Bendra bakteriologinės diagnostikos schema. Bakteriologinio tyrimo metodo etapai
20. Bakteriologinio tyrimo metodo charakteristikos
Kultūrinis (bakteriologinis) tyrimo metodas – metodų visuma, skirta išskirti ir identifikuoti grynąsias mikroorganizmų (bakterijų) kultūras, kultivuojant maistinėse terpėse.
Gryna kultūra yra tos pačios rūšies mikroorganizmų rinkinys. Dažniausiai grynoji kultūra gaunama atrinkus ir kultivuojant izoliuotą koloniją (vienos mikrobinės ląstelės palikuonis).
Metodo žingsniai:
1. Medžiagos rinkimas tyrimams.
2. Grynosios kultūros išskyrimas ir jos identifikavimas.
3. Išvada.
Medžiagos rinkimas tyrimams. Tiriamos medžiagos tipas priklauso nuo tyrimo tikslo (diagnozė – iš paciento; epidemiologinė analizė – iš aplinkos, maisto, paciento ir (ar) bakterijų nešėjo).
Grynosios kultūros izoliacija. Apima 3 arba 4 etapus:
1. Medžiagos sėjimas (po išankstinės mikroskopijos) ant puoduko su tankia maistine terpe (geriausia diferencine diagnostine arba selektyvine), kad būtų gautos izoliuotos kolonijos. Jis dažniausiai gaminamas mechaninio atskyrimo būdu. Kai kuriais atvejais (pavyzdžiui, kraujas) medžiaga iš anksto pasėjama į skystą sodrinimo terpę, po to subkultūrinama lėkštelėje su agaro terpe. Kartais prieš inokuliaciją atliekamas selektyvus medžiagos apdorojimas (atsižvelgiant į išskirto mikroorganizmo savybes; pavyzdžiui, apdorojama rūgštimi ar šarmu, kad būtų išskirtos atsparios bakterijos). Auginama 37°C temperatūroje 18-24 val. Įvairių tipų bakterijų auginimo laikas gali skirtis.
2(3): a) kolonijų tyrimas agaro lėkštelėje (kultūriniai bruožai), tipiškiausių atrinkimas; b) tepinėlių iš šių kolonijų paruošimas su dažymu (pagal gramo ar kitus metodus); a) likusios tiriamos kolonijos atskyrimas ant kaupimo terpės ir auginimas termostate optimalioje temperatūroje.
3 straipsnio 4 dalį. Kultūros, gautos kaupiamojoje terpėje, grynumo tyrimas. Su šiuo
tikslas - paruošti tepinėlį, beicuoti (dažniausiai pagal gramą), mikroskopiškai ištirti
morfologinis ir tinctorinis vienalytiškumas (skirtinguose matymo laukuose).
4 straipsnio 5 dalį. Grynosios kultūros identifikavimas.
Išvada. Pagal požymių visumą, lyginant su etaloninių (tipinių) padermių savybėmis, nurodomas iš medžiagos išskirto mikroorganizmo tipas.
Metodo įvertinimas:
privalumai: santykinai didelis jautrumas ir tikslumas, galimybė nustatyti mikrobų skaičių tiriamojoje medžiagoje, taip pat jautrumas antibiotikams; trūkumai: santykinė trukmė, metodas yra brangus.
21. Maistinės terpės aerobams ir anaerobams. Reikalavimai maistinėms terpėms, klasifikacija.
Reikalavimai:
žiniasklaida turi būti maistinga
turi turėti tam tikrą ph
turi būti izotoninis, t.y. osmosinis slėgis terpėje turi būti toks pat kaip ir ląstelėje.
turi būti drėgnas ir ne per skystas
turi turėti tam tikrą redokso potencialą
turi būti sterilus
turi būti unifikuoti, t.y. yra pastovus atskirų ingredientų kiekis.
Maistinę terpę galima suskirstyti:
A) Kilmė
1) natūralus – natūralus maistas (mėsa, pienas, bulvės);
2) dirbtinės - specialiai paruoštos mikrobams auginti: - natūralių produktų terpės (mėsos vanduo, mėsos-peptono sultinys (MBB), mėsos-peptono agaras (MPA), - neturinčios pastovios sudėties; - sintetinės maistinės terpės - tirpalai griežtai). apibrėžti kiekiai druskų, aminorūgščių, azoto bazių, vitaminų distiliuotame vandenyje – turi pastovią sudėtį, naudojami mikroorganizmams ir ląstelių kultūroms auginti vakcinų, imuninių serumų ir antibiotikų gamyboje;
B) Pagal susitarimą:
1) bendrosios paskirties (MPB, MPA) – ant jų auga dauguma mikrobų;
2) pasirenkamasis – selektyviai skatina vienos rūšies mikrobų augimą iš mišinio (pvz., trynio-druskos agaras stafilokokams);
3) diferencinė diagnostika – leidžia atskirti vieną mikrobų tipą pagal aplinkos išvaizdą nuo kitų (pvz., Endo, Levin media žarnyno mikrobų grupei).
Be to, priklausomai nuo naudojimo tikslais Grynųjų kultūrų išskyrimo schemoje pagal paskirtį galima išskirti šias terpes:
1) sodrinimas – slopina su patogenu susijusių mikrobų augimą;
2) gauti izoliuotas kolonijas;
3) grynosios kultūros kaupimas;
B) Nuoseklumas:
1) skystis;
2) pusiau skystas (pridedant 0,5-0,7 % koncentracijos agaro-agaro);
3) tankus – virš 1%.
Bakterioskopinio metodo esmė: mikrobų nustatymas tiriamojoje medžiagoje; jų morfologinių ir tinktūrinių savybių tyrimas, vietos pobūdis bakteriologiniame tepinėlyje regėjimo lauke.
Vykdymo technika. Vizualiai ištiriama paciento medžiaga, parenkama dalis, kurioje galima didžiausia tikimybe aptikti ligos sukėlėją (gleivių gabalėlius, pūlingus kamščius). Jis tepamas ant stiklelio (kartais medžiaga iš anksto emulsuojama fiziologiniame tirpale, rečiau centrifuguojama). Lašas paskirstomas ant stiklo, išdžiovinamas ir fiksuojamas. Po to tepinėlis nudažomas ir preparatas apžiūrimas mikroskopu. Tepinėlis dažniausiai būna nudažytas gramu. Kartais, kaip pats švelniausias, naudojamas vienas iš paprastų dažymo būdų, tada preparatas dažomas vienu dažikliu (pvz., diagnozuojant meningokokinę infekciją, cholerą).
Jei reikia, naudojami specialūs sudėtingi dažymo metodai, pavyzdžiui, Burri-Gins metodas kapsuliniams organizmams aptikti arba Ziehl-Neelsen metodas rūgštims atsparioms bakterijoms aptikti. Kai kuriais atvejais (ypač tiriant mikroorganizmų motorinį aktyvumą) ruošiami „kabančio lašo“ ir „smulkinto lašo“ preparatai, mikroskopuojamos nedažytos bakterijos.
Bakterioskopinio metodo privalumai: vykdymo paprastumas, galimybė greitai gauti rezultatus, techninis ir ekonominis prieinamumas.
Metodo trūkumai: Norint nustatyti mikroorganizmų tipą, dažnai nepakanka nustatyti jo morfologines savybes, nes jos yra identiškos giminingų rūšių atstovams. Be to, būdingos morfologijos bakterijos dažnai pakinta, ypač veikiant antibiotikams, ir tampa neatpažįstamos; galiausiai patogenų koncentracija tiriamojoje medžiagoje gali būti itin maža, o tuomet juos sunku aptikti.
Atsižvelgiant į tai, kas išdėstyta pirmiau, bakterioskopinis metodas retai naudojamas kaip vienintelis ir galutinis būdas nustatyti ligos etiologiją. Dažniau naudojamas kaip orientacinis, preliminarus, o diagnozuojant kai kurias infekcines ligas, visai nenumatytas.
Kaip suprasti orientaciją ir preliminarią? Tai taikoma gydytojui ir bakteriologui. Gydytojas, gavęs preliminarų atsakymą (teigiamą arba neigiamą), gautą informaciją didesniu ar mažesniu mastu naudoja tolesniuose tyrimuose, kol bus gautas galutinis bakteriologinės diagnostikos metodo rezultatas. Bakteriologas, gavęs orientacinę informaciją apie įtariamą patogeną, jo koncentraciją naudojamoje medžiagoje, gretutinės mikrofloros buvimą, nustato medžiagos apdorojimo ir patogeno grynosios kultūros išskyrimo būdus, parenka maistines terpes tolesniam auginimui.
Bakteriologinis metodas
Metodo esmė – grynos mikrobų – patogeno – kultūros išskyrimas iš patologinės medžiagos, išsamus jo morfologinių, tinktūrinių, kultūrinių, biocheminių, serologinių savybių tyrimas, siekiant vėliau nustatyti patogeną. Įgyvendinant bakteriologinį tyrimo metodą, išskiriami 4 etapai.
A. Atsižvelgiant į bakterioskopinio tyrimo metu gautus duomenis, parenkamos veiksmingiausios maistinės terpės, ant kurių su didžiausia tikimybės laipsniu bus galima gauti tariamų mikrobų – ligų sukėlėjų kultūros augimą.
B. Tiriamoji medžiaga sėjama į daugybę maistinių medžiagų: skystos ir kietos, universalios, pasirenkamosios-selektyvinės, diferencinės diagnostikos. Tuo pačiu metu sėjama ant Petri lėkštelių su tankiomis maistinėmis terpėmis atliekama bakteriologine kilpa su smūgiu, kad būtų užtikrinta galimybė augti viena nuo kitos izoliuotas mikrobų kolonijas (taip pat galite naudoti Drygalsky metodą ar kitą). mikroorganizmų kultūrų atskyrimo metodas).
A. Tiriamos maistinėse terpėse auginamų mikroorganizmų kultūrinės savybės; atrenkamos įtartinos kolonijos. Reikia pabrėžti, kad įtartinų kolonijų atranka yra pats svarbiausias ir sunkiausias darbo etapas. Jis visų pirma pagrįstas mikrobų kolonijoms būdingų požymių nustatymu, tačiau dažnai tai neleidžia atskirti atskirų rūšių mikrobų kolonijų ir būtina papildomai tirti mikrobų morfologiją tepinėliuose iš įtartinų kolonijų, mikroorganizmų augimo ypatybes. diferencinės diagnostikos laikmenos ir kt. Grynųjų bakterijų kultūrų išskyrimas ir jų tyrimas gali būti atliktas atliekant išankstinę inokuliaciją ant skysčių kaupimosi terpės, tačiau šiuo atveju skiriamas papildomas tyrimo laikas.
B. Iš įtartinų kolonijų ruošiamas bakteriologinis tepinėlis, nudažytas pagal gramą ir mikroskopu (nustatomas mikroorganizmų tapatumas su tirtais mikroskopinio tyrimo metu 1 stadijoje). C. Iš likusios įtartinos kolonijos kultūros perkeliama į nuožulnią mėsos peptono agarą (galima naudoti kitas maistines terpes, kuriose tikimasi gero izoliuotų mikroorganizmų augimo). Tikslas yra sukaupti gryną mikrobo – tariamo ligos sukėlėjo – kultūrą, nes. kitame tyrimo etape reikės daug mikrobų masės.
Siūlomas patogenas tiriamas dėl sacharolitinių savybių (sėjama ant margų terpių, Olkenitsky, Ressel terpės ir kt.), proteolitinio aktyvumo (sėjimo ant želatinos, pieno pagal Tukajevą, indolo ir vandenilio sulfido susidarymo augimo metu nustatymas mėsos-peptono sultinio). Tiriamas išskirtų kultūrų jautrumas antibiotikams (dažniau standartinių popierinių diskų metodu, rečiau – serijinių skiedimų metodu). Serotipų nustatymas atliekamas agliutinacijos reakcijoje ant stiklo su grupiniais ir tipiniais diagnostiniais serumais; fagų tipavimas standartiniais diagnostiniais bakteriofagais. Kai kuriais atvejais, siekiant nustatyti, tiriami bakterijų patogeniškumo veiksniai.
Atsižvelgiama į atliktų tyrimų rezultatus. Palyginus mikroorganizmuose nustatytas savybes (morfologines, tinktūrines, kultūrines, biochemines, serologines ir kt.), nustatomi mikrobai. Išduodamas galutinis atsakymas su bakteriologinio tyrimo rezultatais, kuriuose nurodomas patogeno tipas (kartais jo serotipas, biovaras, fago tipas) ir jautrumas antibiotikams.
Gana dažnai, norint gauti patikimų rezultatų, prieš atsakymo išdavimą yra taikomi biologiniai, alergologiniai ar kiti tyrimo metodai.
Bakteriologinės diagnostikos metodo pranašumai: didelis tyrimo rezultatų patikimumas; galimybė gauti papildomų duomenų apie izoliuotų patogenų jautrumą antibiotikams; galimybė atlikti epidemiologinius tyrimus.
Prie metodo trūkumų gali apimti tyrimo trukmę (mažiausiai 4-5 dienas), taip pat negalėjimą jo naudoti tais atvejais, kai patogenai (pavyzdžiui, riketsijos, chlamidijos) neauga ant dirbtinių maistinių medžiagų.
biologinis metodas
Kai kuriais atvejais, siekiant optimizuoti infekcinių ligų diagnostiką, naudojamas biologinis metodas (biologinis tyrimas), kurio metu užkrečiami laboratoriniai gyvūnai. Šiuo atveju tyrėjas gali turėti skirtingus tikslus:
Klinikinio ir patoanatominio ligos vaizdo atkūrimas (pavyzdžiui, diagnozuojant stabligę, leptospirozę);
Grynosios patogeno kultūros išskyrimas per trumpą laiką (diagnozuojant pneumokokinę infekciją);
Patogeno virulentiškumo ir patogeniškumo nustatymas (tuberkuliozės diagnozėje);
Toksinų tipo ir tipo nustatymas (diagnozuojant botulizmą)
Infekcinėms ligoms diagnozuoti naudojami įvairūs gyvūnai. Jų pasirinkimą lemia rūšies jautrumas įvairiems etiologiniams veiksniams. Pavyzdžiui, pelės yra jautrios pneumokokinei infekcijai, juodligei, stabligei; jūrų kiaulytės - tuberkuliozės, bruceliozės, tuliaremijos sukėlėjams; triušiai – į stafilokokus, streptokokus, botulizmą. Tyrimui atrenkami tik tam tikro amžiaus ir kūno svorio sveiki gyvūnai.
Prieš įvedant medžiagą, gyvūnai tvirtinami. Mažus gyvūnus laiko eksperimentuotojas, dideliems gyvūnams naudojami specialūs prietaisai. Užkrėstos medžiagos injekcijos vieta apdorojama alkoholiu arba jodu. Infekuota medžiaga, atsižvelgiant į tiriamos ligos patogenezės ypatybes, suleidžiama po oda, į odą, į veną, į pilvaplėvės ertmę, intracerebriniu būdu ir kt.
At odos metodas infekcijos iš anksto nupjauna vilną, skarifikuoja odą ir įtrina medžiagą.
Poodinis metodas: gyvūnų oda fiksuojama raukšle, geriausia pincetu, adata įduriama iki pusės, po injekcijos uždedamas vatos tamponėlis su spiritu ir adata nuimama.
Intramuskulinis metodas: medžiaga suleidžiama į viršutinės galūnės dalies raumeninį audinį.
Intraperitoninis metodas: gyvūnas laikomas apverstas, kad nesusižalotų žarnynas. Injekcija atliekama apatinėje pilvo dalyje, vidurinės linijos šone. Pilvo siena pradurta trūkčiojančiu judesiu, švirkštas stačiu kampu.
Intraveninis metodas: pelėms, žiurkėms suleidžiama medžiaga – į uodegos veną arba intrakardialinę. Triušiui suleidžiama - į ausies venas, kurios yra paviršutiniškai ir aiškiai matomos (geriau pradurti išorinę veną). Injekcijos vieta po injekcijos užspaudžiama vata su alkoholiu, kad nebūtų kraujavimo. Intrakardine infekcija sergančioms jūrų kiaulytėms adata įšvirkščiama širdies „šoko“ aukštyje į tarpšonkaulinę erdvę. Jei adata įdurta teisingai, švirkšte atsiras kraujo.
Įrankių ir medžiagų paruošimas: švirkštai, skalpeliai, adatos sterilizuojami verdant. Į švirkštą įtraukiama medžiaga (šiek tiek daugiau nei reikia įvesti), pasukama vertikaliai į viršų, adata uždengiama sterilia vata ir stūmokliu iš švirkšto išstumiami oro burbuliukai. Ši manipuliacija atliekama ant dezinfekuojamojo tirpalo.
Diagnozuojant toksino (botulino, juodligės) veikimo sukeltas infekcijas, medžiaga, turinti tariamai patogeno ir toksinų, dedama į fiziologinį tirpalą, po to filtruojama per talku įtrintą popierinį filtrą (gerai adsorbuoja toksiną). Jautrūs gyvūnai yra užkrėsti filtrų tamponais. Kai kuriais atvejais, kai ligos patogenezę lemia paties patogeno patogeninės savybės, gyvūnai užkrečiami mikrobų suspensija.
Užkrėstos baltosios pelės paženklinamos etiketėmis ir dedamos į specialius stiklinius indelius; ant jų pritvirtinama etiketė, nurodanti užsikrėtimo datą ir mikroorganizmo, su kuriuo buvo atliktas darbas, rūšį. Lygiai taip pat pasirašomi narvai su užsikrėtusiais triušiais ar jūrų kiaulytėmis. Gyvūnai yra stebimi. Mirties atveju jie nedelsiant atidaromi.
Prieš išpjaustant baltąsias peles, gyvūnai preliminariai numarinami eterio garais. Pelės trumpam panardinamos į dezinfekavimo tirpalą, o po to fiksuojamos kiuvetėje pilvu aukštyn letenėlėmis. Pastebimas išorinių patologinių pokyčių buvimas ar nebuvimas. Odos pjūvis daromas išilgai nuo gaktos iki apatinio žandikaulio ir skersai link galūnių. Pastebimi odos audinio ir limfmazgių būklės pokyčiai. Iš pastarųjų daryti tepinėlius-atspaudus. Norint ištirti krūtinės ertmę, krūtinkaulis pašalinamas žirklėmis iš abiejų pusių įpjaunant šonkaulius. Po išorinio tyrimo širdies gabalėliai nupjaunami ir dedami į BCH. Sėjama tiesiai ant MPA tepinėlių-atspaudų iš širdies, plaučių.
Atidaroma pilvo ertmė, išorinio tyrimo metu pažymima vidaus organų būklė (dydis, spalva, konsistencija, pūlingų židinių buvimas). Padarykite kepenų, blužnies ir tepinėlių atspaudus.
Darbas atliekamas steriliais instrumentais, po kiekvieno organo paėmimo pincetas ir žirklės nuleidžiamos į spirito stiklinę ir sudeginamos.
Po skrodimo lavonas ir kiuvetė, kurioje buvo atliktas skrodimas, parą užpilami dezinfekavimo priemone.
Pasėliai inkubuojami 24 valandas (arba ilgiau, jei reikia) š
t 37 apie C. Tada jie tiriami, išskiriama patogeno grynoji kultūra ir bakteriologiniu metodu atliekamas jo identifikavimas.
Metodo privalumai: gautų rezultatų patikimumas, nereikia sudėtingos įrangos.
Trūkumai: didelė kaina, ribotas naudojimas, infekcijos rizika.
Panaši informacija.
TIKSLAS:
1. Grynųjų bakterijų kultūrų išskyrimo tyrimo metodai
2. Įvaldyti bakteriologinį infekcinių ligų diagnostikos metodą.
TEORINĖ NUORODOS
Bakteriologinis metodas yra pagrindinis infekcinių ligų diagnostikos metodas. Jo esmė – infekcinio sukėlėjo tipo nustatymas, todėl remiantis bakteriologinio metodo rezultatais galima nustatyti etiologinę (galutinę) diagnozę. Pagrindinis metodo trūkumas yra tyrimo trukmė – nuo 3 iki 5 dienų, o kai kuriais atvejais ir daugiau.
Bakteriologinio metodo sėkmė labai priklauso nuo pradinio etapo, įskaitant tiriamosios medžiagos mėginių paėmimą ir transportavimą bei siuntimo į bakteriologinę laboratoriją planą. Tokiu atveju reikia laikytis kelių taisyklių.
1. Tvora tiriamosios medžiagos kiekis turi būti atliktas prieš pradedant gydymą antibiotikais arba praėjus 8-10 valandų po paskutinės antibiotikų dozės. Norint išvengti mėginio užteršimo aplinkos mikroflora, būtina laikytis griežčiausios aseptikos. Tam naudokite sterilias medžiagas: a) vatos tamponus medžiagai paimti iš žaizdos, iš gleivinių (akių, ryklės, nosies); b) vielos kilpa medžiagai paimti iš makšties, išangės; c) švirkštas kraujui, pūliams paimti; d) sterilūs indai, skirti tiesiogiai į jį surinkti šlapimą, skreplius, išmatas.
2. Transportas Gautą medžiagą reikia kuo greičiau (2-3 val.) pagaminti specialiuose dviračiuose ar penaluose.
3. Kryptis pridedamas prie klinikinio mėginio kaip lydraštis. Jame yra pagrindinė informacija, reikalinga mikrobiologiniam tyrimui atlikti:
Paciento pavardė, vardas, patronimas, amžius;
Siūloma ligos diagnozė;
Ankstesnis antimikrobinis gydymas;
Medžiagos pobūdis;
Medžiagos paėmimo data ir laikas;
Tyrimo tikslas;
Gydymo įstaigos pavadinimas, skyriaus, palatos numeris;
Gydytojo parašas.
Bakteriologinis metodas atliekamas dviem etapais (2.1 pav.):
1. Grynosios patogeno kultūros išskyrimas (1-2 dienos);
2. Grynosios kultūros identifikavimas (1-3 dienos).
Pirmajame etape tiriamoji medžiaga sėjama į kietą arba skystą maistinę terpę, įvertinamos kultūrinės savybės, atrenkamos įtartinos kolonijos ir atrenkama ant pasvirusio agaro. Identifikavimo etapas apima privalomą izoliuotos grynosios kultūros morfologijos, biocheminių savybių ir antigeninės struktūros tyrimą, taip pat papildomus tyrimus, skirtus jautrumui antibiotikams, fagų jautrumui, fago tipizavimui, patogeniškumui ir patvarioms savybėms nustatyti.
PARUOŠIMO KLAUSIMAI:
1. Tiriamosios medžiagos paėmimo ir gabenimo bakteriologiniam tyrimui taisyklės.
2. Siuntimo bakteriologiniam tyrimui išdavimo taisyklės.
3. Grynųjų mikroorganizmų kultūrų išskyrimo metodai.
4. Bakteriologinis diagnostikos metodas. Tikslas. Etapai. diagnostinė vertė.
SAVARANKIŠKAS DARBO PLANAS:
1. Išstudijuokite lenteles „Grynųjų bakterijų kultūrų išskyrimo metodai“ ir „Grynųjų kultūrų išskyrimas ir identifikavimas“.
2. Išskirkite gryną kultūrą iš bakterijų mišinio ir atlikite jos identifikavimą – įsisavinkite bakteriologinės diagnostikos metodą (1 darbas)
4.2. BIOLOGINIAI IR MIKROBIOLOGINIAI VEIKSNIAI
Bakteriologinė vidurių šiltinės ir paratifos A, B ir C diagnostika
Įvedimo data: nuo patvirtinimo momento
1. KŪRĖTA: FGUN Sankt Peterburgo NIIEM juos. Pasteur iš Rospotrebnadzor (L.A. Kaftyreva, Z.N. Matveeva, G.F. Trifonova); Federalinės sveikatos ir socialinės plėtros agentūros GOUVPO "Sankt Peterburgo valstybinė medicinos akademija, pavadinta I. I. Mechnikovo vardu" (A.G. Boytsovas).
3. PATVIRTINTA Federalinės vartotojų teisių apsaugos ir žmogaus gerovės priežiūros tarnybos vadovo, Rusijos Federacijos vyriausiojo valstybinio sanitaro gydytojo G. G. Oniščenkos 2007 m. gruodžio 29 d. 0100/13745-07-34
4. ĮVEDAMAS nuo patvirtinimo momento.
5. PRISTATYTA PIRMĄ KARTĄ.
1 naudojimo sritis
1 naudojimo sritis
1.1. Rekomendacijose išdėstyti pagrindiniai vidurių šiltinės ir paratifos A, B ir C bakteriologinės diagnostikos principai ir ypatumai; yra šiuolaikinės informacijos apie biologines ligų sukėlėjų savybes, atsparumą antibakteriniams vaistams, maistines terpes jų išskyrimui, vidurių šiltinės ir paratifos sukėlėjų diferenciacijos nuo kitų serologinių salmonelių atmainų ypatumus.
2. Santrumpų sąrašas
ABP – antibakterinis vaistas
BCA – bismuto sulfito agaras
MPU – medicinos ir profilaktikos įstaiga
MIC – minimali slopinanti koncentracija
P – tarpinis
U - stabilus
H – jautrus
RIF – imunofluorescencinė reakcija
CNS – centrinė nervų sistema
Lentelėse:
„+“ – teigiama reakcija pirmąją dieną;
"-" - neigiama reakcija 4-20 dienų;
"(+)" - uždelsta teigiama reakcija 2-20 dienų;
d – įvairios fermentinės reakcijos.
Galima diferencijuoti į fermentinius variantus.
3. Bendrosios nuostatos
3.1. Vidurių šiltinė ir paratifas A, B ir C yra antroponotinės žarnyno infekcijos, kurias sukelia Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi B ir Salmonella Paratyphi C. retai – paratifoidas C.
3.2. Ligoms būdingi plonosios žarnos limfinės sistemos opiniai pažeidimai, bakteriemija, karščiavimas, ciklinė klinikinė eiga su sunkia intoksikacija, rožinis bėrimas ant kūno odos, hepato- ir splenomegalija. Vidurių užkietėjimas yra dažnesnis nei viduriavimas. Pejerio klubinės žarnos pleistrų išopėjimas maždaug 1 % atvejų sukelia kraujavimą iš žarnyno ir žarnyno perforaciją, o tai turi nepalankiausių pasekmių pacientui.
3.3. Vidurių šiltinės ir A, B ir C paratifo diagnozė nustatoma remiantis klinikiniais ligos požymiais, atsižvelgiant į epidemiologinę istoriją ir išsamaus laboratorinio tyrimo, apimančio klasikinius bakteriologinius ir serologinius metodus, duomenis. Bakteriologinė diagnostika yra prioritetinė, nes tokiu atveju galima gauti kuo išsamesnę informaciją apie patogeno biologines savybes, įskaitant jo jautrumą antibakteriniams vaistams.
3.4. Antimikrobinių vaistų naudojimas vidurių šiltinės ir paratifos etiotropiniam gydymui leido, viena vertus, sumažinti mirtingumą nuo 10-20% iki mažiau nei 1%, kita vertus, tai apsunkino laboratorinę diagnostiką, nes dažnai medžiagos mėginiai laboratoriniams tyrimams paimami pradėjus gydymą antibiotikais. Dėl šio fakto būtina atidžiau žiūrėti į tyrimo medžiagos parinkimo, tiriamos medžiagos ir tyrimo metodų klausimą.
3.5. Šiuolaikinis vidurių šiltinės epidemiologijos bruožas yra staigus infekcijos įvežimo (pernešimo) iš šios ligos endeminių teritorijų, artimųjų ir tolimųjų užsienio šalių, taip pat Rusijos gyventojų užsikrėtimas išvykstant į šias šalis ir vykstant migracijai šalies viduje. Kitas bruožas – didelis didelės epidemiologinės rizikos kontingentas – asmenų, neturinčių pastovios gyvenamosios vietos, tarp kurių fiksuojamas didelis sergamumas vidurių šiltine.
3.6. Šios rekomendacijos buvo parengtos siekiant suvienodinti vidurių šiltinės ir paratifos A, B ir C bakteriologinės diagnostikos metodus bei teisingai interpretuoti laboratorinio tyrimo rezultatus, atsižvelgiant į šiuolaikines klinikos ypatybes, gydymas ir epidemiologinė situacija konkrečiose srityse.
4. Bakteriologinės diagnostikos indikacijos
Biologinės medžiagos bakteriologinio tyrimo indikacija dėl vidurių šiltinės ir paratifos A, B ir C patogenų buvimo yra būtinybė atlikti tyrimą:
4.1) pacientams, kuriems įtariama vidurių šiltinė, taip pat neaiškios etiologijos karščiavimas, trunkantis 5 ir daugiau dienų;
4.2) asmenys, turėję ryšį su sergančiais vidurių šiltine ir paratifu A, B, C;
4.3) tam tikrų profesijų, ūkio šakų ir organizacijų darbuotojai, priimami dirbti ir pagal epidemiologines indikacijas;
4.4) asmenys prieš patekimą į ligonines ir specializuotas sanatorijas pagal klinikines ir epidemiologines indikacijas;
4.5) asmenys, užsiregistravę gydytis stacionariai psicho-neurologinio (psichosomatinio) profilio ligoninėse (skyriuose), slaugos namuose, asmenų, sergančių lėtinėmis psichikos ligomis ir CNS pažeidimais, internatuose ir kitose uždarose, visą parą veikiančiose įstaigose. likti;
4.6) ligoniams, sergantiems vidurių šiltine ir paratifu, išnykus klinikiniams ligos simptomams prieš išrašant iš stacionaro;
4.7) asmenys, sirgę vidurių šiltine ir paratifu ambulatorinio stebėjimo metu;
4.8) lėtiniai bakterijų nešiotojai, nustatyti tarp tam tikrų profesijų, pramonės šakų ir organizacijų darbuotojų, pakartotinai įsidarbinant šiose įmonėse ir objektuose;
4.9) pjūvių medžiaga įtarus vidurių šiltinę ir paratifoidinę karštligę.
5. Metodo logistika
5.1. Standartinė tyrimo ir pagalbinė įranga, matavimo prietaisai mikrobiologinėms laboratorijoms.
5.2. Maistinės terpės, diagnostiniai serumai ir cheminiai reagentai, skirti vidurių šiltinės ir A, B ir C paratifoidų sukėlėjų auginimui, išskyrimui, identifikavimui ir jautrumui antibakteriniams vaistams nustatyti.
5.3. Laboratorinei vidurių šiltinės ir paratifoidų ligų diagnostikai bei bakterijų nešiotojams nustatyti turėtų būti naudojamos maistinės terpės ir reagentai, nustatyta tvarka patvirtinti naudoti Rusijos Federacijos teritorijoje.
6. Vidurių šiltinės ir paratifo laboratorinė diagnostika
6.1. Bakteriologinio metodo principas pagrįstas gyvų mikroorganizmų aptikimu įvairiuose biologiniuose substratuose (kraujyje, šlapime, išmatose, tulžyje, kaulų čiulpuose, rozeolėje), priklausomai nuo ligos stadijos. Tam tam tikras kiekis biologinės medžiagos pasėjamas ant specialių maistinių medžiagų, po to inkubuojama termostate ir identifikuojamos išaugusios S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B ir S. Paratyphi būdingų mikroorganizmų kolonijos. C, atsižvelgiant į kultūrines ir fermentines savybes bei antigenines savybes.
6.2. Tik bakteriologinis tyrimas gali suteikti tikslią etiologinę diagnozę ir kontroliuoti organizmo išsiskyrimą iš patogeno. Kalbant apie vidurių šiltinės ir paratifoidinės karštinės diferencinę diagnozę, vienintelis metodas yra laboratorinis biologinės medžiagos tyrimas, išskiriant patogeną ir identifikuojant jį iki serologinio varianto lygio, tk. klinikinė infekcinio proceso eiga ne visada leidžia atskirti šias nosologines formas.
7. Bakteriologinis tyrimas
7.1. Vidurių šiltinės ir paratifoidų A, B ir C sukėlėjų išskyrimas atliekamas pagal tą pačią biomedžiagų bakteriologinio tyrimo schemą.
7.2. Medžiagos rinkimo laboratoriniams tyrimams dėl vidurių šiltinės ir paratifoidinės ligos yra nustatyta SP 3.1.1.2137-06.
7.3. Biomedžiagų surinkimo ir transportavimo į mikrobiologines laboratorijas technika aprašyta MU 4.2.2039-05.
7.4. Bakteriologinio tyrimo medžiaga vidurių šiltinės ir paratifos diagnozei nustatyti:
kraujas;
išmatos;
šlapimas;
Patogenus taip pat galima išskirti iš:
rozolio;
kaulų čiulpai;
Motinos pienas.
Medžiaga bakteriologiniams tyrimams, siekiant nustatyti bakterijų nešiotojus, pagal SP 3.1.1.2137-06 yra:
išmatos;
šlapimas;
tulžis (dvylikapirštės žarnos turinys).
7.5. Siekiant patikslinti diagnozę, atliekamas pjūvio medžiagos tyrimas.
7.6. Biologinės medžiagos rinkimas laboratoriniams tyrimams atliekamas prieš etiotropinio gydymo pradžią: medicinos darbuotojo, įtariančio vidurių šiltinės-paratifos infekciją; sergamumo grupiniu ir protrūkio atveju - Rospotrebnadzor įstaigų specialistų ir gydymo įstaigų personalo. Iš hospitalizuotų pacientų medžiaga bakteriologiniam tyrimui paimama ligoninės skubios pagalbos skyriuje.
7.7. Iš asmenų, bendravusių su pacientais ar vežėjais (kontaktais), medžiagą renka sveikatos įstaigų ir kitų organizacijų bei įstaigų medicinos darbuotojai pacientų aptikimo vietoje.
7.8. Biomedžiaga laboratoriniams tyrimams yra lydima specialios krypties. Medžiagos pristatymas patiems tiriamiesiems neleidžiamas. Jei neįmanoma laiku pristatyti medžiagos, naudojami konservantai ir transportavimo priemonės (1 lentelė).
8. Bakteriologinis kraujo tyrimas
Indikacija atlikti kraujo tyrimą – įtarus vidurių šiltinės-paratifoidines ligas arba neaiškios kilmės febrilinė būklė (neaiškios kilmės karščiavimas), stebima 5 ir daugiau dienų (SP 3.1.1.2137-06).
Kraujo ir maistinės terpės santykis turi būti 1:10-1:60. Savarankiškai paimtų kraujo mėginių skaičių ir jų paėmimo laiką nustato gydantis gydytojas pagal MU 4.2.2039-05 dėl neaiškios kilmės karščiavimo arba pagal TSRS sveikatos apsaugos ministerijos MU 04-723/3 ( 1984) dėl įtariamų vidurių šiltinės-paratifos ligų. Pacientams, vartojantiems antibakterinius vaistus, mėginius reikia paimti prieš pat kitos vaisto dozės įvedimą (priėmimą).
Esant karščiavimui, kraują geriausia paimti pakilus kūno temperatūrai (bet ne temperatūros piko metu!). Sėjama ant maistinių medžiagų terpės tiesiai prie paciento lovos.
Įtarus vidurių šiltinės-paratifoines ligas, kraujo pasėliui galima naudoti Rapoport terpę, 20 % tulžies sultinį, mėsos-peptono sultinį su 1 % gliukozės (100 ml buteliukuose). Anksčiau naudotos kraujo kultūros steriliame distiliuotame (čiaupo) vandenyje. Tačiau geriau naudoti specialias kraujo kultūros terpes.
Karščiavimo aukštyje pasėto kraujo kiekis gali būti 10 ml, vėliau - iki 20 ml (vaikams - iki 5 ml).
Dėl neaiškios kilmės karščiavimo, trunkančio ilgiau nei 5 dienas, paprastai reikia ištirti kelis kraujo mėginius. Kraujo mėginių ėmimas iš venos atliekamas pagal MU 4.2.2039-05. Tai būtina norint atskirti tikrąją bakteriemiją nuo atsitiktinio kraujo užkrėtimo venos punkcijos metu (mėginio užteršimo tikimybė dėl atsitiktinio riebalinės ar prakaito liaukos pradurimo yra 3%). Šiuo atveju kraujo kultūrai naudojamos dvi terpės: 1) terpė aerobams ir fakultatyviniams anaerobams ir 2) terpė privalomiems anaerobams (pvz., „dviguba“ terpė + tioglikolio terpė pagal SSRS sveikatos apsaugos ministerijos įsakymą). 12.04.85 N 535) arba universali terpė aerobams ir anaerobams.
Pageidautina naudoti pramoniniu būdu pagamintas laikmenas, patvirtintas naudoti Rusijoje.
Pasėliai inkubuojami 37 °C temperatūroje 10 dienų kasdien stebint. Tokiu atveju buteliukai su „dviguba“ terpe pakreipiami, išplaunant tankiąją terpės dalį.
Jei 10 dieną nėra augimo požymių, išduodamas neigiamas atsakymas.
Jei yra augimo požymių (drumstumas, Rapoport terpės paraudimas, matomų kolonijų atsiradimas tankioje „dvigubos“ terpės dalyje), sėjama lygiagrečiai polikarbonatų terpėje ir tankioje terpėje Petri lėkštelėse ( kraujo agaras esant neaiškios kilmės karščiavimui ir Endo terpė įtariant vidurių šiltinės paratifoidines ligas).
Norint sutrumpinti tyrimo laiką, atliekama tiesioginė inokuliacija ant polikarbonatų terpės, remiantis prielaida, kad pasėjus krauju su didele tikimybe, bus stebimas patogeno monokultūros augimas. Norint kontroliuoti šią prielaidą ir atskirti grynąją kultūrą, padalijant atskiras kolonijas, būtina lygiagrečiai padengti Endo terpę arba kraujo agarą.
Jei šiose terpėse pastebimas monokultūros augimas, galima atsižvelgti į polikarbonatinės terpės biochemines savybes. Norint kontroliuoti kultūros grynumą, būtina mikroskopuoti tepinėlį iš polikarbonatinės terpės, nudažytos Gramu. Šiame etape taip pat galima nustatyti agliutinacijos reakciją ant stiklo su atitinkamais agliutinuojančiais O ir H salmonelių serumais ir pateikti preliminarų atsakymą.
Pacientų, kuriems įtariama vidurių šiltinė ir paratifos karštinė, kraujo bakteriologinio tyrimo schema parodyta 1 pav.
1 pav. Pacientų, kuriems įtariama vidurių šiltinė ir paratifas, kraujo bakteriologinio tyrimo schema
1 pav. Pacientų, kuriems įtariama vidurių šiltinė ir paratifas, kraujo bakteriologinio tyrimo schema
Sergančiųjų neaiškios kilmės karščiavimu bakteriologinio kraujo tyrimo schema parodyta 2 pav.
2 pav. Pacientų, sergančių neaiškios kilmės karščiavimu, kraujo bakteriologinio tyrimo schema
2 pav. Pacientų, sergančių neaiškios kilmės karščiavimu, kraujo bakteriologinio tyrimo schema
Tolesnio kultūros identifikavimo pagal kultūrines-morfologines, fermentines savybes ir serologines charakteristikas eiga aprašyta toliau atitinkamuose skyriuose.
9. Bakteriologinis išmatų tyrimas
Išmatų mėginiai imami iš karto po tuštinimosi iš dezinfekuoto ir kruopščiai išplauto indo, ant kurio dugno uždėtas storo švaraus popieriaus lapas. Medžiaga surenkama naudojant šaukštą-mentele, sumontuotą sterilaus indo dangtelyje. Jei nėra indo su mentele, medžiagai paimti naudojamas bet koks sterilus instrumentas (sterili medinė mentelė, vielinė kilpa, šaukštas ir kt.). Esant patologiniams nešvarumams, reikia parinkti vietas, kuriose yra gleivių, pūlių, dribsnių, bet be kraujo. Skystų išmatų mėginiai imami naudojant sterilią plastikinę Pasteur pipetę su uždaru rezervuaru.
Paimtos medžiagos tūris turi būti ne mažesnis kaip 2 g Optimali medžiaga yra paimti medžiagą dekoruotos kėdės atveju - graikinio riešuto kiekiu; esant laisvoms išmatoms, jos sluoksnis inde turi būti ne mažesnis kaip 1,5-2,0 cm Medžiaga, įdėta į sterilų indą, pristatoma į laboratoriją per 2 valandas.
Jei medžiagos nepavyksta pristatyti į laboratoriją per 2 valandas, ji surenkama į konservantą (transportavimo sistemą su terpe). Medžiagos tūris neturi viršyti terpės tūrio.
Išmatos turi būti kruopščiai homogenizuojamos terpėje. Mėginiai gali būti laikomi prieš pradedant tyrimą per dieną šaldytuve (4–6 °C).
Transporto terpės ir konservantai, naudojami vidurių šiltinės ir paratifo A, B ir C sukėlėjams, taip pat kitiems ūminių žarnyno infekcijų sukėlėjams išskirti, pateikti 1 lentelėje.
1 lentelė
Transportavimo priemonės ir konservantai, dažniausiai naudojami išmatoms vežti
|
Aplinkos pavadinimas |
Užtikrina konservavimą |
|
Trečiadienis Carrie Blair |
visų žarnyno patogenų, įskaitant kampilobakterijas |
|
Trečiadienis Amesas |
visos enterobakterijos |
|
Trečiadienis Stiuartas |
salmonelės ir šigella |
|
glicerino mišinys |
visos enterobakterijos, išskyrus jersiniją; pirmenybė teikiama šigelei |
|
fosfato buferio mišinys |
visos enterobakterijos |
|
borato buferinis tirpalas |
visos enterobakterijos |
|
fiziologinis tirpalas |
visų enterobakterijų, įskaitant kampilobakterijas |
Išmatų mėginiai, paimti tiesiai iš tiesiosios žarnos naudojant tiesiosios žarnos tamponą, pirmiausia naudojami diagnozei objektyvizuoti (MU 4.2.2039-05). Medžiagą paima paramedikai. Paprastai specialus zondas tepinėlio paėmimui yra transporto sistemos dalis. Svarbu pažymėti, kad transportinės terpės patekimas į tiesiosios žarnos gleivinę yra nepriimtinas! Todėl tiesiosios žarnos tamponą reikia panardinti į transportavimo terpę tik paėmus medžiagą. Paciento prašoma gulėti ant šono, o klubai pritraukti prie skrandžio, o sėdmenys delnais atskirti. Tampono zondas įkišamas į išangę iki 4-5 cm gylio ir, švelniai sukant jį aplink ašį, surenkama medžiaga iš išangės kriptų. Atsargiai nuimkite tampono zondą ir panardinkite jį į transportavimo terpę. Tampono gabenimas be terpės neleidžiamas.
Laboratorijoje išmatų mėginių inokuliacija atliekama tiesiai ant tankios diferencinės diagnostinės maistinės terpės ir lygiagrečiai sodrinimo terpėje.
Išmatų bakteriologinio tyrimo schema parodyta 3 pav.
3 pav. Išmatų bakteriologinio tyrimo schema
3 pav. Išmatų bakteriologinio tyrimo schema
Iš natūralių išmatų ruošiama suspensija 0,9% natrio chlorido tirpale santykiu 1:5-1:10, paliekama 30 minučių, kad nusėstų didelės dalelės. Po to vienas lašas supernatanto pasėjamas į indus su tankia maistine terpe ir 1 ml suspensijos pasėjama į sodrinimo terpę (medžiagos ir terpės santykis turi būti 1:5).
Išmatos, pristatomos į laboratoriją konservante (transportavimo terpėje), prieš inokuliaciją turi būti kruopščiai homogenizuojamos terpėje, o po to medžiaga tiesiogiai pasėjama ant kietos terpės ir sodrinimo terpės tokiomis pačiomis proporcijomis kaip ir natūralios išmatos.
Išmatų mėginiai, paimti naudojant tiesiosios žarnos tamponą, tiriami panašiai kaip išmatos, paimtos su konservantu. Reikia atsiminti, kad tiesiosios žarnos tamponu yra mažiau mikroorganizmų, palyginti su natūraliomis išmatomis, todėl reikia padidinti inokuliato dozę.
Maksimalus S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B ir S. Paratyphi C aptikimas išmatose pasiekiamas naudojant sodrinimo terpę, nors pacientams ūminiu ligos periodu sukėlėjas dažnai išskiriamas tiesioginio inokuliavimo būdu. Inokuliacija ant sodrinimo terpės lygiagrečiai su tiesiogine inokuliacija yra privaloma!
Visos inokuliacijos inkubuojamos 37 °C temperatūroje ant diferencinės diagnostikos terpės 18-24 val., ant bismuto-sulfito agaro 24-48 val.. Po 24 valandų sėjama iš sodrinimo terpės ant kietos terpės (bismuto-sulfito agaro arba Endo). vidutinė). Šiems patogenams būdingos kolonijos, užaugintos tankioje terpėje, yra išskyrusios polikarbonatų terpėje.
Pažymėtina, kad medžiagos paskleidimo po plokštelės paviršių tankiomis terpėmis technika turėtų užtikrinti izoliuotų tipiško tipo kolonijų augimą, pagal kurią būtų galima vizualiai įvertinti mikroorganizmo kultūrines savybes.
Bismuto sulfito agaras (BCA) yra tinkamiausias S. Typhi išskyrimo metodas. Tipiškos S. Typhi kolonijos yra juodos ir apsuptos juodu arba rudu apvadu su metaliniu blizgesiu. Tačiau S. Typhi dažnai nesukelia būdingo ICA pajuodėjimo, kai vyksta gausus augimas, todėl lėkštelės turi būti pasėjamos, kad būtų galima augti vienai kolonijai.
Išmatų mėginius galima pasėti į standartines selektyvias enterobakterijų terpes, patvirtintas naudoti Rusijos Federacijoje. Tačiau bismuto sulfito agaras yra tinkamiausias S. tymhi išskyrimo būdas. Tolesnio kultūrų identifikavimo pagal fermentines savybes ir serologines charakteristikas eiga toliau aprašyta atitinkamuose skyriuose.
10. Bakteriologinis šlapimo tyrimas
Šlapimo pasėlis atliekamas diagnozei nuo pirmųjų ligos dienų iki paciento išrašymo, taip pat bakterijų nešiotojui nustatyti. Kadangi vidurių šiltinės ir paratifos sukėlėjo išskyrimas su šlapimu pasireiškia periodiškai ir trumpai, šlapimo tyrimus reikia kartoti kas 5-7 dienas.
Turėtumėte griežtai laikytis bendrųjų šlapimo surinkimo taisyklių, nustatytų MU 4.2.2039-05. Nepriklausomai nuo šlapimo paėmimo būdo, jis turi būti pristatytas į laboratoriją per 2 valandas, kraštutiniais atvejais šlapimą galima laikyti per naktį šaldytuve.
Reikėtų atsiminti, kad priklausomai nuo šlapimo cheminės sudėties, jame esančios bakterijos gali mirti laikant ir daugintis.
Pailgėjus medžiagos galiojimo laikui gali būti labai sunku interpretuoti rezultatą.
Tiesioginis šlapimo (arba nuosėdų po centrifugavimo) inokuliavimas atliekamas be išankstinio sodrinimo pagal SSRS Sveikatos apsaugos ministerijos įsakymą N 535 ant tankių diferencinės diagnostikos terpių, rekomenduojamų salmonelių, įskaitant vidurių šiltinės ir paratifos sukėlėjus. Tuo pačiu metu natūralus šlapimas pasėjamas į dvigubos koncentracijos sodrinimo terpę santykiu 1:1 arba šlapimo nuosėdos pasėjamos į normalios koncentracijos terpę. Inokuliacijos dedamos į termostatą 37 °C temperatūroje 18-24 valandoms, o po to sodrinimo terpė pasėjama ant tankios diferencinės diagnostikos terpės. Kietoje terpėje auginamos kolonijos identifikuojamos pagal kultūrines-fermentines ir serologines savybes.
11. Bakteriologinis tulžies (dvylikapirštės žarnos turinio) tyrimas
Tulžis surenkama į tris sterilius mėgintuvėlius arba sterilius vienkartinius indelius atskirai A, B, C porcijomis pagal MU 4.2.2039-05 ir pristatoma į laboratoriją.
Atlikite kiekvienos porcijos (A, B, C) tyrimą atskirai arba paruoškite trijų porcijų mišinį. Mėginiai inokuliuojami:
ant tankių diferencinės diagnostikos terpių (ICA, Endo, EMS ir kt.) 0,5 ml;
mėgintuvėlyje (butelyje) su maistinių medžiagų sultiniu santykiu 1:10. Į sodrinimo terpę tulžies skiepyti nereikia, kaip pati tulžis yra gera terpė daugintis vidurių šiltinės ir paratifos sukėlėjams.
Inokuliuotos terpės inkubuojamos su tulžies likučiais 37 °C temperatūroje.
Po 18-24 valandų inokuliacijos tiriamos tankioje mitybinėje terpėje (į augimo ant ICA rezultatus atsižvelgiama po 24 ir 48 valandų) ir pakartotinai sėjamos įtartinos kolonijos polikarbonatų terpėje.
Iš maistinių medžiagų sultinio į tankią diferencinę diagnostinę terpę daromos sėklos.
Iš likusios tulžies, esant neigiamam tiesioginio sėjimo rezultatui, pakartotinai sėjama į tankią diferencinę diagnostinę terpę po 18-24 valandų ir 3, 5, 7 ir 10 dienomis.
Išaugę mikroorganizmai identifikuojami pagal kultūrines-morfologines, fermentines ir serologines savybes.
12. Roseola medžiagos bakteriologinis tyrimas
Bakteriologinis tyrimas („grandymas“ rozeole) atliekamas esant aiškiai apibrėžtai rozeolei. Medžiaga surenkama aseptiškai. Norėdami tai padaryti, odos plotas virš rozeolės apdorojamas 70% etilo alkoholiu, tada nuvalomas medvilniniu tamponu, suvilgytu steriliu 0,9% natrio chlorido tirpalu, ir išdžiovinamas steriliu tamponu.
Medžiaga tyrimams (audinių skystis) gaunama skalpeliu skarifikuojant odą virš rozolės. 1-2 lašai tulžies sultinio arba izotoninio natrio chlorido tirpalo užlašinami ant pažeistos odos, sumaišomi su išsikišusiu audinių skysčiu ir surenkama Pasteur pipete ar panašiu vienkartiniu steriliu prietaisu į mėgintuvėlį su viena iš skystų sodrinimo terpių (tulžies). sultinys, Rapoport terpė ir kt.). Laboratorijoje inokuliacija laikoma 37 °C temperatūroje 18-24 valandas, po to sėjama tankiose diferencinės diagnostikos terpėse (Endo, EMS, ICA).
13. Kaulų čiulpų bakteriologinis tyrimas
Gerai žinoma, kad laboratoriškai patvirtinus vidurių šiltinės diagnozę, veiksmingiausias yra bakteriologinis kaulų čiulpų tyrimas (sukėlėjo įskiepijimas 90-95 proc.). Net pacientams, sergantiems lengvomis ir ištrintomis vidurių šiltinės formomis, kurias sunku kliniškai atpažinti, taip pat vartojant antimikrobinius vaistus, mielokultūrų inokuliacija yra žymiai didesnė nei kraujo pasėlių.
Tačiau praktikoje bakteriologinis kaulų čiulpų tyrimas atliekamas labai retai, tik esant ypatingoms klinikinėms indikacijoms, nesant kitų laboratorinių duomenų, patvirtinančių vidurių šiltinės ar paratifo diagnozę, tk. ši invazinė procedūra yra gana traumuojanti. Medžiagos mėginių ėmimas tyrimams atliekamas tik ligoninėje, dalyvaujant atitinkamam specialistui.
Medžiaga bakteriologiniam tyrimui (aspiratas) 0,50-0,75 ml aseptiškai gaunama pradūrus krūtinkaulį (rankeną ar kūną) ir į mėgintuvėlį pasėjama viena iš sodrinimo terpių (tulžies sultinys, Rapoport terpė ir kt.).
Jei aspirato negalima pasėti į sodrinimo terpę iš karto po punkcijos, jis surenkamas į sterilų mėgintuvėlį ir nedelsiant siunčiamas į laboratoriją, kur atliekama inokuliacija į sodrinimo terpę. Laboratorijoje inokuliacijos inkubuojamos 37 °C temperatūroje 18-24 valandas, po to pasėjama tankiose diferencinės diagnostikos terpėse.
Atliekami tolesni tyrimai, kaip ir kitos biologinės medžiagos bakteriologinis tyrimas.
14. Maistinės terpės ir reagentai
Žarnyno infekcijų sukėlėjų, ypač enterobakterijų, išskyrimui ir identifikavimui skirtų maistinių medžiagų sąrašas yra platus ir nuolat plečiamas. Konkrečios aplinkos pasirinkimą daugiausia lemia vietos ekonominės sąlygos ir tradicijos. Tačiau reikėtų vadovautis keliais pagrindiniais principais.
14.1. Auginimo terpės aprašyme turėtų būti nurodyta, kad ji gali būti naudojama ne tik Salmonella, bet ir Salmonella Typhi bei S. Paratyphi A, B ir C aptikimui.
14.2. Pirmenybė turėtų būti teikiama dehidratuotai auginimo terpei iš patikimų gamintojų, o ne terpėms, paruoštoms tiesiogiai laboratorijoje.
14.3. Kiekviena auginimo terpės partija laboratorijoje turi būti kontroliuojama bandomųjų padermių (vidinė kokybės kontrolė).
14.4. Laboratorinei vidurių šiltinės ir paratifoidų ligų diagnostikai bei bakterijų nešiotojams nustatyti turėtų būti naudojamos maistinės terpės ir reagentai, nustatyta tvarka patvirtinti naudoti Rusijos Federacijos teritorijoje.
15. Fermentinių savybių tyrimo metodai
Šiuo metu Enterobacteriaceae šeimos mikroorganizmų, įskaitant vidurių šiltinės ir paratifos sukėlėjus, fermentiniam aktyvumui tirti yra sukurtos, gaminamos ir registruojamos įvairios vidaus ir užsienio gamybos diagnostinių tyrimų sistemos (nuo paprasčiausių klasikinių Hiss terpių mėgintuvėliuose ir plokštelėse iki automatinių analizatoriai). Jei bandymų sistemos leidžia identifikuoti mikroorganizmą iki genties lygio ir nustatyti padermių fermentinio aktyvumo ypatybes, tada jomis galima nustatyti vidurių šiltinės ir paratifos sukėlėjus. Darbo su bandymo sistemomis procedūra yra išsamiai aprašyta naudojimo instrukcijose ir turėtų būti griežtai laikomasi.
16. Patogenų biologinės savybės
Vidurių šiltinės ir A, B ir C paratifų sukėlėjai priklauso Enterobacteriaceae šeimai, Salmonella genčiai, enterica rūšims, I porūšiui (enterica) ir turi šiam porūšiui, rūšiai, gentims ir šeimai būdingų morfologinių, kultūrinių ir fermentinių savybių.
Salmonella genties enterica genties atstovai istoriškai susiklostė situaciją, kai serovarai buvo žymimi ne antigenine formule, kaip kitose bakterijose, o ligų (žmogaus ar gyvūno), šalies, miesto ar gatvės, kurioje jie buvo išskirti, pavadinimais, tt Klaidinga laikyti šiuos rūšių pavadinimus, nes jie neturi taksonominio statuso. Tačiau labiausiai paplitusių Salmonella serovarų pavadinimai yra tokie žinomi, kad beveik neįmanoma jų pakeisti antigeninėmis formulėmis. Todėl šiuolaikinėje Kaufmano-White schemoje, žymint Salmonella enterica tik I porūšį, vietoj rūšies pavadinimo naudojamas serovaro pavadinimas, tačiau jis rašomas didžiąja raide.
Taigi pilni vidurių šiltinės ir paratifos sukėlėjų pavadinimai yra tokie:
Salmonella enterica subsp. enterica serovaro Typhi;
Salmonella enterica subsp. enterica serovaro Paratyphi A;
Salmonella enterica subsp. enterica serovaro Paratyphi B;
Salmonella enterica subsp. enterica serovaras Paratyphi C
Įprastoje praktikoje galima naudoti sutrumpintas pavadinimų versijas:
Salmonella ser. Typhi arba Salmonella Typhi arba S. Typhi;
Salmonella ser. Paratyphi A arba Salmonella Paratyphi A arba S. Paratyphi A;
Salmonella ser. Paratyphi B arba Salmonella Paratyphi B arba S. Paratyphi B;
Salmonella ser. Paratyphi C arba Salmonella Paratyphi C arba S. Paratyphi C
16.1. Kultūrinės ir morfologinės savybės
Mobilios gramneigiamos lazdelės nesudaro sporų ir kapsulių, fakultatyviniai anaerobai gerai auga įprastose maistinėse terpėse.
Ant paprasto maistinio agaro kolonijos yra šiek tiek išgaubtos, lygiu kraštu ir lygiu paviršiumi, drėgnos, daugiau nei 1 mm blizgesio.
Ant diferencinės diagnostikos terpės (kuriose yra laktozės kaip diferencijuojančios medžiagos) - skaidrios, bespalvės arba melsvos, o kartais rausvos arba kolonijos aplinkos spalvos (Endo, Ploskirev, EMS ir kitos panašios terpės).
Ant SS-arape, vidutinės spalvos kolonijos su juodu centru.
Ant bismuto-sulfito terpėje izoliuotos S. Typhi, S. Paratyphi B kolonijos yra juodos su būdingu metaliniu blizgesiu, terpė po kolonija nudažyta juodai. S. Paratyphi A kolonijos yra žalsvos, šviesios terpės spalvos, švelnios.
S. Paratyphi B (paratifoidinio B sukėlėjo) padermės ant mėsos peptono agaro gali suformuoti iškilią gleivinę sienelę palei kolonijų periferiją. Gleivinis kotas vystosi 2-5 dienas, kai pasėliai laikomi kambario temperatūroje. Šis simptomas nėra nuolatinis ir diagnostinis.
16.2. Fermentinės savybės
Fermentinių savybių tyrimas atliekamas atsižvelgiant į angliavandenių, polihidroksilių alkoholių, aminorūgščių ir kitų organinių junginių rinkinį, naudojamą Salmonella ir kitų enterobakterijų identifikavimui ir tyrimui. Paprastai praktinėse laboratorijose atliekamas nedidelis bandymų skaičius, siekiant nustatyti pagrindines žarnyno bakterijų šeimos dalis. Salmonella, įskaitant vidurių šiltinės ir A, B ir C paratifo sukėlėjus, fermentinių savybių charakteristikos pateiktos 2 lentelėje.
2 lentelė
Vidurių šiltinės ir paratifoidų A, B, C patogenų fermentinės savybės
|
substratas |
S. Paratyphis A |
||||
|
Gliukozė (dujos) |
Bakteriologinis patologinės medžiagos tyrimo metodas, skirtas mikobakterijoms išskirti ir identifikuoti, apima 3 metodus: bakterioskopinį, kultūrinį ir biologinį / R.V.Tkzova, 1983; I.I.Rumačikas, 1987, 1993; A.S. Dončenko, 1989; Taip. Kassich, 1990; A.Kh.Naimanovas, 1993; L.P. Khodun, 1997/. Bakteriologinio tyrimo laikotarpis neturi viršyti 3 mėnesių.
Atsižvelgiant į tai, kad makroskopinius tuberkuliozės pokyčius galvijų organuose ir audiniuose sukelia galvijų tuberkuliozės sukėlėjas, tokios medžiagos bakteriologiškai tirti nėra prasmės. Jeigu tokia medžiaga pristatoma į laboratoriją tyrimams, tuomet atliekamas komisijinis patikrinimas ir surašomas aktas. Medžiaga tampa nekenksminga.
Bakterioskopinis (mikroskopinis) medžiagos tyrimas susideda iš kiekvieno organo (ar organo gabalėlių, turinčių įtartinų tuberkuliozės pakitimų) paruošimo ir limfmazgio pristatymo tirti, 2 atspaudų tepinėliams, džiovinimo ore, fiksavimo virš liepsnos. alkoholio lempa, dažymas pagal Cyl-Nielsen ir nudažytų tepinėlių peržiūra mikroskopu, kiekviename tepinėlyje turint mažiausiai 50 matymo laukų. Iš vienos skerdenos iš medžiagos reikia paruošti ne mažiau kaip 20 tepinėlių-atspaudų. Be to, tepinėliai mikroskopijai ruošiami ir iš medžiagos suspensijos, pasėtos ant maistinių medžiagų.
Ziehl-Neelsen tepinėlių dažymas yra selektyvus mikobakterijoms aptikti: mėlyname nudažytų audinių ar pašalinės mikrofloros fone mikobakterijos matomos kaip raudonos, rausvos ar rubino spalvos lazdelės. Geriausia tepinėlius žiūrėti žiūronu mikroskopu, padidinus 1,5 (purkštukas) x 7 (okuliaras) x 90 arba 100 (objektyvas).
Metodas naudojamas kaip signalas, nes mikobakterijų buvimas ar nebuvimas tepinėliuose absoliučiai neturi įtakos tolesnių tyrimų eigai ir net teigiama bakterioskopijos išvada neturi teisinės reikšmės (išskyrus paukščius). Reikia toliau tyrinėti medžiagą.
Laboratorinė paukščių tuberkuliozės diagnozė laikoma nustatyta, jei iš tiriamosios medžiagos yra išskirta paukščių mikobakterijų kultūra (iš papūgų – žmonių ar paukščių rūšių), gaunamas teigiamas biologinio tyrimo rezultatas, taip pat jei mikobakterijų aptinkama tepinėliuose iš patologinės medžiagos. atliekant mikroskopinį tyrimą (7.3 .2 instrukcijų punktas).
Taip pat būtina atkreipti dėmesį į tai, kad atspaudų tepinėlių paruošimas, jų fiksavimas ir peržiūra užima daug laiko, o mikobakterijų juose aptinkama labai retai net tepinėliuose iš sėjamos medžiagos suspensijos. Todėl, norint sutaupyti darbo laiko ir pinigų tiriant medžiagą iš gyvūnų, kurie skerdimo metu nepasikeitė, patartina apsiriboti tepinėlių ruošimu ir apžiūrėjimu tik iš medžiagos suspensijos, pasėtos ant maistinių medžiagų. Tai nesukels žalos diagnozuojant tuberkuliozę, nes medžiagos tyrimas tęsiamas toliau.
Be įprastos šviesos mikroskopijos, galima naudoti ir fluorescencinę mikroskopiją. Tepinėliai ruošiami tokiu pat būdu, fiksuojami ir nudažomi fluorochromų mišiniu. Dažyti tepinėliai apžiūrimi fluorescenciniu mikroskopu. Metodas yra jautresnis, bet mažiau specifinis, todėl nelabai priimtinas, ypač praktinėse laboratorijose.
Kultūrinė mikobakterijų išskyrimas ant maistinių medžiagų yra viena iš svarbių laboratorinės tuberkuliozės diagnostikos grandžių dabartiniame etape. Tačiau maistinė terpė, ant kurios buvo pasėta medžiaga (5–10 mėgintuvėlių pagal instrukcijas), per pirmąsias 2–3 savaites paprastai sudygsta iš dalies arba visiškai dėl sterilumo pažeidimo inokuliacijos metu. iš medžiagos. Pasėliai išmetami kaip tik tuo metu, kai labiausiai tikėtinas pradinis netipinių mikobakterijų augimas (jau nekalbant apie pradinio tuberkuliozės sukėlėjo augimo pasireiškimą, kuris auga ir vėliau). Tokiais atvejais mechaniškai iškrenta kultūrinis mikobakterijų išskyrimo ant maistinių medžiagų terpės metodas. Tai viena iš pagrindinių priežasčių, dėl kurių gaunami neigiami medžiagos bakteriologinio tyrimo rezultatai. Dėl to, po medžiagos inokuliacijos negavus mikobakterijų kolonijų augimo ant maistinių medžiagų, o laboratoriniams gyvūnams išlikus gyviems 3 mėnesius, standartinis laboratorijų atsakymas yra toks: „Tuberkuliozės sukėlėjas neišskirtas“ arba „ Medžiagos tyrimas dėl tuberkuliozės – neigiamas“. Remiantis tyrimų rezultatais, galvijų atsako į tuberkuliną priežastis nenustatyta, o dėl to toliau nepagrįstai skerdžiama daug į tuberkuliną reagavusių gyvulių ūkiuose, kuriuose nėra galvijų tuberkuliozės, kuri sukelia. didelę ekonominę žalą, sutrikdo bandos apyvartą ir dauginimąsi.
Atsižvelgiant į tai, kas išdėstyta pirmiau, būtina teikti pirmenybę kultūriniam mikobakterijų išskyrimo iš maistinėse terpėse esančios medžiagos metodui, nes tai yra silpniausia tuberkuliozės bakteriologinės diagnostikos grandis rajonų veterinarijos laboratorijose.
Teigiami kultūrinio mikobakterijų išskyrimo metodo rezultatai daugiausia priklauso nuo dviejų aplinkybių: padidėjusio mikobakterijų išsėjimo iš medžiagos patikimumo ir sterilumo sąlygų laikymosi dirbant dėžėje.
Mikobakterijų sėjimo iš tyrimui paimtos medžiagos patikimumo padidėjimas visų pirma priklauso nuo jos kokybinės atrankos, apdorojimo prieš sėją ir terpės, kurioje sėjama, mėgintuvėlių skaičiaus padidėjimo.
Pagrindinės sąlygos, kurių laikymasis sėjant medžiagą į maistines terpes garantuoja mikobakterijų kolonijų augimą:
a) paimti bakteriologiniam tyrimui medžiagą iš paskerstų gyvūnų, kurie skerdimo metu nepasikeitė, atskirai nuo kiekvienos skerdenos ir pasėti kiekvieną mėginį (medžiagą iš kiekvieno gyvūno) į 10–20 terpės mėgintuvėlių pagal šią schemą:
Galvos limfmazgiai (submandibuliniai, ryklės);
Bronchų ir tarpuplaučio limfmazgiai;
mezenteriniai (mezenteriniai) limfmazgiai;
Kiti limfmazgiai (jei yra įtartinų vietų);
Organai (taip pat jei reikia).
Rezultatas – medžiaga iš vieno gyvūno pasėjama 30–50 terpės mėgintuvėlių. Taip pasiekiamas 3-5 kartų padidintas mikobakterijų sėjimo patikimumas, nes neatskiriant mėginių (pagal instrukcijas), rekomenduojama sėti medžiagą tik į 5-10 terpės mėgintuvėlių iš dviejų vienos galvutės. ūkis.
b) Tiesiogiai bakteriologinės medžiagos inokuliacijos metu išpjaukite gabalus su sutrikusia limfmazgio ar organo morfologine struktūra (hiperplazija, sukietėjimas, smailūs ir dryžuoti kraujavimai ir kt.). Be to, būtina iškirpti visas pakeistas sritis. Jei viename skiedinyje yra daug medžiagos pagal tūrį, ją galima padalyti į dvi dalis.
c) Griežtai laikytis darbo metodikos, nepažeidžiant medžiagos apdorojimo ir sėjos būdo.
d) Homogenizuojant medžiagą, ypač limfmazgius, būtina naudoti sterilų smėlį arba smulkiai susmulkintą sterilų stiklą. Sumalkite medžiagą kiek įmanoma (iki kreminės konsistencijos), kad mikobakterijos būtų geriau išgaunamos iš tiriamosios medžiagos
e) Į homogenizuotą medžiagą skiedinyje įpilkite druskos tirpalo tiek, kiek reikia medžiagos suspensijai pasėti ant maistinių medžiagų ir atlikti biologinį tyrimą (vidutiniškai iki 0,5 cm3 viename mėgintuvėlyje ir 1-2 cm3 poodinei infekcijai viena jūrų kiaulytė). Šį fiziologinio tirpalo kiekį galima apskaičiuoti iš anksto.
f) Medžiagos pasėlių peržiūra turėtų būti atliekama po 3, 5, 7, 10, 15 dienų ir vėliau kartą per savaitę.
g) Visos mikroorganizmų kolonijos, išaugintos terpėje (tipinės ar netipinės, pigmentuotos ar nepigmentuotos, gleivinės arba sausos ir t. t.), turi būti mikroskopuojamos su selektyviu dažymu pagal Ziehl-Neelsen.
Reikėtų atkreipti dėmesį į medžiagos plovimo nuo rūgšties (arba šarmo) laipsnį, naudojamą medžiagai apdoroti nuo užteršimo svetima mikroflora. Likučio rūgšties visada bus suspensijoje iš sėklos medžiagos, tačiau jos turėtų būti kuo mažiau. To rodiklis yra pirminės terpės spalvos atkūrimas 2-4 dieną po medžiagos sėjos. Jei terpės spalva neatsistato, tai rodo padidėjusį likutinės rūgšties kiekį. Terpės spalva įgauna įvairaus intensyvumo melsvą atspalvį. (Numanomų) mikobakterijų, ypač tuberkuliozės sukėlėjo, augimas šiuo atveju sulėtėja arba jų visai nebus, nes jos yra reiklesnės auginimo režimui. Likęs rūgšties kiekis tam tikru mastu veikia mikobakterijas bakteriostatiškai.
Mėgintuvėliams užsandarinti po medžiagos pasėjimo galima naudoti medvilninius ir vatos-marlės kamščius, po to juos užpildyti parafinu, begumos ir guminius su išpjautu įstrižu grioveliu, žieviniais ir metaliniais kamščiais (langinėmis).
Nustatant izoliuotos mikobakterijų kultūros rūšinę priklausomybę, žinoma daug (apie 300) skirtingų tyrimų: kultūrinių-morfologinių, biologinių, biocheminių, serologinių, atsparumo vaistams nustatymo ir kt. Tačiau veterinarinėje praktikoje naudojamas jų minimumas (žr. vadovą). Laboratorijoms pakanka nustatyti izoliuotą šių rūšių mikobakterijų kultūrą: galvijų, žmonių ir paukščių, kuri nustatoma biologiniu tyrimu, ir netipinių mikobakterijų – suskirstytų į grupes pagal Runyon (1959): I – fotochromogeninė (sudaranti). pigmentas veikiamas šviesos), II – skotochromogeninis (sudaro pigmentą nepriklausomai nuo šviesos poveikio – tiek tamsoje, tiek šviesoje), III – nechromogeninis (nesudaro pigmento) arba jie dar vadinami nepigmentiniais ( čia taip pat įtrauktas paukščių tuberkuliozės sukėlėjas), IV - greitai augančios mikobakterijos ir rūgštims atsparūs saprofitai.
Norėdami tai padaryti, yra gana efektyvu ir ekonomiškai pagrįsta ištirti izoliuotos kultūros savybes pagal sutrumpintą schemą, kurioje pagrindinis dėmesys skiriamas pirminio kolonijų augimo atsiradimo laikui, pigmento susidarymui, kultūriniam augimui. morfologinės ir tonacinės savybės, kai dažytos Ziehl-Neelsen. Ypač svarbus yra virvelės susidarymo tyrimas pirminėje ar net subkultūroje kartu su biologinio tyrimo rezultatais. Norint paruošti tepinėlius iš užaugintų kolonijų, patartina juos vienu metu daryti ir iš kolonijų, ir iš suspenduotų medžiagų bei kondensato likučių, t.y. iš skystos dalies vamzdelio apačioje.
Be to, laboratorijos darbuotojai turi galimybę ne tik atlikti kontrolinį į tuberkuliną reagavusių gyvūnų skerdimą ir paimti medžiagos mėginius tyrimams, bet ir paimti mėginius bakteriologiniams tyrimams per gyvūnų gyvenimą (bronchų ar nosies gleivių, pieno, išmatos, šlapimas, eksudatas, kraujas ir kt.), taip pat pašarų, vandens, aplinkos objektų mėginiai, skirti mikobakterijoms išskirti ir tokiu būdu netiesiogiai įrodyti galvijų reakcijos į tuberkuliną priežastį. Sėjant papildomą medžiagą ir mėginius iš aplinkos objektų, naudojami gerai žinomi mikobakterijų koncentravimo būdai: sedimentacija, flotacija, flotacija-sedimentacija ir kt.
Sutrumpinta mikobakterijų diferenciacijos schema naudojant biologinį tyrimą
