkertamas kelias atsirasti. pakartotinio okliuzijos. Antrasis tipas yra tas, kad užkertant kelią kraujagyslių endotelio ląstelėms, kurias sukelia IL-1, netiesiogiai slopinamas trombocitų krešėjimas, o tai neleidžia atsirasti pakartotiniam okliuzijai. c) Padidėjęs stabilumas. Baltymų preparatai paprastai yra nestabilūs, todėl pageidautina preparatus laikyti užšaldytus sausus arba žemoje temperatūroje tirpalo pavidalu. Skiriant plazminogeno aktyvatorių pacientui, sergančiam ūminiu miokardo infarktu, reikia atlikti procedūrą per kelias valandas nuo priepuolio pradžios, kad būtų sumažintas mirtingumas. Tokiu atveju pageidautina stabilių preparatų, kuriuos galima laikyti kambario temperatūroje. Be to, padidintas stabilumas leidžia termiškai apdoroti, apdoroti rūgštimi ir pan. vaistų ruošimo metu. Konkrečiai kalbant apie šio išradimo patobulintą TSA, kurią gamina ląstelių kultūros, tampa įmanoma pašalinti ląstelinės kilmės retrovirusą, kuris, kaip žinoma, yra nestabilus karščiui. Toliau išradimas aprašomas konkrečiau su nuoroda į pavyzdžius, bet jais neapsiriboja. Jei nenurodyta kitaip, rekombinantinė DNR gaminama pagal laboratorijos rekomendacijas. Maniatis T ir kt., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Niujorkas (1982). 1 pavyzdys. Klonavimas į tAT DNR. Bowes žmogaus melanomos ląstelės (pirktos iš Dr. Roblin, R., Nacionalinis vėžio tyrimų institutas, JAV) buvo kultivuojamos pagal Opdenakker ir kt. metodą. (Opdenakker, G. ir kt., Eur. J. Biochem, 131, 481-487 (1983)). Norint sukelti tRNR mRNR, į kultūros mišinį pridedama TFA (12-O-tetradekanoilforbol-13-acetato), kurios galutinė koncentracija yra 100 ng/ml, po to kultivuojama 16 valandų. Tada iš kultivuotų ląstelių išskiriama bendra ląstelių RNR pagal Freeman ir kt. modifikuotą metodą. ((Okayama) Berqa DNA Manual, p. 3, 1985, Fine Chemicals Pharmacy). Naudojant oligo-dT celiuliozės kolonėlę (gaminta Pharmacia Fine Chemicals), poli(A)+RNR atskiriama nuo visos ląstelinės RNR. Dėl to iš maždaug 10 o ląstelių gaunama apie 400 μg poli(A) + RNR. Ši poli(A)+RNR frakcionuojama įprastu būdu centrifuguojant sacharozės tankio gradientu. Paimama frakcionuotos poli(A) + RNR dalis ir atliekama taškinė hibridizacija (Perbal, B., Apractical Gube to Molecular Cloninq, 410, 1984, John Wiley and Sons, Inc), naudojant oligonukleotidinį zondą, būdingą tBA. mRNR. Čia naudojamas zondas (zondas Y) turi 5'-GCNNGGCAAAGATGGCA-3' bazinę seką, kuri yra komplementari mRNR sričiai, koduojančiai aminorūgščių liekanas nuo +291 iki +297 TPA sekoje, aprašytoje Pennicaetal, ir buvo susintetinta α-cianofosfamidato metodas, naudojant DNR sintezatoriaus modelį 380A (gaminta „Applied Biosystems“). DNR oligomero sintezė, apsauginės grupės skilimas, skilimas iš dervos ir gryninimas vykdomas pagal DNR sintezatoriaus 380A naudojimo instrukcijas. Y zondo radioaktyvusis žymėjimas 5' gale buvo atliktas pagal laboratorijos vadovą, naudojant T4 polinukleotidų kinazę (gaminta Taka-Ra Shuzo Co., Ltd.) su t ir -(32 P) ATP. Y zondas hibridizuotas stipriai, daugiausia su 20-30S poli(A) + RNR (ši frakcija vadinama frakcija M) Naudojant šabloną, paruošiama 10 μg poli(A) + RNR iš frakcijos M, gaunama 3 μg dvigrandės kDNR. sintezuojama naudojant atvirkštinę transkriptazę (gaminta Biochemical Industry Co., Ltd.) pagal Gubler-Hoffman metodą (Gubler, U. ir Hoffman, B. J., Gene 25, 263, 1983), ir pridedama prie dvigrandės cDNR. 3' deoksi C grandinės galas pagal Denq-Wu metodą (Denq, G. R. ir Wu, R., Nucleic Acids Res., 9, 4173, 1981). Dvigrandė cDNR, prailginta deoksi C grandine, filtruojama geliu naudojant Sepharose CL 4B (gaminta Fine Chemicals Pharmacy), kad būtų pašalintos mažos molekulinės masės nukleorūgštys, turinčios mažiau nei 500 bazinių porų. Po to cDNR buvo atkaitinta su pBR322 (gaminta Bethesda Research), turinčiu deoksi G grandinę Pst 1 vietoje, naudojant įprastą techniką. Mišinys, gautas po atkaitinimo, buvo transformuotas į E. coli HB101 kompetentingas ląsteles (gaminta Takara Shuzo Co. , Ltd.). Rezultatas yra cDNR bankas, susidedantis iš maždaug 4000 nepriklausomų transformantų. Ši kDNR buvo atlikta kolonijų hibridizacijai naudojant Y zondą, aprašytą aukščiau pagal Woods metodą (Woods, D., Focus, 6 (3), 1, 1984, pagaminta Bethesda Research Lab.), siekiant gauti Y zondu sąveikaujančius klonus. Tarp klonų buvo nustatytas pTPA1 klonas, turintis ilgiausią TPA cDNR. Tada atliekamas dideoksi metodas (Carlson, J. ir kt., J. Biotechnoloqy, 1, 253, 1984), naudojant M13 fago vektorių ir 7-DEAZA metodą (Mizusawa S. ir kt., Nucleis Acids Res. ., 14, 1319, 1986). Dėl to buvo nustatyta, kad plazmidėje pTPA1 yra Pennicaetal aprašyto TPA geno bazinė seka nuo T y+441 iki A y+2544. 2 pavyzdys. Patobulinto APT (II) projektavimas. 1 pavyzdyje parodytoje plazmidėje pTPA1 N-galinės srities nepakanka, kad būtų sukurtas pagerintas TPA (II), kuriame nėra kringle 1 domeno. Todėl trūkumas DNR segmentas buvo susintetintas, kaip aprašyta aukščiau, naudojant 380A DNR sintezatorių (gaminta „Applied Biosystems“). Susintetinto oligomero bazinė seka ir visa susintetinta seka parodyta Fig. 1-4. Specifiniai patobulinto TSA (II) konstravimo būdai naudojant šiuos oligomerus parodyti Fig. 5-6. 2-1). IV bloko konstrukcija (Bql II-Eco R1 fragmentas, apie 480 bp). IV bloko fragmentas pav. 5 gaunamas tokiu būdu. Pirma, pagal laboratorijos rekomendacijas, 40 pmol kiekvieno iš sintetinių oligonukleotidų 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ir 15, parodytų Fig. 1-2 buvo fosforilinti 10 vienetų T4 polinukleotido kinazės (gaminta Takara Shuzo Co., Ltd.) 37°C temperatūroje vieną valandą 50 µl reakcijos tirpalo kiekvienam iš jų. Reakcijos tirpalas apdorojamas fenoliu. Nusodinus etanoliu, nuosėdos džiovinamos sumažintame slėgyje ir ištirpinamos steriliame distiliuotame vandenyje. Nusodinus 40 pmol kiekvieno oligomero 150 µl tirpalo, kuriame yra 6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM NaCl, 7 mM MgCl 2 ir 0,1 mM EDTA, 80 o C temperatūroje 5 minutes, esant temperatūrai. 60 o C temperatūroje 5 minutes ir kambario temperatūroje vieną valandą, atitinkamuose I bloko blokuose (oligomerai 1, 2, 3 ir 4), II bloko (5, 6, 7, 8, 9 ir 10 oligomerai) ir III bloke (oligomerai 11, 12, 13, 14, 15 ir 16) atliekamas nusodinimas etanoliu ir džiovinimas sumažintame slėgyje. Likutis ištirpinamas 40 µl sterilaus distiliuoto vandens. Reakcija buvo vykdoma 400 µl reakcijos tirpalo 4 °C temperatūroje 15 valandų, naudojant DNR ligavimo rinkinį (gaminta Takara Shuzo Co., Ltd.). Nusodinus etanoliu ir išdžiovinus sumažintame slėgyje, nuosėdos ištirpinamos steriliame distiliuotame vandenyje: I bloko (1) atveju gelio elektroforezė atliekama 5% poliakrilamide (laboratorijos vadovas), atskiriama ir išgryninama tradiciniu būdu. (laboratorijos vadovas), maždaug 100 bazinių porų fragmentas, o II bloko (2) ir III bloko (3) atveju gelio elektroforezė atliekama 3% agarozės gelyje (LMP agarozė, pagaminta BRL) ( laboratorinis vadovas) ir maždaug 190 porų fragmentai išskiriami ir išgryninami elektroeliu (laboratorijos vadovas). Tada 0,1 μg, 0,2 μg ir 0,2 μg I bloko, II bloko ir III bloko fragmentų atitinkamai surišami naudojant aukščiau pateiktą DNR ligavimo rinkinį. Atlikite gelio elektroforezę 1,5% agarozės koncentracijoje, kad išskirtumėte maždaug 480 bazinių porų Bgl II-Eco R1 fragmentą (IV blokas). Tada DNR išskiriama iš agarozės gelio elektroeliucijos būdu. Tada ši DNR yra fosforilinama 100 µl reakcijos tirpalo 37 °C temperatūroje vieną valandą, naudojant 10 vienetų aukščiau nurodytos T4 polinukleotido kinazės, po to ji apdorojama fenoliu, nusodinama etanoliu ir džiovinama sumažintame slėgyje. Šis sintetinis geno fragmentas ir bloko IV bazės seka buvo patvirtinta bazių sekvenavimu dideoksi metodu, naudojant M13 fago vektorių. Konkrečios technologijos parodytos fig. 6. Sujungus aukščiau pateiktą Bgl II-Eco R1 bloko IV fragmentą su M13 mp18 DNR (gaminta Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.), suardyta restrikcijos fermentais BamH1 (gaminta Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) ir Eco R1 (gaminta Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) jo bazinė seka buvo nustatyta naudojant M13 sekos nustatymo rinkinį (gaminta Taraka Shuzo K., Ltd.) ir 7-DEAZA sekos nustatymo rinkinį (gaminta Takara Shuzo Co. , Ltd.). Bgl11 restrikcijos fermento skilimo vieta ir BamH1 restrikcijos fermento skilimo vieta yra surišamos izoschizomeriniu būdu per (BamH1 - Bgl11 skilimo galas - skilimo vieta), o surištas fragmentas gali būti suskaldytas Xho 11 restrikcijos fermentu, todėl susidaro natūralus Bgl 11 ir Bamh1 skilimo galai atitinkamai. Siekiant tikslesnės bazinės sekos nustatymo, M 13mp18 fagas (sudarantis IV bloko fragmentą) yra užkrėstas E. cjli JM109 pagal Messing/Messing J. metodą, Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983), po to gaunama dvigrandė DNR (replikacinis tipas). Po to, kai ši DNR (50 μg) buvo suardyta restrikcijos fermentais Xho 11 (gamintojas Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co) ir Eco R1, buvo atlikta gelio elektroforezė 1,5 % agarozės gelyje, siekiant išskirti maždaug 480 bazinių porų fragmentą (IV blokas). . Ši DNR išgaunama elektroeliucijos būdu. Išskirtą DNR surišus su M13mp19 DNR (gaminta Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd), suskaidyta restrikcijos fermentais Eco R1 ir BamH1 tokiu pačiu būdu, kaip aprašyta aukščiau, naudojant DNR ligavimo rinkinį, buvo nustatyta bazių seka. Kaip aprašyta aukščiau, šią seką galima tiksliau patikrinti nustatant abiejų DNR seką naudojant M13mP18 ir M13mp19. Be to, aprašytu būdu gaunama dviguba replikacinė DNR M13mp19 (su IV bloku). Suskaidžius šią DNR (50 μg) restrikcijos fermentais Eco R1 ir Xho 11, atliekama gelio elektroforezė 1,5 % agarozėje, išskiriant maždaug 480 bazinių porų fragmentą (IV blokas). 2-2). V bloko išskyrimas (Eco R1-Bal1 fragmentas, apie 1250 bp). Iš 1 pavyzdyje gauto pTRA1 klono plazmidės DNR buvo išskirta dideliais kiekiais pagal metodą, aprašytą laboratorijos vadove, kaip parodyta Fig. 5. Suvirškinus 70 μg šios DNR restrikcijos fermentais Bal1 (gamintojas Takara Shuzo Co., Ltd.) ir Nar1 (gaminta Nirro Gen Co., Ltd.), buvo atlikta 0,8 % agarozės gelio elektroforezė, siekiant išskirti Nar1-. Bal1 fragmentas.(apie 1540 bazinių porų). DNR išskiriama elektroeliucijos būdu. Po tolesnio dalinio šios DNR skaidymo restrikcijos fermentu Eco R1, elektroforezė atliekama 0,7% agarozės gelyje, išryškinant Eco R1-Bal1 fragmentą (apie 1250 bazinių porų). DNR išskiriama elektroeliucijos būdu. 2-3). Patobulinto tAM(II) geno konstravimas iš IV ir V blokų. Kaip parodyta Fig. 5, patobulintas tPA genas gaunamas taip. Po dopingo IV bloko (fragmentas Bgl11-Eco R1, apie 480 bp), gauto 2-1 pavyzdyje, su V bloku (fragmentu Eco R1-Bal1, apie 1250 bp), gautu 2-2 pavyzdyje, naudojant aprašytą DNR dopingo rinkinį aukščiau, legiruotas produktas yra nusodinamas etanoliu. Po džiovinimo sumažintame slėgyje nuosėdos buvo suardytos restrikcijos fermentu Xho 11 įprastu būdu. Tada atliekama 0,8 % agarozės gelio elektroforezė, kad būtų išskirtas Bgl 11-Xho 11 fragmentas (apie 1500 bazinių porų, turi patobulintą tPA geną). Tada DNR išskiriama elektroeliu. Taip gauto patobulinto tPA(II) geno pilna bazinė seka parodyta Fig. 8-13. Išvestinė aminorūgščių seka taip pat parodyta Fig. 14-19. 3 pavyzdys Patobulinto taktinio V, VI ir VIII geno konstravimas. Patobulinto taktinio V, VI arba VIII geno konstrukcija yra pagrįsta patobulintu taktiniu genu (II), remiantis toliau pateiktomis publikacijomis. Genetinė konversija atliekama taikant vietinės mutacijos indukcijos metodą. Publikacijos: Zoller M.J. ir Smith.M., Method in fermentology, 100, p. 468-500 (1983), Zoller M.J. ir Smith. M. DNA, 3, p. 479-488 (1984), Morinaga, Y. ir kt., Biotechnology, p. 636-630 (1984 m. liepos mėn.), Adelman J. P. ir kt., DNA, 2, p. 183-193 ( 1983), 6. M13 sekos nustatymo vadovas (puC), išleistas Jean Sayens Room Co., Ltd.). 3-1). Patobulinto spąstų geno (V) konstravimas. A) M13mp19 (apt/p/) generavimas mutacijai. Patobulintas taktinio geno fragmentas (II), aprašytas 2 pavyzdyje, 2-3), buvo susietas su M13mp9 dvigrande DNR, apdorota BamH1 restrikcijos fermentu ir šarmine fosfataze (gaminta Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligavimo produktas buvo transfekuotas į E. cjli JM109 kompetentingas ląsteles (gaminta Takara Shuzo Co., Ltd.). Kiekvienas klonas, sukuriantis bespalvę sterilią dėmę, buvo naudojamas E. coli JM109 užkrėsti. Iš kultūros supernatanto išskiriama viengrandė DNR, o iš E. cjli ląstelių išskiriama dvigrandė (replikacinė) DNR pagal Mesingo metodą (Messing, J., Methods in Enzymology, 101, p. 20-78, 1983). ). Šių dvigrandžių DNR apibūdinimas po virškinimo restrikcijos fermentu Pst1 agarozės gelio elektroforezės būdu duoda mp9 kloną (patobulintą TPA (II), kuriame TPA (II) genas įterpiamas į mp9 DNR norima kryptimi, kaip parodyta Fig. 21. Dalį šių DNR suskaidžius Pst restrikcijos fermentu, buvo atlikta 0,8 % agarozės gelio elektroforezė, kur klonas mp9 (patobulintas TAP(II) parodė paprastą juostą 7300 bp, 840 bp, 430 bp ir 80 bp padėtyse). , apytiksliai.. Šio klono viengrandė DNR buvo panaudota vėlesniame vietos specifinės mutacijos indukcijos eksperimente. B) Pradmenų, galinčių sukelti vietos specifinę mutaciją, sintezė. Sintetinis oligonukleotidas, naudojamas patobulinto tPA(II) geno vietai specifinei mutacijai sukelti, buvo susintetintas β-cianoetilfosfoamidato metodu, naudojant DNR sintezatoriaus modelį 380 A (gaminta Applied Biosystems). DNR oligomero sintezė, apsauginės grupės pašalinimas, skilimas iš dervos ir gryninimas atliekami pagal DNR sintezatoriaus 380 A naudojimo instrukcijas. Norint sukelti mutaciją konkrečioje vietoje, pradmuo (1), galintis Paruošiami vietai specifinę mutaciją indukuojantys pradmenys (2) dideoksi sekos nustatymui naudojant M13 fago vektorių (Carlson, J. ir kt., Journal of Biotechnology, 1, p. 253, 1984). Pateikiamos patobulinto TSA (II) aminorūgščių ir nukleotidų sekos. Pradmenys (1), galintys sukelti mutaciją, pabraukta baze skiriasi nuo patobulinto gaudyklės (II) genų sekos (žr. 1 lentelę). C) Vietai būdingos mutacijos indukcija. Toliau pateikiamas metodas, skirtas sukurti kloną, turintį pradmens (1) bazinę seką, galinčią sukelti mutaciją, ty patobulinto tPA (IV) geną. Sujungus (renatūravus) viengrandę DNR, aprašytą 3,3-1 pavyzdyje), A) klonas mp9 (patobulintas TPA (II) ir pradmuo (1), renatūracijos produktas buvo paverstas dvigrande DNR, kuri buvo tada transformuojama į E. coli JM109. Tada, naudojant sekos nustatymo pradmenį, DNR sekos tikrinamos, kad būtų išskirtas fago klonas, turintis mutavusį pagerintą tAM(II) geną, t. y. patobulintą TAT(V) geną. 5'- sintetinio oligomero fosforilinimo pabaiga. DNR pradmuo (1), skirtas vietai specifinei mutacijai sukelti, fosforilinamas 2,2-1 pavyzdyje aprašytu metodu). kaitinami 30 µg tirpalo, kuriame yra 2 pmol fosforilinto pradmens (1), 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA ir 50 mM NaCl, 90 °C (2 min.), 50 °C temperatūroje. 5 min.), 37 °C (5 min.) ir kambario temperatūroje (10 min.). Į tirpalą įpilama 36 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) tirpalo, kuriame yra 4 vienetai Klenow fermento, 7 vienetai T4 DNR ligazės, 0,1 mM EDTA, 12 mM MgCl 2, 10 mM ditiotreitolio, 0,7 mM ATP. , 0,07 dATP ir 0,2 mM dGTP, dTTP ir dCTP, kad būtų skatinamas pradmenų pailgėjimas. Mišinys sąveikauja 20 o C temperatūroje 2 valandas ir 4 o C temperatūroje 15 valandų. Transformacija buvo atlikta naudojant aukščiau aprašytą tirpalą ir E. coli JM109 kompetentingas ląsteles (gaminta Takara Shuzo Co., Ltd.), kol susidarė lizės dėmės. Atskyrus bespalvę dėmę, fagas užkrečiamas E. coli JN109, kad jis daugintųsi. Tada iš kiekvieno klono kultūros supernatanto gaunama šabloninė viengrandė DNR. Šioms viengrandėms DNR buvo taikoma tik dideoksi metodo „T“ reakcija (3-2 pavyzdyje „A“ ir „T“ reakcija), naudojant sekos nustatymo pradmenį (2), po to buvo atlikta poliakrilamido gelio elektroforezė. Po džiovinimo gelis buvo analizuojamas autoradiografijos būdu. Remiantis rezultatais, identifikuojamas klonas, turintis pageidaujamą mutanto seką. Klono kultūros supernatantas buvo naudojamas užkrėsti E. coli JM109 ląsteles ir pakartotinai inokuliuotas ant plokštelės, kad būtų išskirta viena dėmė. Iš gautos vienos dėmės vienos grandinės DNR išskiriama aukščiau nurodytu būdu. Naudojant šias DNR, pirmiausia dideoksi metodu buvo nustatyta DNR bazinė seka, naudojant sekos nustatymo pradmenį (2), kad būtų gautas klonas, mutavęs į norimą bazinę seką. Užkrėtus šį fago kloną E. coli JM-109 ląstelėmis, naudojant 2 pavyzdyje aprašytą maišymo metodą, gaunama dvigrandė DNR. Ši dvigrandė DNR buvo suardyta restrikcijos fermentu Xho 11, atlikta elektroforezė 0,8 % agarozės gelyje, siekiant išskirti fragmentą (patobulintas taktinis genas (V) apie 1500 bazinių porų, turintis patobulintą taktinį geną. Tada DNR buvo išskirta Be to, dideoksi metodu nustatoma visa tokiu būdu gautos DNR bazinė seka, pagal kurią nustatoma, kad DNR yra pagerintas tAM(V) genas. genas (tačiau turintis signalinį peptidą nuo -35 iki -1) parodytas 11 - 13 paveiksluose. Iš jo gauta aminorūgščių seka taip pat parodyta 17 - 19 paveiksluose. 3-2) Patobulintų TPA (VI) konstravimas ir (VIII). Metodai yra panašūs į aprašytus 3 pavyzdyje, 3-1). Pirma, sukonstruotas M13mp3 (patobulintas TAP(II)), po kurio sintetinami pradmenys, kad sukeltų vietos specifinę mutaciją. Šių pradmenų bazinė seka aprašyta aukščiau, tačiau 5'-fosforilintas pradmenys (3) ir 5'-fosforilintas pradmenys (5) naudojami patobulintam tAM genui (VI) ir patobulintam taktiniam genui (VIII) sukurti. , atitinkamai (žr. skirtuką. 2). Po specifinės vietos mutacijos indukcijos visa bazių seka nustatoma dideoksi metodu. Patvirtinta, kad jie turi norimas bazines sekas. Taip gaunami patobulinto takto (VI) ir pagerinto takto (VIII) genai. Tada šie genai integruojami į pVY1 vektorių pagal 4 ir 5 pavyzdžiuose aprašytą procedūrą. 4 pavyzdys Patobulinto tPA(II) geno integravimas į pVY1 vektorių. 4-1) pVY1 vektoriaus konstravimas. pVY1 vektorius generuojamas kaip parodyta Fig. 7. A) pAdD26SV (A) N3 (N) konstravimas ir Eco R1 skilimo vietos atskyrimas. Pirma, DNR pAdD26SV(A) N3 (pirkta iš dr. Hiroshi Handa Tokijo universitete, žinoma iš santraukų Mo1, Ce 11. Biol, 2 (11, 1982)) yra atsieta su restrikcijos fermentu Bgl11 (gaminta Boehringer). Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd). ir džiovinant sumažintame slėgyje, nuosėdos ištirpinamos steriliame distiliuotame vandenyje Po tolesnio ligavimo reakcijos mišiniu transformuojamos į kompetentingas E. coli HB101 ląsteles (gaminta Takra Shuzo, Co. Ltd.) Plazmidinės DNR buvo pagamintos iš tetraciklinui atsparių transformantų. įprastu būdu Po to, kai dalis šių DNR buvo suardyta restrikcijos fermentu BgL 1, buvo atlikta elektroforezė esant 0,7 %. Rezultate gaunamas klonas, turintis DNR, kuri nėra suskaldyta restrikcijos fermentu BgL 11, kaip aprašyta aukščiau. Po apdorojimo fenoliu, nusodinimo etanoliu ir džiovinimo sumažintame slėgyje nuosėdos ištirpinamos distiliuotame steriliame vandenyje. B) Kpn 1-BamH1 fragmento (apie 2900 bp) išskyrimas iš pKSV10 ir bukų galų formavimas. Po to, kai pKSV10 DNR (pagaminta Fine Chemicals Pharmacy) buvo suardyta restrikcijos fermentais Kpn1 ir BamH1 įprastiniu būdu, DNR buvo bukas, naudojant T4 DNR polimerazę (laboratorijos vadovas, p. 114-121). Tada atlikite elektroforezę 0,7% agarozės gelyje, paskirdami maždaug 2900 bazinių porų fragmentą. Tada fragmentas elektrolituojamas, kad būtų išgaunama DNR.
C) pVY1 konstravimas. Sujungus DNR fragmentą, gautą pagal A) ir DNR fragmentą, gautą pagal B), kompetentingos E. coli HB101 ląstelės (aprašytos aukščiau) transformuojamos. Iš transformantų, pasižyminčių atsparumu tetraciklinui, plazmidinė DNR gaunama tradiciniu būdu. Dalį šių plazmidinių DNR suskaidžius Pst1 restrikcijos fermentu (gaminta Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd), buvo atlikta 1,0 % agarozės gelio elektroforezė. Rezultatas yra klonas (plazmidė pVY1), kuriam būdingos maždaug 3400 bazių porų, apie 3200 bazių porų ir apie 1400 bazių porų juostos. Šis E/coli HB101 klonas (pVY1 deponuotas Japonijos Pramonės mokslo ir technologijų agentūros Fermentacijos tyrimų moksliniame institute registracijos numeriu P-9625 (FEPM BP 2106). 4-2) Patobulinto tPA integravimas (II) geną į pVY1 vektorių. 4-1 pavyzdyje gautos plazmidės pVY1 DNR suskaidžius įprastu būdu restrikcijos fermentu BgL11, buvo atliktas defosforilinimas naudojant šarminę fosfatazę (gaminta Takara Shuzo. Co. Ltd.). Tada tris kartus apdorokite fenoliu. O nusodinus etanoliu ir išdžiovinus sumažintame slėgyje, nuosėdos ištirpinamos steriliame distiliuotame vandenyje. Po to, kai ši DNR buvo susieta su BgL 11-Xho11 fragmentu (apie 1500 bazių porų), gauto 3, 3-1 pavyzdžiuose), ir kompetentingos E. coli HB101 ląstelės buvo transformuotos ligavimo produktu aukščiau aprašytu būdu. Iš transporantų, turinčių atsparumą tetraciklinui, tradiciniu būdu gaukite plazmidės DNR. Šias DNR suskaidžius restrikcijos fermentais (BqL 11, Pst 1), parenkamas klonas, turintis patobulintą tPA(II) geną pVY1 vektoriuje, integruotą norima kryptimi, atranka atliekama remiantis agarozės gelio analize. elektroforezės modelis. Pirma, dalis šių DNR suardoma su BqL 11 restrikcijos fermentu, po to atliekama 0,8 % agarozės gelio elektroforezė, kad būtų gautas klonas, kurio fragmento juosta yra apie 1500 bazinių porų, kai BqL 11-Xho 11 fragmentas surišamas su BqL fragmentu. 11 plazmidės pVY1, liguota Xho 11 ir BqL 11 dalis gali būti supjaustoma restrikcijos fermentu BqL 11. Šių klonų plazmidinės DNR dalis toliau virškinama restrikcijos fermentu Pst1 ir DNR atliekama elektroforezė. 0,8 % agarozės gelio, kad gautų kloną, turintį vieną maždaug 3400 bp dydžio juostą, dvi maždaug 2300 bp juostas, vieną apie 1400 bp juostą ir vieną apie 80 bp juostą. Naudojant šį kloną (plazmidės pVY1-TPA (II) pagal laboratorijos vadovą, buvo gautos plazmidinės DNR. 4-1 pavyzdyje), restrikcijos fermentas BqL 11 buvo įprastai defosforilinamas naudojant šarminę fosfatazę (gaminta Takara Shuzo, Co., Ltd.). ), po to apdorojama (3 kartus) fenoliu, nusodinama etanoliais ir džiovinama sumažintame slėgyje. Po to nuosėdos ištirpinamos steriliame distiliuotame vandenyje. Po šios DNR surišimo su maždaug 1500 bazinių porų BqLII-Xho 11 fragmentu, gautu 2, 2-3 pavyzdžiuose, ligavimo produktas buvo transformuotas į aukščiau nurodytas kompetentingas E. coli HB101 ląsteles. Plazmidė DNR gaunama iš transformantų, kurie pasižymi atsparumu tetraciklinui, tradiciniu metodu. Suvirškinus šias DNR restrikcijos fermentais BqL11 ir Pstl, atliekama agarozės gelio elektroforezė. Analizuojant atskyrimo modelį agarozės gelyje, atrenkami klonai, kuriuose patobulintas tPA (V) genas įterpiamas į pVYI vektorių norima kryptimi. Pirma, suskaidžius dalį šių DNR su BqL11 restrikcijos fermentu, buvo atlikta 0, 8% agarozės gelio elektroforezė, siekiant gauti klonus ir gauta apie 1500 bazinių porų juosta. Kai BqL11-Xholl fragmentas yra susietas su pVYI vektoriaus BqL11 fragmentu, dalis Xholl ir BqL11 gali būti atskirta naudojant BqL11 restrikcijos fermentą dėl anksčiau minėtos izochizomero konfigūracijos. Toliau suskaidžius šių klonų plazmos DNR restrikcijos fermentu Pstl, elektroforezė buvo atlikta esant 0,8 % agarozės gelio koncentracijai, kad būtų gautas klonas, kurio juosta yra apie 3400 bp, juosta apie 2300 bp, dvi juostos. apie 1400 bp, viena apie 800 bp juosta ir viena apie 80 bp juosta. Remiantis laboratorijos vadovu, naudojant kloną (plazmidę pVYI-TAP(V)) buvo gauta dideli plazmidės DNR kiekiai. Panašiu būdu patobulintų tPA (VI) ir (VIII) genai yra integruoti į pVYI vektorių. 6 pavyzdys Patobulintos tPA ekspresija CHO ląstelėse. Plazmidė pVYI – patobulinta t-PA(VI), t-PA(II), t-PA(V) arba t-PA-(VIII) yra transfekuota į DHFR trūkumą turinčias CHO ląsteles (Urlaub ir kt., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 77(7), 4216-4224, 1980) kalcio fosfato metodu (Graham ir kt. , Viroloqy, 52, 456, 1973). Nustatyta, kad transformato klonas, pagamintas selektyvioje terpėje (MEM A LPHA (-), GIBCO), dalyvaujant metotreksatui (MTX), TAP aktyvumas yra nuo 50 iki 100 vienetų/ml (vertė nustatyta fibrino/agarozės plokštelėje). toliau aprašytas metodas). Šis klonas naudojamas tolesniems tyrimams. Kaip gamybos terpė buvo naudojama GIT terpė (gaminta Waco Pue Chemical Industry Co., Ltd.), praturtinta 20 tarptautinių vienetų/ml (SIGMA) aprotinino. 7 pavyzdys. Patobulinto TSA gryninimas iš CHO ląstelių kultūros supernatanto. Kultūros supernatantas, gautas 6 pavyzdyje, buvo iš dalies išgrynintas anti-TGA monokloninio antikūno afinitetinėje kolonėlėje. Hibridas, gaminantis monokloninius antikūnus, tradiciniu būdu gaunamas t-PA, kilusio iš žmogaus melanomos ląstelių. Antikūnus gaminantis hibridas buvo inokuliuotas į peles, o monokloninis antikūnas (poklasis: IgGM1), sukurtas sergant ascitu, buvo ekstrahuotas ir išgrynintas naudojant Cellulofin Protein A (gaminta Biochemical Industry Co., Ltd.) ir MAPS buferinę sistemą monokloniniam valymui. antikūnas, pagamintas Biorad Laboratories. Antikūnas sujungiamas su CN3r aktyvuota Sepharose (gaminta Pharmacia Fine Chemicals) 4 mg/ml gelio greičiu įprastu būdu. Antikūnų gelis (24 ml) sumaišomas su keturiais litrais kultūros supernatanto. Po švelnaus kratymo per naktį 4 °C temperatūroje, gelis supilamas į kolonėlę (skersmuo 1,5 cm x 20 cm). Tada gelis paeiliui plaunamas 125 ml kiekvieno iš šių tirpalų (1) Tris-HCl buferis pH 7,4 (buferis A), kuriame yra 25 TV/ml aprotinino (gaminta SIGMA) ir 0,01 % (m/v) Tween 80. , (2) buferis A, kuriame yra 0,5 M NaCl, (3) buferis A, kuriame yra 4 M karbamido, ir (4) buferis A. Patobulintas geliu surištas TSA buvo išplautas 0,2 M glicino-HCl buferiu, pH 2, 5, turinčiu 25 tarptautinių vienetų/ml aprotinino ir 0,01 % (m/v) Tween 80. Aktyvios frakcijos išgaunamos ir sujungiamos. Po dializės prieš 10 mM Tris-HCl buferį, pH 7,4, turintį 25 tarptautinius vienetus/ml aprotinino ir 0,01 % (m/v) Tween 80, dializatas buvo koncentruojamas 20-30 kartų per naktį vakuuminiu išcentriniu koncentratu (Speed VAC, pagamintas pateikė SAVANT Inc.). Koncentratas dar kartą per naktį dializuojamas prieš 10 mM Tris-HCl buferį, pH 7,4, kuriame yra 0,15 M NaCl, 25 TV/ml aprotinino ir 0,01 % (m/v) Tween 80, ir naudojamas tolesniems vertinimams in vitro ir in vivo. . Galiausiai specifinis aktyvumas padidėja 3700-5000 kartų, o išeiga yra nuo 36 iki 42% TAP aktyvumo (nustatyta fibrino/agarozės taurelės metodu). Ši aktyvi frakcija analizuojama natrio dodecilsulfato elektroforeze ir dažant sidabru. Redukuojančiomis sąlygomis pastebima labai stipri 54 kilodaltonų juosta kartu su keliomis kitomis juostomis. Po to elektroforezės gelis apdorojamas 2,5 % (m/v) Triton X-100 ir dedamas ant fibrino/agarozės plokštelės, kad būtų galima autografuoti fibriną 37°C temperatūroje, o ištirpusi juosta aptinkama ties maždaug 50 kilodaltonų. Tame pačiame puodelyje natūralus TPA yra apie 60 kilodaltonų. Rezultatai rodo, kad TAP, absorbuotas ant antikūnų afiniteto kolonėlės ir išplautas šiuo metodu, atitinka patobulintą TPT, kurio molekulinė masė yra maždaug 10 000 mažesnė nei natūraliai pasitaikančio tipo. 8 pavyzdys. Patobulinto takto specifinio aktyvumo matavimas. Baltymų kiekis iš dalies išgrynintame pagerintame TSA nustatomas išmatuojant bendrą baltymą pagal Bradfordo metodą (Bradford, Anal. Bochem., 72, 248 (1976)), naudojant galvijų serumo albuminą kaip etaloninį baltymą. Antigeno TAP kiekis matuojamas fermento imunologiniu tyrimu (ELISA). Fibrinolizinis aktyvumas nustatomas fibrino/agarozės plokštelės metodu ir 1 žymėto fibrino 125 plėvelės tirpinimo metodu. Fibrino/agarozės plokštelė paruošiama pridedant agaro į 95% koaguliuoto fibrinogeno. Plėvele 125 1 pažymėto fibrino tirpinimo metodas atliekamas pagal Hoyraeerts ir kt. aprašymą. (J. Biol. Chem. 257, 2912, 1982), naudojant žmogaus melanomos ląstelių TBA, pagamintą Bioscott Inc., kaip atskaitą. ir standartizuotas pagal tarptautinį APT standartą (Gaffuey ir Curtis, Thromb. Haemostas, 53, 34, 1985). Specifinio aktyvumo vertė, apskaičiuota pagal aktyvumo vertę, nustatytą 1-fibrino 125 plėvelės ištirpinimo metodu, ir antigeno kiekio, nustatyto fermento imunologiniu tyrimu (ELISA), svyravo nuo 300 000 iki 420 000 vienetų/mg antigeno. 9 pavyzdys Fibrino afinitetas ir pagerėjusio TAP fibrino aktyvinimas
Remdamiesi Verheijen ir kt./EMBOJ, 5, 3525, 1986) darbu, ištirkite patobulinto TSA afinitetą fibrinui. Į fibrinogeną įvairiomis koncentracijomis pridedamas sustiprintas arba natūraliai atsirandantis TAP (1000 vnt./ml), po to vienas trombono vienetas, po to 3 minutes reaguojama kambario temperatūroje. Susidaręs fibrino krešulys nusodinamas centrifuguojant 16 000 aps./min 8 minutes, o su fibrinu nesusijungusio TSA kiekis nustatomas matuojant fibrino/agarozės aktyvumą fibrino/agarozės plokštelės metodu. Dėl to buvo nustatyta, kad patobulintas TAP (VI) turi tokį patį afinitetą fibrinui kaip ir natūrali forma. Siekiant ištirti patobulintų spąstų plazminogeno aktyvavimo mastą, kai yra arba nėra fibrino, buvo atliktas toks eksperimentas. Naudojant titravimo plokštelę, natūraliai atsirandantis arba pagerintas TSA pridedamas į 0,1 M Tris-HCl buferį, pH 7,5, kuriame yra 0,3 mM sintetinio substrato p-niroanilido tripeptido S-2251 (H-D-Val-leulys-pNA HCl, gamintojas Kabi Inc. ), 0,13 μM plazminogeno be plazmino, 120 μg/ml DESAFIB TM (gaminta American Diagnostics Inc.) ir 0,1 % Tween 80, kad bendras tūris būtų 200 μl. Sistema palaikoma 37°C temperatūroje. Po tam tikro laiko, naudojant Titertech Multiscan 310 modelį, išmatuojama absorbcija (optinis tankis) esant 405 nm. Patobulinto gaudyklės (VI) amidolitinio aktyvumo ir natūraliai atsiradusio takto dozės-atsako kreivė parodyta Fig. 22. Dozės ir atsako kreivės poslinkis, pridėjus DESAFIB TM natūraliai atsirandančiam t-PA, atitinka 158 kartų reikšmę, o patobulinto t-PA – 100 kartų. Taip yra dėl to, kad patobulinto TSA (VI) aktyvumas, kai nėra DESAFIB TM, yra mažesnis, maždaug 1/20, nei natūralaus TSA aktyvumas. 10 pavyzdys. Fibrinolizinio aktyvumo patobulinto spąstų analizė triušio kraujotakoje. Farmakinetika, lyginant natūraliai atsirandančio t-PA (n-t-PA) ir šio išradimo patobulinto t-PA aktyvumą triušiuose. Kaip matyti iš Fig. 23, patobulintas spąstas rodo žymų biologinio pusinės eliminacijos periodo pailgėjimą aktyvioje būsenoje (natūralaus takto pusinės eliminacijos laikas yra 1-2 minutės, o patobulintas taktas yra biologiškai aktyvus 8-15 minučių). Be to, akivaizdu, kad 5% aktyvumo reikšmė (po 30 sekundžių po vartojimo yra 100%) išlieka patobulintame TAP net ir praėjus 60 minučių po jo vartojimo (natūralus TAP po 60 minučių rodo 0,1% pradinis). Šis eksperimentas atliekamas taip
Tyrimui parenkamas 2,4 kg sveriantis japoniškas baltasis triušis. Taikant anesteziją su pentobarbitaliu, ART įvedamas per periferinę ausies veną. Dozė yra 15400 vienetų (0,8 ml) pagerinto gaudyklės vienam triušiui ir 5400 vienetų (0,8 ml) n-trac vienam triušiui (vertės nustatytos fibrino plokštelės metodu). Tada iš šlaunies arterijos, naudojant kateterį, įvairiais laiko intervalais (nuo 0,5 iki 60 minučių) surenkama 2,5 ml kraujo ir įpilama į 1/9 tūrio natrio citrato (3,8%). Per 30 minučių po kraujo paėmimo centrifuguojama mažu greičiu, atskiriant plazmą. Naudodami atskirtą plazmą išmatuokite t-PA aktyvumą kraujyje. (1) APT aktyvumo matavimas. 16 kartų atskiedus 0,2 ml plazmos 3 mM ledine acto rūgštimi, praskiestas produktas centrifuguojamas mažu greičiu, kad susidarytų nuosėdos. Nuosėdos ištirpinamos 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, su 140 mM NaCl tūriu, atitinkančiu plazmos tūrį, kad būtų gauta euglobulino frakcija. tPA aktyvumas nustatomas pridedant šią euglobulino frakciją į fibrino/agarozės lėkštelę. 16 valandų inkubavus plokštelę 37 o C temperatūroje, t-PA aktyvumas stebimas plokštelės pavidalu. Standartinė fibrino/agarozės plokštelės metodo kreivė paruošiama skiedžiant TSA, naudotą gyvūnui leisti iki 0,1–10 000 vienetų/ml. Taip nustatytas kraujo gaudyklės aktyvumas išreiškiamas procentais, naudojant taktinį aktyvumą, gautą paimant kraują praėjus 30 s po įvedimo, imant 100 %. 11 pavyzdys. Patobulinto TAP (VI) atsparumas karščiui ir rūgštims. Norint nustatyti atsparumą karščiui, patobulintas gaudyklė (VI) ir natūralus gaudyklė skiedžiamas 50 mM Tris buferiu, kuriame yra 100 mM NaCl ir 0,01 % Tween 80, pH 7,4, atitinkamai iki 100 μg/ml koncentracijos. Kiekvienas tirpalas laikomas verdančiame vandenyje (temperatūra 98 o C) 2-60 minučių. Atšaldžius liekamasis aktyvumas nustatomas fibrino taurelės metodu. Kaip parodyta Fig. 24, pagerinto gaudyklės (VI) aktyvumo sumažėjimas yra nežymus, palyginti su natūralaus takto aktyvumo sumažėjimu. Pavyzdžiui, po terminio apdorojimo 2 minutes natūralaus takto aktyvumas sumažėja iki 25%, o patobulintas taktas (VI) vis tiek išlaiko 71%. Norint ištirti atsparumą rūgštims, patobulintas TAP (VI) ir natūralus TAP ištirpinamas 0,5 N. HCl tirpalas, kurio koncentracija 100 µg/ml, po to 30 minučių nusėskite kambario temperatūroje. Po neutralizavimo aktyvumas nustatomas fibrino taurelės metodu. Patobulintas TP neaptinka jokio aktyvumo pokyčio, o natūralaus TP aktyvumas sumažėja 50%. 12 pavyzdys Aktyvaus limfocitus stimuliuojančio faktoriaus slopinimas pagerintu TSA (VI)
Pagerintas TSA (VI) ir natūralus TPA yra tinkamai atskiesti PPM1 1640 audinių auginimo terpėje, kurioje yra 7% veršelio vaisiaus serumo ir 58 μM 2-merkaptoetanolio. 100 µl praskiedimo įpilama į 96 šulinėlių audinių kultūros plokštelę, po to įpilama 50 µl ląstelių suspensijos, kurioje yra timocitų (210 7 ląstelių/ml) iš 4–6 savaičių amžiaus C3H/He J patinų koncanavalino A ( 1,2 μg/ml), taip pat 50 μl IL-1 (4 vnt./ml, Aenzyme Inc), po to 48 valandas kultivuojama inkubatoriuje 37 o C temperatūroje, kuriame yra 5 % anglies dioksido. Tada įpilkite 0,5 mikrono koncentracijos H 3 -timidino. kubas colis / 20 µl/šulinėlis. Po 18 valandų kultivavimo ląstelės buvo surenkamos ant stiklo pluošto filtro, o į ląsteles sušvirkšto 3H-timidino kiekis matuojamas skysčių scintiliacijos skaitikliu, siekiant nustatyti limfocitus stimuliuojančio faktoriaus aktyvumą. Kaip parodyta 25 pav., natūralus spąstai neslopina limfocitus stimuliuojančio faktoriaus aktyvumo, o patobulintas taktas jį žymiai slopina. Bandant tik su tirpikliu, jokio poveikio nepastebėta. 13 pavyzdys Priešuždegiminis aktyvumas, pagrįstas poveikiu denatūruotam baltymui. 1) Denatūruoto baltymo gavimas. Inkubavus baltymo tirpalą (5 mg/ml) 0,1 N. HCl tirpalas arba 0,1 N. NaOH tirpalas 37 o C temperatūroje 2-3 valandas, baltyminis tirpalas neutralizuojamas tokiu pat kiekiu NaOH arba HCl. 2) Patobulinto gaudyklės (VI) giminingumas denatūruotam baltymui. Metodas: Pagal toliau pateiktą procedūrą denatūruotas baltymas „sujungiamas“ su nitroceliuliozės plėvele. Tada išmatuojamas pagerinto TSA kiekis, susijęs su apdorojimu baltymais ir nitroceliuliozės plėvele, taip įvertinant patobulinto TSA afinitetą denatūruotam baltymui. Nitroceliuliozės plėvelės gabalas panardinamas į 20 mM Tris-HCl buferinį tirpalą, pH 7,5, kuriame yra 140 mM NaCl. Džiovinimas. Denatūruotas baltymas (50 µg/10 µl) lašinamas ant nitroceliuliozės plėvelės gabalėlio. Džiovinimas. Blokavimas 3% želatinos tirpalu. Paraudimas. Nitroceliuliozės plėvelės gabalėlis panardinamas į pagerinto TSA /1mcg/ml/ tirpalą. Paraudimas. Įpilama plazminogeno ir sintetinio substrato S-2251, po to inkubuojama 37 o C temperatūroje (kiekybinė absorbuoto pagerinto TBA analizė). Sugerties matavimas esant 405 nm. Rezultatai: Kaip parodyta 3 lentelėje, patobulintas tPA rodo afinitetą IgG, apdorotam HCl, albuminui, apdorotam HCl, albuminui, apdorotam NaOH. Kita vertus, patobulinti spąstai neturi afiniteto nepažeistam imunoglobulinui G ir albuminui. 3) Patobulinto APT (VI) aktyvavimas denatūruotu baltymu. Metodas: Plazminogenas (0,0078 vienetai 10 µl), 100 µl 3 mM sintetinio substrato S-2251 ir įvairūs TBS buferio kiekiai pridedami prie pažangaus TBA aktyvatoriaus (denatūruoto baltymo, BrCN apdoroto fibrinogeno ir kt.) reakcijos tirpalo. ) esant įvairioms koncentracijoms, kad gautųsi 0,275 ml reakcijos tirpalo. Patobulintas TSA (2,5 n/g 25 µl) pridedamas prie reakcijos tirpalo, kad būtų pradėta reakcija. Po tam tikro laiko reakcijos į reakcijos tirpalą buvo pridėta 2% natrio dodecilsulfato (ekvimolinis kiekis), kad reakcija būtų sustabdyta. Matuodami optinį tankį (OD 405) nustatykite patobulinto takto aktyvumą. Rezultatai: Kaip parodyta 26 pav., NaOH apdorotas albuminas ir HCl apdorotas imunoglobulinas G rodo ryškų patobulintų spąstų aktyvinamąjį poveikį. Visų pirma, HCl apdorotame IgG aktyvacija yra stipri, o HCl apdoroto IgG aktyvumas yra maždaug lygus BrCN apdoroto fibrinogeno aktyvumui ir kai koncentracija yra kelis kartus mažesnė. Nepažeistas albuminas ir imunoglobulinas G neaktyvuoja. 4) Denatūruoto baltymo skilimas veikiant patobulintam gaudytojui (VI). Metodas: po to, kai denatūruotas baltymas reaguoja su pagerintu TSA tomis pačiomis sąlygomis kaip ir ankstesnėje pastraipoje aprašytu metodu, išskyrus tai, kad į reakcijos sistemą nededama sintetinio substrato S-2251, o denatūruoto baltymo kiekis yra 133 µg. /ml, atlikti elektroforezę poliakrilamido gelyje su natrio dodecilsulfatu, dalyvaujant α-merkaptoetanoliui. Rezultatai: Kaip parodyta 27 pav., baltymas, denatūruotas apdorojant NaOH arba HCl, lėmė ef-baltymų juostų išnykimą ir susidarė skilimo produktai, rodantys jo skilimą. Kita vertus, naudojant nepažeistą albuminą, po sąveikos su patobulintu spąstu ef modelio pokyčių nenustatyta, todėl denatūruoto baltymo skilimas nebuvo nustatytas.
REIKALAVIMAS
1. Rekombinantinis audinių plazminogeno aktyvatorius, kurio aminorūgščių seka parodyta p. kur Y yra Glu-Ile-Lys;H2N-amino;
COOH – karboksigalas;
R yra tiesioginė nuoroda arba į ją panaši seka, turinti pakaitų ir (arba) ištrynimų ir (arba) intarpų, nesusijusių su aktyvumo pokyčiais,
Ir turinčios šias savybes: fibrinolizinį aktyvumą, nulemtą plėvelės 1 2 5 I-fibrino tirpinimo metodu, gebėjimą aktyvuotis fibrinu ir pagerinto tpA aktyvumą, kai nėra fibrino, kuris yra mažesnis už natūralus tpA, padidėjęs, lyginant su natūralia forma, pusinės eliminacijos laikas, pailgėjęs, lyginant su natūraliu tpA, atsparumas rūgštims ir karščiui, gebėjimas slopinti limfocitus aktyvinantį faktorių, gebėjimas aktyvuotis denatūruotu baltymu. 2. Rekombinantinio audinio plazminogeno aktyvatoriaus gamybos būdas, įskaitant ląstelių šeimininkų, transformuotų rekombinantine DNR, turinčia seką, koduojančią tpA analogą, kultivavimą ir vėlesnį tikslinio produkto gryninimą, b e s i s k i r i a n t i tuo, kad ląstelės šeimininkės yra kultivuojamos transformuotos rekombinantiniu vektoriumi, turinčiu DNR seka, koduojanti tpA 1 punkte.
Ir yra svarbus fibrinolizės sistemos komponentas. Plazminogeno aktyvatorius yra vienas iš dažniausiai dalyvaujančių fermentų sunaikinant bazinę membraną, tarpląstelinę matricą ir invaziją į ląsteles. Jį gamina endotelis ir jis yra kraujagyslės sienelėje [Loscalso, ea 1988]. Audinių faktorius yra fosfolipoproteinas. Šio komplekso apoproteinas yra vientisas membranos glikoproteinas su molekulėmis. sveriantis apie 46 kDa, kuris yra stipriai susijęs su endotelio, lygiųjų raumenų ląstelių membranų fosfolipidais, monocitais. TPA sintetinamas in vivo kaip vienos grandinės polipeptidas (molekulinė masė 72 kDa), kuris įvairių proteinazių, įskaitant plazminą, audinių kallikreiną ir aktyvuotą X faktorių, proteolizės būdu paverčiamas į dvigrandę. Dvigrandė tPA forma yra aktyvesnė nei vienos grandinės pirmtakas. Fermento veikimo pH optimalus, kai angiotenzinogenas virsta Ang II, yra rūgštinėje srityje. Žiūrėkite tPA kaip ang II formuojantį fermentą. Iš kraujo gaunamas tPA yra endotelio aktyvatorius, išsiskiriantis į kraują reaguojant į įvairius dirgiklius. tPA koncentracija kraujyje yra 6,6+/-2,9 ng/ml.
Audinių faktorius, transmembraninis glikoproteinas, II klasės citokinų receptorių šeimos narys, gali sukelti ląstelių aktyvaciją dviem mechanizmais.
Audinių faktorius, išorinio kraujo krešėjimo mechanizmo aktyvavimo iniciatorius, lokalizuotas endotelio ir lygiųjų raumenų ląstelėse, kai jos yra pažeistos, liečiasi su krauju, o tai galiausiai prisideda prie trombino susidarymo ir kraujo paleidimo. krešėjimo mechanizmas. Jis turi didelį afinitetą F.VII, cirkuliuojančiam kraujyje. Esant Ca++ jonams, apoproteinas T.f. sudaro stechiometrinį kompleksą su f.VII, sukeldamas jo konformacinius pokyčius ir pastarąją paversdamas serino proteinaze f.VIIa, skaidydamas Arg-152-Ile peptidinę jungtį. Reakciją skatina nedideli kiekiai kraujyje cirkuliuojančių proteinazių (f.Xa, trombinas, f.VIIa, f.IXa). Gautas kompleksas (f.VIIa-T.f.) paverčia f.X į serino proteinazę f.Xa. Audinio faktoriaus ir VII faktoriaus kompleksas gali aktyvuoti ir X faktorių, ir IX faktorių, o tai galiausiai prisideda prie trombino a susidarymo [Boyle, E.M., Verrier, E.D., ea., (1996)].
Baltymų struktūroje T.f. Yra trys domenai: pagrindinė, esanti ląstelės membranos paviršiuje, transmembraninė ir citoplazminė. Receptorių funkcijos turi paviršiaus domeną, kuriame yra 219 aminorūgščių liekanų Ser-1-Glu-219. Po 23 narių transmembraninio domeno seka citoplazminė „uodega“, per kurią baltymas pritvirtinamas prie membranos. Čia realizuojama galimybė, kad viena šio domeno Cys liekana sudarytų tioeterio ryšį su membranos lipidais (palmitatu arba stearatu). Tam tikras vaidmuo priskiriamas alifatinių aminorūgščių liekanoms, kurių pagalba baltymas įterpiamas į vidinį membranos sluoksnį, taip sustiprinant audinių faktoriaus molekulės „įtvirtinimą“. Paviršiaus domenas yra glikozilintas prie trijų treonino liekanų (Thr-13, Thr-126, Thr-139). Jame yra 4 Cys liekanos, kurios sudaro dvi disulfidines jungtis, vieną N-gale, o kitą - C-gale domeno srityje. Šie ryšiai stabilizuoja atitinkamas peptidines kilpas. Įrodyta, kad C-galinėje srityje esanti disulfidinė jungtis yra funkciškai reikšminga, būtent jos dalyvavimas yra būtinas audinių faktoriaus kofaktorių funkcijoms pasireikšti VII ir VIIa faktorių atžvilgiu. Remiantis pirminės struktūros analize, disulfidinių jungčių išsidėstymu ir funkcinių ypatybių tyrimu, buvo atskleista jo homologija su II klasės citokinų receptorių šeimos interferonais Ifn-alphaR ir Ifn-gammaR. Kraujo krešėjimo sistemoje VII/VIIa faktorių sąveika su receptoriumi – kofaktoriumi – audinių faktoriumi, kelis tūkstančius kartų pagreitina išorinio hemokoaguliacijos mechanizmo aktyvavimą. Šis pagreitis pasiekiamas:
Pirma, proteolitinis mechanizmas, kurį inicijuoja audinių faktoriaus komplekso susidarymas su VII/VIIa (VII aktyvus) kraujo krešėjimo faktoriumi, kuriame audinių faktorius veikia kaip VII/VIIa faktoriaus kofaktorius ir moduliatorius. VIIa faktoriaus prisijungimas prie audinių faktoriaus padidina mitogenų aktyvuotų proteinkinazių (MAP kinazių) – Erk-1, Erk-2, p38, Jnk intracelulinį Ca2+ fosforilinimą ir sukelia Egr-1 geno transkripciją (ankstyvas augimo atsakas) , dažniausiai sukeliamas citokinų ir faktorių augimo.
Antra, naudojant neproteolitinį mechanizmą, kai paties audinio faktoriaus citoplazminis domenas dalyvauja tarpląsteliniame signalizavime, todėl
Įtraukta į vaistus
Įtraukta į sąrašą (2014 m. gruodžio 30 d. Rusijos Federacijos Vyriausybės dekretas Nr. 2782-r):VED
ATH:B.01.A.D.02 Alteplase
Farmakodinamika:Žmogaus audinių plazminogeno aktyvatorius (rekombinantinis): plazminogeno aktyvinimas, plazminogeno pavertimas plazminu, fibrino, fibrinogeno, V ir VIII krešėjimo faktorių sunaikinimas.
Farmakologinis poveikis
Trombolitinis.
Farmakokinetika:Biotransformacija vyksta kepenyse. T1/2 - 35 min. Pašalinimas per inkstus (80% - metabolitų pavidalu).
Indikacijos:Miokardo infarktas (per pirmąsias 6-12 valandų), ūminė masinė plaučių embolija, ūminis išeminis insultas,
apatinių galūnių periferinių arterijų trombozėIX.I20-I25.I21 Ūminis miokardo infarktas
IX.I26-I28.I26 Plaučių embolija
Kontraindikacijos:Hemoraginis vaskulitas, hemoraginė retinopatija, kartu vartojami netiesioginiai antikoaguliantai. Sunkus ar pavojingas kraujavimas (esantis arba neseniai), smegenų kraujotakos sutrikimas (intrakranijinis kraujavimas, hemoraginis insultas), įskaitant per pastaruosius 6 mėnesius. Centrinės nervų sistemos ir kitos lokalizacijos navikai, kartu su padidėjusia kraujavimo, aneurizmos, intrakranijinės ar stuburo operacijos rizika (paskutinių 2 mėnesių istorija). Sunki trauma (per pastarąsias dešimt dienų), trauminis atviros širdies masažas (per pastarąsias 10 dienų). Akušerinis gimdymas (per pastarąsias 10 dienų). Operatyvinės intervencijos, mažo slėgio kraujagyslių punkcija: pavyzdžiui, poraktinė ar jungo vena (per pastarąsias 10 dienų). Sunki nekontroliuojama hipertenzija. Bakterinis endokarditas, perikarditas. Skrandžio ir dvylikapirštės žarnos pepsinė opa (per 3 mėnesius nuo paūmėjimo pradžios), ūminis pankreatitas.
Arterinės ar veninės apsigimimai Kepenų nepakankamumas, kepenų cirozė, portalinė hipertenzija, aktyvus hepatitas. Stemplės venų varikozė. Pacientas yra vyresnis nei 70 metų.
Atsargiai:Neseniai patirti nedideli sužalojimai dėl biopsijos, kraujagyslių punkcijos, injekcijos į raumenis, širdies masažo ir kitų būklių, kurias lydi kraujavimo rizika.
Nėštumas ir žindymo laikotarpis:Nėštumas
FDA rekomendacijų kategorija nebuvo nustatyta. Kontroliuojami tyrimai su žmonėmis ir gyvūnais nebuvo atlikti. Manoma, kad per pirmąsias 18 nėštumo savaičių vartojami tromboliziniai vaistai padidina priešlaikinio placentos atsiskyrimo riziką, nes ji daugiausiai fibrinu prisitvirtina prie gimdos.
Laktacija
Informacijos apie prasiskverbimą į motinos pieną ir komplikacijas nėra. Kadangi daugelis vaistų išsiskiria su pienu, trombolizinius vaistus žindančioms moterims reikia skirti atsargiai.
Dozavimas ir vartojimas:Pirmąsias 6 valandas - 15 mg boliusas į veną per 1-2 minutes, po to - 50 mg dozės infuzija per 30 minučių ir 35 mg - 60 minučių prieš pasiekiant didžiausią dozę (100 mg). ). Pacientams, sveriantiems mažiau nei 65 kg - į veną 15 mg ir 0,75 mg / kg boliuso dozėmis per 30 minučių (daugiausia - 50 mg); tada - 0,5 mg / kg infuzija 60 minučių (daugiausia - 35 mg). Praėjus 6-12 valandų nuo simptomų atsiradimo, vaistas suleidžiamas į veną 10 mg boliuso pavidalu, o pirmąją valandą - 50 mg infuzijos būdu, o vėliau - 10 mg per 30 minučių (iki didžiausia 100 mg dozė per 3 valandas). Pacientams, sveriantiems mažiau nei 65 kg, vaisto dozė yra ne didesnė kaip 1,5 mg / kg.
Tuo pačiu metu paskirti acetilsalicilo rūgštį ir. Acetilsalicilo rūgštis - 160-300 mg per parą po simptomų atsiradimo keletą mėnesių; - prieš pradedant trombolizinį gydymą, į veną boliuso pavidalu, kai dozė yra 5 tūkst. TV, po to - 1 tūkst. TV / h, atsižvelgiant į APTT (aktyvintą dalinį tromboplastino laiką), matuojant kelis kartus (vertės turėtų būti būti 1,5–2,5 karto didesnis nei originalus).
Ūminė masinė plaučių embolija kartu su nestabilia hemodinamika. Į veną 10 mg boliuso dozė per 1-2 minutes, po to 90 mg į veną per 2 valandas Bendra vaisto dozė pacientams, sveriantiems mažiau nei 65 kg, neturi viršyti 1,5 mg/kg. Jei PV viršija pradinę vertę mažiau nei 2 kartus, tada jis skiriamas tuo pačiu metu (kontroliuojant APTT). Esant masinei plaučių embolijai su nestabilia hemodinamika, vaistas veikia taip pat kaip. Bendros 100 mg alteplazės dozės įvedimas per 2 valandas yra panašus į reteplazės, streptokinazės, kai dozė yra 1,5 milijono TV 2 valandas, urokinazės, kai dozė yra 1 milijonas TV, boliuso dozę 10 minučių (po to - 2 mln. TV į veną 2 val.) ir veiksmingiau nei lašinamas natrio heparinas 1750 TV/val. Pastaruoju atveju šalutinio poveikio tikimybė yra didesnė.
Ūminis išeminis insultas - trombolizė (įskaitant alteplazę nuo 0,9 mg / kg iki 90 mg 100 ml 0,9% natrio chlorido. 10% dozės kaip boliusas, likusi dalis - į veną 1 val.; Alteplazė 0,85 mg / per parą kg į veną per 60 minučių per pirmąsias 90 minučių ir 91-180 minučių nuo ligos pradžios); alteplazė (rekombinantinis audinių plazminogeno aktyvatorius) 1,1 mg/kg iki 100 mg IV, 10 % dozės boliuso pavidalu, likusi dalis IV 1 val.;
Vietiškai vartojant apatinių galūnių periferinių arterijų trombozės atveju, alteplazė yra pranašesnė už urokinazę. Sergant smegenų arterijų tromboze, 2 mln. V/d alteplazės skyrimas turi pranašumų, palyginti su 60 tūkst. V/d urokinazės įvedimu į veną 7 dienas.
Vartoti vaikams
Veiksmingumas ir saugumas netirti.
Sergant intravaskuline tromboze, vaistas skiriamas į veną srove (steriliame injekciniame vandenyje, kol gaunamas 1 mg / ml koncentracijos tirpalas) arba lašinamas (0,9% natrio chlorido tirpale, kol koncentracija pasiekia 200 μg / ml). . Negalima skiesti vaisto dekstrozės tirpalu. Naujagimiams vaistas skiriamas 100-500 mcg / kg per valandą 3-6 valandas; vaikai nuo 1 mėnesio iki 18 metų - 100-500 mcg / kg per valandą 3-6 valandas (didžiausia paros dozė - 100 mg). Prieš skiriant antrą kursą, būtina ultragarsu stebėti atsaką į pirmąjį kursą.
Esant arterioveninių šuntų ar kateterių okliuzijai 1 mėnesio–18 metų vaikams, vaistas įšvirkščiamas tiesiai į kateterį ne didesne kaip 2 ml (priklausomai nuo kateterio tipo) tirpalo, kurio koncentracija 1 mg/ml; lizatas išsiurbiamas po 4 valandų, po to kateteris išplaunamas 0,9 % natrio chlorido tirpalu. Informacijos apie vaisto vartojimą naujagimių arterijų ar venų trombozei gydyti nėra.
Šalutiniai poveikiai:Hematologinis: kraujavimas, mirtinas intrakranijinis kraujavimas (vartojamas ūminiu išeminio insulto laikotarpiu) Iš širdies ir kraujagyslių sistemos pusės: krūtinės skausmas, aritmijos, hipotenzija, nesusijusi su kraujavimu ar aritmija. Padidėjęs jautrumas: alerginės reakcijos Kita: karščiavimas.
Perdozavimas:Kraujavimas. Gydymas: šviežios šaldytos plazmos, viso kraujo perpylimas, plazmą pakeičiantys tirpalai, sintetiniai fibrinolizės inhibitoriai.
Sąveika:Kraujavimo rizika didėja kartu vartojant kumarino darinius, antitrombocitus, hepariną ir kitus kraujo krešėjimą slopinančius vaistus.
Specialios instrukcijos:Esant ūminiam koronariniam sindromui, patartina atlikti trombolizę. Tai padeda sumažinti mirtingumą ir yra ekonomiškas. Paskyrus audinių plazminogeno aktyvatorių, streptokinazę ir anizoluotą plazminogeno-streptokinazės kompleksą, išgyvenamumas nesiskyrė; aptariama trombolizinio gydymo trukmė ir režimas. Papildomas gydymas antikoaguliantais ir antitrombocitais vaistais tikriausiai padidina trombolizinio gydymo veiksmingumą.
Kuo anksčiau atliekama trombolizė, tuo ji efektyvesnė. Būtent todėl trombolizė turėtų būti įtraukta į kasdienę gydymo įstaigų praktiką. Reikia atsižvelgti į riziką, kad gali prireikti gaivinimo, susijusio su trombolize.
Ambulatorinėje praktikoje pasirinktu vaistu laikoma urokinazė (tenekteplazės ar reteplazės boliusas), stacionariomis sąlygomis - streptokinazė (išskyrus tuos atvejus, kai pacientai ją gavo anksčiau). Naujesni vaistai (alteplazė) yra brangesni, todėl negali būti pirmos eilės vaistai. Apytikslė vieno paciento gydymo kurso kaina, naudojant audinių tromboplastino aktyvatoriaus inhibitorių, yra 2900 USD, naudojant streptokinazę - 400 USD, anizoluotą plazminogeno-streptokinazės kompleksą - 1900 USD, o urokinazę - 775 USD.
Sveikatos priežiūros įstaigų vadovai ir administratoriai, ligoninių kardiologai turėtų padėti bendrosios praktikos gydytojams atlikti trombolizę.
Koagulogramos (APTT, fibrinogeno, fibrino skilimo produktų, trombino laiko), hematokrito, hemoglobino koncentracijos, trombocitų skaičiaus, elektrokardiogramos (su vainikinių arterijų tromboze) stebėjimas; su smegenų kraujagyslių tromboze - psichinės ir neurologinės būklės kontrolė (prieš gydymo pradžią ir periodiškai vartojant vaistą). Gydymui laikui bėgant įvertinti naudojamas vienas ar keli kriterijai; reguliariai nustatomas kraujospūdis, pulsas ir kvėpavimo dažnis.
Vartojant didesnes nei 100 mg vaisto dozes, padidėja hemoraginių komplikacijų atsiradimo rizika.
Reikia įvertinti galimą alteplazės vartojimo riziką ir naudą atsižvelgiant į neseniai patirtus nedidelius sužalojimus (biopsija, kraujagyslių punkcija, injekcijos į raumenis, širdies masažas) ir kitas sąlygas, susijusias su kraujavimo rizika nėštumo metu, per pirmąsias 10 dienų po gimdymo (padidėjęs). kraujavimo rizika) žindymo laikotarpiu, senyviems žmonėms ir vaikams.
Natrio heparino vartojimas atšaukiamas prieš trombolizinį gydymą; Kitas įvedimas galimas po trombolizės ir trombino laiko ir (arba) APTT grįžimo iki du kartus didesnių nei kontrolinių verčių arba mažesnių (paprastai po 2-4 valandų).
Instrukcijos Temos "Eozinofilai. Monocitai. Trombocitai. Hemostazė. Kraujo krešėjimo sistema. Antikoaguliantinė kraujo sistema" turinys.:1. Eozinofilai. Eozinofilų funkcijos. Eozinofilinių leukocitų funkcijos. Eozinofilija.
2. Monocitai. makrofagai. Monocitų – makrofagų funkcijos. Normalus monocitų – makrofagų skaičius.
3. Granulocitopoezės ir monocitopoezės reguliavimas. Granulocitų kolonijas stimuliuojantys veiksniai. Keylons.
4. Trombocitai. Trombocitų struktūra. Trombocitų funkcijos. Glikoproteinų funkcijos. Hialoplazmos solo-gelio zona.
5. Trombocitopoezė. trombocitopoezės reguliavimas. Trombopoetinas (trombocitopoetinas). Megakariocitai. trombocitopenija.
6. Hemostazė. Kraujo krešėjimo mechanizmai. Trombocitų hemostazė. trombocitų reakcija. pirminė hemostazė.
7. Kraujo krešėjimo sistema. Išorinis kraujo krešėjimo aktyvinimo būdas. krešėjimo faktoriai.
8. Vidinis kraujo krešėjimo aktyvinimo būdas. Trombinas.
9. Antikoaguliantų kraujo sistema. Antikoaguliantiniai kraujo mechanizmai. Antitrombinas. Heparinas. Baltymai. Prostaciklinas. Trombomodulinas.
10. Audinių plazminogeno aktyvatorius. Ektofermentai. Endotelio vaidmuo antikoaguliantų sistemoje. audinių faktorius. Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius. Willebrand faktorius. Antikoaguliantai.
Audinių plazminogeno aktyvatorius. Ektofermentai. Endotelio vaidmuo antikoaguliantų sistemoje. audinių faktorius. Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius. Willebrand faktorius. Antikoaguliantai.
Audinių plazminogeno aktyvatorius yra baltymas, dauginasi ir nuolat išskiriamas kraujagyslių endotelio. Suteikia tiesioginį vietinį trombolizinį aktyvumą prieš susidariusį trombą. Kraujyje palaikomas pastovus šio faktoriaus lygis, užtikrinantis sisteminį trombolizinį kraujo aktyvumą.
Ektofermentai- tai ADPazė, ATPazė ir endotelio suformuotas adenoziną konvertuojantis fermentas. Endotelio ADPazė greitai suskaido proaggregantą ADP, kurį išskiria aktyvuoti trombocitai.
Kraujagyslių endotelio ląstelės sintezuoti ir protromboziniai veiksniai: audinių faktorius, plazminogeno aktyvatoriaus inhibitoriai, von Willebrand faktorius.
Ryžiai. 7.11. Kraujagyslės endotelio vaidmuo kraujo krešėjimui. Po užrašu „Antikoaguliantai“ yra endotelio veiksniai, turintys antikoaguliacinį poveikį dėl trombocitų agregacijos slopinimo, fibrino krešulio susidarymo ir fibrinolizės aktyvinimo. „Prokoaguliantai“ vadinami endotelio faktoriais, dalyvaujančiais trombocitų trombų, fibrino krešulių susidarymo ir fibrinolizės slopinimo procese.audinių faktorius yra sudėtingas ląstelės membranos baltymas, kurio masė yra 46 kDa. Dalis jo molekulės, kai ląstelė yra pažeista, glaudžiai jungiasi su Vila krešėjimo faktoriumi, išlaikydama savo, kaip greitintuvo, funkciją išoriniame kraujo krešėjimo kelyje.
Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius-I yra 52 kDa baltymas, randamas cirkuliuojančiame kraujyje. Glaudžiai prisijungęs prie plazminogeno aktyvatoriaus, jis jį inaktyvuoja, todėl dalyvauja fibrinolizės reguliavime organizme.
Willebrand faktorius yra daugiamatė molekulė, sverianti 1-20 milijonų Da, susintetinta endotelio ir saugoma endotelio sekrecijos granulėse. Išsilaisvinusi nuo jų, atlieka lipnios trombocitų molekulės funkciją, palaiko jų agregaciją. Padidėjusį von Willebrand faktoriaus išsiskyrimą iš endotelio sukelia trombinas.
Kraujo krešėjimas inde lygus endotelio paviršius taip pat neleidžia patekti į vidinį aktyvios protrombinazės susidarymo kelią. Endotelio paviršiuje adsorbuotas monomolekulinio baltymo sluoksnis atbaido krešėjimo faktorius ir trombocitus, taip pat apsaugo nuo kraujo krešėjimo.
Antikoaguliantai naudojamas klinikinėje praktikoje. Pavyzdžiui, sumažinti padidėjusį kraujo krešumą sergantiesiems išemine širdies liga, palaikyti skystą kraują naudojant širdies-plaučių aparatą, traumuojant kraujo ląsteles, dėl kurių suaktyvėja vidinis kraujo krešėjimo kelias.