PGR tikslas ir metodo principas. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) ir jos taikymas

SEI HPE „Krasnojarsko valstybinė medicinos akademija

pavadintas Yasenetsky federalinės sveikatos ir socialinės plėtros agentūros vardu »

IPO Medicininės genetikos ir klinikinės neurofiziologijos katedra

PAGRINDINIAI METODO PRINCIPAI

POLIMERAZĖS GRANDINĖ REAKCIJA

Metodinis vadovas 3-4 kursų studentams

bendrosios medicinos specialybėse (060101) ir

Krasnojarskas – 2007 m

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Pagrindiniai polimerazės grandininės reakcijos metodo principai. Bendrosios medicinos (060101) ir pediatrijos (060103) specialybių 3-4 kursų studentų popamokinio darbo metodinis vadovas. - Krasnojarskas: GOU VPO leidykla KrasGMA, 2007. - 42p.

Metodinis vadovas visiškai atitinka Valstybinio standarto (2000) reikalavimus ir atspindi pagrindinius šiuolaikinio paveldimų žmogaus ligų diagnostikos metodo – polimerazės grandininės reakcijos metodo – aspektus, mokomoji medžiaga pritaikyta edukacinėms technologijoms, atsižvelgiant į specifiką. mokymas 3-4 medicinos ir pediatrijos fakultetų kursuose.

Recenzentai: Valstybinės aukštosios mokyklos Medicininės genetikos katedros vedėjas

„Federalinės sveikatos ir socialinės plėtros agentūros Novosibirsko valstybinis medicinos universitetas“, medicinos mokslų daktaras, profesorius;

DNR replikacija

Šio metodo tyrimo objektas yra dezoksiribonukleino rūgštis (DNR). DNR yra universalus genetinės informacijos nešėjas visuose Žemėje egzistuojančiuose organizmuose (išskyrus RNR turinčius mikroorganizmus). DNR yra dviguba grandinė, susukta į spiralę. Kiekviena grandinė susideda iš nuosekliai sujungtų nukleotidų. DNR grandinės turi priešingą kryptį: vienos grandinės 5' galas atitinka antrosios grandinės 3' galą. Unikali DNR savybė yra jos gebėjimas dubliuotis. Šis procesas vadinamas replikacija. DNR molekulės replikacija vyksta sintetiniu tarpfazės periodu. Kiekviena iš dviejų „motinos“ molekulės grandinių tarnauja kaip „dukters“ šablonas. Po replikacijos naujai susintetintoje DNR molekulėje yra viena „motiniška“ grandinė, o antroji – „dukra“, naujai susintetinta (pusiau konservatyvus metodas). Naujos DNR molekulės šablono sintezei būtina, kad senoji molekulė būtų despiralizuota ir ištempta. Replikacija prasideda keliose DNR molekulės vietose. DNR molekulės atkarpa nuo vienos replikacijos pradžios iki kitos pradžios vadinama replikonas.

Suaktyvinama replikacijos pradžia gruntai(sėklos), susidedančios iš 100-200 bazinių porų. DNR helikazės fermentas išsivynioja ir padalija pirminę DNR spiralę į dvi grandines, ant kurių pagal komplementarumo principą, dalyvaujant DNR polimerazės fermentui, surenkamos „dukterinės“ DNR grandinės. Kad fermentas pradėtų veikti, reikalingas pradinis blokas – nedidelis pradinis dvigrandė fragmentas. Pradinis blokas susidaro pradmeniui sąveikaujant su atitinkamos pirminės DNR grandinės komplementaria sritimi. Kiekviename replikone DNR polimerazė gali judėti palei "motininę" grandinę tik viena kryptimi (5`=>3`).

Pirmojoje sruogoje, replikonui išsivyniojus, palaipsniui nuolat auga „dukterinė“ sruogelė. Atsiliekančioje grandinėje dukterinė grandinė taip pat sintetina kryptimi (5`=>3`), bet atskirais fragmentais, kai replikonas išsivynioja.

Taigi „dukterinių“ gijų komplementarių nukleotidų prijungimas vyksta priešingomis kryptimis (antilygiagrečiai). Replikacija visuose replikonuose vyksta vienu metu. Skirtinguose replikonuose susintetinti „dukterinių“ gijų fragmentai ir dalys fermento ligazės surišamos į vieną grandinę. Replikacijai būdingas pusiau konservavimas, antiparaleliškumas ir nenuoseklumas. Visas ląstelės genomas replikuojamas vieną kartą per laikotarpį, atitinkantį vieną mitozinį ciklą. Replikacijos proceso rezultate iš vienos DNR molekulės susidaro dvi DNR molekulės, kurių viena grandinė yra iš pirminės DNR molekulės, o antroji – dukterinė – naujai susintetinama (1 pav.).

Ryžiai. vienas. DNR molekulės replikacijos diagrama.

Taigi, DNR replikacijos ciklas apima trys pagrindiniai etapai:

1. DNR spiralės išsivyniojimas ir sruogų divergencija (denatūracija);

2. gruntų tvirtinimas;

3. vaiko gijos grandinės užbaigimas.

PGR metodo principas

Būtent DNR replikacija sudarė PGR pagrindą. Atliekant PGR, pirmiau išvardyti procesai atliekami mėgintuvėlyje cikliniu režimu. Perėjimas iš vienos reakcijos stadijos į kitą pasiekiamas keičiant inkubacinio mišinio temperatūrą. Kai tirpalas pašildomas iki 93-95°C, įvyksta DNR denatūracija. Norėdami pereiti prie kito žingsnio – pradmenų pridėjimo arba „atkaitinimo“ – inkubacinis mišinys atšaldomas iki 50-65°C. Tada mišinys pašildomas iki 70-72°C – optimalus taq-DNR polimerazės veikimas – šiame etape baigiama kurti nauja DNR grandinė. Tada ciklas kartojasi dar kartą. Kitaip tariant PGR metodas yra daugkartinis kopijų skaičiaus padidinimas (stiprinimas) specifinė DNR dalis, katalizuojama fermento DNR polimerazės.

Dukterinės DNR grandinės pratęsimas turi vykti vienu metu abiejose motininės DNR grandinėse, todėl antrosios grandinės replikacijai taip pat reikalingas atskiras pradmuo. Taigi į reakcijos mišinį įvedami du pradmenys: vienas „+“ grandinei, antrasis „-“ grandinei. Prisijungdami prie priešingų DNR molekulės grandžių, pradmenys apsiriboja ta jos dalimi, kuri vėliau bus pakartotinai padvigubinta arba amplifikuojama. Tokio fragmento, kuris vadinamas amplikonu, ilgis paprastai yra keli šimtai nukleotidų.

PGR žingsniai

Kiekvienas stiprinimo ciklas apima 3 etapus, vykstančius skirtingomis temperatūros sąlygomis (2 pav.).

· 1 etapas: DNR denatūracija . Jis teka 93-95° kampu 30-40 sekundžių.

· 2 etapas: grunto atkaitinimas . Pradmenų prijungimas vyksta papildant atitinkamas sekas priešingose ​​DNR grandinėse konkrečios vietos ribose. Kiekviena gruntų pora turi savo atkaitinimo temperatūrą, kurios reikšmės yra 50-65°C diapazone. Atkaitinimo laikas 20-60 sek.

· 3 etapas: DNR grandinių pratęsimas.. Komplementarus DNR grandinių pratęsimas vyksta nuo grandinės 5" galo iki 3" galo priešingomis kryptimis, pradedant nuo pradmenų prisijungimo vietų. Medžiaga naujų DNR grandinių sintezei yra dezoksiribonukleozido trifosfatai, pridedami prie tirpalo. Sintezės procesą katalizuoja fermentas taq-polimerazė ir jis vyksta 70-72°C temperatūroje. Sintezės laikas - 20-40 sek.

Pirmajame amplifikacijos cikle susidariusios naujos DNR grandinės tarnauja kaip šablonai antrajam amplifikacijos ciklui, kuriame susidaro specifinis amplikono DNR fragmentas (3 pav.). Vėlesniuose amplifikacijos cikluose amplikonai tarnauja kaip šablonas naujų grandinių sintezei.

Taigi amplikonai tirpale kaupiasi pagal formulę 2", kur n yra amplifikacijos ciklų skaičius. Todėl net jei pradiniame tirpale iš pradžių buvo tik viena dvigrandė DNR molekulė, tirpale susikaupia apie 108 amplikonų molekulės. 30-40 ciklų Tokio kiekio pakanka patikimam vizualiniam šio fragmento aptikimui agarozės gelio elektroforeze.

Stiprinimo procesas atliekamas specialiame programuojamame termostate ( dviratininkas), kuri pagal nurodytą programą automatiškai keičia temperatūrą pagal stiprinimo ciklų skaičių.

Stiprinimui reikalingi šie komponentai:

· DNR šablonas(DNR arba jos dalis, kurioje yra norimas specifinis fragmentas);

· Gruntai(sintetiniai oligonukleotidai (20-30 nukleotidų porų), papildantys DNR sekas ties konkretaus nustatomo fragmento ribomis). Konkretaus fragmento pasirinkimas ir pradmenų parinkimas vaidina didelį vaidmenį amplifikacijos specifiškumui, o tai turi įtakos analizės kokybei.

· Deoksinukleotido trifosfatų (dNTP) mišinys(keturių dNTP mišinys, kuris yra medžiaga naujų komplementarių DNR grandinių sintezei, kurių lygiavertė koncentracija yra 200–500 mikronų)

· FermentasTaq- polimerazė(termostabili DNR polimerazė, katalizuojanti pradmenų grandinių pailgėjimą, nuosekliai pridedant nukleotidų bazes į augančią susintetintos DNR grandinę, 2-3 mm).

· buferinis tirpalas(reakcijos terpė, kurioje yra Mg2+ jonų, būtinų fermentų aktyvumui palaikyti, PH 6,8-7,8).

Norint nustatyti konkrečias RNR virusų genomo sritis, pirmiausia iš RNR šablono gaunama DNR kopija, naudojant atvirkštinės transkripcijos (RT) reakciją, katalizuojamą fermento atvirkštinės transkriptazės (atvirkštinės transkriptazės).

Ryžiai. 2. Stiprinimas (1 ciklas).

Ryžiai. 3. Stiprinimas (2 ciklas).

Pagrindinės PGR taikymo sritys

klinikinė medicina:

o infekcijų diagnostika,

o mutacijų nustatymas, įskaitant paveldimų ligų diagnozę,

o genotipų nustatymas, įskaitant ŽLA genotipą,

o korinio ryšio technologijos

ekologija (kaip būdas stebėti aplinkos objektų ir maisto būklę bei kokybę)

transgeninių organizmų (GMO) apibrėžimas

Asmens tapatybė, tėvystė, teismo ekspertizė

bendroji ir specialioji biologija,

Pagrindiniai principai

diagnostinių laboratorijų organizavimas

Darbas PGR laboratorijoje vykdomas laikantis „Sveikatos priežiūros sistemos sanitarinių ir epidemiologinių įstaigų projektavimo, saugos, pramoninės sanitarijos, antiepideminio režimo ir asmens higienos taisyklių dirbant laboratorijose (skyriuose, skyriuose).

DNR mėginių užteršimas

PGR diagnostikos atlikimas yra susijęs su problema, kurią sukelia didelis metodo jautrumas - galimybė užteršimas. Jei į reakcijos mėgintuvėlį patenka nedidelis teigiamos DNR kiekis (specifiniai DNR amplifikacijos produktai – amplikonai; DNR standartas naudojamas kaip teigiama kontrolė; teigiama klinikinio mėginio DNR), PGR metu amplifikuojamas specifinis DNR fragmentas ir dėl to klaidingai teigiamų rezultatų atsiradimas.

Darbo metu galite susitikti dviejų tipų tarša:

1. kryžminis užteršimas nuo mėginio iki mėginio (apdorojant klinikinius mėginius arba iškasant reakcijos mišinį), todėl atsitiktiniai klaidingai teigiami rezultatai;

2. amplifikacijos produkto užterštumas(amplikonai), o tai turi didžiausią reikšmę, nes PGR proceso metu amplikonai susikaupia didžiuliais kiekiais ir yra idealūs produktai reamplifikacijai.

Dėl indų, automatinių pipečių ir laboratorinės įrangos, laboratorinių lentelių paviršiaus ar net laboratorijos darbuotojų odos paviršiaus užteršimo amplikonais gaunami sistemingi klaidingai teigiami rezultatai. Nustatyti užteršimo šaltinį gali būti labai sunku ir tam reikia didelių laiko ir pinigų investicijų. Patirtis, sukaupta iki šiol dirbant PGR metodą diagnostikai naudojančiose laboratorijose, leidžia suformuluoti pagrindinius tokių laboratorijų organizavimo ir pačių tyrimų atlikimo reikalavimus. Šių reikalavimų laikymasis pašalina užteršimo ir klaidingų teigiamų rezultatų gavimo galimybę.

PGR analizės etapai

Geografiškai atskirti, patalpinti į atskiras patalpas (4.5 pav.):

· Prieš PGR kambarys, kur atliekamas klinikinių mėginių apdorojimas, DNR išskyrimas, reakcijos mišinio paruošimas PGR ir PGR (jei yra sąlygos, paskutinius du veiksmus taip pat rekomenduojama atlikti papildomoje atskiroje patalpoje). Šiose patalpose draudžiama atlikti visus kitus darbus su tiriamomis medžiagomis, kurių PGR diagnostika atliekama šioje laboratorijoje.

· Kambarys po PGR, kur atliekamas amplifikacijos produktų nustatymas. Šioje patalpoje gali būti naudojami kiti aptikimo metodai. Pageidautina, kad patalpa amplifikacijos produktams aptikti būtų kuo toliau nuo patalpų prieš PGR.

Darbo patalpose yra įrengtos ultravioletinės lempos, kurių maksimali spinduliuotė yra 260 nm (DB-60 tipas), kurių greitis yra 2,5 W / 1 m3. Lempos išdėstytos taip, kad darbo stalų, įrangos ir medžiagų paviršiai, su kuriais operatorius liečiasi atliekant PGR analizę, būtų veikiami tiesioginės spinduliuotės. Švitinimas atliekamas per 1 valandą iki darbo pradžios ir per 1 valandą po darbo pabaigos.

Laboratorijos gydytojai dirba su specialiais laboratoriniais drabužiais, kurie keičiami pereinant iš vienos patalpos į kitą, ir su vienkartinėmis pirštinėmis. Drabužių iš skirtingų patalpų apdirbimas atliekamas atskirai. Skirtingi darbuotojai dirba skirtinguose PGR analizės etapuose.

Darbui naudojami atskiri dozatorių komplektai, plastikiniai ir stikliniai indai, laboratorinė įranga, chalatai ir pirštinės, skirti įvairiems analizės etapams ir negali būti pernešami iš vienos patalpos į kitą. Kiekviename kambaryje esanti įranga, medžiagos ir inventorius yra atitinkamai paženklinti.

Visi darbo etapai atliekami tik naudojant vienkartines eksploatacines medžiagas: automatinių pipečių antgalius, mėgintuvėlius, pirštines ir t.t. Perkeldami nuo mėginio prie mėginio, būtinai pakeiskite antgalius. Būtina naudoti antgalius su aerozoliniu barjeriniu filtru, kad į pipetę nepatektų tirpalo mikrolašeliai. Panaudoti mėgintuvėliai ir antgaliai išmetami į specialius indus arba konteinerius su dezinfekuojančiu tirpalu. Klinikiniai mėginiai laikomi atskirai nuo reagentų.

Darbo vietos apdirbimui ir valymui kiekviename kambaryje yra vatos-marlės tamponai (servetėlės), pincetai, dezinfekciniai ir inaktyvuojantys tirpalai.

PGR diagnostikos laboratorijoje darbai, susiję su rekombinantinių plazmidžių, turinčių šioje laboratorijoje diagnozuojamų patogenų DNR sekas ar genų fragmentus, gamyba (klonavimu) ir išskyrimu.

Klinikinės medžiagos rinkimas

Tiriama medžiaga PGR gali būti epitelio ląstelių, kraujo, plazmos, serumo, pleuros ir smegenų skysčio, šlapimo, skreplių, gleivių ir kitų biologinių išskyrų, biopsijos mėginiai.

Medžiagos mėginių ėmimas atliekamas atitinkamo profilio gydymo kambario sąlygomis. Paėmus mėginius, mėginius reikia kuo greičiau nuvežti į PGR diagnostikos laboratoriją.

Mėginiai turi būti imami naudojant sterilius, pageidautina vienkartinius instrumentus tik vienkartiniuose steriliuose plastikiniuose arba stikliniuose vamzdeliuose, iš anksto valandą apdorotus chromo mišiniu, kruopščiai nuplauti distiliuotu vandeniu ir kaitinti orkaitėje 150 °C temperatūroje. 1 valandai.

Aptikimo zona (kitas aukštas ar kitas pastatas).

Ryžiai. keturi. PGR laboratorinis prietaisas su aptikimu elektroforezės būdu.

Aptikimo zona (skirtingame aukšte ar pastate)

Ryžiai. 5. PGR laboratorinis prietaisas su fluorescenciniu detektavimu (kiekybinė analizė).

Ryžiai. 6. DNR išgavimo kambarys. Parodyta stalinė dėžutė su baktericidine lempa.

Ryžiai. 7. stiprinimo kambarys.

Ryžiai. aštuoni. Aptikimo kambarys.

Ryžiai. 9. Kraujo mėginiai paveldimų ligų DNR diagnostikai.

Mėginių laikymas ir transportavimas

Paveldimų ligų diagnostikai kraujo mėginiai ilgą laiką laikomi ant specialių popierinių formų arba epindorfuose (plastikiniuose mėgintuvėliuose) sušaldyti (9 pav.).

Infekcinėms ligoms diagnozuoti mėginiai laikomi kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 2 valandas. Jei reikia ilgiau laikyti, mėginius galima įdėti į šaldytuvą 2-8°C temperatūroje ne ilgesniam kaip 24 valandų laikotarpiui. Ilgesnis saugojimas (iki 2 savaičių) yra priimtinas užšaldžius šaldiklyje minus 20°C temperatūroje. Pakartotinis mėginių užšaldymas-atšildymas neleidžiamas.

Jeigu PGR diagnostikos laboratorija ir procedūrų patalpa mėginiams paimti yra geografiškai atskirtos, tai mėginiai turi būti vežami termosuose arba termose, laikantis mėginių laikymo taisyklių ir infekcinių medžiagų gabenimo taisyklių.

DNR išskyrimas iš mėginių

Plačiai paplitęs kietosios fazės sorbcijos metodas, kurį sudaro lizuojančio agento, kuriame yra guanidino tirpalo, pridėjimas, DNR sorbcija ant sorbento, pakartotinis plovimas ir DNR rezorbcija buferiniu tirpalu. Serumo, plazmos ar viso kraujo apdorojimo atveju dažniausiai naudojamas fenolio ekstrahavimo metodas. Metodas apima deproteinizaciją fenoliu/chloroformu, po to DNR (arba RNR) nusodinimą etanoliu arba izopropanoliu. Apdorojimas atliekamas Eppendor P tipo mikrocentrifuginiuose mėgintuvėliuose, kurių tūris yra 1,5 ml. Apdorojimo laikas 1,5-2 valandos (10 pav.).

Ryžiai. dešimt. DNR išskyrimas.

PGR atlikimas

Tam tikras kiekis mėginio iš apdoroto klinikinio mėginio perkeliamas į specialų Eppendorf tipo mikrocentrifugos mėgintuvėlį, kurio tūris yra 0,2 arba 0,5 ml. Į jį įpilamas amplifikacinis mišinys, susidedantis iš vandens, PGR buferio, dNTP tirpalo, pradmenų tirpalo ir tirpalo. Taq-polimerazė (į mišinį dedama paskutinė. Paprastai reakcijos mišinio tūris yra 25 µl. Tada į kiekvieną mėgintuvėlį įlašinamas vienas lašas mineralinės alyvos, kad reakcijos mišinys neišgaruotų amplifikacijos metu. Mėgintuvėliai perkeliamas į programuojamą termostatą (stiprintuvą), kur stiprinimas atliekamas automatiniu režimu pagal duotą programą (11 pav.).

Ryžiai. vienuolika. stiprintuvas" Termocikleris ».

Reakcijos laikas, priklausomai nuo nurodytos programos, yra 2-3 valandos. Lygiagrečiai su eksperimentiniais mėginiais dedami kontroliniai mėginiai: teigiama kontrolė apima visus reakcijos komponentus, tačiau vietoj klinikinio mėginio medžiagos įvedamas kontrolinis tiriamo geno DNR preparatas. Neigiama kontrolė apima visus reakcijos komponentus, tačiau vietoj klinikinės medžiagos ar DNR preparato pridedamas atitinkamas kiekis dejonizuoto vandens arba ekstrakto, kuriame nėra tiriamos DNR. Neigiama kontrolė yra būtina norint patikrinti reakcijos komponentus, ar juose nėra DNR dėl užteršimo, ir pašalinti klaidingai teigiamus rezultatus.

Rezultatų registracija

Amplifikuotas specifinis DNR fragmentas aptinkamas agarozės gelio elektroforeze, dalyvaujant etidžio bromidui. Etidžio bromidas sudaro stabilų intersticinį junginį su DNR fragmentais, kurie pasirodo kaip šviečiančios juostos, kai gelis apšvitinamas UV spinduliuote, kurio bangos ilgis yra 290-330 nm. Priklausomai nuo gautų PGR amplikonų dydžio, naudojamas gelis, kuriame yra 1,5–2,5 % agarozės. Agarozės geliui paruošti agarozės, buferio ir vandens mišinys ištirpinamas mikrobangų krosnelėje arba vandens vonioje ir įpilamas etidžio bromido tirpalas. Atšaldytas iki 50-60°C, mišinys pilamas į formą 4-6 mm storio sluoksniu ir specialiomis šukomis į gelį padaromos kišenės mėginiui uždėti. Šukos nustatomos taip, kad tarp šulinių dugno ir gelio pagrindo liktų 0,5-1 mm agarozės sluoksnis. Geliui sukietėjus, ant kišenių užtepamas 5-15 µl amplifikatas. DNR fragmentų ilgio žymenų mišinio elektroforezę rekomenduojama atlikti lygiagrečiai su kontroliniais ir eksperimentiniais mėginiais. Paprastai tokiame mišinyje yra dešimt DNR fragmentų 100, 200, 300 ir tt ilgų bazių porų.

Tokio mėginio nustatymas leidžia patikrinti amplikonų ilgį kontroliniuose ir eksperimentiniuose mėginiuose. Gelis su uždėtu mėginiu perkeliamas į elektroforezės kamerą, užpildytą buferiu, kamera prijungiama prie maitinimo šaltinio ir elektroforetinis stiprinimo produktų atskyrimas atliekamas 30-45 minutes, esant 10-15 elektrinio lauko stipriui. V/cm. Šiuo atveju dažų priekinė dalis, kuri yra reakcijos mišinio dalis, turi praeiti mažiausiai 3 cm.

Pasibaigus elektroforezei, gelis perkeliamas į transiliuminatoriaus stiklą ir apžiūrimas ultravioletinėje šviesoje. Dokumentacijai gelis fotografuojamas ant Mikrat 300 plėvelės arba įrašomas naudojant vaizdo sistemą, prijungtą prie kompiuterio.

Pirmiausia įvertinami kontroliniai mėginiai. Elektroforezės juostoje, atitinkančioje teigiamą kontrolę, turėtų būti oranžinė šviečianti juosta. Jo elektroforezinis mobilumas turi atitikti instrukcijose nurodytą amplikono ilgį.

Elektroforezės takelyje, atitinkančiame neigiamą kontrolę, tokios juostos neturėtų būti. Tokios juostos buvimas neigiamoje kontrolėje rodo užteršimą – naudojamų reagentų užterštumą tiriama DNR arba amplikonu. Tiriamieji mėginiai vertinami pagal juostos buvimą atitinkamoje juostoje, kuri yra tame pačiame lygyje kaip juosta teigiamame kontroliniame mėginyje. Juostos švytėjimo intensyvumas atitinka tiriamos DNR kiekį mėginyje, todėl galima pusiau kiekybiškai įvertinti PGR. Paprastai teigiami rezultatai vertinami keturių balų skalėje. Jei juostos švytėjimas bandomajame mėginyje yra labai silpnas, tuomet tokį mėginį reikia pertvarkyti (12 pav.).

Ryžiai. 12. Elektroforezė agarozės gelyje.

PGR programos, skirtostaškinių mutacijų ir genų polimorfizmų diagnostika

Viena iš pirmaujančių PGR taikymo sričių praktinėje sveikatos priežiūros srityje yra taškinių mutacijų ir genų polimorfizmų diagnostika. . Yra tiesioginiai ir netiesioginiai DNR diagnostikos metodai. Tais atvejais, kai yra žinomas genas, kurio pažeidimas lemia paveldimos ligos išsivystymą, šį pažeidimą galima nustatyti molekulinės genetikos metodais. Tokie metodai vadinami tiesioginiais. Taikant tiesioginius metodus, nustatomi pirminės DNR nukleotidų sekos sutrikimai (mutacijos ir jų tipai). Tiesioginiai metodai pasižymi tikslumu, siekiančiu beveik 100%.

Tačiau praktiškai šie metodai gali būti taikomi tam tikromis sąlygomis.:

su žinoma citogenetine geno, atsakingo už paveldimos ligos vystymąsi, lokalizacija;

Ligos genas turi būti klonuotas ir žinoma jo nukleotidų seka.

Tiesioginės DNR diagnostikos tikslas – nustatyti mutantinius alelius.

Taigi tais atvejais, kai yra žinoma, koks DNR pažeidimas sukelia paveldimą ligą, DNR fragmentas, kuriame yra pažeidimas, tiriamas tiesiogiai, t. y. naudojamas tiesioginis DNR diagnostikos metodas.

Tačiau iki šiol daugelio ligų genai nėra kartografuoti, nežinoma jų egzonintronų organizacija, o daugeliui paveldimų ligų būdingas ryškus genetinis heterogeniškumas, neleidžiantis visapusiškai panaudoti tiesioginių DNR diagnostikos metodų. Todėl tais atvejais, kai žalos lokalizacija nežinoma, taikomas kitoks požiūris, siejamas su geno, atsakingo už genų ligą, apylinkių tyrimu, kartu su šeimos analize, ty netiesioginiais molekulinės genetinės diagnostikos metodais. vartojamos paveldimos ligos.

Taškinėms mutacijoms ir nedidelėms delecijoms nustatyti gali būti naudojami įvairūs metodai, tačiau visi jie yra pagrįsti PGR metodo naudojimu. Ši reakcija leidžia pakartotinai padauginti DNR nukleotidų seką ir tada ieškoti mutacijų. DNR fragmentų, turinčių mutacijas, paieškos metodai yra pagrįsti lyginamąja mutantų ir normalių DNR nukleotidų sekų analize.

PGR produktų analizė

tiesioginės DNR diagnostikos procese

Tai apima specifinių geno amplifikuoto regiono savybių tyrimą. Taigi, sergant ligomis, kurias sukelia trinukleotidų pasikartojimų išsiplėtimas, amplifikacijos produktai skiriasi savo ilgiu (atspindi skirtingą tripletų skaičių tiriamoje geno srityje) ir dėl to judėjimo greičiu gelyje. Dėl to pasiekiamas aiškus normalių ir mutantinių alelių elektroforetinis atskyrimas ir tikslus patologiškai pailginto fragmento nustatymas, t.y. ligos DNR diagnozė (13 pav.).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Ryžiai. keturiolika. Ištrynimo diagnozė GAG gene DYT 1 pacientams, sergantiems nuo dopa nepriklausoma distonija (poliakrilamido gelio elektroforezė). Trasos 2,3,6 - serga; juostos 1,4,5 - kontrolė. Plona rodyklė rodo normalų alelį, paryškinta rodyklė rodo trumpesnį mutantinį alelį (trijų nukleotidų ištrynimas).

Jei tiriama DNR sritis yra visiškai įtraukta į išplėstinę deleciją, tada DNR PGR amplifikacija iš šio pašalinto alelio nebus atlikta, nes trūksta vietų pradmenų hibridizacijai. Tokiu atveju homozigotinė delecija bus diagnozuota remiantis visišku reakcijos PGR produkto nebuvimu (DNR sintezė iš abiejų geno kopijų neįmanoma). Esant heterozigotinei delecijai, galima identifikuoti PGR produktą, susintetintą iš normalaus (saugaus) alelio, tačiau norint patikimai diagnozuoti tokią mutaciją, būtina naudoti sudėtingesnius DNR vizualizacijos metodus, leidžiančius įvertinti galutinis PGR produktas.

Norint nustatyti taškines mutacijas (dažniausiai nukleotidų pakaitalus) tam tikrose vietose, PGR metodas naudojamas kartu su kitais molekulinės genetinės analizės metodais. Jei lokalizacijos vieta ir siūlomos taškinės mutacijos pobūdis yra tiksliai žinomi, tada norint tikslingai aptikti tokią mutaciją, restrikcijos endonukleazės (riboja) yra specialūs ląstelių fermentai, išskirti iš įvairių bakterijų padermių.

Šie fermentai atpažįsta specifines nukleotidų sekas, kurių ilgis yra nuo keturių iki dešimties nukleotidų. Tada šių sekų restrikcijos (lot. (pjovimas)) atliekamos kaip dvigrandės DNR molekulės dalis.Kiekvienas restrikcijos fermentas atpažįsta ir fiksuotoje vietoje supjausto griežtai apibrėžtą, specifinę nukleotidų seką - apribojimo vieta (atpažinimo vieta).

Tais atvejais, kai taškinė mutacija pakeičia natūralią konkretaus restrikcijos fermento atpažinimo vietą, tas fermentas negalės suskaldyti mutantinio PGR amplifikuoto fragmento. Kai kuriais atvejais dėl mutacijos atsiranda nauja tam tikro restrikcijos fermento atpažinimo vieta, kurios normoje nėra.

Abiem atvejais mutantiniai ir normalūs PGR produktai, apdoroti pasirinktu restrikcijos fermentu, duos skirtingo ilgio restrikcijos fragmentus, kuriuos galima nesunkiai aptikti elektroforezės būdu (15 pav.).

Taigi, jei reikia greitai aptikti kokią nors konkrečią taškinę mutaciją, užduotis sumažinama iki atitinkamo restrikcijos fermento, kurio atpažinimo vieta yra lokalizuota sutrikusios nukleotidų sekos vietoje, paieška. PGR produktų apdorojimas šiuo restrikcijos fermentu leis lengvai atskirti normalius ir mutantinius alelius. Restrikcijos analizė labai supaprastina žinomų taškinių mutacijų nustatymą ir šiuo metu plačiai naudojama tiesioginei paveldimų ligų DNR diagnostikai.

paskutinis etapas mutacijų molekulinė genetinė analizė yra tiriamo DNR fragmento nukleotidų sekos nustatymas (sekvenavimas), kuris lyginamas su norma ir suformuluojama galutinė genetinė diagnozė. Dėl molekulinės genetikos pažangos DNR diagnostikos metodai dabar sukurti daugiau nei 400 paveldimų ligų.

Ryžiai. penkiolika. Taškinės mutacijos aptikimas naudojant restrikcijos analizę: A – amplifikuojama geno sritis, turinti restrikcijos vietąAGCTdėl restrikcijos endonukleazėsAlu aš. MutacijaG→ Apakeičia šią nukleotidų seką, todėl susidaro restrikcijos fermentasAluiužblokuotas; B - restrikcijos produktų elektroferograma: 1 juosta - homozigotiškumas normaliam aleliui; 2 juosta, homozigotiškumas mutacijai; 3 juosta – heterozigotinė būsena (normalus alelis + mutacija).

Paveldimų ligų diagnostika, pagrįsta tiesioginiu pacientų, jų šeimos narių ar spėjamų heterozigotinių patologinių mutacijų nešiotojų mutantinių alelių ištyrimu, tinka presimptominei ir prenatalinei diagnostikai, kuri gali būti taikoma ankstyviausiose vaisiaus vystymosi stadijose, dar nepasireiškus vaisiaus vystymuisi. bet kokie klinikiniai ar biocheminiai simptomai.ligą.

Nepriklausomai nuo mutacijų aptikimo metodo, tikslią kiekvienos mutacijos molekulinę apibūdinimą galima gauti tik tiesiogiai nustatant seką. Šiam procesui automatizuoti pastaraisiais metais plačiai naudojami specialūs įrenginiai – sekvenatoriai, leidžiantys gerokai paspartinti DNR informacijos nuskaitymo procesą.

Kelias platesniam molekulinių biologinių tyrimų pritaikymui klinikinės diagnostikos laboratorijose atveriamas paspartinus analitinį procesą, visas procedūras atliekant vienu kontinuumu, neperkeliant mėginių, sudarant sąlygas išvengti užteršimo lygiagrečiai tiriant daugybę analičių ir objektyviai registruojant. kiekvieno ciklo rezultatų.

Pagrindinės PGR metodo modifikacijos

Naudojamas greitai nuskaityti ir ieškoti žinomų genų mutacijų.

Multipleksinė (multipramerinė) PGR

Šis metodas pagrįstas kelių tiriamo geno egzonų amplifikavimu vienu metu vienoje reakcijoje. Tai leidžia ekonomiškai greitai patikrinti dažniausiai pasitaikančias mutacijas. Pavyzdžiui, norint greitai diagnozuoti distrofino geno delecijų pernešimą pacientams, sergantiems progresuojančia Duchenne/Becker raumenų distrofija, vienu metu atliekama dažniausiai mutuojančių šio geno egzonų rinkinio amplifikacija. Kadangi šios ligos yra paveldimos su X susietu recesyviniu tipu ir yra susijusios su vienintelės X chromosomos pažeidimu berniukams, ilgesnės delecijos atveju reakcijos produktų elektroforezė parodys, kad nėra vieno ar daugiau DNR fragmentų (egzonų). ), kuris gali būti molekulinis diagnozės patvirtinimas. Be to, PGR amplifikacijai parinkus specifines genų sritis, galima gana tiksliai įvertinti bendrą delecijos ir genų lūžio taškų ilgį (iki egzono).

Kombinuotas kelių daugialypių reakcijų naudojimas leidžia diagnozuoti iki 98 % visų ištrynimų, atsirandančių pacientams, sergantiems progresuojančia Duchenne/Becker raumenų distrofija. Tai yra maždaug 60% visų žinomų distrofino geno mutacijų skaičiaus ir rodo labai didelį šio atrankos metodo veiksmingumą diagnozuojant DNR distrofinopatiją (16 pav.).

Ryžiai. 16. Tiesioginė Diušeno raumenų distrofijos DNR diagnostika naudojant multipleksinę PGR (agarozės gelio elektroforezę). Kiekviename iš tirtų asmenų vienu metu buvo amplifikuoti keturi distrofino geno egzonai (17, 19, 44 ir 45 egzonai; rodyklės rodo atitinkamus amplifikacijos produktus). 1 juosta - kontrolinė, 2-5 juostos - pacientai, sergantys Diušeno raumenų distrofija su įvairiomis distrofino geno delecijomis (2 ir 5 juostos - 45 egzono delecija, 3 juosta - 44 egzono delecija, 4 juosta - 17 ir 19 egzonų delecija ).

Aleliui būdingas amplifikavimas

Metodas pagrįstas dviejų nepriklausomų pradmenų porų naudojimu konkrečiam geno regionui: vienas pradmuo abiejose porose yra bendras, o antrasis kiekvienos poros pradmuo turi skirtingą struktūrą ir papildo normalias arba mutantines DNR sekas. . Dėl tokios reakcijos tirpale vienu metu gali būti susintetinti dviejų tipų PGR produktai – normalūs ir mutantiniai. Be to, naudojamų pradmenų konstrukcija leidžia aiškiai atskirti normalius ir mutantus amplifikacijos produktus pagal jų molekulinį dydį. Šis metodas yra labai aiškus ir leidžia patikrinti tiek homo-, tiek heterozigotinį mutantinio alelio nešimą.

Amplifikuotos DNR modifikavimo vietoje metodas

Metodas pagrįstas vadinamojo neatitikimo pradmens (ne visiškai papildančio šabloną) naudojimu PGR, kuris skiriasi nuo šabloninės DNR sekos vienu nukleotidu. Į mutantinio PGR produkto sudėtį įtraukus nurodytą pradmenį, jame susidaro dirbtinai sukurta vienos iš restrikcijos endonukleazių restrikcijos vieta, kuri leidžia tiesiogiai DNR diagnozuoti tam tikrą žinomą mutaciją naudojant restrikcijos analizę. Sukurti tokią dirbtinę restrikcijos vietą gali prireikti, jei paieška neatskleidė žinomo ir prieinamo fermento, kurio „natūrali“ restrikcijos vieta yra paveikta dėl tiriamos mutacijos atsiradimo DNR molekulėje. .

Atvirkštinės transkriptazės PGR metodas (RT- PGR)

Šis metodas taikomas tais atvejais, kai tyrimo objektu patogiau naudoti ne genominę DNR, o kompaktiškesnę ir informatyvesnę cDNR, gautą tinkamai apdorojus audinių mėginius, pavyzdžiui, biopsijos medžiagą ar limfocitų ląstelių linijas, fibroblastai ir kt. Čia svarbi sąlyga yra norimo geno ekspresija (bent jau minimali) tiriamame audinyje.

Pirmajame etape atliekama atvirkštinė mRNR transkripcija, o gautos cDNR molekulės yra PGR šablonas. Vėliau pakankamu kiekiu amplifikuotai kritinei cDNR sričiai atliekami sekos nustatymo ir kiti mutacijų atrankos metodai, tiesioginis elektroforezinis tyrimas (delecijos, intarpų nustatymas ir kt.) arba integravimas į ekspresijos sistemą, kad būtų gautas baltyminis produktas ir jo tiesioginė analizė. .

Šis metodas ypač efektyvus nustatant mutacijas, vedančias į „sutrumpinto“ baltymo sintezę (nesąmonių mutacijos, sujungimo mutacijos, didelės delecijos) – tai vadinamoji PTT analizė (Protein Truncation Test). PTT analizė dažniausiai naudojama tiriant išplėstinius kelių egzonų genus, tokius kaip Duchenne/Becker raumenų distrofijos, ataksijos-telangiektazijos arba 1 tipo neurofibromatozės genas.

realaus laiko PGR(realiojo laiko PGR)

Kiekvienais metais praktinėje sveikatos priežiūros srityje realaus laiko PGR tampa vis populiaresniu diagnostikos metodu. Pagrindinis jo bruožas yra polimerazės grandininės reakcijos produktų kaupimosi stebėjimas ir kiekybinė analizė bei automatinis rezultatų registravimas ir interpretavimas. Šis metodas nereikalauja elektroforezės pakopos, todėl sumažėja PGR laboratorijos reikalavimai. Sutaupius gamybos plotą, sumažėjus darbuotojų skaičiui ir DNR/RNR kiekybinio įvertinimo poreikiui, šis metodas pastaraisiais metais sėkmingai naudojamas didžiausiuose išsivysčiusių pasaulio šalių sanitarinės epidemijos, diagnostikos ir tyrimų centruose, pakeičiant PGR dabartinį ("klasikinį") formatą.

Realaus laiko PGR naudoja fluorescenciniu būdu pažymėtus oligonukleotidinius zondus, kad aptiktų DNR amplifikacijos metu. Realaus laiko PGR leidžia atlikti visą mėginio analizę per 20-60 minučių ir teoriškai gali aptikti net vieną DNR ar RNR molekulę mėginyje.

Ryžiai. 17. PCR realiu laiku.

Realaus laiko PGR naudoja TaqMan sistemą, kad kontroliuotų PGR kinetiką tiesiogiai amplifikacijos metu, naudojant rezonansinį fluorescencinį gesinimą. Aptikimui naudojamas zondas, turintis fluoroforą ir gesintuvą, papildantį amplifikuoto fragmento vidurinę dalį. Kai fluoroforas ir gesintuvas yra prijungti prie oligonukleotido zondo, pastebima tik nedidelė fluorescencinė emisija. Amplifikacijos proceso metu dėl Taq polimerazės 5'-egzonukleazės aktyvumo fluorescencinė etiketė pereina į tirpalą, išsilaisvindama nuo gesintuvo arti, ir generuoja fluorescencinį signalą, kuris didėja realiu laiku proporcingai kaupimuisi. amplifikuoti (17 pav.).

Pagrindiniai PGR-realiojo laiko pranašumai, palyginti su PGR su gelio elektroforeze:

Visas metodas vyksta viename mėgintuvėlyje;

· Metodas trunka 1 valandą;

Pakanka 1-2 darbo kambarių;

Kartu su kokybiniu rezultato įvertinimu tampa įmanoma jį kiekybiškai įvertinti (pavyzdžiui, skiriant AIDS ar virusinio hepatito antivirusinį gydymą, būtina žinoti viruso kiekį, t. y. viruso kiekį 1 vnt., kuris suteikia realų). -laikinis PGR);

· Dramatiškai sumažina užteršimo riziką.

Išvada

PGR metodas yra vienas iš labiausiai paplitusių molekulinių biologinių tyrimų metodų. Šį metodą gydytojai turėtų naudoti prasmingai, o gydytojas, nusprendęs savo darbe naudoti PGR, turi turėti tam tikrų žinių apie šio metodo ypatybes ir galimybes. Antra, tarp gydytojo ir PGR laboratorijos turi būti glaudus grįžtamasis ryšys, būtinas sudėtingų atvejų analizei ir teisingos diagnostikos strategijos sukūrimui. Trečia, PGR analizė nėra panacėja diagnozuojant (pirmiausia infekcines ligas) ir nepakeičia esamų tyrimo metodų, o tik juos papildo. O svarbiausia – PGR negali pakeisti intuicijos ir analitinio mąstymo, kurį turėtų turėti gydytojas, kuris tikisi sėkmės.

P . S . Molekuliniai-biologiniai tyrimai – diagnostikos ir gydymo atskaitos taškų kaita. Molekulinių biologinių metodų naudojimas yra susijęs su radikalaus laboratorinės diagnostikos akcentų pasikeitimo perspektyva. Galime kalbėti ne tik apie savalaikę informaciją, bet ir apie išankstinį jos gavimą. Jei dabar laboratoriniai tyrimai daugeliu atvejų atliekami jau pažengusiai ligai ir pradėtas gydymas, tai tikimasi, kad iš molekulinės biologinės laboratorinės informacijos bus galima nustatyti žmogaus polinkį į tam tikros rūšies patologijas ir jautrumo tam tikriems vaistams laipsnį, leis pagrįsti prognozuojamą, prevencinį ir personalizuotą ateities medicinos pobūdį.

DIAGNOZĖS IR GYDYMO DĖMESIO KEITIMAS

PAVELDIMOS LIGOS

Šiandien Ateityje

Diagnozė Genetinis pasas

8. Kiek darbo patalpų reikia PGR laboratorijai su fluorescencijos nustatymu (kiekybinė analizė, realaus laiko PGR)?

9. Kas yra aptikimas?

10. Kokie išskiriami DNR diagnostikos metodai?

11. Kuris fermentas veikia PGR pagrindu?

12. Kodėl aptikimo zona turi būti atskirta nuo kitų darbo zonų?

13. Kas yra apribojimų svetainė?

14. Kuo skiriasi tiesioginis DNR diagnostikos metodas nuo netiesioginio?

15. Kas yra sekvenavimas?

16. Kas yra multipleksinė PGR?

17. Kokių tipų mutacijos nustatomos PGR?

18. Kas yra tarša?

19. Kokia yra aleliui specifinio amplifikacijos metodo esmė?

20. PGR medžiagos laikymo sąlygos?

21. Koks įrenginys naudojamas stiprinimui?

22. Koks yra atvirkštinės transkriptazės PGR (RT-PGR) metodas?

23. Kokia medžiaga PGR diagnostikai?

24. Išvardykite užterštumo tipus?

Testai savarankiškam mokymuisi

1. Restrikcijos endonukleazės:

a) fermentai, „sulaužantys“ DNR griežtai tam tikrose vietose;

b) fermentai, kurie susiuva DNR molekulės plyšius;

c) fermentai, kurie suteikia junginių, kurie atlieka DNR taisymą.

2. Genų amplifikacija:

3. Kuris iš molekulinės genetikos metodų naudojamas diagnozuojant ligas, kurias sukelia žinomos sekos mutantinis genas?

a) konkretaus apribojimo naudojimas;

b) tiesioginis aptikimas naudojant specifinius molekulinius zondus;

c) normalaus restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmo pasiskirstymo šeimos analizė.

4. DNR sekos nustatymas:

a) DNR bazinės sekos identifikavimas;

b) pakartotinis bet kurio DNR segmento pasikartojimas;

c) DNR fragmento, kuriame yra tiriamas genas, išskyrimas.

5. DNR mėginius galima gauti naudojant :

b) choriono gaureliai;

c) vaisiaus vandenys;

d) vaisiaus vandenų ląstelės;

e) odos, raumenų, kepenų biopsijos,

e) viskas teisinga, išskyrus "c" punktą,

g) viskas teisinga, išskyrus "d" punktą,

h) Visa tai, kas išdėstyta pirmiau, yra teisinga.

6. Kokios mutacijos diagnozuojamos PGR?

a) genominis;

b) chromosomų;

c) genas (taškas).

7. Gruntas yra:

a) papildoma DNR dalis;

b) sintetinį oligonukleotidą, pažymėtą (radioaktyviai arba fluorescenciškai) seką, komplementarią mutantui arba normaliam genui;

c) oligonukleotidas, veikiantis kaip "sėkla" ir inicijuojantis polinukleotidinės grandinės sintezę DNR arba RNR šablone.

8. Kas sukūrė PGR metodo principą?

b) K. Mullis

9. Ar PGR metodas naudojamas trinukleotidų pasikartojimų (dinaminio tipo mutacijų) išsiplėtimui diagnozuoti?

10. Kokiose srityse naudojamas PGR?

a) klinikinė medicina;

b) transgeninių organizmų (GMO) apibrėžimas

c) asmens identifikavimas, tėvystės nustatymas, kriminalistika

d) visa tai, kas išdėstyta pirmiau

d) nė vienas iš aukščiau išvardytų dalykų.

Atsakymų pavyzdžiai: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - in; 7 - į; 8 - b; 9 – a, 10 – d.

Pagrindinis

1. Bočkovo genetika. Maskva. GEOTAR, 2002 m.

Papildomas

1., Bakharevas ir įgimtų bei paveldimų vaikų ligų gydymas. - Maskva, 2004 m.

2. DNR diagnostika ir medicininis genetinis konsultavimas. - Maskva, 2004 m.

3. Ginter genetika. - Maskva, 2003 m.

4. Gorbunov medicinos genetikos pagrindai. – Sankt Peterburgas: Intermedica, 1999 m.

5. J. McGee. Molekulinė klinikinė diagnostika. – Pasaulis, 1999 m.

6. Menšikovas - biologiniai tyrimai klinikinėje laboratorinėje diagnostikoje: problemos galimybės (paskaitos). Klinikinė laboratorinė diagnostika, 2006 Nr.3.

7. Kornienko apie PGR laboratorijos darbą atliekant tiesioginę biologinės medžiagos analizę. Klinikinė laboratorinė diagnostika, 2006 Nr.10.

8. PGR laboratorijos darbo organizavimas. Metodinės instrukcijos. MU 1.3.1794-03. Rusijos Federacijos vyriausiasis sanitaras, 2003 m.

9. Erlicho H. A. PGR technologija. – Percin-Elmer Cetus, 1993 m.

10. Heid C. A., Stevens J. Realaus laiko kiekybinė PGR. Genome Res. - 1996 Nr.6.

PAGRINDINIAI METODO PRINCIPAI

POLIMERAZĖS GRANDINĖ REAKCIJA

Bendrosios medicinos (060101) ir pediatrijos (060103) specialybių 3-4 kursų studentų popamokinio darbo metodinis vadovas.

SEI HPE "Federalinės sveikatos ir socialinės plėtros agentūros Krasnojarsko valstybinė medicinos akademija"

Rusija, Krasnojarskas,

Federalinė švietimo agentūra

Valstybinė švietimo įstaiga

Aukštasis profesinis išsilavinimas

„Karelijos valstybinė pedagoginė akademija“

Kursinis darbas šia tema:

Polimerazės grandininė reakcija (PGR) ir jos taikymas

Baigė: studentė Koryagina Valeria Aleksandrovna

Patikrino: Karpikova Natalija Michailovna

Petrozavodskas 2013 m

Įvadas

1 skyrius Literatūros apžvalga

1.5.4 Plokštumos efektas

1.5.6 Stiprinimas

Išvada

Įvadas

Pastarieji dvidešimt metų buvo pažymėti plačiai paplitusiu molekulinių genetinių metodų diegimu biologijos, medicinos ir žemės ūkio moksluose.

Aštuntojo dešimtmečio pradžioje atrodė, kad molekulinė biologija pasiekė tam tikrą tobulumo laipsnį. Šiuo laikotarpiu mikroorganizmai buvo pagrindinis molekulinių genetinių tyrimų objektas. Perėjimas prie eukariotų tyrėjams iškėlė visiškai naujas problemas, kurių nepavyko išspręsti taikant tuo metu egzistavusius genetinės analizės metodus. Proveržis molekulinės genetikos raidoje tapo įmanomas atsiradus naujai eksperimentinei priemonei – restrikcijos endonukleazėms. Vėlesniais metais ėmė sparčiai daugėti tiesioginių DNR analizės metodų, pagrįstų kokybiškai skirtingais metodais.

Daugeliu atvejų šiuolaikinės technologijos leido pradėti giliau tirti įvairių organizmų branduolinio ir ekstrabranduolinio genomo smulkią struktūrinę ir funkcinę organizaciją. Tai buvo ypač svarbu kuriant naujus įvairių ligų diagnostikos ir gydymo metodus. Ne mažiau svarbi buvo galimybė panaudoti molekulinės genetikos pasiekimus populiacijų biologijoje ir selekcijoje populiacijų, veislių ir padermių genetiniam kintamumui nustatyti ir analizuoti, ekonomiškai vertingiems individams identifikuoti ir sertifikuoti, genetiškai modifikuotiems organizmams kurti, kitiems klausimams spręsti.

Kiekvienas metodas turi savo privalumų ir trūkumų. Nėra universalaus metodo, kuris galėtų išspręsti visas kylančias problemas. Todėl konkretaus metodo pasirinkimas vykdomam tyrimui yra vienas iš svarbiausių bet kokio mokslinio darbo etapų.

1 skyrius Literatūros apžvalga

1.1 Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) atradimo istorija

1983 metais K.B. Mullis ir kt. paskelbė ir užpatentavo polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodą, kuriam buvo lemta turėti didelę įtaką visoms nukleorūgščių tyrimų ir taikymo sritims. Šio metodo reikšmė molekulinei biologijai ir genetikai pasirodė tokia didelė ir akivaizdi, kad po septynerių metų autorius buvo apdovanotas Nobelio chemijos premija.

Metodo naudojimo pradžioje po kiekvieno šildymo-aušinimo ciklo į reakcijos mišinį reikėjo dėti DNR polimerazę, nes ji buvo inaktyvuota aukštoje temperatūroje, reikalinga atskirti DNR spiralės grandines. Reakcijos procedūra buvo palyginti neefektyvi, reikalaujanti daug laiko ir fermentų. 1986 metais buvo žymiai patobulintas polimerazės grandininės reakcijos metodas. Buvo pasiūlyta naudoti termofilinių bakterijų DNR polimerazes. Šie fermentai pasirodė esantys termostabilūs ir gali atlaikyti daugybę reakcijos ciklų. Jų naudojimas leido supaprastinti ir automatizuoti PGR. Viena pirmųjų termostabilių DNR polimerazių buvo išskirta iš bakterijų Thermus aquaticusir pavadintas Taq- polimerazė.

Galimybė amplifikuoti bet kurį DNR segmentą, kurio nukleotidų seka yra žinoma, ir gauti jį po PGR homogenine forma ir preparatiniu kiekiu, daro PGR alternatyviu trumpų DNR fragmentų molekulinio klonavimo metodu. Šiuo atveju nereikia taikyti sudėtingų metodinių metodų, kurie naudojami genų inžinerijoje įprastinio klonavimo metu. PGR metodo sukūrimas labai išplėtė molekulinės genetikos, o ypač genų inžinerijos metodologines galimybes, tiek, kad radikaliai pakeitė ir sustiprino daugelio savo sričių mokslinį potencialą.

1.2 Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) rūšys

· Įdėtas PGR- naudojamas šalutinių reakcijos produktų skaičiui sumažinti. Naudokite dvi poras pradmenų ir atlikite dvi reakcijas iš eilės. Antroji pradmenų pora amplifikuoja DNR sritį pirmosios reakcijos produkte.

· Apverstas PGR- naudojamas, kai žinomas tik nedidelis norimos sekos plotas. Šis metodas ypač naudingas, kai reikia nustatyti gretimas sekas po DNR įterpimo į genomą. Norint įgyvendinti apverstą PGR, atliekama DNR pjūvių serija - naudojant restrikcijos fermentus<#"justify">polimerazės grandininės reakcijos pradmenys

· Konkrečios grupės PGR- PGR artimiesiems<#"center">1.3 Polimerazės grandininė reakcija

Devintojo dešimtmečio viduryje atrasta polimerazės grandininė reakcija (PGR) per kelias valandas gali milijonus kartų padidinti originalaus mėginio kopijų skaičių. Per kiekvieną reakcijos ciklą iš pradinės molekulės susidaro dvi kopijos. Kiekviena susintetinta DNR kopija gali būti kaip šablonas naujų DNR kopijų sintezei kitame cikle. Taigi pakartotinis ciklų kartojimas lemia eksponentiškai didėjantį kopijų skaičių. Iš skaičiavimų matyti, kad net jei yra 30 ciklų, originalios molekulės kopijų skaičius bus didesnis nei 1 mlrd. Net jei atsižvelgsime į tai, kad ne visi amplikonai yra dubliuojami per kiekvieną ciklą, bendras kopijų skaičius, nepaisant to, yra gana didelis skaičius.

Kiekvienas polimerazės grandininės reakcijos (PGR) ciklas susideda iš šių etapų:

· Denatūracija – temperatūrai padidėjus, dvigrandė DNR molekulė išsivynioja ir suskaidoma į dvi viengrandes;

· Atkaitinimas – temperatūros sumažinimas leidžia pradmenims prisijungti prie komplementarių DNR molekulės sričių;

· Pailgėjimas – fermentas DNR polimerazė užbaigia komplementarią grandinę.

Pasirinktam fragmentui amplifikuoti naudojami du oligonukleotidiniai pradmenys (sėklos), besiribojantys su tam tikra DNR sritimi. Į gruntus orientuotas 3 - baigiasi vienas kito link ir seka, kurią reikia sustiprinti, kryptimi. DNR polimerazė atlieka vienas kitą papildančių DNR grandinių sintezę (užbaigimą), pradedant pradmenimis. DNR sintezės metu pradmenys fiziškai įterpiami į naujai susintetintų DNR molekulių grandinę. Kiekviena DNR molekulės grandinė, suformuota naudojant vieną iš pradmenų, gali būti kaip šablonas papildomos DNR grandinės sintezei naudojant kitą pradmenį.

1.4 Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) vykdymas

Polimerazės grandininė reakcija atliekama specialiuose plonasieniuose polipropileno mėgintuvėliuose, kurių dydis suderinamas su naudojamu terminiu cikleriu (stiprintuvu) - prietaisu, kuris kontroliuoja polimerazės grandininės reakcijos (PGR) etapų temperatūrą ir laiko charakteristikas. .

1.5 Polimerazės grandininės reakcijos metodo principas

Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra in vitro DNR amplifikacijos metodas, leidžiantis išskirti ir padauginti specifinę DNR seką milijardus kartų per kelias valandas. Galimybė gauti daugybę vieno griežtai apibrėžto genomo regiono kopijų labai supaprastina esamo DNR mėginio tyrimą.

Norint atlikti polimerazės grandininę reakciją, turi būti įvykdytos kelios sąlygos:

1.5.1 Kai kurių komponentų buvimas reakcijos mišinyje

Pagrindiniai reakcijos (PGR) mišinio komponentai yra: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, nukleotidų trifosfatų mišinys (ATP, GTP, CTP, TTP), pradmenys (oligonukleotidai), analizuotas DNR preparatas, termostabili DNR polimerazė. Kiekvienas reakcijos mišinio komponentas tiesiogiai dalyvauja polimerazės grandininėje reakcijoje (PGR), o reagentų koncentracija tiesiogiai veikia amplifikacijos eigą.

· Tris-HCl – nustato reakcijos mišinio pH, sukuria buferinę talpą. DNR polimerazės aktyvumas priklauso nuo terpės pH, todėl pH reikšmė tiesiogiai veikia polimerazės grandininės reakcijos eigą. Paprastai pH vertė yra 8–9,5 intervale. Aukštas pH yra dėl to, kad kylant temperatūrai Tril-HCl buferio pH krenta.

· KCl - kalio chlorido koncentracija iki 50 mM turi įtakos denatūravimo ir atkaitinimo procesų eigai, koncentracija virš 50 mM slopina DNR polimerazę.

· MgCl 2- nes DNR polimerazė yra Mg 2+- priklausomas fermentas, tada magnio jonų koncentracija veikia fermento aktyvumą (Mg 2+sudaro kompleksus su NTP – būtent šie kompleksai yra polimerazės substratas). Didelė koncentracija padidina nespecifinę amplifikaciją, o maža - reakcijos slopinimą, optimalus (įvairioms polimerazėms) yra 0,5 - 5 mM. Be to, magnio druskų koncentracija turi įtakos denatūravimo ir atkaitinimo procesų eigai – padidėja Mg koncentracija. 2+sukelia DNR lydymosi temperatūros padidėjimą (t. y. temperatūrą, kuriai esant 50 % dvigrandžių DNR grandinių suskaidoma į viengrandes).

· NTP – nukleotidų trifosfatai yra tiesioginiai nukleorūgščių monomerai. Norint išvengti grandinės nutraukimo, rekomenduojamas vienodas visų keturių nukleotidų trifosfatų santykis. Maža šių komponentų koncentracija reakcijos mišinyje padidina komplementarios DNR grandinės konstravimo klaidų tikimybę.

· Gruntai – optimaliausias yra gruntų, kurių lydymosi temperatūros skirtumas ne didesnis kaip 2–4, naudojimas. o C. Kartais ilgai laikant 4 laipsnių temperatūroje o Su arba po daugelio užšaldymo – atšildymo pradmenys sudaro antrines struktūras – dimerus, mažinančius PGR efektyvumą. Šios problemos pašalinimas sumažinamas iki inkubavimo vandens vonioje (T = 95 o C) 3 minutes ir po to greitai atvėsinama iki 0° NUO.

· DNR preparatai – DNR preparato (matricos) kiekis ir kokybė tiesiogiai veikia polimerazės grandininės reakcijos eigą ir parametrus. DNR mėginio perteklius slopina polimerazės grandininę reakciją (PGR). Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) efektyvumą gali sumažinti ir DNR preparate esančių įvairių medžiagų priemaišos: natrio acetatas, natrio chloridas, izopropanolis, etanolis, heparinas, fenolis, karbamidas, hemoglobinas ir kt.

· DNR polimerazė – naudojant nedidelį DNR polimerazės kiekį, stebimas galutinio produkto sintezės sumažėjimas, tiesiogiai proporcingas fragmentų dydžiui. Polimerazės perteklius 2–4 kartus lemia difuzinių spektrų atsiradimą, o 4–16 kartų – mažos molekulinės masės nespecifinius spektrus. Naudojamų koncentracijų diapazonas yra 0,5–1,5 aktyvumo vienetų 25 µl PGR mišinio.

Be pagrindinių PGR mišinio komponentų, naudojama nemažai papildomų medžiagų, gerinančių kokybinius ir kiekybinius PGR rodiklius: acetamidas (5%) – pagrindinių komponentų tirpumo padidėjimas; betainas (natrio druska) - DNR polimerazės stabilizavimas, DNR lydymosi temperatūros mažinimas, lydymosi temperatūros išlyginimas; galvijų albuminas (10-100 μg / ml) - DNR polimerazės stabilizavimas; dimetilsulfoksidas (1-10%) - didinant pagrindinių komponentų tirpumą; formamidas (2-10%) - atkaitinimo specifiškumo padidėjimas; glicerolis (15-20%) - fermento terminio stabilumo padidėjimas, DNR mėginio denatūravimo temperatūros sumažėjimas; amonio sulfatas – sumažina denatūravimo ir atkaitinimo temperatūrą.

1.5.2 Ciklas ir temperatūra

Bendras polimerazės grandininės reakcijos (PGR) programos vaizdas yra toks:

etapas. Užsitęsusi pirminė DNR preparato denatūracija.1 ciklas

etapas. Greitas DNR preparato denatūravimas. Grunto atkaitinimas. Pailgėjimas.30 - 45 ciklai.

etapas. Ilgalaikis pailgėjimas. Reakcijos mišinio aušinimas 1 ciklas.

Kiekvienas stadijos elementas – denatūravimas, atkaitinimas, pailgėjimas – turi individualias temperatūros ir laiko charakteristikas. Kiekvieno elemento temperatūros ir tekėjimo laiko parametrai parenkami empiriškai, atsižvelgiant į stiprinimo produktų kokybinius ir kiekybinius rodiklius.

Denatūravimas. Šio polimerazės grandininės reakcijos elemento metu dvigrandė DNR molekulė suskaidoma į dvi viengrandes. Denatūravimo temperatūros parametrai yra 90–95 laipsnių diapazone o C, bet jei DNR mėginyje yra daug guanino ir citozino, temperatūrą reikia padidinti iki 98 o C. Denatūravimo temperatūra turi būti pakankama visiškai denatūruoti – suskaldyti DNR grandines ir išvengti „staigaus atšalimo“ ar greito atkaitinimo, tačiau termostabili DNR polimerazė yra mažiau stabili aukštoje temperatūroje. Taigi optimalių denatūravimo temperatūros parametrų parinkimas pradmenų ir mėginio santykiui (DNR paruošimui) yra svarbi amplifikacijos sąlyga. Jei denatūravimo temperatūra pirmajame etape viršija 95 o C, rekomenduojama į reakcijos mišinį po pirminės denatūracijos pridėti DNR polimerazės. Šio etapo elemento trukmė polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metu turėtų būti pakankama visiškam DNR denatūravimui, tačiau tuo pačiu metu neturėtų reikšmingai paveikti DNR polimerazės aktyvumo tam tikroje temperatūroje.

Atkaitinimas. Atkaitinimo temperatūra (T a ) yra vienas iš svarbiausių polimerazės grandininės reakcijos parametrų. Atkaitinimo temperatūra kiekvienam konkrečiam gruntui parenkama atskirai. Tai priklauso nuo pradmens ilgio ir nukleotidų sudėties. Paprastai jis yra mažesnis 2–4 o Nuo lydymosi temperatūros vertės (T m ) gruntas. Jei sistemos atkaitinimo temperatūra yra žemesnė už optimalią, tada nespecifinių amplifikuotų fragmentų skaičius didėja ir, atvirkščiai, aukštesnė temperatūra sumažina amplifikuotų produktų skaičių. Tokiu atveju specifinių amplikonų koncentracija gali smarkiai sumažėti iki polimerazės grandininės reakcijos (PGR) slopinimo. Padidėjus atkaitinimo laikui, taip pat padidėja nespecifinių amplikonų skaičius.

Pailgėjimas. Paprastai kiekvienas termostabilios DNR polimerazės tipas turi individualų aktyvumo temperatūros optimalumą. Fermento komplementarios DNR grandinės sintezės greitis taip pat yra kiekvienai polimerazei būdinga reikšmė (vidutiniškai 30–60 nukleotidų per sekundę arba 1–2 tūkst. bazių per minutę), todėl pailgėjimo laikas parenkamas priklausomai nuo. apie DNR polimerazės tipą ir amplifikuotos srities ilgį.

1.5.3 Pagrindiniai grunto parinkimo principai

Kuriant PGR testavimo sistemą, viena iš pagrindinių užduočių yra teisingas pradmenų pasirinkimas, kuris turi atitikti keletą kriterijų:

Gruntai turi būti konkretūs. Ypatingas dėmesys skiriamas 3 - pradmenų galai, nes būtent nuo jų Taq polimerazė pradeda užbaigti papildomą DNR grandinę. Jei jų specifiškumas yra nepakankamas, tikėtina, kad mėgintuvėlyje su reakcijos mišiniu įvyks nepageidaujami procesai, būtent nespecifinės DNR (trumpų ar ilgų fragmentų) sintezė. Jis matomas elektroforezės metu sunkių arba lengvų papildomų juostų pavidalu. Tai apsunkina reakcijos rezultatų įvertinimą, nes konkretų amplifikacijos produktą lengva supainioti su susintetinta svetima DNR. Dalis pradmenų ir dNTP sunaudojama nespecifinės DNR sintezei, todėl labai prarandamas jautrumas.

Gruntai neturi formuoti dimerų ir kilpų, t.y. nereikėtų formuoti stabilių dvigubų sruogų, atkaitinant gruntus prie savęs ar vienas su kitu.

1.5.4 Plokštumos efektas

Reikėtų pažymėti, kad specifinių stiprinimo produktų kaupimosi procesas eksponentiškai trunka tik ribotą laiką, o tada jo efektyvumas kritiškai krenta. Taip yra dėl vadinamojo „plato“ efekto.

termino efektas plokščiakalnis naudojamas apibūdinti PGR produktų kaupimosi procesą paskutiniuose amplifikacijos ciklus.

Priklausomai nuo sąlygų ir amplifikacijos reakcijos ciklų skaičiaus, tuo metu, kai pasiekiamas efektas plokščiakalnis substratų (dNTP ir pradmenų) panaudojimas, reagentų (dNTP ir fermentų) stabilumas, inhibitorių skaičius, įskaitant pirofosfatus ir DNR dupleksus, konkurencija dėl reagentų su nespecifiniais produktais arba pradmenimis-dimerais, konkretaus produkto koncentracija , ir nepilna denatūracija esant didelėms amplifikacijos produktų koncentracijoms.

Kuo mažesnė pradinė tikslinės DNR koncentracija, tuo didesnė reakcijos rizika plokščiakalnis". Šis taškas gali atsirasti anksčiau nei pakanka konkrečių amplifikacijos produktų skaičiaus analizei. Tik gerai optimizuotos bandymų sistemos gali to išvengti.

1.5.5 Biologinės medžiagos mėginių paruošimas

Priklausomai nuo užduočių, DNR išskyrimui naudojami skirtingi metodai. Jų esmė – DNR išskyrimas (ekstrahavimas) iš biologinio produkto ir pašalinių priemaišų pašalinimas arba neutralizavimas, siekiant gauti PGR tinkamo grynumo DNR preparatą.

Marmur aprašytas gryno DNR preparato gavimo būdas laikomas standartiniu ir jau tapo klasikiniu. Tai apima fermentinę proteolizę, po kurios seka deproteinizacija ir DNR nusodinimas alkoholiu. Šis metodas leidžia gauti gryną DNR preparatą. Tačiau tai yra gana sudėtinga ir apima darbą su tokiomis agresyviomis ir aštriomis medžiagomis kaip fenolis ir chloroformas.

Vienas iš šiuo metu populiarių metodų yra DNR ekstrahavimo metodas, kurį pasiūlė Boom ir kt. Šis metodas pagrįstas stiprios chaotropinės medžiagos, guanidino tiocianato (GuSCN) naudojimu ląstelių lizei ir vėlesnei DNR sorbcijai ant nešiklio (stiklo karoliukų, diatomito, stiklo pieno ir kt.). Po plovimo DNR lieka mėginyje, adsorbuotame ant nešiklio, iš kurio ją galima lengvai pašalinti naudojant eliuavimo buferį. Metodas patogus, technologiškai pažangus ir tinkamas mėginių paruošimui amplifikacijai. Tačiau DNR nuostoliai galimi dėl negrįžtamos sorbcijos ant nešiklio, taip pat daugelio plovimų metu. Tai ypač svarbu dirbant su nedideliu DNR kiekiu mėginyje. Be to, net nedideli GuSCN kiekiai gali slopinti PGR. Todėl naudojant šį metodą labai svarbu teisingai pasirinkti sorbentą ir atidžiai laikytis technologinių niuansų.

Kita mėginių paruošimo metodų grupė yra paremta Chilex tipo jonų mainų naudojimu, kurie, skirtingai nei stiklas, sorbuoja ne DNR, o atvirkščiai – reakcijai trukdančias priemaišas. Paprastai šią technologiją sudaro du etapai: mėginio virinimas ir priemaišų adsorbcija ant jonų keitiklio. Metodas itin patrauklus dėl jo vykdymo paprastumo. Daugeliu atvejų jis tinkamas darbui su klinikine medžiaga. Deja, kartais yra mėginių su priemaišomis, kurių negalima pašalinti naudojant jonų mainus. Be to, kai kurių mikroorganizmų negalima sunaikinti paprastu virimu. Tokiais atvejais būtina įvesti papildomus mėginių apdorojimo etapus.

Taigi mėginio paruošimo metodo pasirinkimas turėtų būti vertinamas atsižvelgiant į numatomų tyrimų tikslus.

1.5.6 Stiprinimas

Norint atlikti amplifikacijos reakciją, reikia paruošti reakcijos mišinį ir į jį įpilti analizuotą DNR mėginį. Šiuo atveju svarbu atsižvelgti į kai kurias grunto atkaitinimo ypatybes. Faktas yra tas, kad analizuojamame biologiniame mėginyje paprastai yra įvairių DNR molekulių, su kuriomis reakcijoje naudojami pradmenys turi dalinę, o kai kuriais atvejais reikšmingą homologiją. Be to, pradmenys gali susijungti vienas su kitu, kad susidarytų pradmenys-dimeriai. Abu jie sukelia daug pradmenų, skirtų šalutinių (nespecifinių) reakcijos produktų sintezei, ir dėl to žymiai sumažina sistemos jautrumą. Dėl to elektroforezės metu sunku arba neįmanoma nuskaityti reakcijos rezultatų.

1.6 Standartinio PGR reakcijos mišinio sudėtis

x PGR buferis (100 mM Tris-HCl tirpalas, pH 9,0, 500 mM KCl tirpalas, 25 mM MgCl2 tirpalas ) …….2,5 µl

Vanduo (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Nukleotidų trifosfatų (dNTP) mišinys

mM kiekvieno………………………………………….……….0,5 µl

Gruntas 1 (10 mM tirpalas) …………………………………………….….1 µl

Gruntas 2 (10 mM tirpalas) …………………………………………….….1 µl

DNR polimerazė (5 vienetai / µl) ……………………………………………… 0,2 µl

DNR mėginys (20 ng/µl) ……………………………………………..1 µl

1.7 Reakcijos rezultatų įvertinimas

Norint teisingai įvertinti PGR rezultatus, svarbu suprasti, kad šis metodas nėra kiekybinis. Teoriškai pavienių tikslinių DNR molekulių amplifikacijos produktus elektroforezės būdu galima aptikti jau po 30–35 ciklų. Tačiau praktikoje tai daroma tik tais atvejais, kai reakcija vyksta idealioms artimomis sąlygomis, su kuo nedažnai susiduriama gyvenime. Ypač didelę įtaką amplifikacijos efektyvumui turi DNR preparato grynumo laipsnis; tam tikrų inhibitorių buvimas reakcijos mišinyje, kurių kai kuriais atvejais gali būti labai sunku atsikratyti. Kartais dėl jų buvimo neįmanoma amplifikuoti net dešimčių tūkstančių tikslinių DNR molekulių. Taigi dažnai nėra tiesioginio ryšio tarp pradinio tikslinės DNR kiekio ir galutinio amplifikacijos produktų kiekio.

2 skyrius: Polimerazės grandininės reakcijos taikymas

PGR naudojamas daugelyje sričių analizei ir moksliniams eksperimentams.

Kriminalistika

PGR naudojama vadinamiesiems „genetiniams pirštų atspaudams“ palyginti. Mums reikia genetinės medžiagos mėginio iš nusikaltimo vietos – kraujo, seilių, spermos, plaukų ir kt. Jis lyginamas su įtariamojo genetine medžiaga. Užtenka labai mažo DNR kiekio, teoriškai – vienos kopijos. DNR supjaustoma į fragmentus, tada amplifikuojama PGR. Fragmentai atskiriami DNR elektroforezės būdu. Gautas DNR juostų vietos vaizdas vadinamas genetiniu pirštų atspaudu.

Tėvystės nustatymas

DNR fragmentų, amplifikuotų PGR, elektroforezės rezultatai. tėvas. Vaikas. Motina. Vaikas paveldėjo kai kurias abiejų tėvų genetinio atspaudo ypatybes, kurios suteikė naują, unikalų įspaudą.

Nors „genetiniai pirštų atspaudai“ yra unikalūs, šeimos ryšius vis tiek galima užmegzti padarius kelis tokius pirštų atspaudus. Tas pats metodas su nedideliais pakeitimais gali būti taikomas evoliuciniams ryšiams tarp organizmų nustatyti.

Medicininė diagnostika

PGR leidžia žymiai pagreitinti ir palengvinti paveldimų ir virusinių ligų diagnostiką. Dominantis genas amplifikuojamas PGR, naudojant tinkamus pradmenis, o tada sekvenuojamas, kad būtų nustatytos mutacijos. Virusinės infekcijos gali būti aptiktos iškart po užsikrėtimo, likus savaitėms ar mėnesiams iki ligos simptomų atsiradimo.

Individualizuota medicina

Kartais vaistai kai kuriems pacientams yra toksiški arba sukelia alergiją. To priežastys iš dalies yra individualūs vaistų ir jų darinių jautrumo ir metabolizmo skirtumai. Šie skirtumai nustatomi genetiniame lygmenyje. Pavyzdžiui, vienam ligoniui tam tikras citochromas gali būti aktyvesnis, kitam – mažiau. Norint nustatyti, kokio tipo citochromą turi konkretus pacientas, prieš vartojant vaistą, siūloma atlikti PGR analizę. Ši analizė vadinama preliminariu genotipo nustatymu.

Genų klonavimas

Genų klonavimas – tai genų išskyrimo ir dėl genų inžinerijos manipuliacijų didelio kiekio tam tikro geno produkto gavimo procesas. PGR naudojamas amplifikuoti geną, kuris vėliau įterpiamas į vektorių, DNR gabalėlį, pernešantį svetimą geną į tą patį organizmą arba į kitą organizmą, kurį lengva auginti. Kaip vektoriai, pavyzdžiui, naudojamos plazmidės arba virusinė DNR. Genų įterpimas į svetimą organizmą dažniausiai naudojamas šio geno produktui – RNR arba dažniausiai baltymui gauti. Taigi daugelis baltymų gaunami pramoniniais kiekiais, skirti naudoti žemės ūkyje, medicinoje ir kt.

DNR sekos nustatymas

PGR yra neatskiriama sekos nustatymo metodo, naudojant dideoksinukleotidus, paženklintus fluorescencine žyma arba radioaktyviuoju izotopu, dalis, nes būtent polimerizacijos metu į DNR grandinę įterpiami fluorescencine arba radioaktyvia žyme pažymėti nukleotidų dariniai. Tai sustabdo reakciją, leidžiančią nustatyti konkrečių nukleotidų padėtis po sintezuotų sruogų atskyrimo gelyje.

Mutagenezė

Šiuo metu PGR tapo pagrindiniu mutagenezės metodu. PGR naudojimas leido supaprastinti ir pagreitinti mutagenezės procedūrą, taip pat padaryti ją patikimesnę ir atkuriamą.

PGR metodas leido išanalizuoti žmogaus papilomos viruso sekų buvimą žmogaus gimdos kaklelio navikų biopsijos skyriuose, įterptuose į parafiną likus 40 metų iki šio tyrimo. Be to, PGR pagalba buvo galima amplifikuoti ir klonuoti mitochondrijų DNR fragmentus iš 7 tūkstančių metų amžiaus žmogaus smegenų fosilinių liekanų!

Galimybė vienu metu analizuoti du lokusus, esančius skirtingose ​​nehomologinėse chromosomose, buvo įrodyta atskirų žmogaus spermatozoidų lizatuose. Šis metodas suteikia unikalią galimybę atlikti smulkią genetinę analizę ir tirti chromosomų rekombinaciją, DNR polimorfizmą ir kt. Atskirų spermatozoidų analizės metodas iškart buvo pritaikytas teismo medicinoje, nes haploidinių ląstelių HLA tipo nustatymas leidžia nustatyti tėvystę arba identifikuoti. nusikaltėlis (HLA kompleksas yra žmogaus pagrindinio histokompatibilumo komplekso genų rinkinys; HLA komplekso lokusai yra polimorfiškiausi iš visų žinomų aukštesniųjų stuburinių gyvūnų: rūšies viduje, kiekviename lokuse, yra neįprastai daug skirtingi aleliai – alternatyvios to paties geno formos).

Naudojant PGR, galima atskleisti svetimų genetinių struktūrų integracijos teisingumą iš anksto nustatytame tiriamų ląstelių genomo regione. Visa ląstelinė DNR yra sujungta su dviem oligonukleotidiniais pradmenimis, iš kurių vienas yra komplementarus šeimininko DNR vietai netoli įterpimo taško, o kitas - integruoto fragmento seka antilygiagrečioje DNR grandinėje. Polimerazės grandininė reakcija nepakitusios chromosomų DNR struktūros siūlomoje įterpimo vietoje sąlygoja neapibrėžto dydžio viengrandžių DNR fragmentų susidarymą, o planuojamo įterpimo atveju – žinomos dvigrandės DNR fragmentų susidarymą. dydis, nustatomas pagal atstumą tarp dviejų pradmenų atkaitinimo vietų. Be to, analizuojamo genomo regiono amplifikacijos laipsnis pirmuoju atveju priklausys tiesiškai nuo ciklų skaičiaus, o antruoju - eksponentiškai. Eksponentinis iš anksto nustatyto dydžio amplifikuoto fragmento kaupimasis PGR metu leidžia vizualiai jį stebėti po DNR preparato elektroforetinio frakcionavimo ir padaryti nedviprasmišką išvadą apie svetimos sekos įterpimą į tam tikrą chromosomų DNR sritį.

Išvada

Šiuo metu PGR metodas yra plačiausiai naudojamas kaip įvairių infekcinių ligų diagnostikos metodas. PGR leidžia nustatyti infekcijos etiologiją, net jei analizei paimtame mėginyje yra tik kelios patogeno DNR molekulės. PGR plačiai taikoma ankstyvai ŽIV infekcijų, virusinio hepatito ir kt. Iki šiol beveik nėra infekcinių ligų sukėlėjų, kurių nebūtų galima aptikti naudojant PGR.

Naudotos literatūros sąrašas

1.Padutov V.E., Baranovas O.Yu., Voropaev E.V. Molekulinės – genetinės analizės metodai. - Minskas: Unipolas, 2007. - 176 p.

2.PGR „realiu laiku“ / Rebrikovas D.V., Samatovas G.A., Trofimovas D.Yu. ir kt.; red. b. n. D.V. Rebrikovas; pratarmė L.A. Ostermanas ir akad. RAS ir RAAS E.D. Sverdlovas; 2 leidimas, red. ir papildomas - M.: BINOM. Žinių laboratorija, 2009. - 223 p.

.Patruševas L.I. Dirbtinės genetinės sistemos. - M.: Nauka, 2005. - Po 2 tonas

.B. Glick, J. Pasternak Molekulinė biotechnologija. Principai ir taikymas 589 psl., 2002 m

5.Shchelkunovas S.N. genetinė inžinerija. - Novosibirskas: Sib. univ. leidykla, 2004. - 496 p.

Redagavo A.A. Vorbjeva „Polimerazės grandininė reakcija ir jos taikymas diagnostikai dermatovenerologijoje“; Medicinos naujienų agentūra – 72 puslapiai

http://ru. wikipedia.org

http://mokslininkas. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - medicinos žurnalas

Mokymas

Reikia pagalbos mokantis temos?

Mūsų ekspertai patars arba teiks kuravimo paslaugas jus dominančiomis temomis.
Pateikite paraišką nurodydami temą dabar, kad sužinotumėte apie galimybę gauti konsultaciją.

Tačiau tuo metu ši idėja liko nepriimta. Polimerazės grandininę reakciją 1983 metais iš naujo atrado Kary Mullis. Jo tikslas buvo sukurti metodą, kuris leistų amplifikuoti DNR daug kartų iš eilės dubliuojant pradinę DNR molekulę naudojant DNR polimerazės fermentą. Praėjus 7 metams nuo šios idėjos paskelbimo, 1993 m., Mullis už tai gavo Nobelio premiją.

Metodo naudojimo pradžioje, po kiekvieno šildymo-aušinimo ciklo, į reakcijos mišinį turėjo būti pridėta DNR polimerazės, nes ji greitai buvo inaktyvuota aukštoje temperatūroje, reikalinga atskirti DNR spiralės grandines. Procedūra buvo labai neefektyvi, pareikalavo daug laiko ir fermentų. 1986 metais jis buvo gerokai patobulintas. Buvo pasiūlyta naudoti termofilinių bakterijų DNR polimerazes. Šie fermentai pasirodė esantys termostabilūs ir gali atlaikyti daugybę reakcijos ciklų. Jų naudojimas leido supaprastinti ir automatizuoti PGR. Viena pirmųjų termostabilių DNR polimerazių buvo išskirta iš bakterijų Thermus aquaticus ir pavadintas Taq- polimerazė. Šios polimerazės trūkumas yra tas, kad klaidingo nukleotido įvedimo tikimybė yra gana didelė, nes šis fermentas neturi klaidų taisymo mechanizmų (3" → 5" egzonukleazės aktyvumas). Polimerazės pfu ir Pwo, išskirtos iš archajų, turi tokį mechanizmą, jų naudojimas žymiai sumažina DNR mutacijų skaičių, tačiau jų darbo greitis (procesiškumas) yra mažesnis nei Taq. Šiuo metu naudojami mišiniai Taq ir pfu pasiekti didelį polimerizacijos greitį ir didelį kopijavimo tikslumą.

Metodo išradimo metu Mullis dirbo korporacijoje Cetus, kuri užpatentavo PGR metodą. 1992 m. Cetus pardavė metodo teises ir naudojimo patentą Taq- polimerazės kompanija Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) už 300 milijonų dolerių. Tačiau paaiškėjo, kad Taq-polimerazę 1980 metais charakterizavo rusų biochemikas Aleksejus Kaledinas, dėl kurio bendrovė Promega (Promega) teisme bandė priversti Roche atsisakyti išskirtinių teisių į šį fermentą. Amerikietiškas PGR metodo patentas pasibaigė 2005 m. kovo mėn.

PGR atlikimas

Metodas pagrįstas daugkartiniu selektyviu tam tikros DNR srities kopijavimu fermentų pagalba dirbtinėmis sąlygomis ( in vitro). Tokiu atveju nukopijuojama tik tas sritis, kuri atitinka nurodytas sąlygas, ir tik tuo atveju, jei ji yra tiriamoje imtyje. Priešingai nei DNR amplifikacija gyvuose organizmuose (replikacija), palyginti trumpos DNR dalys amplifikuojamos naudojant PGR. Įprastiniame PGR procese replikuotų DNR sričių ilgis yra ne didesnis kaip 3000 bazinių porų (3 kbp). Įvairių polimerazių mišinio pagalba, naudojant priedus ir tam tikromis sąlygomis PGR fragmento ilgis gali siekti 20-40 tūkstančių bazinių porų. Tai vis dar yra daug mažiau nei eukariotinės ląstelės chromosominės DNR ilgis. Pavyzdžiui, žmogaus genomas yra maždaug 3 milijardų bazinių porų ilgio.

Reakcijos komponentai

Paprasčiausiu atveju PGR reikalingi šie komponentai:

• DNR šablonas, kuriame yra DNR dalis, kurią reikia amplifikuoti.
• Du gruntai, papildantis priešingus norimos DNR fragmento skirtingų grandžių galus.
• termostabilūs DNR polimerazė yra fermentas, katalizuojantis DNR polimerizaciją. Polimerazė, skirta naudoti PGR, turi išlikti aktyvi aukštoje temperatūroje ilgą laiką, todėl naudojami iš termofilų išskirti fermentai - Thermus aquaticus(Taq polimerazė), Pyrococcus furiosus(Pfu polimerazė), Pyrococcus woesei(Pwo-polimerazė) ir kt.
• Deoksinukleozidų trifosfatai(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Mg 2+ jonai, reikalingi polimerazei veikti.
• buferinis tirpalas, užtikrinant reikiamas reakcijos sąlygas – pH, tirpalo joninę stiprumą. Sudėtyje yra druskų, galvijų serumo albumino.

Kad reakcijos mišinys neišgaruotų, į mėgintuvėlį įpilama aukštai verdančio aliejaus, pavyzdžiui, vazelino. Jei naudojamas šildomas dangtelis, to nereikia.

Pirofosfatazės pridėjimas gali padidinti PGR reakcijos išeigą. Šis fermentas katalizuoja pirofosfato, šalutinio produkto, pridedant nukleotidų trifosfatų prie augančios DNR grandinės, hidrolizę į ortofosfatą. Pirofosfatas gali slopinti PGR reakciją.

Gruntai

PGR specifiškumas pagrįstas komplementarių kompleksų susidarymu tarp šablono ir pradmenų, trumpų sintetinių 18-30 bazių ilgio oligonukleotidų. Kiekvienas pradmuo papildo vieną iš dvigrandinio šablono grandinių ir riboja sustiprintos srities pradžią ir pabaigą.

Po šablono hibridizacijos su pradmeniu (atkaitinimas), pastarasis naudojamas kaip DNR polimerazės pradmuo sintezuojant šablono komplementarią grandinę (žr.).

Svarbiausia pradmenų charakteristika yra pradmenų ir matricų komplekso lydymosi temperatūra (Tm). T m yra temperatūra, kurioje pusė šabloninės DNR sudaro kompleksą su oligonukleotido pradmeniu. Lydymosi temperatūrą galima apytiksliai nustatyti pagal formulę , kur n X yra X nukleotidų skaičius pradmenyje. Jei pradmens ilgis ir nukleotidų sudėtis arba atkaitinimo temperatūra parinkta neteisingai, gali susidaryti iš dalies papildantys kompleksai su kitomis DNR šablono sritimis, dėl kurių gali atsirasti nespecifinių produktų. Viršutinę lydymosi temperatūros ribą riboja optimali polimerazės veikimo temperatūra, kurios aktyvumas krenta aukštesnėje nei 80 °C temperatūroje.

Renkantis gruntus, pageidautina laikytis šių kriterijų:

stiprintuvas

Ryžiai. vienas: PGR cikleris

PGR atliekamas stiprintuve - įrenginyje, kuris periodiškai vėsina ir kaitina mėgintuvėlius, paprastai ne mažesniu kaip 0,1 ° C tikslumu. Šiuolaikiniai dviračiai leidžia nustatyti sudėtingas programas, įskaitant „karštojo paleidimo“, „Touchdown“ PGR (žr. toliau) ir paskesnį amplifikuotų molekulių saugojimą 4 °C temperatūroje. Realaus laiko PGR atveju gaminami prietaisai su fluorescenciniu detektoriumi. Prietaisus taip pat galima įsigyti su automatiniu dangteliu ir mikroplokštelių skyriumi, todėl juos galima integruoti į automatizuotas sistemas.

Reakcijos eiga

Gelio, kuriame yra žymeklio DNR (1) ir PGR reakcijos produktų (2, 3), nuotrauka. Skaičiai rodo DNR fragmentų ilgį nukleotidų poromis.

Paprastai, atliekant PGR, atliekami 20-35 ciklai, kurių kiekvienas susideda iš trijų etapų (2 pav.).

Denatūravimas

Dvigubos grandinės DNR šablonas kaitinamas iki 94-96°C (arba 98°C, jei naudojama ypač termostabili polimerazė) 0,5-2 minutes, kad DNR grandinės galėtų atsiskirti. Šis etapas vadinamas denatūravimas nes vandeniliniai ryšiai tarp dviejų DNR grandžių nutrūksta. Kartais prieš pirmąjį ciklą (prieš pridedant polimerazę) reakcijos mišinys pašildomas 2–5 min. visiškai denatūruoti šabloną ir pradmenis. Toks požiūris vadinamas karšta pradžia, tai leidžia sumažinti nespecifinių reakcijos produktų kiekį.

Atkaitinimas

Kai sruogos atskiriamos, temperatūra sumažinama, kad gruntai galėtų prisijungti prie viengubo šablono. Šis etapas vadinamas atkaitinimas. Atkaitinimo temperatūra priklauso nuo gruntų sudėties ir dažniausiai pasirenkama 4-5°C žemiau jų lydymosi temperatūros. Scenos laikas - 0,5-2 min. Neteisingai pasirinkus atkaitinimo temperatūrą, pradmenys blogai prisiriša prie šablono (aukštesnėje temperatūroje), arba susiriša netinkamoje vietoje ir atsiranda nespecifinių produktų (žemoje temperatūroje).

Pailgėjimas

PGR veislės

• "Nested" PCR (Nested PCR (eng.)) - naudojamas siekiant sumažinti šalutinių reakcijos produktų skaičių. Naudokite dvi poras pradmenų ir atlikite dvi reakcijas iš eilės. Antroji pradmenų pora amplifikuoja DNR sritį pirmosios reakcijos produkte.
• "Inverted" PGR (atvirkštinis PCR (angl.)) - naudojamas, jei norimoje sekoje žinomas tik nedidelis plotas. Šis metodas ypač naudingas, kai reikia nustatyti gretimas sekas po DNR įterpimo į genomą. Norint įgyvendinti apverstą PGR, atliekama eilė DNR pjūvių su restrikcijos fermentais, po to sujungiami fragmentai (ligavimas). Dėl to žinomi fragmentai yra abiejuose nežinomo regiono galuose, po kurių PGR gali būti atlikta kaip įprasta.
• Atvirkštinės transkripcijos PGR (RT-PGR) naudojama žinomai sekai iš RNR bibliotekos amplifikuoti, išskirti arba identifikuoti. Prieš atliekant įprastą PGR, iRNR šablone, naudojant reversetazę, susintetinama viengrandė DNR molekulė ir gaunama viengrandė cDNR, kuri naudojama kaip PGR šablonas. Šis metodas dažnai nustato, kur ir kada šie genai yra išreikšti.
• asimetrinė PGR. Asimetrinė PGR) – atliekama, kai reikia amplifikuoti daugiausia vieną iš pradinės DNR grandinių. Naudojamas kai kuriuose sekos nustatymo ir hibridizacijos analizės metoduose. PGR atliekama kaip įprasta, išskyrus tai, kad vienas iš pradmenų imamas dideliu pertekliumi.
• Kiekybinė PGR (Q-PGR) naudojama norint greitai išmatuoti specifinės DNR, cDNR arba RNR kiekį mėginyje.
• Kiekybinė realaus laiko PGR – šis metodas naudoja fluorescenciniu būdu pažymėtus reagentus, kad tiksliai išmatuotų reakcijos produkto kiekį, kai jis kaupiasi.
• Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR(English) ) - naudojant šį metodą, sumažinama nespecifinio pradmenų surišimo įtaka produkto susidarymui. Pirmieji ciklai atliekami esant aukštesnei nei atkaitinimo temperatūrai, po to kas kelis ciklus temperatūra mažinama. Tam tikroje temperatūroje sistema praeis per optimalaus pradmenų specifiškumo juostą DNR.
• Molekulinės kolonijos metodas (PGR gelyje) Polonijos-PCR kolonija) - akrilamido gelis polimerizuojamas su visais PGR komponentais ant paviršiaus ir atliekama PGR. Taškuose, kuriuose yra analizuojama DNR, amplifikacija vyksta formuojant molekulines kolonijas.
• PGR su greitu cDNR galų amplifikavimu Greitas cDNR galų amplifikavimas, RACE-PGR )
• Ilgų fragmentų PGR Ilgo nuotolio PGR) - PGR modifikavimas išplėstų DNR segmentų amplifikacijai (10 tūkst. bazių ir daugiau). Naudojamos dvi polimerazės, viena iš kurių yra Taq polimerazė, turinti didelį procesyvumą (tai yra, vienu žingsniu galinti susintetinti ilgą DNR grandinę), o antroji – DNR polimerazė, turinti 3'-5' endonukleazės aktyvumą. Antroji polimerazė reikalinga norint ištaisyti pirmosios įvestas klaidas.
• RAPD-PCR Atsitiktinis polimorfinės DNR PGR amplifikavimas , PGR su atsitiktine polimorfinės DNR amplifikacija – naudojama, kai reikia atskirti organizmus, kurie yra artimi genetine seka, pavyzdžiui, skirtingų veislių auginamų augalų, šunų veislių ar artimai giminingų mikroorganizmų. Šiam metodui dažniausiai naudojamas vienas mažas gruntas (20-25 bp). Šis pradmuo iš dalies papildys atsitiktines tiriamų organizmų DNR sritis. Pasirinkus sąlygas (pradžio ilgis, pradmenų sudėtis, temperatūra ir kt.), galima pasiekti patenkinamą dviejų organizmų PGR modelio skirtumą.

Jei šablono nukleotidų seka iš dalies žinoma arba visai nežinoma, galima naudoti išsigimę pradmenys, kurios sekoje yra išsigimusių pozicijų, kuriose gali būti bet kokių bazių. Pavyzdžiui, pradmenų seka gali būti: ...ATH... kur H yra A, T arba C.

PGR taikymas

PGR naudojamas daugelyje sričių analizei ir moksliniams eksperimentams.

Kriminalistika

PGR naudojama vadinamiesiems „genetiniams pirštų atspaudams“ palyginti. Reikalingas genetinės medžiagos mėginys iš nusikaltimo vietos – kraujo, seilių, spermos, plaukų ir kt. Jis lyginamas su įtariamojo genetine medžiaga. Užtenka labai mažo DNR kiekio, teoriškai – vienos kopijos. DNR supjaustoma į fragmentus, tada amplifikuojama PGR. Fragmentai atskiriami naudojant DNR elektroforezę. Gautas DNR juostų išsidėstymo vaizdas vadinamas genetinis pirštų atspaudas(Anglų) genetinis pirštų atspaudas).

Tėvystės nustatymas

Ryžiai. 3: DNR fragmentų, amplifikuotų PGR, elektroforezės rezultatai. (1) Tėvas. (2) Vaikas. (3) Motina. Vaikas paveldėjo kai kurias abiejų tėvų genetinio atspaudo ypatybes, kurios suteikė naują, unikalų įspaudą.

Nors „genetiniai pirštų atspaudai“ yra unikalūs (išskyrus identiškų dvynių atvejus), šeimos ryšius vis tiek galima užmegzti padarius kelis tokius pirštų atspaudus (3 pav.). Tas pats metodas su nedideliais pakeitimais gali būti taikomas evoliuciniams ryšiams tarp organizmų nustatyti.

Medicininė diagnostika

PGR leidžia žymiai pagreitinti ir palengvinti paveldimų ir virusinių ligų diagnostiką. Norimas genas amplifikuojamas PGR, naudojant tinkamus pradmenis, o tada sekvenuojamas, kad būtų nustatytos mutacijos. Virusinės infekcijos gali būti aptiktos iškart po užsikrėtimo, likus savaitėms ar mėnesiams iki ligos simptomų atsiradimo.

Individualizuota medicina

Yra žinoma, kad dauguma vaistų veikia ne visus pacientus, kuriems jie skirti, o tik 30–70 proc. Be to, kai kuriems pacientams daugelis vaistų yra toksiški arba sukelia alergiją. To priežastys iš dalies yra individualūs vaistų ir jų darinių jautrumo ir metabolizmo skirtumai. Šie skirtumai nustatomi genetiniame lygmenyje. Pavyzdžiui, vienam ligoniui tam tikras citochromas (kepenų baltymas, atsakingas už pašalinių medžiagų apykaitą) gali būti aktyvesnis, pas kitą – mažiau. Norint nustatyti, kokio tipo citochromą turi konkretus pacientas, prieš vartojant vaistą, siūloma atlikti PGR analizę. Ši analizė vadinama preliminariu genotipo nustatymu. numatomas genotipų nustatymas).

Genų klonavimas

Genų klonavimas (nepainioti su organizmų klonavimu) yra genų išskyrimo ir dėl genų inžinerijos manipuliacijų didelio kiekio tam tikro geno produkto gavimo procesas. PGR naudojamas amplifikuoti geną, kuris vėliau įterpiamas į vektorius- DNR fragmentas, pernešantis svetimą geną į tą patį ar kitą patogų augti organizmą. Kaip vektoriai, pavyzdžiui, naudojamos plazmidės arba virusinė DNR. Genų įterpimas į svetimą organizmą dažniausiai naudojamas šio geno produktui – RNR arba dažniausiai baltymui gauti. Taigi daugelis baltymų gaunami pramoniniais kiekiais, skirti naudoti žemės ūkyje, medicinoje ir kt.

Ryžiai. keturi: Genų klonavimas naudojant plazmidę. .
(1) A organizmo chromosominė DNR. (2) PGR. (3) Kelios organizmo A geno kopijos. (4) Geno įterpimas į plazmidę. (5) Plazmidė su organizmo A genu. (6) Plazmidės įvedimas į organizmą B. (7) Organizmo A geno kopijos skaičiaus dauginimas organizme B.

DNR sekos nustatymas

PGR yra neatskiriama sekos nustatymo metodo, naudojant dideoksinukleotidus, paženklintus fluorescencine žyma arba radioaktyviuoju izotopu, dalis, nes būtent polimerizacijos metu į DNR grandinę įterpiami fluorescencine arba radioaktyvia žyme pažymėti nukleotidų dariniai. Tai sustabdo reakciją, leidžiančią nustatyti konkrečių nukleotidų padėtis po sintezuotų sruogų atskyrimo gelyje.

Mutagenezė

Šiuo metu PGR tapo pagrindiniu mutagenezės metodu. PGR naudojimas leido supaprastinti ir pagreitinti mutagenezės procedūrą, taip pat padaryti ją patikimesnę ir atkuriamą.

Bakterijų genetika. Informacija antrajai pamokai.

polimerazės grandininė reakcija

Polimerazės grandininė reakcija – tai metodas, leidžiantis daug kartų padidinti (amplifikuoti) tam tikrų DNR molekulių skaičių analizuojamame mėginyje (įskaitant biologinę medžiagą arba grynąją kultūrą).

Pagrindiniai PGR, kaip diagnostikos metodo mikrobiologijoje, privalumai yra labai didelis jautrumas, leidžiantis aptikti itin mažas patogenų koncentracijas mėginiuose, taip pat reguliuojamas specifiškumas, leidžiantis aptikti ar identifikuoti patogenus prie generinių, rūšių. , arba porūšio lygiu. Pagrindinis PGR trūkumas kyla dėl itin didelio jautrumo – vaizdai labai lengvai gali užteršti teigiamos kontrolės, kito mėginio ar PGR produkto DNR, o tai sukelia klaidingai teigiamą reakciją. Tai nustato griežtus apribojimus sąlygomis, kuriomis PGR maišomas ir apdorojamas su gatavais PGR produktais.

PGR atlikimas. Paruošiamas reakcijos mišinys, kurį sudaro šie komponentai:

iš tiriamojo mėginio išskirta DNR,

buferinis tirpalas,

Mg2+ jonai (reikalingi, kad fermentas veiktų),

Du pradmenys yra vienos grandinės trumpos DNR molekulės (dažniausiai 18–24 nukleotidų ilgio), papildančios skirtingų aptinkamos DNR sekos grandinių galus.

Deoksinukleotido trifosfatų mišinys.

Karščiui atspari DNR polimerazė (dažniausiai naudojama Taq polimerazė, polimerazė, išskirta iš Termusas aquaticus).

Tada šis reakcijos mišinys dedamas į ciklerį, kuris iš tikrųjų yra programuojamas termostatas. Cikleryje atliekama 30-40 temperatūros keitimo ciklų. Kiekvienas iš šių ciklų susideda iš trijų etapų (žr. 1 pav.):

Denatūracija (temperatūra 94 ° C) - vandenilio grandinės nutrūksta, o DNR grandinės skiriasi.

Pradmenų atkaitinimas (temperatūra paprastai yra 50-60 ° C) - pradmenys pritvirtinami prie DNR grandinių galų. Apskritai, nukritus temperatūrai, pirminių DNR grandžių susijungimas iš tiriamo mėginio (renatūravimas) yra energetiškai palankesnis, tačiau pradmenų koncentracija reakcijos mišinyje yra daug dydžių didesnė nei DNR koncentracija. iš mėginio (bent jau pradiniuose PGR cikluose), todėl pradmenų susijungimo reakcija vyksta greičiau nei renatūracija.DNR. Atkaitinimo temperatūra parenkama priklausomai nuo gruntų lydymosi (denatūravimo) temperatūrų.

Pailgėjimas (temperatūra paprastai yra 72 ° C) - DNR polimerazė užbaigia pradmenis pagal ilgų DNR grandinių šabloną. Temperatūra atitinka optimalią naudojamos DNR polimerazės veikimo temperatūrą.

Rezultatų aptikimas skiriasi skirtingose ​​PGR formulėse ir yra aprašytas skyriuje „PGR veislės“.

PGR dinamika

Ankstyvųjų PGR ciklų metu dvigubų DNR molekulių, kurių dydį lemia atstumas tarp pradmenų vietų, skaičius padvigubėja su kiekvienu ciklu. Taip pat susidaro nedidelis skaičius ilgesnių DNR molekulių, kurių galima nepaisyti (žr. 2 pav.).

Taigi ankstyvaisiais ciklais PGR produkto kiekis apibūdinamas formule m*2 n, kur m – pradinis norimos DNR kiekis mėginyje, n – ciklų skaičius. Tada reakcija pasiekia plynaukštę. Taip yra dėl reakcijos produkto kaupimosi, pradmenų ir deoksinukleotid trifosfatų koncentracijos sumažėjimo, taip pat dėl ​​pirofosfato koncentracijos padidėjimo (žr. 3 pav.).

PGR veislės

Įprasta PGR

Šioje PGR nustatymo versijoje reakcija vyksta iš anksto pasirinktą ciklų skaičių (30–40), po kurių analizuojama, ar reakcijos mišinyje nesusikaupė dvigrandės DNR molekulės.

Šis PGR variantas, naudojamas kaip diagnostikos metodas, yra kokybinis metodas. Teigiama reakcija rodo, kad mėginyje yra bent pėdsakai norimų DNR molekulių. Neigiama reakcija rodo jų nebuvimą. Kiekybiškai įvertinti pradinių DNR molekulių kiekį mėginyje neįmanoma, nes reakcija pasiekia plokščiakalnį.

Pagrindinis produkto buvimo nustatymo metodas yra elektroforezė agarozės arba poliakrilamido gelyje. PGR produktai yra atskiriami gelyje, veikiant elektriniam laukui, pagal jų molekulinę masę. Į gelį pridedamas interkaluojantis dažiklis (fluorescuojantis su dvigrande DNR – dažniausiai etidžio bromidas). Taigi, veikiant ultravioletiniams spinduliams, bus galima pamatyti, ar yra arba nėra juostelės, atitinkančios reikiamos molekulinės masės DNR. Atliekant PGR diagnostikos tikslais, visada dedamos teigiamos ir neigiamos reakcijos kontrolinės medžiagos, su kuriomis lyginami mėginiai (žr. 4 pav.).

realaus laiko PGR

Šioje PGR sąrankos versijoje PGR produkto kiekis reakcijos mišinyje yra nuolat registruojamas reakcijos metu. Tai leidžia sudaryti reakcijos kreivę (žr. 3 pav.) ir pagal ją apskaičiuoti norimų DNR molekulių skaičių mėginiuose.

Vienas iš realaus laiko PGR tipų yra tarpinis dažiklis, kuris dedamas tiesiai į reakcijos mišinį (dažniausiai naudojamas SYBRGreen). Kitas tipas – naudojant vieną iš fluorescencinių zondų tipų, kurie jungiasi prie vietos PGR produkto viduje, todėl galima padidinti aptikimo specifiškumą (žr. 5 pav.) Fluorescencijos aptikimas vyksta tiesiogiai įrenginyje reakcijos metu.

Be kiekybinio aptikimo galimybės, yra ir kitų realaus laiko PGR pranašumų, palyginti su įprastine PGR. Šis PGR variantas yra paprastesnis, greitesnis ir nereikalauja atidaryti mėgintuvėlių su PGR produktais, o tai sumažina galimybę užteršti kitus mėginius. Pagrindinis trūkumas yra didesnė stiprintuvo su įmontuota fluorescencijos aptikimo galimybe kaina, palyginti su įprastu.

Skaitmeninis kiekybinis PGR

Nauja, brangi ir vis dar mažai naudojama PGR versija, leidžianti tiksliau nustatyti DNR kiekį mėginyje. Šioje versijoje reakcijos mišinys, kuriame yra fluorescencinių dažų, yra padalintas į daugybę mikroskopinių tūrių (pvz. , lašeliai emulsijoje). Po PGR analizuojama, kurioje lašelių dalyje reakcija pasirodė teigiama ir atitinkamai stebima fluorescencija. Ši proporcija bus proporcinga dominančių DNR molekulių skaičiui mėginyje.

atvirkštinės transkripcijos PGR

Tokiu atveju prieš vieną ar kitą PGR variantą, naudojant atvirkštinį fermentą, atliekama atvirkštinės transkripcijos reakcija (RNR į DNR). Taigi šis metodas leidžia kokybiškai arba kiekybiškai aptikti RNR molekules. Tai gali būti naudojama aptikti RNR turinčius virusus arba nustatyti konkretaus geno transkripcijos lygį (mRNR kiekį).

1 paveikslas. PGR žingsniai. Gruntai pažymėti raudonai.

2 pav. Pradmenų ribotų dvigrandžių DNR molekulių kaupimasis PGR metu.

3 pav PGR reakcijos dinamika esant skirtingoms pradinėms norimų DNR molekulių koncentracijoms mėginyje. (a) – didžiausia koncentracija (b) – vidutinė koncentracija (c) – mažiausia koncentracija

4 pav PGR produktų agarozės elektroforezė. K+ – teigiama kontrolė (akivaizdu, kad reikiama DNR yra). 1-7 - tiriamieji mėginiai (iš kurių 1-2 teigiami, 3-7 neigiami). K- -neigiama kontrolė (tikrai trūksta norimos DNR). Daugeliu atvejų, be tikslinio produkto, yra matomi lengvesni nespecifiniai reakcijos produktai (pradmenys-dimeriai).

5 pav Aptikimo metodai naudojant realaus laiko PGR. (a) – įsiterpiantis dažiklis – fluorescuoja, kai prisijungia prie dvigrandės DNR (b) – Taqman zondas – fluorescencija atsiranda, kai zondą suskaido DNR polimerazė, turinti 5’-3’ endonukleazės aktyvumą dėl fluoroforo ir gesintuvo atskyrimo. (c) MolecularBeacon zondas – fluorescencija atsiranda, kai zondas hibridizuojasi su tiksliniu fragmentu dėl erdvinio fluoroforo ir gesintuvo atskyrimo (d) – LightCycler zondai – akceptoriaus fluorescencija atsiranda, kai zondai (turintys akceptorių ir donorą) hibridizuojasi su taikiniu. fragmentas dėl rezonansinės fluorescencinės energijos perdavimo (FRET).

1. Polimerazės grandininė reakcija (PGR)

2. Polimerazės grandininės reakcijos metodo principas

2.1 Daugelio komponentų buvimas reakcijos mišinyje

2.2 Temperatūros ciklas

2.3 Pagrindiniai grunto parinkimo principai

2.4 Plokštumos efektas

3. PGR nustatymo etapai

3.2 Stiprinimas

3.4.1 Teigiami valdikliai

3.4.2 Vidaus kontrolė

4.1 Kokybinė analizė

4.1.2 RNR molekulių aptikimas

3.1 Biologinės medžiagos mėginio paruošimas

Priklausomai nuo užduočių, DNR išskyrimui naudojami skirtingi metodai. Jų esmė – DNR išskyrimas (ekstrahavimas) iš biologinio produkto ir pašalinių priemaišų pašalinimas arba neutralizavimas, siekiant gauti PGR tinkamo grynumo DNR preparatą.

Marmur aprašytas gryno DNR preparato gavimo būdas laikomas standartiniu ir jau tapo klasikiniu. Tai apima fermentinę proteolizę, po kurios seka deproteinizacija ir DNR nusodinimas alkoholiu. Šis metodas leidžia gauti gryną DNR preparatą. Tačiau tai yra gana sudėtinga ir apima darbą su tokiomis agresyviomis ir aštriomis medžiagomis kaip fenolis ir chloroformas.

Vienas iš šiuo metu populiarių metodų yra DNR ekstrahavimo metodas, kurį pasiūlė Boom ir kt. Šis metodas pagrįstas stiprios chaotropinės medžiagos, guanidino tiocianato (GuSCN) naudojimu ląstelių lizei ir vėlesnei DNR sorbcijai ant nešiklio (stiklo karoliukų, diatomito, stiklo pieno ir kt.). Po plovimo DNR lieka mėginyje, adsorbuotame ant nešiklio, iš kurio ją galima lengvai pašalinti naudojant eliuavimo buferį. Metodas patogus, technologiškai pažangus ir tinkamas mėginių paruošimui amplifikacijai. Tačiau DNR nuostoliai galimi dėl negrįžtamos sorbcijos ant nešiklio, taip pat daugelio plovimų metu. Tai ypač svarbu dirbant su nedideliu DNR kiekiu mėginyje. Be to, net nedideli GuSCN kiekiai gali slopinti PGR. Todėl naudojant šį metodą labai svarbu teisingai pasirinkti sorbentą ir atidžiai laikytis technologinių niuansų.

Kita mėginių paruošimo metodų grupė yra paremta Chilex tipo jonų mainų naudojimu, kurie, skirtingai nei stiklas, sorbuoja ne DNR, o atvirkščiai – reakcijai trukdančias priemaišas. Paprastai šią technologiją sudaro du etapai: mėginio virinimas ir priemaišų adsorbcija ant jonų keitiklio. Metodas itin patrauklus dėl jo vykdymo paprastumo. Daugeliu atvejų jis tinkamas darbui su klinikine medžiaga. Deja, kartais yra mėginių su priemaišomis, kurių negalima pašalinti naudojant jonų mainus. Be to, kai kurių mikroorganizmų negalima sunaikinti paprastu virimu. Tokiais atvejais būtina įvesti papildomus mėginių apdorojimo etapus.

Taigi mėginio paruošimo metodo pasirinkimas turėtų būti vertinamas atsižvelgiant į numatomų tyrimų tikslus.

3.2 Stiprinimas

Norint atlikti amplifikacijos reakciją, reikia paruošti reakcijos mišinį ir į jį įpilti analizuotą DNR mėginį. Šiuo atveju svarbu atsižvelgti į kai kurias grunto atkaitinimo ypatybes. Faktas yra tas, kad analizuojamame biologiniame mėginyje paprastai yra įvairių DNR molekulių, su kuriomis reakcijoje naudojami pradmenys turi dalinę, o kai kuriais atvejais reikšmingą homologiją. Be to, pradmenys gali susijungti vienas su kitu, kad susidarytų pradmenys-dimeriai. Abu jie sukelia daug pradmenų, skirtų šalutinių (nespecifinių) reakcijos produktų sintezei, ir dėl to žymiai sumažina sistemos jautrumą. Dėl to elektroforezės metu sunku arba neįmanoma nuskaityti reakcijos rezultatų.

3.3 Reakcijos rezultatų įvertinimas

Norint teisingai įvertinti PGR rezultatus, svarbu suprasti, kad šis metodas nėra kiekybinis. Teoriškai pavienių tikslinių DNR molekulių amplifikacijos produktus elektroforezės būdu galima aptikti jau po 30–35 ciklų. Tačiau praktikoje tai daroma tik tais atvejais, kai reakcija vyksta idealioms artimomis sąlygomis, su kuo nedažnai susiduriama gyvenime. Ypač didelę įtaką amplifikacijos efektyvumui turi DNR preparato grynumo laipsnis; tam tikrų inhibitorių buvimas reakcijos mišinyje, kurių kai kuriais atvejais gali būti labai sunku atsikratyti. Kartais dėl jų buvimo neįmanoma amplifikuoti net dešimčių tūkstančių tikslinių DNR molekulių. Taigi dažnai nėra tiesioginio ryšio tarp pradinio tikslinės DNR kiekio ir galutinio amplifikacijos produktų kiekio.

3.3.1 Horizontaliosios elektroforezės metodas

Amplifikacijos rezultatams vizualizuoti naudojami įvairūs metodai. Šiandien labiausiai paplitęs elektroforezės metodas, pagrįstas DNR molekulių atskyrimu pagal dydį. Norėdami tai padaryti, paruošiama agarozės gelio plokštelė, kuri agarozė užšaldoma ištirpus 1,5–2,5% koncentracijos elektroforezės buferyje, pridedant specialaus DNR dažiklio, pavyzdžiui, etidžio bromido. Užšaldyta agarozė sudaro erdvinę gardelę. Pilant šukomis, gelyje susidaro specialūs šuliniai, į kuriuos vėliau dedami amplifikacijos produktai. Gelio plokštelė dedama į horizontalų gelio elektroforezės aparatą ir prijungiamas pastovios įtampos šaltinis. Neigiamai įkrauta DNR pradeda judėti gelyje nuo minuso iki pliuso. Tuo pačiu metu trumpesnės DNR molekulės juda greičiau nei ilgos. DNR judėjimo greitį gelyje įtakoja agarozės koncentracija, elektrinio lauko stiprumas, temperatūra, elektroforezės buferio sudėtis ir, kiek mažesniu mastu, DNR GC sudėtis. Visos vienodo dydžio molekulės juda tuo pačiu greičiu. Dažai įterpiami (interkaluojasi) plokščiomis grupėmis į DNR molekules. Baigus elektroforezę, kuri trunka nuo 10 minučių iki 1 valandos, gelis dedamas ant transiliuminatoriaus filtro, skleidžiančio šviesą ultravioletinių spindulių diapazone (254 - 310 nm). UV energija, kurią sugeria DNR ties 260 nm, perkeliama į dažus, todėl jie fluorescuoja oranžinės-raudonoje matomo spektro srityje (590 nm).

Stiprinimo produktų juostų ryškumas gali būti skirtingas. Tačiau tai negali būti siejama su pradiniu tikslinės DNR kiekiu mėginyje.

3.3.2 Vertikalios elektroforezės metodas

Vertikalios elektroforezės metodas iš esmės panašus į horizontaliąją elektroforezę. Jų skirtumas yra tas, kad šiuo atveju vietoj agarozės naudojami poliakrilamido geliai. Jis atliekamas specialioje vertikalios elektroforezės kameroje. Poliakrilamido gelio elektroforezė pasižymi didesne skiriamąja geba nei agarozės elektroforezė ir leidžia atskirti įvairaus dydžio DNR molekules vieno nukleotido tikslumu. Poliakrilamido gelio paruošimas yra šiek tiek sudėtingesnis nei agarozės. Be to, akrilamidas yra toksiška medžiaga. Kadangi poreikis nustatyti amplifikacijos produkto dydį 1 nukleotido tikslumu iškyla retai, įprastame darbe naudojamas horizontaliosios elektroforezės metodas.

3.4 Amplifikacijos reakcijos eigos stebėjimas

3.4.1 Teigiami valdikliai

Kaip „teigiamą kontrolę“ naudokite norimo mikroorganizmo DNR preparatą. Nespecifiniai amplikonai dydžiu skiriasi nuo amplikonų, gautų amplifikuojant kontroliniu DNR preparatu. Nespecifinių produktų dydis gali būti didesnis arba mažesnis už teigiamą kontrolę. Blogiausiu atveju šie matmenys gali sutapti ir elektroforezės metu nuskaitomi kaip teigiami.

Norint kontroliuoti gauto amplifikacijos produkto specifiškumą, gali būti naudojami hibridizacijos zondai (DNR sritys, esančios amplifikuojamoje sekoje), paženklintos fermentinėmis žymėmis arba radioaktyviais izotopais ir sąveikaujantys su DNR pagal tuos pačius principus, kaip ir pradmenys. Tai labai apsunkina ir pailgina analizę, o jos kaina žymiai padidėja.

3.4.2 Vidaus kontrolė

Būtina kontroliuoti amplifikacijos eigą kiekviename mėgintuvėlyje su reakcijos mišiniu. Tam naudojama papildoma, vadinamoji „vidinė kontrolė“. Tai bet koks DNR preparatas, kuris nėra panašus į norimo mikroorganizmo DNR. Jei į reakcijos mišinį įvedama vidinė kontrolė, ji taps tuo pačiu pradmenų susijungimo taikiniu kaip ir norimo infekcinio agento chromosominė DNR. Vidinės kontrolės amplifikacijos produkto dydis parenkamas taip, kad jis būtų 2 ar daugiau kartų didesnis nei amplikonai, susidarę amplifikuojant mikroorganizmo tikslinę DNR. Dėl to, jei į reakcijos mišinį kartu su tiriamuoju mėginiu įvedama ir vidinė kontrolinė DNR, tai nepriklausomai nuo mikroorganizmo buvimo biologiniame mėginyje, vidinė kontrolė sukels specifinių amplikonų susidarymą, bet daug ilgesnį (sunkesnį). nei mikroorganizmo amplikonas. Sunkiųjų amplikonų buvimas reakcijos mišinyje parodys normalią amplifikacijos reakcijos eigą ir inhibitorių nebuvimą. Jeigu nesusidarė reikiamo dydžio amplikonai, tačiau nesusidarė ir vidinės kontrolės amplikonai, galima daryti išvadą, kad tiriamame mėginyje yra nepageidaujamų priemaišų, kurios turėtų būti pašalintos, bet ne norimos DNR nebuvimas.

Deja, nepaisant viso šio metodo patrauklumo, jis turi reikšmingą trūkumą. Jei reikiamos DNR yra reakcijos mišinyje, tai jos amplifikacijos efektyvumas smarkiai sumažėja dėl konkurencijos su vidine pradmenų kontrole. Tai ypač svarbu esant mažoms DNR koncentracijoms tiriamajame mėginyje, o tai gali sukelti klaidingai neigiamus rezultatus.

Nepaisant to, jei bus išspręsta konkurencijos dėl pradmenų problema, šis stiprinimo efektyvumo kontrolės metodas tikrai bus labai naudingas.

4. Metodai, pagrįsti polimerazės grandinine reakcija

4.1 Kokybinė analizė

Klasikinis PGR nustatymo metodas, kurio principai buvo aprašyti aukščiau, buvo sukurti kai kuriais pakeitimais, kuriais siekiama įveikti PGR apribojimus ir padidinti reakcijos efektyvumą.

4.1.1 Kaip nustatyti PGR naudojant „karštą paleidimą“

Siekiant sumažinti nespecifinių amplifikacijos reakcijos produktų susidarymo riziką, taikomas metodas, vadinamas „karštu paleidimu“, kurio esmė yra užkirsti kelią galimybei pradėti reakciją tol, kol vamzdyje bus pasiektos sąlygos, užtikrinančios specifinį atkaitinimą. gruntai.

Faktas yra tas, kad, priklausomai nuo HC sudėties ir dydžio, gruntai turi tam tikrą lydymosi temperatūrą (Tm). Jei sistemos temperatūra viršija Tm, pradmenys negali prilipti prie DNR grandinės ir denatūruojasi. Esant optimalioms sąlygoms, t.y. atkaitinimo temperatūra artima lydymosi temperatūrai, pradmuo sudaro dvigrandę molekulę tik tada, kai yra visiškai komplementari ir taip užtikrina reakcijos specifiškumą.

Yra įvairių „karštojo paleidimo“ įgyvendinimo variantų:

Taq polimerazės įvedimas į reakcijos mišinį per pirmąjį ciklą po vamzdelio pakaitinimo iki denatūravimo temperatūros.

Reakcijos mišinio ingredientų atskyrimas parafino sluoksniu į sluoksnius (apatinėje dalyje pradmenys, viršutinėje dalyje Taq polimerazė ir tikslinė DNR), kurie sumaišomi, kai parafinas ištirpsta (~65-75 0 С).

Monokloninių antikūnų prieš Taq polimerazę naudojimas. Monokloninių antikūnų surištas fermentas suaktyvėja tik po pirmo denatūravimo etapo, kai monokloniniai antikūnai negrįžtamai denatūruojasi ir atpalaiduoja aktyviąsias Taq polimerazės vietas.

Visais šiais atvejais, net jei nespecifinis atkaitinimas įvyko prieš prasidedant terminiam ciklui, pailgėjimas nevyksta, o pradmenų-DNR kompleksai denatūruojami kaitinant, todėl nesusidaro nespecifiniai produktai. Vėliau temperatūra vamzdelyje nenukrenta žemiau lydymosi temperatūros, o tai užtikrina specifinio amplifikacijos produkto susidarymą.

4.1.2 RNR molekulių aptikimas

Galimybė naudoti RNR kaip PGR taikinį žymiai išplečia šio metodo taikymo sritį. Pavyzdžiui, daugelio virusų (hepatito C, gripo viruso, pikornavirusų ir kt.) genomus reprezentuoja RNR. Tuo pačiu metu jų gyvavimo cikluose nėra tarpinės transformacijos į DNR fazės. Norint aptikti RNR, ji pirmiausia turi būti paversta DNR forma. Tam naudojama atvirkštinė transkriptazė, kuri yra išskirta iš dviejų skirtingų virusų: paukščių mieloblastozės viruso ir Moloney pelių leukemijos viruso. Šių fermentų naudojimas yra susijęs su tam tikrais sunkumais. Visų pirma, jie yra termolabūs, todėl gali būti naudojami ne aukštesnėje kaip 42 ° C temperatūroje. Kadangi šioje temperatūroje RNR molekulės lengvai formuoja antrines struktūras, reakcijos efektyvumas ženkliai sumažėja ir, įvairiais vertinimais, yra maždaug 5%. Šį trūkumą bandoma apeiti naudojant termostabilią polimerazę, gautą iš termofilinio mikroorganizmo Thermus Thermophilus, kuri, esant Mn 2+, demonstruoja transkriptazės aktyvumą, kaip atvirkštinę transkriptazę. Tai vienintelis žinomas fermentas, galintis parodyti polimerazės ir transkriptazės aktyvumą.

Norint atlikti atvirkštinės transkripcijos reakciją, reakcijos mišinyje, kaip ir PGR, turi būti pradmenų kaip sėklos ir 4 dNTP mišinio kaip statybinė medžiaga.

Po atvirkštinės transkripcijos reakcijos gautos cDNR molekulės gali būti PGR taikinys.

5. PGR nustatymo technologinio proceso organizavimas

Dėl potencialiai didelio polimerazės grandininės reakcijos jautrumo būtina ypač kruopščiai suprojektuoti PGR laboratoriją. Taip yra dėl opiausios metodo problemos – užterštumo.

Užteršimas – iš išorinės aplinkos patekimas į specifinių DNR molekulių reakcijos mišinį, kurios gali būti taikiniais amplifikacijos reakcijoje ir duoti klaidingai teigiamus rezultatus.

Yra keletas būdų, kaip susidoroti su šiuo nemaloniu reiškiniu. Vienas iš jų – fermento N-uracilo glikozilazės (UG) naudojimas. Šis metodas pagrįstas UG gebėjimu skaidyti DNR molekules su įterptu uracilu. Amplifikacijos reakcija atliekama naudojant dNTP mišinį, kuriame dTTP pakeičiamas uracilu, o po terminio ciklo visuose mėgintuvėlyje susidariusiuose amplikonuose bus uracilo. Jei į reakcijos mišinį prieš amplifikaciją pridedama HC, amplikonai, kurie patenka į reakcijos mišinį, bus sunaikinti, o natūrali DNR išliks nepakitusi ir vėliau bus amplifikacijos taikinys.

Taigi šis metodas tik tam tikru mastu pašalina užteršimo šaltinį ir negarantuoja klaidingų teigiamų rezultatų.

Kitas būdas kovoti su užteršimo rezultatais yra reikšmingas reakcijos ciklų skaičiaus sumažinimas (iki 25-30 ciklų). Tačiau net ir taikant šį metodą, rizika gauti klaidingai teigiamus rezultatus yra didelė, nes tokiu atveju, nesant inhibitorių, dėl užteršimo lengva gauti amplifikacijos produktą.

Taigi, nepaisant išankstinių amplifikacijos priemonių, kuriomis siekiama inaktyvuoti klaidingai teigiamus rezultatus sukeliančias DNR molekules, privalumų, radikaliausia priemonė yra gerai apgalvota laboratorijos organizacija.

Išvada

Šiuo metu PGR metodas yra plačiausiai naudojamas kaip įvairių infekcinių ligų diagnostikos metodas. PGR leidžia nustatyti infekcijos etiologiją, net jei analizei paimtame mėginyje yra tik kelios patogeno DNR molekulės. PGR plačiai taikoma ankstyvai ŽIV infekcijų, virusinio hepatito ir kt. Iki šiol beveik nėra infekcinių ligų sukėlėjų, kurių nebūtų galima aptikti naudojant PGR.