Цитокинова терапия. Цитокини и възпаление Функционалната активност на цитокините се проявява

Цитокините са около 100 сложни протеини, участващи в много имунни и възпалителни процеси в човешкото тяло. Те не се натрупват в клетките, които ги произвеждат и бързо се синтезират и секретират.

Правилно функциониращите цитокини поддържат гладкото и ефективно функциониране на имунната система. Тяхната характерна черта е гъвкавостта на действието. В повечето случаи те проявяват каскаден ефект, който се основава на взаимния независим синтез на други цитокини. Развиващият се възпалителен процес се контролира от взаимосвързани провъзпалителни цитокини.

Какво представляват цитокините

Цитокините са голяма група регулаторни протеини, чието молекулно тегло варира от 15 до 25 kDa (килодалтон е единица за атомна маса). Те действат като медиатори на междуклетъчното сигнализиране. Тяхната характерна особеност е предаването на информация между клетките на къси разстояния. Те участват в контрола на ключови жизнени процеси на тялото. Те са отговорни за стартирането пролиферация, т.е. процесът на размножаване на клетките, последван от тяхната диференциация, растеж, активност и апоптоза. Цитокините определят хуморалната и клетъчната фаза на имунния отговор.

Цитокините могат да се разглеждат като вид хормони на имунната система. Сред другите свойства на тези протеини се отличава по-специално способността да се влияе върху енергийния баланс на тялото чрез промени в апетита и скоростта на метаболизма, ефекти върху настроението, функциите и структурите на сърдечно-съдовата система и повишена сънливост.

Особено внимание трябва да се обърне на провъзпалителни и противовъзпалителни цитокини. Преобладаването на първото води до възпалителна реакция с треска, ускорено дишане и левкоцитоза. Други имат предимството да генерират противовъзпалителен отговор.

Свойства на цитокините

Основни характеристики на цитокините:

• съкращаване- способността да произвежда същия ефект
• плиотропия- способността да се влияе върху различни видове клетки и да се предизвикват различни действия в тях
• синергия- взаимодействие
• индукцияетапи на положителна и отрицателна обратна връзка
• антагонизъм– Взаимно блокиране на ефектите на действие

Цитокините и ефектът им върху други клетки

Цитокините действат по-специално върху:

• В лимфоцитите са клетки на имунната система, отговорни за хуморалния имунен отговор, т.е. производство на антитела;
• Т-лимфоцити - клетки на имунната система, отговорни за клетъчния имунен отговор; те произвеждат по-специално Th1 и Th2 лимфоцити, между които се наблюдава антагонизъм; Th1 поддържащ клетъчен отговор и Th2 хуморален отговор; Th1 цитокините влияят негативно върху развитието на Th2 и обратно;
• NK клетки - група клетки на имунната система, която е отговорна за явленията на естествена цитотоксичност (токсични ефекти върху цитокините, които не изискват стимулиране на специфични механизми под формата на антитела);
• Моноцитите са морфологични елементи на кръвта, те се наричат ​​бели кръвни клетки;
• Макрофагите са популация от клетки в имунната система, която идва от прекурсори на кръвни моноцити; те действат както в процесите на вроден имунитет, така и в придобития (адаптивен);
• Гранулоцитите са вид бели кръвни клетки, които проявяват свойствата на фагоцитите, което трябва да се разбира като способността да абсорбират и унищожават бактерии, мъртви клетки и някои вируси.

Провъзпалителни цитокини

Провъзпалителни цитокиниучастват в регулирането на имунния отговор и хематопоезата (процесът на производство и диференциация на морфотични кръвни елементи) и инициират развитието на възпалителна реакция. Те често се наричат ​​имунотрансмитери.

Основните провъзпалителни цитокини включват:

• TNF или фактор на туморната некроза, наричан по-рано кекцин. Под това име е група протеини, които определят активността на лимфоцитите. Те могат да предизвикат апоптоза, естествения процес на програмирана смърт на раковите клетки. Изолирани са TNF-α и TNF-β.
• IL-1, т.е. интерлевкин 1. Той е един от основните регулатори на възпалителния имунен отговор. Особено активно участва във възпалителни реакции на червата. Сред неговите 10 разновидности се отличават IL-1α, IL-1β, IL-1γ. В момента се описва като интерлевкин 18.
• IL-6, т.е. интерлевкин 6, който има плейотропен или многопосочен ефект. Концентрацията му се повишава в серума на пациенти с улцерозен колит. Стимулира хемопоезата, проявявайки синергия с интерлевкин 3. Стимулира диференциацията на В-лимфоцитите в плазмени клетки.

Противовъзпалителни цитокини

Противовъзпалителните цитокини намаляват възпалителния отговор чрез потискане на производството на провъзпалителни цитокини от моноцити и макрофаги, особено IL-1, IL-6, IL-8.

Сред основните противовъзпалителни цитокини се споменават по-специално IL-10, т.е. интерлевкин 10 (фактор, който инхибира синтеза на цитокини), IL 13, IL 4, които в резултат на индуцирането на секрецията на цитокини които засягат хемопоезата, има положителен ефект върху производството на кръвни клетки.

Активирането на клетките на възпалителната зона се проявява във факта, че клетките започват да синтезират и отделят много цитокини, които засягат близките клетки и клетките на отдалечените органи. Сред всички тези цитокини има такива, които насърчават (провъзпалителни) и такива, които предотвратяват развитието на възпалителния процес (противовъзпалителни). Цитокините причиняват ефекти, подобни на проявите на остри и хронични инфекциозни заболявания.

Провъзпалителни цитокини

90% от лимфоцитите (вид левкоцити), 60% от тъканните макрофаги (клетки, способни да улавят и усвояват бактерии) са способни да секретират провъзпалителни цитокини. Инфекциозните агенти и самите цитокини (или други възпалителни фактори) са стимулатори на производството на цитокини.

Локалното освобождаване на провъзпалителни цитокини причинява образуването на възпалителен фокус. С помощта на специфични рецептори провъзпалителните цитокини се свързват и включват в процеса други видове клетки: кожа, съединителна тъкан, вътрешна стена на кръвоносните съдове, епителни клетки. Всички тези клетки също започват да произвеждат провъзпалителни цитокини.

Най-важните провъзпалителни цитокини са IL-1 (интерлевкин-1) и TNF-алфа (тумор некрозис фактор-алфа). Те причиняват образуването на огнища на адхезия (залепване) върху вътрешната обвивка на съдовата стена: първо, левкоцитите се придържат към ендотела и след това проникват в съдовата стена.

Тези провъзпалителни цитокини стимулират синтеза и освобождаването на други провъзпалителни цитокини (IL-8 и други) от левкоцитите и ендотелните клетки и по този начин активират клетките да произвеждат възпалителни медиатори (левкотриени, хистамин, простагландини, азотен оксид и други).

Когато инфекцията навлезе в тялото, производството и освобождаването на IL-1, IL-8, IL-6, TNF-алфа започва на мястото на въвеждане на микроорганизма (в клетките на лигавицата, кожата, регионалната лимфа възли) - т.е. цитокините активират локалните защитни реакции.

Както TNF-alpha, така и IL-1, освен локално действие, имат и системен ефект: активират имунната, ендокринната, нервната и хемопоетичната система. Провъзпалителните цитокини могат да причинят около 50 различни биологични ефекта. Почти всички тъкани и органи могат да бъдат техни мишени.

Например, анемията при остри и хронични инфекциозни заболявания е резултат от излагане на тялото на провъзпалителни цитокини (интерлевкин-1, интерферон-бета, интерферон-гама, TNF, неоптерин). Те инхибират растежа на еритроидния зародиш, освобождаването на желязо от клетките на макрофагите и инхибират производството на еритропоетин в бъбреците. Цитокините действат много ефективно и бързо.

Противовъзпалителни цитокини

Контролът върху действието на провъзпалителните цитокини се осъществява от противовъзпалителни цитокини, които включват IL-4, IL-13, IL-10, TGF-бета. Те могат не само да потиснат синтеза на провъзпалителни цитокини, но и да насърчат синтеза на антагонисти на интерлевкин рецептор (RAIL или RAIL).

Съотношението между противовъзпалителните и провъзпалителните цитокини е важен момент в регулацията на възникването и развитието на възпалителния процес. От този баланс зависи както протичането на заболяването, така и изходът от него. Именно цитокините стимулират производството на фактори на кръвосъсирването в съдовите ендотелни клетки, производството на хондролитични ензими и допринасят за образуването на белези.

Цитокини и имунен отговор

Всички клетки в имунната система имат определени различни функции. Тяхното координирано взаимодействие се осъществява от цитокини – регулатори на имунните отговори. Именно те осигуряват обмена на информация между клетките на имунната система и координацията на техните действия.

Наборът и количеството на цитокините е матрица от сигнали (често променящи се), които действат върху клетъчните рецептори. Сложният характер на тези сигнали се обяснява с факта, че всеки цитокин може да инхибира или активира няколко процеса (включително синтеза на собствени или други цитокини), образуването на рецептори на клетъчната повърхност.

Цитокините осигуряват взаимовръзка в имунната система между специфичния имунитет и неспецифичната защитна реакция на организма, между хуморалния и клетъчния имунитет. Цитокините са тези, които комуникират между фагоцити (осигуряващи клетъчен имунитет) и лимфоцити (клетки на хуморалния имунитет), както и между лимфоцити с различни функции.

Чрез цитокини Т-хелперите (лимфоцити, които "разпознават" чужди протеини на микроорганизми) предават команда на Т-убийците (клетки, които унищожават чуждия протеин). По същия начин, с помощта на цитокини, Т-супресорите (вид лимфоцити) контролират функцията на Т-убийците и им предават информация, за да спрат разрушаването на клетките.

Ако такава връзка бъде прекъсната, тогава смъртта на клетките (вече собствени за тялото, а не чужди) ще продължи. Ето как се развиват автоимунните заболявания: синтезът на IL-12 не се контролира, клетъчно-медиираният имунен отговор ще бъде прекалено активен.

Протичането и изходът на инфекциозно заболяване зависи от способността на неговия патоген (или неговите компоненти) да индуцира синтеза на цитокин IL-12. Например, видовете гъбички Candida albicans могат да индуцират синтеза на IL-12, което допринася за развитието на ефективна клетъчна защита срещу този патоген. Leishmania инхибира синтеза на IL-12 - развива се хронична инфекция. HIV потиска синтеза на IL-12 и това води до дефекти в клетъчния имунитет при СПИН.

Цитокините също регулират специфичния имунен отговор на организма към въвеждането на патогена. Ако местните защитни реакции са неефективни, тогава цитокините действат на системно ниво, т.е. засягат всички системи и органи, които участват в поддържането на хомеостазата.

Когато действат върху централната нервна система, целият комплекс от поведенчески реакции се променя, синтезът на повечето хормони, протеиновият синтез и плазменият състав се променят. Но всички промени, които се случват, не са случайни: те са или необходими за увеличаване на защитните реакции, или помагат за превключване на енергията на тялото за борба с патогенните ефекти.

Именно цитокините, комуникирайки между ендокринната, нервната, хематопоетичната и имунната система, включват всички тези системи във формирането на сложна защитна реакция на организма към въвеждането на патогенен агент.

Макрофагът поглъща бактерии и освобождава цитокини (3D модел) - видео

Анализ за полиморфизъм на цитокинови гени

Анализът на полиморфизма на цитокиновия ген е генетично изследване на молекулярно ниво. Такива изследвания предоставят широк спектър от информация, която позволява да се идентифицира наличието на полиморфни гени (провъзпалителни варианти) в изследваното лице, да се предскаже предразположението към различни заболявания, да се разработи програма за превенция на такива заболявания за този конкретен човек, и т.н.

За разлика от единичните (спорадични) мутации, полиморфните гени се срещат в приблизително 10% от популацията. Носителите на такива полиморфни гени имат повишена активност на имунната система по време на хирургични интервенции, инфекциозни заболявания и механични въздействия върху тъканите. В имунограмата на такива индивиди често се открива висока концентрация на цитотоксични клетки (клетки убийци). Такива пациенти често развиват септични, гнойни усложнения на заболявания.

Но в някои ситуации такава повишена активност на имунната система може да попречи: например при ин витро оплождане и презасаждане на ембриони. А комбинацията от провъзпалителни гени на интерлевкин-1 или IL-1 (IL-1), антагонист на рецептора на интерлевкин-1 (RAIL-1), тумор некротизиращ фактор-алфа (TNF-алфа) е предразполагащ фактор за спонтанен аборт по време на бременност. Ако изследването установи наличие на провъзпалителни цитокинови гени, тогава е необходима специална подготовка за бременност или IVF (ин витро оплождане).

Анализът на цитокиновия профил включва откриването на 4 полиморфни генни варианта:

• 
  интерлевкин 1-бета (IL-бета);
• 
  интерлевкин-1 рецепторен антагонист (ILRA-1);
• 
  интерлевкин-4 (IL-4);
• 
  тумор некротизиращ фактор-алфа (TNF-алфа).

За доставката на анализа не се изисква специална подготовка. Материалът за изследването е изстъргване от букалната лигавица.

Съвременните проучвания показват, че при обичайния спонтанен аборт в тялото на жените често се откриват генетични фактори на тромбофилия (склонност към тромбоза). Тези гени могат да доведат не само до спонтанен аборт, но и до плацентарна недостатъчност, забавяне на растежа на плода и късна токсикоза.

В някои случаи полиморфизмът на гена на тромбофилията при плода е по-изразен, отколкото при майката, тъй като плодът също получава гени от бащата. Мутациите на протромбиновия ген водят до почти сто процента вътрематочна смърт на плода. Следователно особено трудни случаи на спонтанен аборт изискват преглед и съпруг.

Имунологичното изследване на съпруга ще помогне не само да се определи прогнозата за бременността, но и да се идентифицират рисковите фактори за неговото здраве и възможността за използване на превантивни мерки. Ако се установят рискови фактори при майката, препоръчително е след това да се проведе преглед на детето - това ще помогне за разработването на индивидуална програма за превенция на заболяванията при детето.

При безплодие е препоръчително да се идентифицират всички известни фактори, които могат да доведат до него. Пълното генетично изследване на генния полиморфизъм включва 11 показателя. Изследването може да помогне за идентифициране на предразположеност към плацентарна дисфункция, високо кръвно налягане, прееклампсия. Точната диагноза на причините за безплодието ще позволи необходимото лечение и ще позволи поддържането на бременността.

Разширената хемостазиограма може да даде информация не само за акушерската практика. Използвайки изследването на генния полиморфизъм, е възможно да се идентифицират факторите на генетичното предразположение за развитието на атеросклероза, коронарна болест на сърцето, да се предскаже нейното протичане и вероятността от развитие на инфаркт на миокарда. Дори вероятността от внезапна смърт може да бъде изчислена с помощта на генетични изследвания.

Изследвано е и влиянието на генните полиморфизми върху скоростта на развитие на фиброза при пациенти с хроничен хепатит С, което може да се използва за прогнозиране на хода и изхода на хроничния хепатит.

Молекулярно-генетичните изследвания на мултифакторни заболявания помагат не само за създаване на индивидуална здравна прогноза и превантивни мерки, но и за разработване на нови терапевтични методи с помощта на антицитокини и цитокинови лекарства.

Цитокинова терапия

Лечение на туморни заболявания

Цитокинотерапията може да се използва във всеки (дори IV) стадий на злокачествено заболяване, при наличие на тежка съпътстваща патология (чернодробно-бъбречна или сърдечно-съдова недостатъчност). Цитокините селективно унищожават само злокачествените туморни клетки и не засягат здравите. Цитокинотерапията може да се използва като независим метод на лечение или като част от комплексната терапия.

Имунологичните изследвания при пациенти с рак показват, че повечето злокачествени заболявания са придружени от нарушен имунен отговор. Степента на неговото потискане зависи от големината на тумора и проведеното лечение (лъчелечение и химиотерапия). Получени са данни за биологичните ефекти на цитокините (интерлевкин-2, интерферони, фактор на туморна некроза и др.).

Цитокиновата терапия се използва в онкологията от няколко десетилетия. Но по-рано се използваха главно интерлевкин-2 (IL-2) и интерферон-алфа (IFN-алфа) - ефективни само при кожен меланом и рак на бъбреците. През последните години бяха създадени нови лекарства, показанията за тяхната ефективна употреба се разшириха.

Един от цитокиновите препарати - тумор некротизиращ фактор (TNF-алфа) - действа чрез рецептори, разположени върху злокачествената клетка. Този цитокин се произвежда в човешкото тяло от моноцити и макрофаги. Когато взаимодейства с рецепторите на злокачествена клетка, цитокинът стартира програмата за смърт на тази клетка.

TNF-alpha започва да се използва в онкологичната практика в САЩ и Европа още през 80-те години на миналия век. Използва се и днес. Но високата токсичност на лекарството ограничава употребата му само в случаите, когато е възможно да се изолира орган с туморен процес от общия кръвен поток (бъбреци, крайници). Лекарството в този случай циркулира с помощта на апарат сърце-бял дроб само в засегнатия орган и не навлиза в общото кръвообращение.

В Русия Refnot (TNF-T) е създаден през 1990 г. в резултат на сливането на гените на тимозин-алфа и фактора на туморната некроза. Той е 100 пъти по-малко токсичен от TNF, преминал е клинични изпитвания и от 2009 г. е одобрен за употреба при лечение на различни видове и локализации на злокачествени тумори.

Като се има предвид намаляването на токсичността на лекарството, то може да се прилага интрамускулно или подкожно. Лекарството има ефект както върху първичния туморен фокус, така и върху метастазите (включително отдалечени), за разлика от TNF-алфа, който може да има ефект само върху първичния фокус.

Друго обещаващо цитокинно лекарство е интерферон-гама (IFN-гама). На негова основа през 1990 г. в Русия е създадено лекарството Ingaron. Въздейства директно върху туморните клетки или задейства програмата за апоптоза (самата клетка програмира и извършва своята смърт), повишава ефективността на имунните клетки.

Лекарството също е преминало клинични изпитвания и е одобрено за употреба при лечение на злокачествени тумори от 2005 г. Лекарството активира тези рецептори на злокачествената клетка, с които Refnot след това взаимодейства. Ето защо най-често цитокинотерапията с Refnot се комбинира с употребата на Ingaron.

Начинът на приложение на тези лекарства (мускулно или подкожно) позволява лечение в амбулаторни условия. Цитокинотерапията е противопоказана само по време на бременност и автоимунни заболявания. В допълнение към директния ефект върху злокачествената клетка, Ingaron и Refnot имат косвен ефект - активират собствените си клетки на имунната система (Т-лимфоцити и фагоцити), повишават общия имунитет.

За съжаление, ефективността на цитокиновата терапия е само 30-60%, в зависимост от стадия и местоположението на тумора, вида на злокачественото новообразувание, разпространението на процеса и общото състояние на пациента. Колкото по-висок е стадият на заболяването, толкова по-слабо изразен е ефектът от лечението.

Но дори и при наличие на множество и отдалечени метастази и невъзможност за химиотерапия (поради тежестта на общото състояние на пациента), се отбелязват положителни резултати под формата на подобрение на общото благосъстояние и спиране на по-нататъшното развитие на болестта.

Основните направления на действие на съвременните лекарства-цитокини:

• 
  пряко въздействие върху клетките на самия тумор и метастазите;
• 
  засилване на антитуморния ефект на химиотерапията;
• 
  предотвратяване на метастази и рецидиви на тумори;
• 
  намаляване на нежеланите реакции от химиотерапия чрез инхибиране на хематопоезата и имуносупресия;
• 
  лечение и профилактика на инфекциозни усложнения по време на лечението.

Възможни резултати от употребата на цитокинова терапия:

• 
  пълно изчезване на тумора или намаляване на неговия размер (поради задействане на апоптоза - програмираната смърт на туморни клетки);
• 
  стабилизиране на процеса или частична регресия на тумора (когато клетъчният цикъл е спрян в туморните клетки);
• 
  липса на ефект - растежът и метастазите на тумора продължават (с нечувствителност на туморните клетки към лекарството поради мутации).

От гореизложеното може да се види, че клиничният резултат от използването на цитокинова терапия зависи от характеристиките на туморните клетки в самия пациент. За да се оцени ефективността на употребата на цитокини, се провеждат 1-2 курса на лечение и се оценява динамиката на процеса с помощта на различни инструментални методи за изследване.

Възможността за използване на цитокинова терапия не означава отказ от други методи на лечение (хирургия, химиотерапия или лъчева терапия). Всеки от тях има своите предимства за въздействие върху тумора. Във всеки отделен случай трябва да се използват всички посочени и налични лечения.

Цитокините значително улесняват поносимостта на лъчева и химиотерапия, предотвратяват появата на неутропения (намаляване на броя на левкоцитите) и развитието на инфекции по време на химиолъчева терапия. В допълнение, Refnot повишава ефективността на повечето химиотерапевтични лекарства. Използването му в комбинация с Ingaron седмица преди началото на химиотерапията и продължаването на употребата на цитокина след курс на химиотерапия ще предпази от инфекции или ще ги излекува без антибиотици.

Схемата на цитокиновата терапия се определя индивидуално за всеки пациент. И двете лекарства практически не показват токсичност (за разлика от лекарствата за химиотерапия), нямат странични реакции и се понасят добре от пациентите, нямат инхибиторен ефект върху хемопоезата и повишават специфичния противотуморен имунитет.

Лечение на шизофрения

Проучванията установяват, че цитокините участват в психоневроимунните реакции и осигуряват съгласуваната работа на нервната и имунната система. Балансът на цитокините регулира процеса на регенерация на дефектни или увредени неврони. Това е основата за използването на нови методи за лечение на шизофрения - цитокинова терапия: използването на имунотропни лекарства, съдържащи цитокини.

Един от начините е да се използват анти-TNF-алфа и анти-IFN-гама антитела (антитуморен некрозисфактор-алфа и интерферон-гама антитела). Лекарството се прилага интрамускулно в продължение на 5 дни, 2 r. в един ден.

Съществува и техника за използване на съставен разтвор на цитокини. Прилага се под формата на инхалации с помощта на пулверизатор, 10 ml на 1 инжекция. В зависимост от състоянието на пациента, лекарството се прилага на всеки 8 часа през първите 3-5 дни, след това за 5-10 дни - 1-2 рубли / ден и след това дозата се намалява до 1 r. в 3 дни за дълго време (до 3 месеца) с пълното премахване на психотропните лекарства.

Интраназалното приложение на цитокинов разтвор (съдържащ IL-2, IL-3, GM-CSF, IL-1бета, IFN-гама, TNF-алфа, еритропоетин) подобрява ефективността на лечението на пациенти с шизофрения (включително при първия пристъп на заболяването), по-дълга и стабилна ремисия. Тези методи се използват в клиники в Израел и Русия.

Повече за шизофренията

Цитокините, по своята същност, са протеини, произведени от клетки на имунната система (често наричани "фактори" в литературата). Те участват в диференциацията на новородените клетки на имунната система, като им придават определени характеристики, които са източник на разнообразие от имунни клетки, а също така осигуряват междуклетъчно взаимодействие. За да направим този процес по-лесен за разбиране, можем да сравним производството на имунни клетки с фабрика. На първия етап идентични клетъчни заготовки напускат конвейера, след това на втория етап, с помощта на различни групи цитокини, всяка клетка е надарена със специални функции и се сортира в групи за последващо участие в имунните процеси. Така от еднакви клетки се получават Т-лимфоцити, В-лимфоцити, неутрофили, базофили, еозинофили, моноцити.

Интерес за науката представлява особеността на въздействието на цитокина върху клетката, което генерира производството на други цитокини от тази клетка. Тоест, един цитокин предизвиква производството на други цитокини.

Цитокините, в зависимост от ефекта върху имунните клетки, се разделят на шест групи:

• Интерферони
• Интерлевкини
• колонии стимулиращи фактори
• растежни фактори
• Хемокини
• Фактори на туморна некроза

Интерферониса цитокини, произведени от клетки в отговор на вирусна инфекция или други стимули. Тези протеини (цитокини) блокират възпроизвеждането на вируса в други клетки и участват в имунното междуклетъчно взаимодействие.

Първият тип (има антивирусни и антитуморни ефекти):

интерферон-алфа

интерферон-бета

Интерферон-гама

Интерфероните алфа и бета имат подобен механизъм на действие, но се произвеждат от различни клетки.

Интерферон-алфа се произвежда от мононуклеарни фагоцити. От това следва и името му - " левкоцитен интерферон».

Интерферон-бета се произвежда от фибробласти. Оттук и името му - фибробластен интерферон».

Интерфероните от първия тип имат свои собствени задачи:

• Увеличете производството на интерлевкини (IL1)
• Намалете нивото на pH в междуклетъчната среда с повишаване на температурата
• Свързва се със здравите клетки и ги предпазва от вируси
• Способен да инхибира клетъчната пролиферация (растеж) чрез блокиране на синтеза на аминокиселини
• Заедно с естествените клетки убийци, те индуцират или потискат (в зависимост от ситуацията) образуването на антигени

Интерферон-гама се произвежда от Т-лимфоцити и естествени клетки убийци. Носи името - имунен интерферон»

Интерферонът от втори тип също има задачи:

• Активира Т-лимфоцити, В-лимфоцити, макрофаги, неутрофили,
• Инхибира пролиферацията на тимоцитите,
• Укрепва клетъчния имунитет и автоимунитета,
• Регулира апоптозата на нормални и инфектирани клетки.

Интерлевкини(съкратено IL) са цитокини, които регулират взаимодействието между левкоцитите. Науката е идентифицирала 27 интерлевкина.

колонии стимулиращи факториса цитокини, които регулират деленето и диференциацията на стволови клетки от костен мозък и прекурсори на кръвни клетки. Тези цитокини са отговорни за способността на лимфоцитите да се клонират и също така са способни да стимулират функционалността на клетките извън костния мозък.

Растежни фактори – регулират растежа, диференциацията и функционалността на клетките в различни тъкани

Към днешна дата са открити следните фактори на растежа:

• трансформиращи растежни фактори алфа и бета
• епидермален растежен фактор
• растежен фактор на фибробластите
• тромбоцитен растежен фактор
• фактор на растежа на нервите
• инсулиноподобен растежен фактор
• хепарин-свързващ растежен фактор
• растежен фактор на ендотелните клетки

Най-изследвани са функциите на трансформиращия растежен фактор бета. Той е отговорен за потискането на растежа и активността на Т-лимфоцитите, инхибира някои функции на макрофагите, неутрофилите, В-лимфоцитите. Въпреки че този фактор се отнася до факторите на растежа, всъщност той участва в обратните процеси, т.е. потиска имунния отговор (потиска функциите на клетките, участващи в имунната защита), когато инфекцията се елиминира и работата на имунните клетки вече не е необходимо. Именно под въздействието на този фактор се засилва синтеза на колаген и производството на IgA имуноглобулин по време на заздравяването на рани и се генерират клетки на паметта.

Хемокиниса цитокини с ниско молекулно тегло. Основната им функция е да привличат левкоцитите от кръвния поток към фокуса на възпалението, както и да регулират подвижността на левкоцитите.

Фактори на туморна некроза(съкратено като TNF) са два вида цитокини (TNF-алфа и TNF-бета). Резултатите от тяхното действие: развитие на кахексия (крайно изтощение на тялото, в резултат на което се забавя активността на ензима, който допринася за натрупването на мазнини в тялото); развитие на токсичен шок; инхибиране на апоптоза (клетъчна смърт) на клетки на имунната система, индуциране на апоптоза на туморни и други клетки; активиране на тромбоцитите и заздравяване на рани; инхибиране на ангиогенезата (пролиферация на кръвоносни съдове) и фиброгенезата (дегенерация на тъкан в съединителна тъкан), грануломатоза (образуване на грануломи - пролиферация и трансформация на фагоцити) и много други резултати.

Тази глава ще разгледа интегриран подход към оценката на цитокиновата система, използвайки описаните по-горе съвременни методи за изследване.

Първо, ние очертаваме основните понятия на цитокиновата система.

Понастоящем цитокините се разглеждат като протеиново-пептидни молекули, произведени от различни клетки на тялото и осъществяващи междуклетъчни и междусистемни взаимодействия. Цитокините са универсални регулатори на жизнения цикъл на клетката, те контролират процесите на диференциация, пролиферация, функционална активация и апоптоза на последната.

Цитокините, произведени от клетките на имунната система, се наричат ​​имуноцитокини; те представляват клас разтворими пептидни медиатори на имунната система, необходими за нейното развитие, функциониране и взаимодействие с други системи на тялото (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Като регулаторни молекули, цитокините играят важна роля в осъществяването на вродени и адаптивни имунни реакции, осигуряват тяхната взаимовръзка, контролират хемопоезата, възпалението, заздравяването на рани, образуването на нови кръвоносни съдове (ангиогенеза) и много други жизненоважни процеси.

Понастоящем има няколко различни класификации на цитокини, като се вземат предвид тяхната структура, функционална активност, произход и тип цитокинови рецептори. Традиционно, в съответствие с биологичните ефекти, е обичайно да се разграничават следните групи цитокини.

1. Интерлевкини(IL-1-IL-33) - секреторни регулаторни протеини на имунната система, осигуряващи медиаторни взаимодействия в имунната система и връзката й с други системи на тялото. Интерлевкините се разделят според тяхната функционална активност на про- и противовъзпалителни цитокини, растежни фактори на лимфоцитите, регулаторни цитокини и др.

3. Фактори на туморна некроза (TNF)- цитокини с цитотоксични и регулаторни действия: TNFa и лимфотоксини (LT).

4. Растежни фактори на хематопоетичните клетки- растежен фактор на стволови клетки (Kit - лиганд), IL-3, IL-7, IL-11, еритропоетин, тробопоетин, гранулоцитно-макрофагов колониестимулиращ фактор - GM-CSF, гранулоцитен CSF - G-CSF, макрофаги-

ny KSF - M-CSF).

5. Хемокини- С, СС, СХС (IL-8), СХ3С - регулатори на хемотаксиса на различни видове клетки.

6. Нелимфоидни клетъчни растежни фактори- регулатори на растежа, диференциацията и функционалната активност на клетки с различна тъканна принадлежност (фибробластен растежен фактор - FGF, растежен фактор на ендотелни клетки, епидермален растежен фактор - епидермален EGF) и трансформиращи растежни фактори (TGFβ, TGFα).

Между другото, през последните години активно се изследва фактор, който инхибира миграцията на макрофагите (миграционен инхибиторен фактор - MIF), който се счита за неврохормон с цитокинова и ензимна активност (Suslov A.P., 2003; Kovalchuk L.V. et al. ,

Цитокините се различават по структура, биологична активност и други свойства. Въпреки това, наред с разликите, цитокините имат общи свойства,характерни за този клас биорегулаторни молекули.

1. Цитокините са, като правило, гликозилирани полипептиди със средно молекулно тегло (по-малко от 30 kD).

2. Цитокините се произвеждат от клетки на имунната система и други клетки (например ендотел, фибробласти и др.) В отговор на активиращ стимул (свързани с патогени молекулни структури, антигени, цитокини и др.) и участват в реакциите на вроден и адаптивен имунитет, регулиращ тяхната сила и продължителност. Някои цитокини се синтезират конститутивно.

3. Секрецията на цитокини е кратък процес. Цитокините не се запазват като предварително формирани молекули, а по-скоро

синтезът винаги започва с транскрипция на гени. Клетките произвеждат цитокини в ниски концентрации (пикограми на милилитър).

4. В повечето случаи цитокините се произвеждат и действат върху таргетните клетки, които са в непосредствена близост (действие на къси разстояния). Основното място на действие на цитокините е междуклетъчният синапс.

5. СъкращаванеЦитокиновата система се проявява във факта, че всеки тип клетка е способен да произвежда няколко цитокина и всеки цитокин може да се секретира от различни клетки.

6. Характеризират се всички цитокини плейотропия,или многофункционалност на действието. По този начин, проявата на признаци на възпаление се дължи на влиянието на IL-1, TNFα, IL-6, IL-8. Дублирането на функции осигурява надеждността на цитокиновата система.

7. Действието на цитокините върху прицелните клетки се медиира от силно специфични мембранни рецептори с висок афинитет, които са трансмембранни гликопротеини, обикновено състоящи се от повече от една субединица. Извънклетъчната част на рецепторите е отговорна за свързването на цитокини. Има рецептори, които елиминират излишните цитокини в патологичния фокус. Това са така наречените рецептори за примамка. Разтворимите рецептори са извънклетъчният домен на мембранен рецептор, отделен от ензим. Разтворимите рецептори са в състояние да неутрализират цитокините, да участват в транспортирането им до фокуса на възпалението и в екскрецията от тялото.

8. Цитокини работят като мрежа.Те могат да действат съвместно. Много от функциите, първоначално приписани на един цитокин, изглежда се дължат на съгласуваното действие на няколко цитокини. (синергизъмдействия). Примери за синергично взаимодействие на цитокините са стимулирането на възпалителни реакции (IL-1, IL-6 и TNFa), както и синтеза на IgE

(IL-4, IL-5 и IL-13).

Някои цитокини индуцират синтеза на други цитокини (каскада).Каскадното действие на цитокините е необходимо за развитието на възпалителни и имунни реакции. Способността на някои цитокини да увеличават или намаляват производството на други определя важни положителни и отрицателни регулаторни механизми.

Антагонистичният ефект на цитокините е известен, например производството на IL-6 в отговор на повишаване на концентрацията на TNF-a може да бъде

отрицателен регулаторен механизъм за контролиране на производството на този медиатор по време на възпаление.

Цитокинова регулация на функциите на целевите клетки се осъществява чрез автокринни, паракринни или ендокринни механизми. Някои цитокини (IL-1, IL-6, TNFα и др.) Могат да участват в осъществяването на всички горепосочени механизми.

Отговорът на клетката към влиянието на цитокин зависи от няколко фактора:

От вида на клетките и първоначалната им функционална активност;

От локалната концентрация на цитокина;

От наличието на други медиаторни молекули.

По този начин продуцентските клетки, цитокините и техните специфични рецептори върху прицелните клетки образуват една единствена медиаторна мрежа. Това е набор от регулаторни пептиди, а не отделни цитокини, които определят крайния отговор на клетката. Понастоящем цитокиновата система се разглежда като универсална система за регулиране на нивото на целия организъм, която осигурява развитието на защитни реакции (например по време на инфекция).

През последните години се появи идея за цитокинова система, която комбинира:

1) продуцентски клетки;

2) разтворими цитокини и техните антагонисти;

3) клетки-мишени и техните рецептори (фиг. 7.1).

Нарушенията на различни компоненти на цитокиновата система водят до развитие на множество патологични процеси, поради което откриването на дефекти в тази регулаторна система е важно за правилната диагноза и назначаването на адекватна терапия.

Нека първо разгледаме основните компоненти на цитокиновата система.

Клетки, произвеждащи цитокини

I. Основната група клетки, произвеждащи цитокини в адаптивния имунен отговор, са лимфоцитите. Клетките в покой не секретират цитокини. При разпознаване на антигена и с участието на рецепторни взаимодействия (CD28-CD80/86 за Т-лимфоцитите и CD40-CD40L за В-лимфоцитите) настъпва клетъчно активиране, което води до транскрипция на цитокинови гени, транслация и секреция на гликозилирани пептиди в извънклетъчното пространство.

Ориз. 7.1.Цитокинова система

CD4 Т-хелперите са представени от субпопулации: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, които се различават един от друг в спектъра на секретираните цитокини в отговор на различни антигени.

Th0 произвеждат широк спектър от цитокини при много ниски концентрации.

Посока на диференциация Th0определя развитието на две форми на имунен отговор с преобладаване на хуморални или клетъчни механизми.

Естеството на антигена, неговата концентрация, локализация в клетката, типът на антиген-представящите клетки и определен набор от цитокини регулират посоката на Th0 диференциация.

Дендритните клетки, след улавяне и обработка на антиген, представят антигенни пептиди на Th0 клетките и произвеждат цитокини, които регулират посоката на тяхната диференциация в ефекторни клетки. Ролята на отделните цитокини в този процес е показана на фиг. 7.2. IL-12 индуцира синтеза на IFNγ от Т-лимфоцити и ]ChGK. IFNu осигурява диференциация на Th1, които започват да секретират цитокини (IL-2, IFNu, IL-3, TNFa, лимфотоксини), които регулират развитието на реакции към вътреклетъчни патогени

(свръхчувствителност от забавен тип (DTH) и различни видове клетъчна цитотоксичност).

IL-4 осигурява диференциацията на Th0 в Th2. Активираният Th2 произвежда цитокини (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 и др.), които определят пролиферацията на В-лимфоцитите, тяхната по-нататъшна диференциация в плазмени клетки и развитието на антитела отговор, главно към извънклетъчни патогени.

IFNy регулира отрицателно функцията на Th2 клетките и, обратно, IL-4, IL-10, секретирани от Th2, инхибират функцията на Th1 (фиг. 7.3). Молекулярният механизъм на тази регулация е свързан с транскрипционни фактори. Експресията на T-bet и STAT4, определена от IFNy, насочва Т-клетъчната диференциация по Th1 пътя и потиска развитието на Th2. IL-4 индуцира експресията на GATA-3 и STAT6, което съответно осигурява превръщането на наивни Th0 в Th2 клетки (фиг. 7.2).

През последните години е описана отделна субпопулация от Т хелперни клетки (Th17), произвеждащи IL-17. Членовете на семейството на IL-17 могат да бъдат експресирани от активирани клетки на паметта (CD4CD45RO), y5T клетки, NKT клетки, неутрофили, моноцити под влияние на IL-23, IL-6, TGFβ, произведени от макрофаги и дендритни клетки. ROR-C е основният фактор на диференциация при хора и ROR-γ при мишки. лПоказана е кардиналната роля на IL-17 в развитието на хронично възпаление и автоимунна патология (виж фиг. 7.2).

В допълнение, Т-лимфоцитите в тимуса могат да се диференцират в естествени регулаторни клетки (Treg), експресиращи CD4+ CD25+ повърхностни маркери и FOXP3 транскрипционния фактор. Тези клетки са способни да потискат имунния отговор, медииран от Th1 и Th2 клетки чрез директен междуклетъчен контакт и синтез на TGFβ и IL-10.

Схеми на диференциация на Th0 клонове и цитокини, секретирани от тях, са показани на Фиг. 7.2 и 7.3 (вижте също цветна вложка).

Т-цитотоксични клетки (CD8 +), естествени убийци - слаби производители на цитокини, като интерферони, TNFa и лимфотоксини.

Прекомерното активиране на една от Th субпопулациите може да определи развитието на един от вариантите на имунния отговор. Хроничният дисбаланс на активирането на Th може да доведе до формиране на имунопатологични състояния, свързани с прояви на

ми алергии, автоимунна патология, хронични възпалителни процеси и др.

Ориз. 7.2.Различни субпопулации на Т-лимфоцити, продуциращи цитокини

II. Във вродената имунна система основните производители на цитокини са миелоидните клетки. Използвайки Toll-подобни рецептори (TLR), те разпознават сходни молекулярни структури на различни патогени, така наречените патоген-асоциирани молекулярни модели (PAMP), например повторения и т.н.

Това взаимодействие с TLR задейства вътреклетъчна сигнална трансдукционна каскада, водеща до експресия на гени за две основни групи цитокини: провъзпалителни и тип 1 IFN (фиг. 7.4, вижте също цветна вложка). Предимно тези цитокини (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, хемокини и др.) индуцират развитието на възпаление и участват в защитата на тялото от бактериални и вирусни инфекции.

Ориз. 7.3.Спектър на цитокини, секретирани от Th1 и Th12 клетки

III. Клетки, които не са част от имунната система (клетки на съединителната тъкан, епител, ендотел), конститутивно секретират автокринни растежни фактори (GGF, EGF, TGFr и др.). и цитокини, подпомагащи пролиферацията на хематопоетичните клетки.

Цитокини и техните антагонистиса описани подробно в редица монографии (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Ориз. 7.4. TLR-медиирана индукция на производство на цитокини от вродени имунни клетки

Прекомерната експресия на цитокини не е безопасна за тялото и може да доведе до развитие на прекомерна възпалителна реакция, отговор на острата фаза. Различни инхибитори участват в регулирането на производството на провъзпалителни цитокини. По този начин са описани редица вещества, които неспецифично свързват цитокина IL-1 и предотвратяват проявата на неговото биологично действие (а2-макроглобулин, С3-компонент на комплемента, уромодулин). Специфични инхибитори на IL-1 могат да бъдат разтворими рецептори-примамки, антитела и IL-1 рецепторен антагонист (IL-1RA). С развитието на възпалението се наблюдава повишаване на експресията на гена IL-1RA. Но дори и нормално, този антагонист присъства в кръвта във висока концентрация (до 1 ng / ml или повече), блокирайки действието на ендогенния IL-1.

прицелни клетки

Действието на цитокините върху прицелните клетки се медиира чрез специфични рецептори, които свързват цитокините с много висок афинитет и отделните цитокини могат да използват

общи рецепторни субединици. Всеки цитокин се свързва със своя специфичен рецептор.

Цитокиновите рецептори са трансмембранни протеини и се разделят на 5 основни типа. Най-често срещаният е така нареченият хемопоетичен тип рецептори, които имат два извънклетъчни домена, единият от които съдържа обща последователност от аминокиселинни остатъци от два триптофанови и серинови повторения, разделени от която и да е аминокиселина (WSXWS мотив). Вторият тип рецептор може да има два извънклетъчни домена с голям брой запазени цистеини. Това са рецептори от семейството на IL-10 и IFN. Третият тип е представен от цитокинови рецептори, принадлежащи към групата на TNF. Четвъртият тип цитокинов рецептор принадлежи към суперсемейството на имуноглобулиновите рецептори, които имат извънклетъчни домени, подобни по структура на тези на имуноглобулиновите молекули. Петият тип рецептори, които свързват молекули от семейството на хемокините, са представени от трансмембранни протеини, които пресичат клетъчната мембрана на 7 места. Цитокиновите рецептори могат да съществуват в разтворима форма, запазвайки способността да свързват лиганди (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Цитокините са в състояние да повлияят на пролиферацията, диференциацията, функционалната активност и апоптозата на таргетните клетки (виж Фиг. 7.1). Проявата на биологичната активност на цитокините в прицелните клетки зависи от участието на различни вътреклетъчни системи в предаването на сигнала от рецептора, което е свързано с характеристиките на прицелните клетки. Сигналът за апоптоза се осъществява, наред с други неща, с помощта на специфична област от фамилията рецептори на TNF, така наречената област на "смъртта" (фиг. 7.5, вижте цветната вложка). Сигналите за диференциране и активиране се предават чрез вътреклетъчни Jak-STAT протеини - сигнални преобразуватели и активатори на транскрипция (фиг. 7.6, вижте цветната вложка). G-протеините участват в сигналната трансдукция от хемокини, което води до повишена клетъчна миграция и адхезия.

Комплексният анализ на цитокиновата система включва следното.

I. Оценка на продуцентски клетки.

1. Дефиниция на израз:

Рецептори, които разпознават патоген или TCR антиген, TLR) на ниво гени и протеинови молекули (PCR, метод на поточна цитометрия);

Адаптерни молекули, които провеждат сигнал, който задейства транскрипцията на цитокинови гени (PCR и др.);

Ориз. 7.5.Сигнална трансдукция от TNF рецептора

Ориз. 7.6. Jak-STAT - тип 1 цитокинов рецепторен сигнален път

Цитокинови гени (PCR); протеинови молекули на цитокини (оценка на цитокин-синтезиращата функция на човешки мононуклеарни клетки).

2. Количествено определяне на клетъчни субпопулации, съдържащи определени цитокини: Th1, Th2 Th17 (метод на вътреклетъчно оцветяване на цитокини); определяне на броя на клетките, секретиращи определени цитокини (метод ELISPOT, вижте Глава 4).

II. Оценка на цитокините и техните антагонисти в биологичните среди на организма.

1. Изследване на биологичната активност на цитокините.

2. Количествено определяне на цитокини с помощта на ELISA.

3. Имунохистохимично оцветяване на цитокини в тъканите.

4. Определяне на съотношението на противоположните цитокини (про- и противовъзпалителни), цитокини и цитокинови рецепторни антагонисти.

III. Оценка на целевата клетка.

1. Определяне на експресията на цитокинови рецептори на ниво гени и протеинови молекули (PCR, метод на поточна цитометрия).

2. Определяне на сигнални молекули във вътреклетъчното съдържание.

3. Определяне на функционалната активност на таргетните клетки.

Разработени са множество методи за оценка на цитокиновата система, за да се предостави разнообразна информация. Сред тях се отличават:

1) молекулярно-биологични методи;

2) методи за количествено определяне на цитокини с помощта на имуноанализ;

3) изследване на биологичната активност на цитокините;

4) вътреклетъчно оцветяване на цитокини;

5) методът ELISPOT, който прави възможно откриването на цитокини около една клетка, произвеждаща цитокини;

6) имунофлуоресценция.

Ние даваме кратко описание на тези методи.

Като се използва молекулярно-биологични методивъзможно е да се изследва експресията на гени на цитокини, техните рецептори, сигнални молекули, да се изследва полиморфизма на тези гени. През последните години бяха проведени голям брой проучвания, които разкриха връзки между вариантите на алелите на молекулите на цитокиновата система гени и предразположението

към редица заболявания. Изследването на алелни варианти на цитокинови гени може да предостави информация за генетично програмираното производство на определен цитокин. Най-чувствителна е полимеразната верижна реакция в реално време - PCR-RT (виж гл. 6). метод на хибридизация на мястови позволява да изясните тъканната и клетъчната локализация на експресията на цитокиновите гени.

Количественото определяне на цитокини в биологични течности и в култури от мононуклеарни клетки на периферна кръв чрез ELISA може да се характеризира, както следва. Тъй като цитокините са локални медиатори, по-подходящо е да се измерват нивата им в съответните тъкани след екстракцията на тъканните протеини или в естествени течности, като сълзи, лаваж от кухини, урина, амниотична течност, цереброспинална течност и др. Нивата на цитокини в серума или други телесни течности отразяват текущото състояние на имунната система, т.е. синтез на цитокини от клетките на тялото in vivo.

Определянето на нивата на производство на цитокини от мононуклеарните клетки на периферната кръв (PBMC) показва функционалното състояние на клетките. Спонтанното производство на MNC цитокини в култура показва, че клетките вече са активирани. in vivo.Индуцираният (от различни стимуланти, митогени) синтез на цитокини отразява потенциалната, резервна способност на клетките да реагират на антигенен стимул (по-специално на действието на лекарства). Намаленото индуцирано производство на цитокини може да служи като един от признаците на състояние на имунна недостатъчност. Цитокините не са специфични за определен антиген. Следователно специфичната диагностика на инфекциозни, автоимунни и алергични заболявания чрез определяне на нивото на определени цитокини е невъзможна. В същото време оценката на нивата на цитокини дава възможност да се получат данни за тежестта на възпалителния процес, прехода му към системно ниво и прогноза, функционалната активност на клетките на имунната система и съотношението на Th1 и Th2 клетките, което е много важно при диференциалната диагноза на редица инфекциозни и имунопатологични процеси.

В биологична среда цитокините могат да бъдат количествено определени с помощта на диапазон от методи за имуноанализ,използване на поликлонални и моноклонални антитела (виж Глава 4). ELISA ви позволява да разберете какви са точните концентрации на цитокини в био-

логични телесни течности. Откриването на цитокини чрез ELISA има редица предимства пред други методи (висока чувствителност, специфичност, независимост от наличието на антагонисти, възможност за точно автоматизирано отчитане, стандартизация на отчитането). Този метод обаче има и своите ограничения: ELISA не характеризира биологичната активност на цитокините и може да даде неверни резултати поради кръстосано реагиращи епитопи.

биологично изследванеизвършва се въз основа на познаването на основните свойства на цитокините, тяхното действие върху целевите клетки. Изследването на биологичните ефекти на цитокините е довело до разработването на четири вида тестове за цитокини:

1) чрез индуциране на пролиферация на прицелни клетки;

2) чрез цитотоксичен ефект;

3) чрез индуциране на диференциация на костномозъчни прогенитори;

4) чрез антивирусно действие.

IL-1 се определя от стимулиращия ефект върху пролиферацията на миши тимоцити, активирани от митоген инвитро; IL-2 - според способността да стимулира пролиферативната активност на лимфобластите; за цитотоксични ефекти върху миши фибробласти (L929), тествани са TNFa и лимфотоксини. Факторите, стимулиращи колониите, се оценяват по способността им да поддържат растежа на прогениторите в костния мозък като колонии върху агар. Антивирусната активност на IFN се открива чрез инхибиране на цитопатичното действие на вируси в културата на диплоидни човешки фибробласти и туморната линия на миши фибробласти L-929.

Създадени са клетъчни линии, чийто растеж зависи от наличието на определени цитокини. В табл. 7.1 е списък на клетъчни линии, използвани за тестване на цитокини. Съгласно способността за индуциране на пролиферация на чувствителни таргетни клетки се извършва биотестиране на IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 и др. Въпреки това, тези методи за изследване не са много чувствителни и информативни. Инхибиторните и антагонистичните молекули могат да маскират биологичната активност на цитокините. Някои цитокини проявяват обща биологична активност. Независимо от това, тези методи са идеални за тестване на специфичната активност на рекомбинантни цитокини.

Таблица 7.1.Клетъчни линии, използвани за тестване на биологичната активност на цитокините

Краят на масата. 7.1

Лаборатория 7-1

Определяне на биологичната активност на IL-1 чрез неговия комитогенен ефект върху пролиферацията на миши тимоцити

Методът за биологично изследване на IL-1 се основава на способността на цитокина да стимулира пролиферацията на миши тимоцити.

IL-1 може да се определи в култура от моноцити, стимулирани с LPS, както и във всяка телесна течност.Необходимо е да се обърне внимание на редица детайли.

1. За тестване се използват тимоцити от C3H/HeJ мишки, стимулирани да пролиферират с митогени (конканавалин A - ConA и фитохемаглутинин - PHA). C3H/HeJ тимоцитите не са избрани произволно: мишките от тази инбредна линия не реагират на LPS, който може да присъства в тестовия материал и да причини производството на IL-1.

2. Тимоцитите реагират на IL-2 и митогени, следователно в препарати, тествани за IL-1, трябва също да се определи наличието на IL-2 и митогени.

Оперативна процедура

1. Вземете суспензия от тимоцити в концентрация 12×10 6 /ml среда RPMI 1640, съдържаща 10% серум от фетални крави и 2-меркаптоетанол (5×10 -5 М).

2. Приготвя се серия от последователни двукратни разреждания на експериментални (телесни течности) и контролни проби. Като контроли се използват биологични течности, съдържащи IL-1 или проби, получени чрез инкубиране на мононуклеарни клетки без LPS и лабораторен стандартен препарат, съдържащ IL-1. В облодънни плаки с 96 ямки, 50 µl от всяко разреждане се прехвърлят в 6 ямки.

3. Добавете 50 µl пречистен PHA (Wellcome), разтворен в пълна среда при концентрация от 3 µg/ml към три ямки от всяко разреждане и 50 µl среда към останалите 3 ямки.

4. Добавете 50 µl суспензия от тимоцити към всяка ямка и инкубирайте за 48 часа при 37°C.

6. Преди завършване на култивирането, 50 μl от разтвор (1 μCi / ml) на [" 3 H]-тимидин се добавят към ямките и се инкубират за още 20 часа.

7. За да се определи нивото на радиоактивност, културалните клетки се прехвърлят върху филтърна хартия с помощта на автоматичен клетъчен харвестър, филтрите се изсушават и включването на етикет се определя от течен сцинтилационен брояч.

8. Резултатите се изразяват като коефициент на стимулация.

където m cp е средният брой импулси в 3 отвора.

Ако тимоцитите реагират на стимулация със стандартен IL-1, тогава индексът на стимулация на тестовата проба, надвишаващ 3, надеждно показва активността на IL-1.

Биологичният анализ е единственият метод за оценка на функционирането на даден цитокин, но този метод трябва да бъде допълнен от различни видове подходящи контроли за специфичност, като се използват моноклонални антитела. Добавянето на определени моноклонални антитела към цитокина в културата блокира биологичната активност на цитокина, което доказва, че сигналът за пролиферацията на клетъчната линия е определеният цитокин.

Използване на биотест за откриване на интерферон.Принципът за оценка на биологичната активност на IFN се основава на неговия антивирусен ефект, който се определя от степента на инхибиране на възпроизвеждането на тестовия вирус в клетъчната култура.

В работата могат да се използват клетки, чувствителни към действието на IFN: първоначално трипсинизирани пилешки и човешки ембрионални фибробластни клетки, трансплантирани клетки от човешки диплоидни фибробласти и миша клетъчна култура (L929).

При оценка на антивирусния ефект на IFN е препоръчително да се използват вируси с кратък цикъл на възпроизвеждане, висока чувствителност към действието на IFN: миши енцефаломиелитен вирус, миши везикулозен стоматит и др.

Лаборатория 7-2

Определяне на активността на интерферона

1. Суспензия от диплоидни човешки фетални фибробласти върху среда с 10% серум от говежди ембриони (клетъчна концентрация - 15-20×10 6 /ml) се излива в стерилни 96-ямкови плаки с плоско дъно, 100 μl на ямка и се поставя в CO 2 -инкубатор при температура 37 °C.

2. След образуване на пълен монослой, растежната среда се отстранява от ямките и към всяка ямка се добавят 100 µl поддържаща среда.

3. Титруването на активността на IFN в тестовите проби се извършва по метода на двойните разреждания върху монослой от фибробласти.

Едновременно с пробите, вирусът на миши енцефаломиелит (MEM) се въвежда в ямките в доза, която причинява 100% увреждане на клетките 48 часа след заразяването.

4. Ямките с интактни (нетретирани) инфектирани с вирус клетки се използват като контроли.

Референтни IFN проби с известна активност се използват като референтни препарати във всяко изследване.

5. Плаките за разреждане на пробата се инкубират в продължение на 24 часа при 37°C в 5% CO 2 атмосфера.

6. Нивото на активност на IFN се определя от реципрочната стойност на максималното разреждане на пробата за изследване, което забавя цитопатичния ефект на вируса с 50%, и се изразява в единици активност на 1 ml.

7. За да се определи вида на IFN, към системата се добавя антисерум срещу IFNα, IFNβ или IFNγ. Антисерумът отменя действието на съответния цитокин, което прави възможно идентифицирането на вида на IFN.

Определяне на биологичната активност на миграцията на инхибиторния фактор.Понастоящем са формирани напълно нови идеи за природата и свойствата на MYTH, открит през 60-те години на миналия век като медиатор на клетъчния имунитет и дълги години оставен без необходимото внимание (Bloom B.R., Bennet B., 1966; David J.R. , 1966). Едва през последните 10-15 години стана ясно, че MYTH е един от най-важните биологични медиатори в организма с широк спектър от биологични функции на цитокин, хормон и ензим. Действието на MIF върху прицелните клетки се осъществява чрез CD74 - рецептора или чрез некласическия път на ендоцитоза.

MYTH се счита за важен възпалителен медиатор, който активира функцията на макрофагите (продукция на цитокини, фагоцитоза, цитотоксичност и др.), както и ендогенен имунорегулаторен хормон, който модулира глюкокортикоидната активност.

Натрупва се все повече информация за ролята на MYTH в патогенезата на много възпалителни заболявания, включително сепсис, ревматоиден артрит (RA), гломерулонефрит и др. При RA концентрацията на MYTH в течността на засегнатите стави е значително повишена , което корелира с тежестта на заболяването. Под въздействието на MIF се увеличава производството на провъзпалителни цитокини както от макрофагите, така и от синовиалните клетки.

Съществуват различни методи за тестване на активността на MIF, когато мигриращи клетки (прицелни клетки за MIF) се поставят в стъклена капилярка (капилярен тест), в капка агароза или в кладенче за агароза.

Представяме сравнително прост метод за скрининг, базиран на образуването на клетъчни микрокултури (левкоцити или макрофаги) със стандартна площ и брой клетки на дъното на ямките на плоскодънна плака с 96 ямки, последвано от тяхното култивиране в хранителна среда и определяне на промяната в площта на тези микрокултури под действието на MIF (Suslov A.P., 1989).

Лаборатория 7-3

Дефиниция на MYTH дейност

Определянето на биологичната активност на MIF се извършва с помощта на устройство за образуване на клетъчни микрокултури (фиг. 7.7) - MIGROSCRIN (Изследователски институт по епидемиология и микробиология на името на N.F. Gamaleya на Руската академия на медицинските науки).

1. В ямките на 96-ямкова плака (Flow, UK или подобна) добавете 100 µl проба, разредена в културална среда, в която се определя MIF активността (всяко разреждане в 4 паралела, експериментални проби). Културалната среда включва RPMI 1640, 2 тМ L-глутамин, 5% фетален говежди серум, 40 μg/ml гентамицин.

2. В контролните ямки добавете хранителната среда (в 4 паралела) 100 µl.

3. Приготвя се клетъчна суспензия от перитонеални макрофаги, за която 2 хибридни мишки (CBAxC57B1 / 6) F1 се инжектират интраперитонеално с 10 ml разтвор на Ханк с хепарин (10 U / ml), коремът се масажира леко в продължение на 2-3 минути. . След това животното се заколва чрез обезглавяване, внимателно се пробива коремната стена в областта на слабините и ексудатът се аспирира през иглата със спринцовка. Клетките от перитонеален ексудат се промиват двукратно с разтвор на Hank, като се центрофугират за 10-15 минути при 200 g. След това се приготвя клетъчна суспензия с концентрация 10±1 милиона/ml среда RPMI 1640. Броенето се извършва в камера на Goryaev.

4. Сглобява се системата MIGROSCRIN, която представлява стойка за насочена и стандартна фиксация на накрайници с клетъчни култури в строго вертикално положение на дадена височина над центъра на ямката на 96-ямкова културална плака, а също така включва 92 накрайника за автоматична пипета от Costar, САЩ (фиг. .7.7).

Поставете краката на статива в ъгловите отвори на плочата. Клетъчната суспензия се събира с автоматична пипета в накрайници - по 5 μl, изплакват се от излишните клетки чрез еднократно потапяне в средата и се поставят вертикално в гнездата на системната стойка. Напълнената решетка с накрайници се държи при стайна температура за 1 час върху строго хоризонтална повърхност. През това време клетките от суспензията се утаяват на дъното на ямките, където се образуват стандартни клетъчни микрокултури.

5. Внимателно отстранете стойката за върха от чинията. Плаката с микрокултура от клетки се поставя в строго хоризонтално положение в CO 2 инкубатор, където се култивира в продължение на 20 ч. По време на култивирането клетките мигрират по дъното на ямката.

6. Количественото определяне на резултатите след инкубацията се извършва на бинокулярна лупа, като визуално се оценява размерът на колонията по скала вътре в окуляра. Микрокултурите са оформени като кръг. След това изследователите определят средния диаметър на колонията от резултатите от измерванията на колонията в 4 тестови или контролни ямки. Грешката на измерване е ±1 mm.

Индексът на миграция (MI) се изчислява по формулата:

Пробата има MYTH активност, ако стойностите на MI са равни на

За условна единица (U) активност на MYTH, обратната стойност се приема равна на стойността на най-високото разреждане на пробата (пробата), при което индексът на миграция е 0,6 ± 0,2.

Биологичната активност на PEOα се оценява чрез неговия цитотоксичен ефект върху линията на трансформирани фибробласти L-929. Рекомбинантният TNFa се използва като положителна контрола, а клетките в културална среда се използват като отрицателна контрола.

Цитотоксичният индекс (CI) се изчислява:

където а- броя на живите клетки в контролата; b- броя на живите клетки в експеримента.

Ориз. 7.7.Схема МИГРОСКРИН - уреди за количествена оценка на миграцията на клетъчни култури

Клетките се оцветяват с багрило (метиленово синьо), което се съдържа само в мъртвите клетки.

За конвенционална единица TNF активност се взема стойността на обратното разреждане на пробата, което е необходимо за получаване на 50% клетъчна цитотоксичност. Специфичната активност на пробата е отношението на активността в произволни единици на 1 ml към концентрацията на протеина, съдържащ се в пробата.

Вътреклетъчно оцветяване с цитокини.Промяната в съотношението на клетките, произвеждащи различни цитокини, може да отразява патогенезата на заболяването и да служи като критерий за прогнозата на заболяването и оценката на терапията.

Методът на вътреклетъчното оцветяване определя експресията на цитокина на ниво една клетка. Поточната цитометрия ви позволява да преброите броя на клетките, експресиращи определен цитокин.

Нека изброим основните стъпки при определянето на вътреклетъчните цитокини.

Нестимулираните клетки произвеждат малки количества цитокини, които по правило не се отлагат, следователно важна стъпка в оценката на вътреклетъчните цитокини е стимулирането на лимфоцитите и блокадата на освобождаването на тези продукти от клетките.

Активаторът на протеин киназа С форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА) в комбинация с калциевия йонофор йономицин (IN) най-често се използва като индуктор на цитокини. Използването на тази комбинация предизвиква синтеза на широк спектър от цитокини: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. Недостатъкът на използването на FMA-IN е проблемът с откриването на CD4 молекули на повърхността на лимфоцитите след такова активиране. Също така производството на цитокини от Т-лимфоцити се индуцира с помощта на митогени (PGA). В клетките и моноцитите стимулират

Мононуклеарните клетки се инкубират в присъствието на индуктори на производството на цитокини и блокер на техния вътреклетъчен транспорт, брефелдин А или монензин, в продължение на 2-6 часа.

След това клетките се ресуспендират в буферен разтвор. За фиксиране добавете 2% формалдехид, инкубирайте за 10-15 минути при стайна температура.

След това клетките се третират със сапонин, който повишава пропускливостта на клетъчната мембрана и се оцветяват с моноклонални антитела, специфични за цитокините, които трябва да се определят. Предварителното оцветяване на повърхностни маркери (CD4, CD8) увеличава количеството на получената информация за клетката и дава възможност за по-точно определяне на нейната популационна принадлежност.

Има някои ограничения при прилагането на описаните по-горе методи. По този начин, използвайки ги, е невъзможно да се анализира синтеза на цитокини от една клетка, невъзможно е да се определи броят на клетките, произвеждащи цитокини в субпопулация, невъзможно е да се определи дали клетките, произвеждащи цитокини, експресират уникални маркери, дали различни цитокини се синтезират от различни клетки или от едни и същи. Отговорът на тези въпроси се получава с помощта на други изследователски методи. За да се определи честотата на клетките, продуциращи цитокини в популацията, се използват методът на ограничаващо разреждане и вариантът ELISPOT на ензимно-свързания имуносорбентен анализ (вижте Глава 4).

Метод на in situ хибридизация.Методът включва:

2) фиксиране с параформалдехид;

3) откриване на иРНК с помощта на белязана кДНК. В някои случаи цитокинова иРНК се определя на срезове с помощта на радиоизотопна PCR.

Имунофлуоресценция.Методът включва:

1) замразяване на органа и подготовка на криостатни секции;

2) фиксация;

3) третиране на срезове с маркирани с флуоресцеин анти-цитокинови антитела;

4) визуално наблюдение на флуоресценцията.

Тези техники (хибридизация на мястои имунофлуоресценция) са бързи и не зависят от праговите концентрации на секретирания продукт. Те обаче не определят количеството секретиран цитокин и могат да бъдат технически сложни. Необходимо е разнообразно внимателно проследяване за неспецифични реакции.

С помощта на представените методи за оценка на цитокините са идентифицирани патологични процеси, свързани с нарушения в цитокиновата система на различни нива.

По този начин оценката на цитокиновата система е изключително важна за характеризиране на състоянието на имунната система на организма. Изследването на различни нива на цитокиновата система позволява да се получи информация за функционалната активност на различни видове имунокомпетентни клетки, тежестта на възпалителния процес, прехода му на системно ниво и прогнозата на заболяването.

Въпроси и задачи

1. Избройте общите свойства на цитокините.

2. Дайте класификация на цитокините.

3. Избройте основните компоненти на цитокиновата система.

4. Избройте клетките, произвеждащи цитокини.

5. Опишете семействата цитокинови рецептори.

6. Какви са механизмите на функциониране на цитокиновата мрежа?

7. Разкажете ни за производството на цитокини във вродената имунна система.

8. Какви са основните подходи за комплексна оценка на цитокиновата система?

9. Какви са методите за изследване на цитокини в телесни течности?

10. Какви са дефектите в цитокиновата система при различни патологии?

11. Какви са основните методи за биологично изследване на IL-1, IFN, MIF, TNFa в биологични течности?

12. Опишете процеса на определяне на вътреклетъчното съдържание на цитокини.

13. Опишете процеса на определяне на цитокините, секретирани от една клетка.

14. Опишете последователността от методи, използвани за откриване на дефект на ниво цитокинов рецептор.

15. Опишете последователността от методи, използвани за откриване на дефект на ниво цитокин-продуциращи клетки.

16. Каква информация може да се получи чрез изследване на производството на цитокини в култура от мононуклеарни клетки в кръвен серум?

Цитокините включват различни протеини с молекулно тегло 15-40 kDa, които се синтезират от различни клетки в тялото. Цитокините са молекули, които осигуряват взаимодействието на клетките на имунната система, съдовия ендотел, нервната система и черния дроб. Понастоящем са известни повече от 200 цитокина.

Едни и същи цитокини могат да се синтезират от клетки от различен тип – имунната система, далака, тимуса, съединителната тъкан. От друга страна, определена клетка е способна да произвежда много различни цитокини. Най-голямото разнообразие от цитокини се образува от лимфоцити, поради което лимфоцитният имунитет взаимодейства с други имунни механизми и с тялото като цяло.

Съществена характеристика на цитокините, за разлика от хормоните и другите сигнални молекули, е еднакъв, различен или дори противоположен резултат от тяхното действие за различните клетки. Тези. Крайният резултат от въздействието на един цитокин не зависи от вида му, а от вътрешната програма на таргетната клетка, от нейните индивидуални задачи!

Функции на цитокините

Ролята на цитокините в регулирането на функциите на тялото може да бъде разделена на 4 основни компонента:

1. Регулиране на ембриогенезата, полагането и развитието на органите, включително органите на имунната система.

2. Регулиране на процесите на растеж на тъканите:

3. Регулиране на индивидуалните физиологични функции:

• осигуряване на функционалната активност на клетките,
• координация на реакциите на ендокринната, имунната и нервната системи,
• поддържане на хомеостазата (динамично постоянство) на тялото.

4. Регулиране на защитните реакции на организма на локално и системно ниво:

• промени в продължителността и интензивността на имунните реакции (антитуморна и антивирусна защита на организма),
• модулиране на възпалителните реакции,
• участие в развитието на автоимунни реакции.
• стимулиране или инхибиране на клетъчния растеж,
• участие в процеса на хематопоеза.