A fluoreszcens in situ hibridizációs módszer szakaszai. FISH teszt: gyors rákdiagnózis

A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISF – fluoreszcencia in situ hibridizáció) módszere egyedi nukleotid-DNS-szekvenciák próbaként történő felhasználását jelenti a kívánt DNS-szekvenciák megkeresésére a pácienstől kapott anyagban. A lókusz-specifikus vagy gén-specifikus DNS-próbát specifikus markerrel (pl. fluorokrómmal) jelölik, hogy fluoreszcens mikroszkóppal kimutatható legyen. A vizsgált DNS kromoszómák mikroszkopikus vizsgálatra alkalmas preparátuma, amely az interfázisban (nem osztódó állapotban) lévő metafázis magjában szálakat tartalmaz. A DNS-próba és a teszt-DNS denaturálódik, ami egyszálú DNS-t eredményez. A DNS-próbát a kromoszómakészítményhez adjuk, és a páciens DNS-próbájának és komplementer DNS-szekvenciáinak hibridizálásához elegendő ideig inkubáljuk, ha a betegnek a DNS-próbával komplementer DNS-régiója van. A hibridizáció csak a komplementer DNS-régiókon megy végbe, és nem érinti a genom más részeiből származó más DNS-szekvenciákkal rendelkező fragmentumokat. A hibridizáció után a fluorokrómmal jelölt próba jelenlétét vagy hiányát a DNS-ben a kromoszómák fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatával határozzuk meg. Az eredmény általában nem kétséges (28.1. ábra).

A FISH előnyei közé tartozik a nagyszámú sejt gyors elemzése, a nagy érzékenység és specificitás, valamint a nem tenyészthető és nem osztódó sejtek vizsgálatának képessége. Ezzel a módszerrel lehetőség nyílik a paraffin metszetekben lévő sejtek vizsgálatára. A módszer hátránya, hogy nem lehet információt szerezni a vizsgált DNS vagy kromoszómarégió fizikai állapotáról. A FISH megköveteli a kromoszóma-rendellenességben szerepet játszó lókusz ismeretét, valamint egy megfelelő DNS-próba kiválasztását, amely képes kimutatni ezt az aberrációt. A FISH-t nem használják szűrési módszerként. A módszert arra használjuk, hogy választ kapjunk egy konkrét kérdésre (meghatározzuk a feltételezett specifikus mutáció hiányát vagy jelenlétét). Általában kiegészíti a kromoszómák festésének klasszikus módszereit, és egyben a metafázisban vagy interfázisban lévő kromoszómák és az adott betegség (fenotípus) hátterében álló specifikus DNS-nukleotidszekvenciák azonosításának fő módja.

A FISH-t a prenatális diagnosztikában és a daganatok jellemzésére használják; a gyermekgyógyászati gyakorlatban általában a specifikus malformációkkal kapcsolatos szubmikroszkópos deléciók azonosítására használják. A mikrodeléción alapuló szindrómákat korábban ismeretlen etiológiájú betegségeknek tekintették, mivel az ilyen betegségek kialakulását okozó kromoszóma-deléciókat és átrendeződéseket a hagyományos kromoszómaelemzési módszerekkel általában nem jelenítik meg. Az ilyen kis deléciók a kromoszómák meghatározott régióiban nagy pontossággal detektálhatók FISH segítségével. A szubmikroszkópos deléciók által okozott betegségek közé tartozik

Az onkológiai patológiák kezelésére a tudósok még nem dolgoztak ki tökéletes terápiás módszereket, amelyek elősegítik a gyógyulást. A mellrák halelemzése reményt ad a betegség korai diagnosztizálására. A módszer lehetővé teszi a nők számára, hogy a kezelést a legkorábbi stádiumban kezdjék meg, ami növeli a gyógyulás esélyeit.

Ami?

Az emlőrák halvizsgálata a korai diagnózis egyik progresszív és releváns eszköze. Angolról lefordítva intracelluláris fluoreszcens hibridizációs tesztet jelent. Ezzel a génteszttel az onkológusok elemzik a daganatok eredetét. Az elemzés az agresszív típusú rák patogenezisében és progressziójában szerepet játszó gén - a HER2 - pozitív vagy negatív hatását is jelzi.

A tudományos kutatás folyamatos fejlődése befolyásolja a FISH-teszt költségének csökkenését, és egyre több nő számára teszi elérhetővé.

A hónaljban megnagyobbodott nyirokcsomók jelezhetik a betegség kialakulását.

duzzadt nyirokcsomók a hónaljban;
tömítések a mellkas területén;
fájdalom a mellbimbó megnyomásakor;
az emlőmirigyek aszimmetriája;
kellemetlen érzés és fájdalom az egyik mellben;
váladék a mellbimbókból;
ráncos bőr az emlőmirigyen;
fordított mellbimbó.

Elemzés elkészítése és benyújtása

A halteszt sikeres teljesítéséhez nincs szükség különösebb felkészülésre. Nem csak alkoholt fogyaszthat, hanem bármilyen teszt elvégzése előtt, és zsíros, húsos és nehéz ételeket fogyaszthat. Az ételnek könnyűnek kell lennie, jobb, ha zöldségételek és gyümölcslevek. A mellrák haltesztje egy ártalmatlan és biztonságos eljárás, amely két szakaszból áll:

Szövettani. Helyi érzéstelenítésben biopsziát végzünk a mellből származó bioanyagból. A kapott anyagot speciális festékkel, fluoreszcens markerekkel dolgozzák fel. Kémiai tulajdonságaik szerint ezek a markerek kizárólag a kijelölt kromoszómákhoz és sejtkészleteikhez kapcsolódnak. A kutatás eredményeként a markerrel leginkább festett kromoszómakészletek láthatók, ami az onkológiai hovatartozás szerint jelzi a genom változásának mértékét.
Halelemzés. Egy DNS-komponenst infundálnak a vénába - dezoxiribonukleinsavat specifikus markerekkel megfestenek. A marker címkék sejtszinten integrálódnak a genomokba. A vizsgálatot a beteg jelenlétében végzik, és az elemzés eredményeit azonnal rendelkezésre bocsátják.

Mit mutatnak az eredmények?

Az emlő szövettana lehetővé teszi a daganat típusának és előfordulásának okainak megállapítását.

A mellrák halelemzése a következő eredményeket mutatja:

Szövettani vizsgálat. Az eredményeket a kromoszómakészletek régióiban lévő markerek telítettsége szerint állítjuk be. 1 vagy kevesebb szám azt jelenti, hogy nincs veszély. A szám egy határállapotot jelöl, amely további vizsgálatokat igényel. A 3-as szám az onkológiai folyamat kialakulását jelöli.
Halreakció emlőrákban. A negatív reakció eredménye azt jelenti, hogy a dezoxiribonukleinsav molekulák nem vesznek részt az atipikus sejtek patogenezisében. Rosszindulatú formáció kialakulásával a HER2 gén nem befolyásolja a rákos sejtet. Pozitív reakció esetén az onkológiai molekulák patogenezisében részt vevő gének osztódási sebessége megduplázódik.

hibridizációs módszer in situ* (a helyén, lat.) a DNS vagy RNS azon képességén alapul, hogy stabil hibrid molekulákat hozzon létre a DNS/RNS próbákkal közvetlenül a rögzített kromoszómák és interfázisú magok preparátumain. Ezzel a módszerrel szinte bármilyen DNS- vagy RNS-szekvencia pontos elhelyezkedése meghatározható közvetlenül a sejtben, sejtmagban vagy kromoszómákban.

Hibridizációhoz. in situ bármely szövet vagy szerv sejtjeinek megfelelő citológiai vagy szövettani készítményei, amelyeket szabványos módszerekkel készítenek. Klinikai citogenetikai laboratóriumban tenyésztett perifériás vér limfociták, chorion epithelialis citotrofoblaszt sejtek, magzatvíz tenyésztett és nem tenyésztett sejtjei, vetélési anyagból származó különféle szövetek, valamint bukkális epitélium és vérsejtek keneteit használják.

hibridizációs módszer in situ különösen fontos a gyakorlati citogenetika szempontjából egy nem izotópos változat kifejlesztése miatt, amely nem radioaktív módosított nukleotidokkal jelölt próbák felhasználásán alapul. A preparátumokon történő hibridizáció nem izotópos változatai (különösen a fluoreszcensek) számos előnnyel rendelkeznek az izotóposokhoz képest: nagy felbontás, ami megegyezik a mikroszkóp felbontásával (0,1 - 0,2 μm), nincs szükség az eredmények statisztikai feldolgozására, sebesség és biztonság az egészségügyi kutatók számára

Ezenkívül a különböző detektálórendszerekkel kimutatott, eltérően módosított próbák kombinációja lehetővé teszi két vagy több DNS-szekvencia elhelyezkedésének egyidejű meghatározását egy sejtben vagy egy metafázisú lemezen. A fluorokrómokkal jelölt ismétlődő szekvenciák DNS-próbaként történő alkalmazása pedig 7-9 órára csökkenti az eljárás idejét (a klasszikus nem izotópos hibridizáció két napot vesz igénybe, az izotópváltozatok egy héttől egy hónapig tartanak), ami különösen fontos a prenatális diagnózis szempontjából. Használat FISH módszer a citogenetikai diagnosztikában lehetővé teszi a kromoszóma szerkezeti átrendeződéseinek azonosítását, a marker kromoszómák természetének megállapítását, a kromoszómakészlet számszerű megsértésének elemzését, mind a metafázisú kromoszómákon, mind az interfázisos magokban.

A FISH módszer elve

A magban FISH módszer a hibridizációs reakció egy mesterségesen létrehozott DNS-próba és annak komplementer nukleáris DNS-szekvenciája között. A DNS-molekula két spirálisan összekapcsolt nukleotidláncból áll, és a hibridizáció csak akkor lehetséges, ha a láncok szétválnak. A DNS nukleotidláncainak szétválasztásához denaturációt alkalmaznak (a későbbi hibridizációhoz mind a vizsgált minta magjaiban lévő DNS-t, mind magát a DNS-próbát denaturálni kell). A denaturálás után a DNS-próba hibridizálódik a komplementer nukleotidszekvenciájához, és fluoreszcens mikroszkóppal kimutatható.

Így a beállítási protokoll általános formája HAL a következő formában lehet bemutatni:

1. Szövettani vagy citológiai készítmény készítése.
A szövettani készítmény elkészítése a szabványos séma szerint történik: vágás, jelölés, huzalozás, öntés, mikrotómia, a vágás tárgylemezre helyezése és paraffinmentesítés. Citológiai készítmény készítésekor speciális kicsapó oldatokat és centrifugálást alkalmaznak, amely lehetővé teszi a koncentrált sejtszuszpenzió előállítását.

2. Előkezelés (ha szükséges).
A készítményt proteázok dolgozzák fel, hogy kiküszöböljék a hibridizációt gátló fehérjék jelenlétét.

3. DNS-próba alkalmazása a készítményre, majd az azt követő denaturálás.
A próba és a minta DNS denaturálásához formamiddal kezeljük, és körülbelül 85-90 °C hőmérsékletre melegítjük.

4. Hibridizáció.
A denaturálást követően a gyógyszert egy bizonyos hőmérsékletre (klinikai vizsgálatok esetén 37 °C) lehűtjük, és nedves kamrában több órán át inkubáljuk (az inkubáció időtartamát az egyes protokollokban feltüntetjük). Jelenleg automatikus hibridizálókat használnak a denaturációhoz és a hibridizációhoz.

5. Mosás.
A hibridizáció befejezése után a nem kötött próbákat le kell mosni, ami egyébként olyan hátteret hozna létre, amely megnehezíti a FISH-eredmények értékelését. Az öblítéshez általában citrátot és nátrium-kloridot (SSC) tartalmazó oldatot használnak.

6. Ellenfestés.
Fluoreszcens festékek (DAPI - 4,6-diamidin-2-phenylindol; propidium-jodid) segítségével az összes sejtmag DNS megfestődik.

7. Az eredmények elemzése fluoreszcens mikroszkóp segítségével. A rutin műveletek (viaszmentesítés, előkezelés, mosás) automatizálhatók.

* - Az anyag nyílt forrásból származó információk alapján készült.

A FISH-festési módszert (fluoreszcens in situ hibridizáció) a Livermore National Laboratory-ban (USA) fejlesztették ki 1986-ban. Ez egy alapvetően új módszer a kromoszómák tanulmányozására - egy módszer a fluoreszcens DNS kimutatására specifikus molekuláris próbákkal végzett in situ hibridizációval. A módszer a kromoszómális DNS azon képességén alapul, hogy bizonyos körülmények között DNS-fragmensekhez (DNS-próbák) kötődjön, amelyek a kromoszómális DNS-sel komplementer nukleotidszekvenciákat tartalmaznak. A DNS-próbákat speciális anyagokkal (például biotinnal vagy digoxigeninnel) előre megjelölik. Jelzett DNS-próbákat alkalmaznak a hibridizációra előkészített metafázisú kromoszómák citogenetikai preparátumaira. A hibridizáció megtörténte után a készítményeket speciális, biotinhoz vagy digoxigeninhez szelektíven kötődni képes anyagokkal konjugált fluoreszcens festékekkel kezelik. Minden kromoszómának van saját színe. A hibridizáció radioaktívan jelölt szondákkal is elvégezhető. A citogenetikai elemzést fluoreszcens mikroszkóp alatt végezzük ultraibolya fényben.

A FISH módszert a kis deléciók és transzlokációk kimutatására használják. A különböző színű kromoszómák közötti kromoszómacserék (transzlokációk és dicentrikusok) könnyen azonosíthatók többszínű struktúrákként.

Munka vége -

Ez a téma a következőkhöz tartozik:

Tanulási modul. sejtbiológia

Felsőfokú szakmai végzettség.. Baskír Állami Orvostudományi Egyetem.. Egészségügyi és Szociális Fejlesztési Minisztérium..

Ha további anyagra van szüksége ebben a témában, vagy nem találta meg, amit keresett, javasoljuk, hogy használja a munkaadatbázisunkban található keresést:

Mit csinálunk a kapott anyaggal:

Ha ez az anyag hasznosnak bizonyult az Ön számára, elmentheti az oldalára a közösségi hálózatokon:

Az összes téma ebben a részben:

Tanulási modul. Az általános és orvosi genetika alapjai
(útmutató hallgatóknak) Tanulmányi tudományág Biológia A felkészítés irányába Általános Orvostudományi Rt.

A laboratóriumi munka nyilvántartásának szabályai
Egy tárgy mikroszkópos vizsgálatának szükséges eleme a vázlat egy albumban. A vázlat célja a tárgy szerkezetének, az egyes struktúrák alakjának jobb megértése és emlékezetben való rögzítése.

Praktikus munka
1. Ideiglenes készítmény készítése "Hagymafilmsejtek" Hagymafilmes ideiglenes készítmény elkészítéséhez távolítsa el

A citoplazma membránok szerkezete. A membránok szállítási funkciója
2. Tanulási célok: Ismerni: - az univerzális biológiai membrán szerkezetét - az anyagok membránokon keresztüli passzív transzportjának mintázatait

Az eukarióta sejtek szerkezete. Citoplazma és összetevői
2. Tanulási célok: Ismerje: - az eukarióta sejtek szerveződésének sajátosságait - a citoplazmatikus organellumok szerkezetét és működését.

Az anyagok szintézisében részt vevő organellumok
Bármely sejtben végbemennek a rá jellemző anyagok szintézise, amelyek vagy az újonnan kialakult szerkezetek építőanyagai a kopottak helyett, vagy biokémiai reakciókban részt vevő enzimek.

Védő és emésztő funkcióval rendelkező organellumok
Lizoszómák Ezek az organellumok az 1950-es évek óta ismertek, amikor a belga biokémikus de Duve felfedezte a májsejtekben hidrolitikus tartalmú kis granulátumokat.

A sejt energiaellátásában részt vevő organellumok
A sejtfunkciók túlnyomó többsége energiafelhasználással jár. Egy élő sejt állandóan lezajló redox folyamatok eredményeként képződik

A sejtosztódásban és mozgásban részt vevő organellumok
Ezek közé tartozik a sejtközpont és származékai - csillók és flagellák. Sejtközpont A sejtközpont állati sejtekben és néhányban található

1. sz. gyakorlati munka
1. ábra A "Golgi-komplex a gerinc ganglion sejtjeiben" permanens készítmény mikroszkópos elemzése A preparátumon elnevezett idegsejtek

Riboszómák
Elektronmikroszkóppal kimutathatóak minden pro- és eukarióta szervezet sejtjéből, méretük 8-35 nm, szomszédosak az endoplazmatikus retikulum külső membránjával. Riboszómákon hajtják végre

Szemcsés endoplazmatikus retikulum
Vizsgáljuk meg a durva endoplazmatikus retikulum szubmikroszkópos szerkezetét elektronmikroszkóppal! Egy éhező denevér hasnyálmirigyében három acinus sejt területet fedeznek fel. Előtt

Citoplazmatikus mikrotubulusok
A citoplazmatikus tubulusok minden állati és növényi szervezet sejtjében megtalálhatók. Ezek hengeres, fonalas képződmények, 20-30 mikron hosszúak, 1

Mitotikus aktivitás a szövetekben és sejtekben
Jelenleg számos állati és növényi szövet mitotikus ciklusait és mitotikus aktivitásának módját tanulmányozták. Kiderült, hogy minden szövetnek van egy bizonyos szintű mitotikus aktivitása. Körülbelül m

Mitózis (közvetett osztódás) a hagyma gyökér sejtjeiben
A mikroszkóp kis nagyításával keresse meg a hagyma hegyének szaporodási zónáját, helyezzen a látómező közepére egy jól látható, aktívan osztódó sejteket tartalmazó területet. Ezután állítsa be a gyógyszert nagy növekedésre

Amitózis (közvetlen osztódás) egérmájsejtekben
Vizsgálja meg az egér májsejteket a mikroszkóp nagy nagyításával. A készítményen a sejtek sokrétűek. A nem osztódó sejtekben a mag egy maggal van lekerekítve. A megkezdett osztódó sejtekben

Ascaris ovum synkaryon
A mikroszkóp kis nagyításával keresse meg az orsóféreg méhének egy szakaszát, amely petesejtekkel teli tüszővel van teli. Tekintse meg a mintát nagy nagyítással. A tojásban lévő citoplazma összezsugorodik és lehámlik

A DNS és az RNS felépítése és funkciói. A gének szerkezete és a génexpresszió szabályozása pro- és eukariótákban. A fehérje bioszintézis szakaszai
2. Tanulási célok: Ismerje: - a nukleinsavak kémiai összetételét és szerkezeti jellemzőit; - különbségek a DNS és az RNS között;

A tulajdonságok öröklődési mintái monohibrid keresztezésben. Az allél gének kölcsönhatásának típusai
2. Tanulási célok: Ismerni: - a monohibrid keresztezés mintáit; - Mendel I. és II. törvénye; - interakció típusai

A tulajdonságok független öröklődésének törvénye. A nem allél gének kölcsönhatásának típusai
2. Tanulási célok: Ismerni: - a di- és polihibrid keresztezés mintáit; - III. Mendel-törvény; - interakció típusai

A változékonyság, mint az élők tulajdonsága, formája. Fenotípusos (módosult vagy nem örökletes) változékonyság. Genotípusos variabilitás
2. Tanulási célok: Ismerni: - a variabilitás főbb formáit; - ötleteket merítsen a felismerés penetranciájáról és kifejezőképességéről

A tanulók önálló munkája tanári felügyelet mellett
Gyakorlati munka Egy tulajdonság variabilitásának mértékének és a környezeti feltételektől függő variációs együtthatójának meghatározása.

Törzskönyv elemzés
Nem minden genetikai módszer alkalmazható bizonyos tulajdonságok öröklődésének elemzésére az emberben. A rokonok több generációjának fenotípusának tanulmányozásával azonban megállapítható az öröklődés természete.

Iker módszer az emberi genetika tanulmányozására
Az iker-módszer felméri a genetikai és környezeti tényezők relatív szerepét egy adott tulajdonság vagy betegség kialakulásában. Az ikrek egypetéjűek (azonosak) és kétpetéjűek (szer

Dermatoglif módszer az emberi genetika tanulmányozására
A dermatoglifikus elemzés az ujjak, tenyér és láb papilláris mintázatának vizsgálata. Ezeken a bőrterületeken nagy bőrpapillák találhatók, és az ezeket borító hámréteg g

Citogenetikai módszer a humán genetika vizsgálatában
Az emberi örökletes patológia tanulmányozásának számos módszere között a citogenetikai módszer fontos helyet foglal el. A citogenetikai módszer segítségével lehetőség nyílik az öröklődés anyagi alapjainak elemzésére

A kromoszómakészlet vizsgálata
Kétféleképpen hajtható végre: 1) közvetlen módszerrel - a metafázisú kromoszómák tanulmányozása osztódó sejtekben, például csontvelőben (használt

Praktikus munka
1. "Human kariotípus" bemutató készítmény megtekintése a citogenetikai laboratóriumban X90-es nagyítással a leukociták láthatók a látómezőben

Kariotípus elemzés kromoszómabetegségben szenvedő betegeknél (fényképekből)
1. sz. triszómia a 13. kromoszómán (Patau-szindróma). Kariotípus 47, +13. 2. sz. triszómia a 18. kromoszómán (Edwards-szindróma). Kariotípus 47, +18. 3. sz. triszómia a 21. kromoszómán (Down-kór).

Ujjlenyomat-elemzés elvégzése
A saját ujjlenyomat készítéséhez a következő eszközökre van szükség: fényképező henger, 20x20 cm2-es üveg, habszivacs darab, nyomdafesték (vagy hasonló

A kariotípus citogenetikai elemzése (metafázisos lemezek mikrofotói alapján)
1. Vázolja fel a metafázis lemezt. 2. Számolja meg a kromoszómák teljes számát. 3. Azonosítsa az A csoport kromoszómáit (3 pár nagy metacentrikus kromoszóma), B (két pár nagy

Expressz módszer az X-ivar kromatin tanulmányozására a szájnyálkahártya epitéliumának magjaiban
A kaparás előtt a pácienst arra kérik, hogy harapja meg fogaival az arc nyálkahártyáját, és törölje le az arc belső felületét egy gézszalvétával. Ez az eljárás az elpusztult sejtek eltávolításához szükséges, pl

Népességstatisztikai módszer
A populáció ugyanazon fajhoz tartozó egyedek halmaza, amelyek hosszú ideig ugyanazon a területen élnek, viszonylag elszigetelve e faj más egyedcsoportjaitól, szabadon keresztezik egymást és adnak

Biokémiai módszer
A biokémiai módszerek az enzimrendszerek aktivitásának vizsgálatán alapulnak (akár maga az enzim aktivitása, akár az ezen enzim által katalizált reakció végtermékeinek mennyisége alapján). Biokémiai anyagok

Molekuláris genetikai módszer
Minden molekuláris genetikai módszer a DNS szerkezetének vizsgálatán alapul. A DNS analízis szakaszai: 1. DNS izolálása sejtmagot tartalmazó sejtekből (vér

A DNS szintézis polimeráz láncreakciója
A polimeráz láncreakció (PCR) a DNS in vitro amplifikációjának (szaporításának) módszere, melynek segítségével néhány órán belül 80-tól azonosítható és megsokszorozható a számunkra érdekes DNS-fragmens.

szám Teljes név genotípus Ivanov AA Petrov Aa

Megfigyelt genotípus és allélgyakoriság
Genotípusok, allélok Esetek száma Gyakoriság (részesedésben) АА 1/5 = 0,2 Аа

A genotípusok és allélok megfigyelt és várható gyakorisága
Megfigyelt esetek száma Megfigyelt gyakoriság Az AA várható gyakorisága (p2)

Megfigyelt genotípus és allélgyakoriság
№ p / p Képes a nyelvet csőbe csavarni Genotípusok tudom (igen) A_

Rövid válasz: A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH - fluoreszcens in situ hibridizáció) módszere egyedi DNS nukleotid szekvenciák próbaként történő felhasználását jelenti a kívánt DNS szekvenciák megkeresésére a pácienstől kapott anyagban. A módszer egy DNS-próba komplementer kötődésén alapul metafázisú kromoszómák vagy interfázisú sejtek DNS-éhez. A DNS-próbát és a teszt-DNS-t denaturálják, hogy egyszálú DNS-t kapjanak. A DNS-próbát a kromoszómakészítményhez adjuk, és egy bizonyos ideig inkubáljuk. A hibridizáció után a fluorokrómmal jelölt próba jelenlétét vagy hiányát a DNS-ben a kromoszómák fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatával határozzuk meg.

Részletes válasz: Fluoreszcens hibridizációs módszer in situ lehetővé teszi az egyes kromoszómák vagy azok egyedi metszeteinek azonosítását metafázisú kromoszómák vagy interfázisú magok preparátumain egy fluoreszcens jelöléssel konjugált DNS-próba és a kromoszóma kívánt helyének komplementer kölcsönhatása alapján. A peptid-nukleinsav vegyületek kromoszómán való megjelenítéséhez fehérjeterméken alapuló PNA-próbákat használnak.
A módszer egy DNS-próba komplementer kötődésén alapul metafázisú kromoszómák vagy interfázisú sejtek DNS-éhez, és a következő lépéseket tartalmazza:
1. Denaturáció kétszálú próba-DNS és cél-DNS egyszálúvá válik magas hőmérséklet vagy kémiai ágensek hatására.
2. Hibridizáció DNS-próba DNS-célponttal a komplementaritás elve szerint egy kétszálú hibrid molekula kialakításával
3. Hibridizáció utáni mosás a nem hibridizált DNS-próba eltávolítására
4. Elemzés hibridizációs jeleket fluoreszcens mikroszkóppal

Előnyök A FISH molekuláris genetikai diagnosztikai módszerek magukban foglalják nagyszámú sejt gyors elemzését, nagy szenzitivitást és specificitást, valamint a nem tenyészthető és nem osztódó sejtek tanulmányozásának lehetőségét.
Hibák módszerrel nem lehet információt szerezni a vizsgált DNS vagy kromoszóma szegmens fizikai állapotáról.
A FISH-t prenatális molekuláris genetikai diagnosztikában és daganatok jellemzésére használják; a gyermekgyógyászati gyakorlatban általában a specifikus malformációkkal kapcsolatos szubmikroszkópos deléciók azonosítására használják. A mikrodeléción alapuló szindrómákat korábban ismeretlen etiológiájú betegségeknek tekintették, mivel az ilyen betegségek kialakulását okozó kromoszóma-deléciókat és átrendeződéseket a hagyományos kromoszómaelemzési módszerekkel általában nem jelenítik meg. Az ilyen kis deléciók a kromoszómák meghatározott régióiban nagy pontossággal detektálhatók FISH segítségével. A szubmikroszkópos deléciók által okozott betegségek közé tartozik Prader-Willi, Angelman, Williams, Miller-Dieker, Smith-Magenis szindrómák és velocardiofacialis szindróma. A FISH megkönnyíti ezen szindrómák diagnosztizálását atipikus esetekben, különösen csecsemőkorban, amikor a betegség számos diagnosztikailag jelentős tünete még hiányzik. Ennek a molekuláris genetikai diagnosztikai módszernek az alkalmazása serdülő- és felnőttkorban is célszerű, amikor a betegség gyermekkori jellemző klinikai tünetei megváltoznak.

121. DNS-próbák. Alkalmazásuk örökletes betegségek meghatározásában.

Rövid áttekintés

A DNS-szonda az fluoreszceinnel, enzimmel vagy radioaktív izotóppal konjugált rövid DNS-fragmentum, amelyet a cél-DNS-molekula komplementer régiójához való hibridizációra használnak.

Fő rész

DNS diagnosztikai rendszerek

Az élőlények tulajdonságainak sokféleségére vonatkozó információkat a genetikai anyag tartalmazza. Így a baktériumok patogenitását egy adott gén vagy génkészlet jelenléte határozza meg bennük, és egy adott gén károsodása következtében örökletes genetikai betegség lép fel. Az ezt a biológiai tulajdonságot meghatározó DNS-szakasz szigorúan meghatározott nukleotidszekvenciával rendelkezik, és diagnosztikai markerként szolgálhat.

Számos gyors és megbízható diagnosztikai módszer alapszik a nukleinsav-hibridizáción - különböző DNS-molekulák két komplementer szegmensének párosításán. Az eljárás általánosságban a következő.

1. Egyszálú DNS célpont rögzítése membránszűrőn.

2. Jelzett egyszálú DNS próba alkalmazása, amely bizonyos körülmények között (hőmérséklet és ionerősség) párosul a cél DNS-sel.

3. Mossuk ki a szűrőt, hogy eltávolítsuk a felesleges, nem kötött jelölt DNS-próbát.

4. Próba/cél hibrid molekulák kimutatása.

A nukleinsav-hibridizáción alapuló diagnosztikai teszteknél három komponens kulcsfontosságú: egy DNS-próba, egy DNS-célpont és egy hibridizációs szignál kimutatási módszer. Az észlelőrendszernek nagyon specifikusnak és nagyon érzékenynek kell lennie.

* A fluoreszcein (dioxifluorán, uranin A) szerves vegyület, fluoreszcens festék. Az analitikai kémiában a fluoreszceint lumineszcens sav-bázis indikátorként használják. A biokémiában és a molekuláris biológiában a fluoreszcein izotiocianát származékai, mint biológiai színezékek antigének és antitestek meghatározására.

* Az észlelés valaminek az észlelése, azonosítása, megtalálása.

*konjugáció=ragozás

*Ha egy DNS-keveréket, például embert és egeret, egy „kémcsőben” megolvasztunk és összekeverünk, akkor az egér DNS-láncok egyes szakaszai rekombinálódnak humán DNS-láncok komplementer szakaszaival, és hibridek jönnek létre. Az ilyen helyek száma a faj rokonsági fokától függ. Minél közelebb vannak egymáshoz a fajok, annál több a DNS-szálak komplementaritása. Ezt a jelenséget az ún DNS-DNS hibridizáció.

122. A közvetlen DNS-diagnosztika alkalmazásának módszerei és feltételei.

Rövid ismertető:

Direkt módszerekkel kimutatható a DNS primer nukleotidszekvenciájának zavara (mutációk és típusaik). A direkt módszereket közel 100%-os pontosság jellemzi.

A direkt diagnosztika célja a mutáns allélek (az elsődleges DNS nukleotidszekvencia eltérései, mutációk és típusaik) azonosítása.

A direkt DNS-diagnosztika hátránya, hogy ismerni kell a gén pontos helyét és mutációi spektrumát. A közvetlen DNS-diagnosztika módszerei olyan betegségek esetén javasoltak, mint a fenilketonuria (R408W mutáció), cisztás fibrózis (a leggyakoribb delF508 mutáció), Huntington-kór (trinukleotid ismétlődések expanziója-CTG ismétlődések) stb.

Teljes válasz:

Direkt módszerekkel kimutatható a DNS primer nukleotidszekvenciájának zavara (mutációk és típusaik). A direkt módszereket közel 100%-os pontosság jellemzi. A gyakorlatban azonban ezek a módszerek bizonyos feltételek mellett alkalmazhatók:

1) az örökletes betegség kialakulásáért felelős gén ismert citogenetikai lokalizációja,

2) a betegséggént klónozni kell, és nukleotidszekvenciáját ismerni kell.

A direkt diagnosztika célja a mutáns allélek (az elsődleges DNS nukleotid szekvencia eltérései, mutációk és típusaik) azonosítása. A direkt DNS-diagnosztikai módszer nagy pontossága a legtöbb esetben nem igényli az összes családtag DNS-elemzését, mivel a megfelelő gén mutációjának kimutatása lehetővé teszi a diagnózis közel 100% -os pontosságú megerősítését és a genotípus meghatározását. a beteg gyermek minden családtagja, beleértve a heterozigóta hordozókat is.

A direkt DNS-diagnosztika hátránya, hogy ismerni kell a gén pontos helyét és mutációi spektrumát.

A közvetlen DNS-diagnosztika módszerei olyan betegségek esetén javasoltak, mint a fenilketonuria (R408W mutáció), cisztás fibrózis (a leggyakoribb delF508 mutáció), Huntington-kór (trinukleotid ismétlődések expanziója-CTG ismétlődések) stb.

A mai napig azonban számos betegség génje nem került feltérképezésre, exon-intron szerveződésük ismeretlen, és számos örökletes betegségre jellemző a kifejezett genetikai heterogenitás, ami nem teszi lehetővé a direkt DNS-diagnosztikai módszerek teljes körű alkalmazását. Ezért a direkt DNS-diagnosztika módszerének információtartalma igen változatos. Tehát a Huntington-chorea, az achondroplasia diagnózisában ez 100%, fenilketonuriával, cisztás acidózissal, adrenogenitális szindrómával - 70-80%, Wilson-Konovalov-kórral és Duchenne / Becker myopathiával - 45-60%. Ebben a tekintetben az örökletes betegségek molekuláris genetikai diagnózisának közvetett módszereit alkalmazzák.