Polimerazės grandininė reakcija kosmetologijoje. Polimerazės grandininė reakcija (PGR)
Straipsnio pabaigoje žr
Polimerazės grandininė reakcija (PGR, PGR) 1983 metais išrado Carey Mullis (amerikiečių mokslininkas). Vėliau už šį išradimą jis gavo Nobelio premiją. Šiuo metu PGR diagnostika yra vienas tiksliausių ir jautriausių infekcinių ligų diagnostikos metodų.
Polimerazės grandininė reakcija (PGR)- eksperimentinis molekulinės biologijos metodas, metodas, leidžiantis reikšmingai padidinti mažas tam tikrų nukleino rūgšties fragmentų (DNR) koncentracijas biologinėje medžiagoje (mėginyje).
PGR metodas pagrįstas pakartotiniu tam tikros DNR dalies padvigubinimu fermentų pagalba dirbtinėmis sąlygomis (in vitro). Dėl to susidaro pakankamas DNR kiekis vizualiniam aptikimui. Tokiu atveju nukopijuojama tik tas sritis, kuri atitinka nurodytas sąlygas, ir tik tuo atveju, jei ji yra tiriamoje imtyje.
Be to, kad paprasčiausiai padidina DNR kopijų skaičių (šis procesas vadinamas amplifikacija), PGR leidžia atlikti daugybę kitų manipuliacijų su genetine medžiaga (mutacijų įvedimas, DNR fragmentų sujungimas) ir yra plačiai naudojamas, pavyzdžiui, biologinėje ir medicinos praktikoje. diagnozuoti ligas (paveldimas, infekcines), nustatyti tėvystę, klonuoti genus, įvesti mutacijas, išskirti naujus genus.
Specifiškumas ir pritaikymas
PGR atlikimas
Paprasčiausiu atveju PGR reikalingi šie komponentai:
- DNR šablonas, kuriame yra amplifikuotinos DNR dalis;
- du pradmenys, papildantys norimo fragmento galus;
- termostabili DNR polimerazė;
- deoksinukleotido trifosfatai (A, G, C, T);
- Mg2+ jonai, būtini polimerazės veikimui;
- buferinis tirpalas.
PGR atliekamas stiprintuve - įrenginyje, kuris periodiškai vėsina ir kaitina mėgintuvėlius, paprastai ne mažesniu kaip 0,1 ° C tikslumu. Kad reakcijos mišinys neišgaruotų, į mėgintuvėlį įpilama aukštai verdančio aliejaus, pavyzdžiui, vazelino. Pridėjus specifinių fermentų, gali padidėti PGR reakcijos išeiga.
Reakcijos eiga
Paprastai atliekant PGR, atliekami 20–35 ciklai, kurių kiekvienas susideda iš trijų etapų. Dvigubos grandinės DNR šablonas kaitinamas iki 94–96 °C (arba 98 °C, jei naudojama ypač termostabili polimerazė) 0,5–2 minutes, kad DNR grandinės galėtų atsiskirti. Šis etapas vadinamas denatūravimu – vandeniliniai ryšiai tarp dviejų grandinių sunaikinami. Kartais prieš pirmąjį ciklą reakcijos mišinys pašildomas 2–5 minutes, kad visiškai denatūruotų šabloną ir pradmenis.
Kai sruogos atskiriamos, temperatūra sumažinama, kad gruntai galėtų prisijungti prie viengubo šablono. Šis etapas vadinamas atkaitinimu. Atkaitinimo temperatūra priklauso nuo gruntų ir dažniausiai pasirenkama 4-5°C žemiau jų lydymosi temperatūros. Scenos laikas – 0,5 – 2 minutės.
DNR polimerazė replikuoja šablono grandinę, naudodama pradmenį kaip pradmenį. Tai pailgėjimo etapas. Pailgėjimo temperatūra priklauso nuo polimerazės. Dažnai naudojamos polimerazės aktyviausios 72°C temperatūroje. Pailgėjimo laikas priklauso ir nuo DNR polimerazės tipo, ir nuo amplifikuojamo fragmento ilgio. Paprastai pailgėjimo laikas yra viena minutė kiekvienai tūkstančiui bazinių porų. Pasibaigus visiems ciklams, dažnai atliekamas papildomas galutinio pailgėjimo etapas, kad būtų užbaigti visi vienos grandinės fragmentai. Šis etapas trunka 10-15 minučių.
Medžiagos paruošimas tyrimams ir transportavimas į laboratoriją
Kad analizė būtų sėkminga, svarbu teisingai surinkti medžiagą iš paciento ir tinkamai ją paruošti. Yra žinoma, kad laboratorinėje diagnostikoje daugiausia klaidų (iki 70%) daroma mėginio paruošimo stadijoje. Kraujo paėmimui INVITRO laboratorijoje šiuo metu naudojamos vakuuminės sistemos, kurios, viena vertus, minimaliai sužaloja pacientą, kita vertus leidžia paimti medžiagą taip, kad ji nesiliestų. su personalu arba aplinka. Taip išvengiama medžiagos užteršimo (užteršimo) ir užtikrinamas PGR analizės objektyvumas.
DNR – dezoksiribonukleino rūgštis – biologinis polimeras, vienas iš dviejų nukleino rūgščių tipų, užtikrinančių saugojimą, perdavimą iš kartos į kartą ir gyvų organizmų vystymosi ir funkcionavimo genetinės programos įgyvendinimą. Pagrindinis DNR vaidmuo ląstelėse yra ilgalaikis informacijos apie RNR ir baltymų struktūrą saugojimas.
RNR – ribonukleino rūgštis yra biologinis polimeras, savo chemine struktūra panašus į DNR. RNR molekulė yra sudaryta iš tų pačių monomerų vienetų – nukleotidų, kaip ir DNR. Gamtoje RNR paprastai egzistuoja kaip viena grandinė. Kai kuriuose virusuose RNR yra genetinės informacijos nešėja. Ląstelėje jis atlieka svarbų vaidmenį perduodant informaciją iš DNR į baltymą. RNR sintetinama ant DNR šablono. Šis procesas vadinamas transkripcija. DNR yra skyriai, kuriuose yra informacija, atsakinga už trijų tipų RNR sintezę, kurios skiriasi savo funkcijomis: pasiuntinio arba pasiuntinio RNR (mRNR), ribosomų (rRNR) ir transportavimo (tRNR). Visi trys RNR tipai vienaip ar kitaip dalyvauja baltymų sintezėje. Tačiau informacija apie baltymų sintezę yra tik mRNR.
Nukleotidai yra pagrindinis pasikartojantis nukleorūgščių molekulių vienetas, azoto bazės, penkių anglies cukraus (pentozės) ir vienos ar daugiau fosfatų grupių cheminio junginio produktas. Nukleorūgštyse esantys nukleotidai turi vieną fosfato grupę. Jie pavadinti pagal juose esančią azoto bazę – adeninas (A), turintis adenino, guaninas (G) – guaninas, citozinas (C) – citozinas, timinas (T) – timinas, uracilas (U) – uracilas. DNR susideda iš 4 tipų nukleotidų – A, T, G, C, RNR taip pat turi 4 tipus – A, U, G, C. Visų DNR nukleotidų sudėtyje esantis cukrus yra dezoksiribozė, RNR – ribozė. Nukleino rūgščių susidarymo metu nukleotidai, jungdamiesi, sudaro cukraus-fosfatinį molekulės pagrindą, kurio vienoje pusėje yra bazės.
Pradmenys yra trumpa DNR, naudojama šablono grandinei replikuoti. Kiekvienas iš pradmenų papildo vieną iš dvigrandinio šablono grandinių, įrėmindamas sustiprintos srities pradžią ir pabaigą.
Literatūra
- Glick B., Pasternak J. Molekulinė biotechnologija. Principai ir taikymas. Per. iš anglų kalbos. - M.: Mir, 2002. - 589 p., iliustr. ISBN 5-03-003328-9
- Shchelkunovas S.N. Genų inžinerija – Novosibirskas: Sib. univ. leidykla, 2004. - 496 p.; nesveikas. ISBN 5-94087-098-8
- Patruševas L.I. Dirbtinės genetinės sistemos - M .: Nauka, 2005 - 2 tomai - ISBN 5-02-033278-X
SVARBU!
Šiame skyriuje pateikta informacija neturėtų būti naudojama savidiagnostikai ar savęs gydymui. Esant skausmui ar kitokiam ligos paūmėjimui, diagnostinius tyrimus turėtų skirti tik gydantis gydytojas. Norėdami diagnozuoti ir tinkamai gydyti, turite kreiptis į gydytoją.
PGR diagnostikos principai
SANTRAUKA
skyriai, 34 puslapiai, 5 paveikslai, 5 literatūros šaltiniai
Šio darbo tikslas – trumpai apibendrinti PGR metodo pagrindiniai principai ir technologinės ypatybės, mokslinis ir praktinis pritaikymas infekcinių ligų diagnostikoje.
SUTARTINIŲ TRUMPINIŲ SĄRAŠAS
HCV – hepatito C virusas
dATP – deoksiadenozino trifosfatas
dGTP – deoksiguanozino trifosfatas
dNTP – deoksinukleotido trifosfatas
dTTP – deoksitimidino trifosfatas
dCTP – deoksicitozino trifosfatas
DNR – dezoksiribonukleino rūgštis
PGR - polimerazės grandininė reakcija
RNR – ribonukleorūgštis – imunoglobulino klasė GTime PGR – realaus laiko PGR metodas
ĮVADAS
PGR METODO PRINCIPAS
PGR ANALIZĖS ETAPAI
REALIOJI LAIKAS PGR METODAS
PGR METODO PRIVALUMAI
PGR METODO APRIBOJIMAI
PGR METODO TAIKYMAS
IŠVADA
NAUDOTOS LITERATŪROS SĄRAŠAS
ĮVADAS
Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodo atradimas tapo vienu ryškiausių įvykių molekulinės biologijos srityje pastaraisiais dešimtmečiais. Tai leido pakelti medicininę diagnostiką į kokybiškai naują lygį. Polimerazės grandininės reakcijos metodo principą sukūrė Carrie Mullis 1983 m. Už PGR analizės kūrimą K. Mullis 1993 metais buvo apdovanotas Nobelio chemijos premija.
Po PGR atradimo jis labai greitai buvo pritaikytas praktiškai. Metodas tapo toks populiarus, kad šiandien sunku įsivaizduoti darbą molekulinės biologijos srityje be jo naudojimo. PGR metodas ypač sparčiai išplėtotas tarptautinės programos „Žmogaus genomas“ dėka. Sukurtos modernios lazerinės sekos nustatymo (DNR nukleotidų sekų iššifravimo) technologijos. Jei neseniai 250 bazinių porų (bp) DNR sekai iššifruoti prireikdavo savaitės, tai šiuolaikiniai lazeriniai sekvenatoriai gali nustatyti iki 5000 bp. per dieną. Tai savo ruožtu prisideda prie reikšmingo informacijos duomenų bazių, kuriose yra DNR sekos, augimo. Šiuo metu buvo pasiūlytos įvairios PGR modifikacijos, parodyta galimybė sukurti mikroorganizmų aptikimo, taškinių mutacijų nustatymo testų sistemas, aprašyta dešimtys galimų metodo pritaikymų.
PGR metodo atsiradimą lėmė tam tikri pasiekimai molekulinės genetikos srityje, pirmiausia daugelio mikroorganizmų genomų nukleotidų sekos dekodavimas. Reikia pažymėti, kad šį atradimą lydėjo kai kurių technologijų kūrimas. Visų pirma, prietaisų, leidžiančių automatiškai sintezuoti viengrandžius DNR fragmentus (oligonukleotidus), atsiradimas. Per tą patį laikotarpį buvo aptikti unikalūs mikroorganizmai, gyvenantys geizeriuose. Jų fermentinė sistema, ypač DNR polimerazė, atlaiko aukštą karštųjų versmių temperatūrą ir išlaiko savo biologinį aktyvumą iki 95°C, o tai yra būtina polimerazės grandininės reakcijos sąlyga.
Polimerazės grandininė reakcija šiuo metu yra pažangiausias molekulinės biologijos, molekulinės genetikos ir klinikinės laboratorinės diagnostikos diagnostikos metodas, leidžiantis aptikti pavienes daugelio infekcinių ligų sukėlėjų ląsteles audiniuose ir biologiniuose organizmo skysčiuose.
PGR metodas pagrįstas papildomu patogeno genominės DNR arba RNR dalies užbaigimu, atliekamu in vitro naudojant fermentą termostabilią DNR polimerazę. Metodo specifiškumą lemia aptiktų infekcinių sukėlėjų genetinės medžiagos, į kurią atrenkami amplifikacijos procese dalyvaujantys oligonukleotidiniai pradmenys, unikalumas.
Infekcinių ligų, tarp jų ir sukeliamų sunkiai kultivuojamų sukėlėjų, diagnostika, mikroorganizmų genotipų nustatymas, jų virulentiškumo įvertinimas, mikrofloros atsparumo antibiotikams nustatymas, prenatalinė diagnostika, biologinė kraujo produktų kontrolė – tai nepilnas medicinos sričių sąrašas. naudojant PGR. Iki šiol PGR analizė išlieka labiausiai paplitusi ir dinamiškai besivystanti technologija. Kasmet rinkoje pasirodo dešimtys naujų PGR analizės tyrimų sistemų, skirtų tiek įvairių ligas sukeliančių mikroorganizmų nukleotidų sekoms nustatyti, tiek žmogaus genams tirti. PGR analizės kaina nuolat mažėja, todėl šis metodas vis dažniau naudojamas medicinos ir diagnostikos įstaigose. PGR laboratorijų skaičius NVS šalyse auga eksponentiškai ir, matyt, artimiausiu metu PGR analizė taps vienu iš labiausiai paplitusių laboratorinės diagnostikos metodų.
1. PGR METODO PRINCIPAS
Polimerazės grandininė reakcija yra metodas, imituojantis natūralų DNR replikaciją ir leidžiantis aptikti vieną specifinę DNR molekulę, dalyvaujant milijonams kitų molekulių.
Metodo esmė yra pakartotinis tam tikrų DNR segmentų kopijavimas (amplifikavimas) mėgintuvėlyje kartotinių temperatūros ciklų procese. Kiekviename amplifikacijos cikle anksčiau susintetintus fragmentus atkuria DNR polimerazė. Dėl to daug kartų padidėja specifinių DNR fragmentų skaičius, o tai labai supaprastina tolesnę analizę.
PGR metodas pagrįstas natūraliu procesu – papildomu DNR šablono užbaigimu, atliekamu DNR polimerazės fermento pagalba. Ši reakcija vadinama DNR replikacija.
Natūrali DNR replikacija susideda iš kelių etapų:
) DNR denatūravimas (dvigubos spiralės išsivyniojimas, DNR grandinių divergencija);
) Trumpų dvigrandžių DNR sekcijų formavimas (sėklos, reikalingos DNR sintezei inicijuoti);
) Naujos DNR grandinės sintezė (abiejų grandžių komplementarus užbaigimas).
Šis procesas gali būti naudojamas trumpų DNR fragmentų, būdingų konkretiems mikroorganizmams, kopijoms, t.y. atlikti tikslinę tokių specifinių sričių paiešką, kuri yra genų diagnostikos tikslas identifikuoti infekcinių ligų sukėlėjus.
Termostabilios DNR polimerazės (Taq polimerazės) atradimas iš termofilinių bakterijų Thermisaquaticus, kurio optimalus yra 70-72°C, leido DNR replikacijos procesą paversti ciklišku ir panaudoti darbui in vitro. Sukūrus programuojamus termostatus (stiprintuvus), kurie pagal tam tikrą programą vykdo ciklinius temperatūros pokyčius, sudarė prielaidas plačiai taikyti PGR metodą laboratorinės klinikinės diagnostikos praktikoje. Kartojant sintezės ciklus, eksponentiškai padidėja konkretaus DNR fragmento kopijų skaičius, o tai leidžia gauti pakankamai DNR kopijų jų identifikavimui iš nedidelio kiekio analizuojamos medžiagos, kurioje gali būti viena. mikroorganizmų ląstelės. Papildomas grandinės užbaigimas neprasideda bet kuriame DNR sekos taške, o tik tam tikruose pradiniuose blokuose – trumpose dvigrandėse atkarpose. Tokius blokus prijungus prie konkrečių DNR sričių, naujos grandinės sintezės procesą galima nukreipti tik šioje srityje, o ne per visą DNR grandinės ilgį. Pradiniams blokams tam tikrose DNR srityse sukurti naudojami du oligonukleotidų pradmenys (20 nukleotidų porų), vadinami pradmenimis. Pradmenys papildo DNR sekas kairėje ir dešinėje konkretaus fragmento ribose ir yra orientuoti taip, kad naujos DNR grandinės užbaigimas įvyktų tik tarp jų. Taigi, PGR yra daugkartinis specifinės DNR srities kopijų skaičiaus padidėjimas (amplifikacija), katalizuojamas DNR polimerazės fermento. . PGR ANALIZĖS ETAPAI
Analizės metodas, naudojant PGR metodą, apima tris etapus: 1.
DNR (RNR) išskyrimas iš klinikinio mėginio; 2.
Specifinių DNR fragmentų amplifikacija; .
Stiprinimo produktų aptikimas. . DNR (RNR) išskyrimas Šiame analizės etape klinikinis mėginys yra specialiai apdorojamas, dėl kurio ląstelinė medžiaga lizuojama, pašalinamos baltymų ir polisacharidų frakcijos ir paruošiamas DNR arba RNR tirpalas, kuriame nėra inhibitorių ir paruoštas tolesniam amplifikavimui. . DNR (RNR) ekstrahavimo technikos pasirinkimą daugiausia lemia apdorotos klinikinės medžiagos pobūdis. 2. Specifinių DNR fragmentų amplifikacija Šiame etape sukaupiami trumpi specifiniai DNR fragmentai, kurių reikia tolesniam jų aptikimui. Norint atlikti polimerazės grandininę reakciją, reakcijos mišinyje turi būti keletas komponentų: · Gruntai- dirbtinai susintetinti oligonukleotidai, kurių dydis paprastai yra nuo 15 iki 30 bp, identiški atitinkamoms tikslinės DNR sekcijoms. Jie atlieka pagrindinį vaidmenį formuojant amplifikacijos reakcijos produktus. Tinkamai parinkti pradmenys užtikrina tyrimo sistemos specifiškumą ir jautrumą. · Taq polimerazė- termostabilus fermentas, užtikrinantis 3 užbaigimą - antrosios DNR grandinės pabaiga pagal komplementarumo principą. · Deoksinukleotido trifosfatų (dNTP) mišinys- deoksiadenozino trifosfatas (dATP), deoksiguanozino trifosfatas (dGTP), deoksicitozino trifosfatas (dCTP) ir deoksitimidino trifosfatas (dTTP) - "statybinė medžiaga", kurią Taq polimerazė naudoja antrajai DNR grandinei sintezuoti. · Buferis –tam tikros koncentracijos katijonų ir anijonų mišinys, užtikrinantis optimalias reakcijos sąlygas, taip pat stabilią pH vertę. · Mėginys analizuojamas- preparatas, paruoštas įvedimui į reakcijos mišinį, kuriame gali būti norimos DNR, pavyzdžiui, mikroorganizmų DNR, kuri tarnauja kaip vėlesnio daugkartinio kopijavimo taikinys. 1 pav. Reakcijos mišinio komponentai Kiekvienas stiprinimo ciklas apima 3 etapus, vykstančius skirtingomis temperatūros sąlygomis: 1 etapas:DNR denatūracija
(dvigubos spiralės išvyniojimas). Jis teka 93-95°C temperatūroje 30-40 sekundžių. Viena iš grandinių (+) naudojama kaip pagrindinė matrica. Jo penkis strypų galus fiksuoja DNR polimerazės fermentas, kuris užtikrina antrosios DNR grandinės konstravimą iš atskirų nukleotidų, papildančių pirmąją. Tas pats, tik priešinga kryptimi, vyksta antroje DNR grandinėje, tačiau kadangi DNR molekulės išvyniojimas vyksta atvirkštine tvarka, nauja grandinė yra pastatyta iš mažų fragmentų, kurie vėliau susiuvami. Kad DNR polimerazės fermentas pradėtų veikti, reikalingas pradmuo arba pradmuo - mažas viengrandė DNR fragmentas, kuris, susijungęs su vienos iš pirminės DNR grandinės komplementaria dalimi, sudaro pradinį bloką dukters auginimui. sruoga. 2 etapas:Gruntų tvirtinimas (atkaitinimas).
Pradmenų prijungimas vyksta papildant atitinkamas sekas priešingose DNR grandinėse tam tikros srities ribose. Kiekviena gruntų pora turi savo atkaitinimo temperatūrą, kurios reikšmės yra 50-65°C diapazone. Tiksliai apskaičiuota ir eksperimentiškai patikrinta pradmenų atkaitinimo temperatūra yra viena iš reakcijos specifiškumą lemiančių charakteristikų, neleidžiančių pradmenų prisijungti prie nevisiškai komplementarių sekų. Kadangi dukterinės DNR grandinės gali pratęsti abiejose pirminės DNR grandinėse vienu metu, pradmenis taip pat reikalingas, kad DNR polimerazė veiktų antroje grandinėje. Taigi į reakcijos mišinį pridedami du pradmenys. Tiesą sakant, pradmenys, sujungę priešingas DNR molekulės grandines, apsiriboja ta jos dalimi, kuri vėliau bus pakartotinai padvigubinta arba amplifikuojama. Tokie DNR fragmentai vadinami amplikonais. Amplikono ilgis gali būti keli šimtai nukleotidų. Pakeitę pradmenų porą, nuo vieno patogeno analizės galime pereiti prie kito patogeno analizės. Atkaitinimo laikas -20-60 sek. 3 etapas:DNR grandinių susidarymas (pailgėjimas).
Kopijavimo mechanizmas yra toks, kad papildomos grandinės pratęsimas gali prasidėti ne bet kuriame DNR sekos taške, o tik tam tikruose pradiniuose blokuose (trumpose dvigrandėse atkarpose). Pradiniams blokams tam tikrose DNR srityse sukurti naudojami pradmenys, kurie yra apie 20 bp ilgio oligonukleotidai, dar vadinami pradmenimis. Jie papildo DNR sekas kairėje ir dešinėje konkretaus fragmento ribose ir yra orientuotos taip, kad DNR sintezė, vykdoma DNR polimerazės, vyktų tik tarp jų. Papildomas DNR grandinių užbaigimas vyksta kryptimi nuo 5'-galo iki 3'-galės priešingomis kryptimis, pradedant nuo pradmenų prijungimo vietų. Įvestas dezoksiribonukleotido fosfatas naudojamas kaip medžiaga naujų DNR grandinių sintezei. Šį procesą katalizuoja fermentas Tag polimerazė. Pirmajame sintezės cikle susidariusi nauja DNR tarnauja kaip antrojo ciklo pradinė medžiaga, kurioje susidaro norimas specifinis DNR fragmentas (amplikonas) ir pan. 2 pav. DNR amplifikacijos principas Šiuo metu mėginiui paruošti PGR naudojami keli metodai. Mėginio paruošimo procedūra apima mikrobų lizę ir nukleorūgščių ekstrakciją. Mikrobų ląstelėms sunaikinti naudojamas paprastas virinimas, užšaldymas-atšildymas esant lizocimui, taip pat specialūs lizės buferiai, kuriuose yra ploviklių ir proteinazės. Metodo pasirinkimą dažniausiai lemia mikrobo prigimtis, tiksliau, jo ląstelės sienelės prigimtis. B.R.Marmionetal aprašytas gryno DNR preparato gavimo būdas laikomas standartiniu ir jau tapo klasikiniu. (1993). Tai apima fermentinę proteolizę, po kurios deproteinizuojama ir DNR nusodinama alkoholiu. Šis metodas leidžia gauti gryną DNR preparatą, tačiau jis yra gana sunkus ir apima darbą su tokiomis agresyviomis ir aštriomis medžiagomis kaip fenolis ir chloroformas. Vienas populiariausių – R.Boometal pasiūlytas DNR išskyrimo būdas. (1990), pagrįsta stiprios lizuojančios medžiagos – guanidino tiocianato (GuSCN) panaudojimu ląstelių lizei ir vėlesnei DNR sorbcijai ant nešiklio (stiklo karoliukų, diatomito, stiklo „pieno“ ir kt.). Po plovimo DNR lieka mėginyje, adsorbuotame ant nešiklio, iš kurio ją galima lengvai pašalinti naudojant eliuavimo buferį. Metodas patogus, technologiškai pažangus ir tinkamas mėginių paruošimui amplifikacijai. Tačiau DNR nuostoliai galimi dėl negrįžtamos sorbcijos ant nešiklio, taip pat daugelio plovimų metu. Tai ypač svarbu dirbant su nedideliu DNR kiekiu mėginyje. Be to, net nedideli GuSCN kiekiai gali slopinti PGR, todėl naudojant šį metodą labai svarbu teisingai parinkti sorbentą ir atidžiai laikytis technologinių niuansų. Reikėtų pažymėti, kad dėl daugybės tirpalų pridėjimo ir pašalinimo etapų, dirbant su mėginiu, reikia būti atsargiems, nes galimas kryžminis mėginių ir susidarančio DNR aerozolio užteršimas. Klasikinė fenolio-chloroformo DNR ekstrahavimo procedūra užtikrina gerą DNR išgryninimą, visų pirma iš Tag-polimerazės inhibitorių, tačiau neišvengiami dideli nukleorūgščių nuostoliai, ypač pastebimi dirbant su mažo tūrio mėginiais su maža infekcinio agento koncentracija. Kita mėginių paruošimo metodų grupė yra paremta Chilex tipo (JAV) jonų mainų naudojimu, kurie, skirtingai nei stiklas, sorbuoja ne DNR, o priemaišas, trukdančias reakcijai. Paprastai šią technologiją sudaro du etapai: mėginio virinimas ir priemaišų adsorbcija ant jonų keitiklio. Metodas itin patrauklus dėl jo vykdymo paprastumo. Daugeliu atvejų jis tinkamas darbui su klinikine medžiaga. Deja, kartais yra mėginių su priemaišomis, kurių negalima pašalinti naudojant jonų mainus. Be to, kai kurių mikroorganizmų negalima sunaikinti paprastu virimu. Tokiais atvejais būtina įvesti papildomus mėginių apdorojimo etapus. Masinės atrankos metu, kai svarbu gauti statistinius duomenis, galima naudoti paprastus metodus, naudojant ploviklius arba apdorojant biologinę medžiagą šarmais, o po to juos neutralizuojant. Tuo pačiu metu tokių metodų naudojimas klinikinei diagnostikai gali sukelti klaidingai neigiamus rezultatus, nes reakcijos mišinyje naudojamas žemos kokybės DNR preparatas. Taigi mėginio paruošimo metodo pasirinkimas turėtų būti vertinamas atsižvelgiant į numatomų tyrimų tikslus. Kitos procedūros – amplifikacijos – metu į nedidelį mėgintuvėlį įvedamas patogeno DNR mėginys su komponentais, užtikrinančiais polimerazės reakciją, dviejų tipų pradmenimis, dviem fermentais (Tag polimerazė ir N-uracilo glikolazė) ir keturių tipų nukleotidu A, D, C, U. Polimerazės reakcijai atlikti naudojamas specialus prietaisas (termocikleris arba DNR stiprintuvas), kuris leidžia automatiškai pagal tam tikrą programą keisti reakcijos mišinio temperatūros režimą. Pirmajame PGR cikle mėginys kaitinamas iki 94 °C temperatūros, kad būtų atskirtos dvi viena kitą papildančios DNR grandinės. Tada temperatūra sumažinama iki 40-60°C, prie kurios pradmenys prisijungia prie vienos DNR grandinės, po to temperatūra vėl pakyla iki 72°C, kai polimerazės aktyvumas yra ryškiausias. Visas ciklas su temperatūros pokyčiais trunka mažiau nei 3 minutes. Norint teisingai įvertinti PGR rezultatus, svarbu suprasti, kad šis metodas nėra kiekybinis. Teoriškai pavienių tikslinių DNR molekulių amplifikacijos produktus elektroforezės būdu galima aptikti jau po 30–35 ciklų. Tačiau praktikoje tai daroma tik tais atvejais, kai reakcija vyksta esant idealioms sąlygoms, o tai yra retai. Ypač didelę įtaką amplifikacijos efektyvumui turi DNR preparato grynumo laipsnis; tam tikrų inhibitorių buvimas reakcijos mišinyje, kurių kai kuriais atvejais gali būti labai sunku atsikratyti. Kartais dėl jų buvimo neįmanoma amplifikuoti net dešimčių tūkstančių tikslinių DNR molekulių. Taigi dažnai nėra tiesioginio ryšio tarp pradinio tikslinės DNR kiekio ir galutinio amplifikacijos produktų kiekio. Amplifikacijos rezultatams vizualizuoti naudojami įvairūs metodai. Šiandien labiausiai paplitusi elektroforezė, pagrįsta DNR molekulių atskyrimu pagal dydį. Norėdami tai padaryti, paruošiama agarozės gelio plokštelė, kuri agarozė užšaldoma išlydžius 1,5–2,5% koncentraciją elektroforezės buferyje, pridedant specialaus DNR dažiklio, pavyzdžiui, etidžio bromido. Užšaldyta agarozė sudaro erdvinę gardelę. Pilant šukomis, gelyje susidaro specialūs šuliniai, į kuriuos vėliau dedami amplifikacijos produktai. Gelio plokštelė dedama į horizontalų gelio elektroforezės aparatą ir prijungiamas pastovios įtampos šaltinis. Neigiamai įkrauta DNR pradeda judėti gelyje nuo minuso iki pliuso. Tuo pačiu metu trumpesnės DNR molekulės juda greičiau nei ilgos. DNR judėjimo gelyje greitį įtakoja agarozės koncentracija, elektrinio lauko stiprumas, temperatūra, elektroforezės buferio sudėtis ir, kiek mažesniu mastu, DNR sudėtis. Visos vienodo dydžio molekulės juda tuo pačiu greičiu. Dažai įterpiami (interkaluojasi) plokščiomis grupėmis į DNR molekules. Pasibaigus elektroforezei, kuri trunka nuo 10 minučių iki 1 valandos, gelis dedamas ant transiliuminatoriaus filtro, skleidžiančio šviesą ultravioletinių spindulių diapazone (254 - 310 nm). UV energija, kurią sugeria DNR ties 260 nm, perduodama dažui, todėl jis fluorescuoja oranžinės-raudonoje matomo spektro srityje (590 nm). Kaip „teigiamą kontrolę“ naudokite standartinę norimo mikroorganizmo DNR. Nespecifinių amplikonų dydis gali būti didesnis arba mažesnis, palyginti su „teigiama kontrole“. Blogiausiu atveju šie matmenys gali sutapti ir elektroforezės metu nuskaitomi kaip teigiami. „Teigiama kontrolė“ leidžia įsitikinti, kad visi reakcijos mišinį sudarantys komponentai užtikrina normalią reakcijos eigą. Tuo pačiu metu DNR preparate, paruoštame PGR iš biologinės medžiagos, gali būti inhibitorių priemaišų, kurios žymiai sumažina reakcijos efektyvumą, o kai kuriais atvejais lemia specifinių amplikonų nebuvimą net ir esant norimam patogenui. Būtina kontroliuoti amplifikacijos eigą kiekviename mėgintuvėlyje su reakcijos mišiniu, kuriam naudojama papildoma, vadinamoji „vidinė kontrolė“, tai yra bet koks DNR standartas, nepanašus į norimo mikroorganizmo DNR. Infekcinėms tyrimo sistemoms kartais, pavyzdžiui, naudojamas p-globino genas, prie kurio galų, naudojant genų inžinerijos manipuliacijas, susiuvamos DNR atkarpos, homologiškos pradmenims, sudarantiems tiriamąją sistemą. Jei „vidinė kontrolė“ įvedama į reakcijos mišinį, ji taps tuo pačiu pradmenų susijungimo taikiniu, kaip ir norimo infekcinio agento chromosomų DNR. Vidinės kontrolės amplifikacijos produkto dydis parenkamas taip, kad jis būtų 2 ar daugiau kartų didesnis nei amplikonai, susidarę amplifikuojant mikroorganizmo tikslinę DNR. Dėl to, jei į reakcijos mišinį kartu su tiriamuoju mėginiu įvedama „vidinės kontrolės“ DNR, tai, nepaisant mikroorganizmo buvimo biologiniame mėginyje, „vidinė kontrolė“ sukels specifinių amplikonų susidarymą, tačiau daug ilgesnis (sunkesnis) nei mikroorganizmo amplikonas. Sunkiųjų amplikonų buvimas reakcijos mišinyje rodo normalią amplifikacijos reakcijos eigą ir inhibitorių nebuvimą. Jei nesusidarė reikiamo dydžio amplikonai ir „vidinė kontrolė“, galima daryti išvadą, kad ištirtame mėginyje yra nepageidaujamų priemaišų, kurios turėtų būti pašalintos, bet ne norimos DNR nebuvimas. Nepaisant viso šio metodo patrauklumo, jis turi reikšmingą trūkumą. Taigi, jei reikiama DNR yra reakcijos mišinyje, jos amplifikacijos efektyvumas smarkiai sumažėja dėl konkurencijos su pradmenų „vidine kontrole“. Tai iš esmės svarbu esant mažoms DNR koncentracijoms tiriamajame mėginyje ir gali sukelti klaidingai neigiamus rezultatus. Nepaisant to, jei bus išspręsta konkurencijos dėl pradmenų problema, šis stiprinimo efektyvumo kontrolės metodas tikrai bus labai naudingas. Fig.3 Antrasis DNR amplifikacijos raundas . Stiprinimo produktų aptikimas ). Horizontaliosios elektroforezės metodas Vienas iš amplifikacijos rezultatų vizualizavimo būdų yra elektroforezės metodas, pagrįstas DNR molekulių atskyrimu pagal dydį. Daugumoje metodų šiame etape amplifikacijos produktų mišinys, gautas 2-ajame etape, yra atskiriamas horizontalia agarozės gelio elektroforeze. Prieš elektroforetinį atskyrimą į amplifikacinį mišinį įpilama etidžio bromido tirpalo, kuris sudaro stiprias intersticines jungtis su dvigrandžiais DNR fragmentais. Šie junginiai, veikiami UV spinduliuotės, gali fluorescuoti, o tai užfiksuojama kaip šviečiančios juostos po amplifikacijos mišinio elektroforetinio atskyrimo agarozės gelyje. Stiprinimo produktų juostų ryškumas gali būti skirtingas. Todėl PGR laboratorijose dažnai įprasta rezultatą vertinti pagal trijų, keturių ar penkių balų sistemą. Tačiau jis negali būti siejamas su pradiniu tikslinės DNR kiekiu mėginyje. Dažnai juostų ryškumo sumažėjimas yra susijęs su amplifikacijos efektyvumo sumažėjimu veikiant inhibitoriams ar kitiems veiksniams. 4 pav. Amplifikacijos produktų aptikimas horizontalia elektroforeze ). Vertikalios elektroforezės metodas Vertikalios elektroforezės metodas iš esmės panašus į horizontaliąją elektroforezę. Jų skirtumas yra tas, kad šiuo atveju vietoj agarozės naudojamas poliakrilamidas. Jis atliekamas specialioje vertikalios elektroforezės kameroje. Poliakrilamido gelio elektroforezė pasižymi didesne skiriamąja geba nei agarozės elektroforezė ir leidžia atskirti įvairaus dydžio DNR molekules vieno nukleotido tikslumu. Poliakrilamido gelio paruošimas yra šiek tiek sudėtingesnis nei agarozės. Be to, akrilamidas yra toksiška medžiaga. Kadangi retai pasitaiko poreikis nustatyti amplifikacijos produkto dydį 1 nukleotido tikslumu, šis metodas nenaudojamas įprastame darbe. 3). Hibridizacijos zondo metodas Kaip alternatyva elektroforetiniam aptikimo metodui, kuris turi tam tikrų trūkumų: rezultatų skaitymo subjektyvumas, įvairių mikroorganizmų DNR nustatymo vienoje reakcijoje apribojimai, gali būti pasiūlytos hibridizacijos aptikimo schemos. Šiose schemose amplifikacijos metu susidaręs DNR fragmentas hibridizuojasi (sudaro 2 grandžių kompleksus – „hibridus“) su specifiniu oligonukleotido zondu. Tokie kompleksai gali būti registruojami kolorimetriškai arba fluorimetriškai. 3. REALIAUS PGR METODAS
Realaus laiko PGR metodas leidžia aptikti amplifikacijos produktus reakcijos metu ir stebėti amplikonų kaupimosi kinetiką. PGR produktui aptikti naudojami fluorescenciniai dažai, kurie suteikia fluorescenciją, kuri yra tiesiogiai proporcinga PGR produkto kiekiui – reporterio fluorescencijai. Jo generavimo mechanizmai skiriasi priklausomai nuo konkretaus realaus laiko PGR tipo. Kinetinė kreivė koordinatėse „Reporterio fluorescencijos lygis – stiprinimo ciklas“ yra S formos. Jį galima suskirstyti į tris etapus: 1.Iniciacijos stadija (kai PGR produktai dar neaptinkami fluorescencine etikete). 2.Eksponentinė stadija (kurioje yra eksponentinė fluorescencijos kiekio priklausomybė nuo PGR ciklo). .Plato (sotumo stadija). Fig.5 Fluorescencijos kinetinės kreivės grafikas naudojant realiojo laiko PGR Fluorescencinio signalo registracija atliekama stiprinant specialiame įrenginyje - stiprintuve, skirtame realaus laiko PGR. Didinant fluorescencinio signalo intensyvumą, naudojant su stiprintuvu pateiktą programinę įrangą, apskaičiuojama pradinio DNR šablono koncentracija. Realaus laiko PGR pranašumai n galimybė tiesiogiai amplifikacijos metu aptikti amplifikacijos produktų susikaupimą; n pagrindinis privalumas yra galimybė aptikti amplikonų susikaupimą neatidarant mėgintuvėlio, o tai sumažina klaidingų teigiamų rezultatų gavimo riziką dėl mėginių ir reagentų užteršimo amplifikacijos produktais; n žymiai sumažinus manipuliacijų su tiriamuoju pavyzdžiu skaičių, sutrumpėja laikas, supaprastėja analizė ir sumažėja klaidų tikimybė; n šis metodas leidžia atsisakyti elektroforezės stadijos, dėl kurios smarkiai sumažėja tiriamų mėginių užteršimo amplifikacijos produktais tikimybė; n reikalavimų PGR laboratorijoms mažinimas; n PGR tyrimo rezultatų aiškinimo objektyvumo didinimas, nes apdorojimas atliekamas naudojant įrenginio programinę įrangą; n žymiai, beveik du kartus, sutrumpėja bendras tyrimo laikas, leidžiantis gauti rezultatą per 1,5–2 valandas po klinikinės medžiagos gavimo laboratorijoje; n šis metodas leidžia pirmą kartą kiekybiškai įvertinti mikroorganizmo DNR kiekį klinikiniame mėginyje; n hibridizacijos zondų naudojimas kartu su pradmenimis padidina analizės specifiškumą; n galimybė vienu metu nepriklausomai registruoti fluorescencinį signalą iš kelių hibridizacijos DNR zondų, leidžia vieno tyrimo metu aptikti kelis skirtingus vieno ar skirtingų DNR taikinių regionus. . PGR METODO PRIVALUMAI
n Tiesioginis infekcinių ligų sukėlėjų nustatymas
PGR metodas tiesiogiai parodo specifinio patogeno DNR fragmento buvimą iš paciento paimtoje medžiagoje. n Didelis PGR specifiškumas
Taikant PGR metodą, tiriamojoje medžiagoje išskiriamas DNR fragmentas, būdingas tik konkrečiam patogenui – bakterijai ar virusui. Ši DNR dalis yra unikali ir nėra būdinga jokiai infekcijai žemėje. Specifiškumas nustatomas pagal pradmenų nukleotidų seką, kuri pašalina galimybę gauti klaidingus rezultatus, priešingai nei naudojant fermentų imuninės analizės metodą, kai dėl kryžmiškai reaguojančių antigenų klaidos nėra neįprastos. n Didelio jautrumo PGR
PGR metodas leidžia aptikti net pavienes bakterijų ar virusų ląsteles. PGR diagnostika nustato infekcinių ligų sukėlėjų buvimą tais atvejais, kai to neįmanoma padaryti kitais metodais (imunologiniais, bakteriologiniais, mikroskopiniais). PGR analizės jautrumas yra 10-1000 ląstelių viename mėginyje (imunologinių ir mikroskopinių tyrimų jautrumas yra 103-105 ląstelės). n PGR universalumas
Kadangi patogeno gali būti bet kokiose biologinėse išskyrose ir audiniuose, PGR tyrimams gali būti naudojamos praktiškai bet kokios medžiagos, įskaitant gleives, šlapimą, kraują, serumą, skreplius, ejakuliatą, epitelio ląstelių nuospaudas, kurių negalima tirti kitais metodais. n Didelis PGR analizės rezultato gavimo greitis
Atliekant PGR analizę nereikia išskirti ir auginti patogeno kultūros, o tai užtrunka daug laiko. Vieningas biomedžiagų apdorojimo ir reakcijos produktų aptikimo metodas bei amplifikacijos proceso automatizavimas leidžia atlikti pilną analizę per 4-4,5 val. n Gebėjimas diagnozuoti bet kokios rūšies infekciją
Didelis PGR metodo jautrumas leidžia diagnozuoti infekciją ne tik ūminėje ligos stadijoje, bet ir lėtines infekcijas bei net pavienių bakterijų ar virusų buvimą. Šiuo metu PGR analizės pranašumas prieš mikroorganizmų aptikimo kultūros metodą yra toks: Didesnis mikrobo aptikimo dažnis, viršijantis tą patį rodiklį naudojant kultivavimo metodą, 6-7%. Šie skirtumai paaiškinami galimu mikrobo žūtimi sandėliavimo ir transportavimo metu, o PGR gali aptikti ir negyvybingas mikroorganizmo formas. Patogenui aptikti kultūriniu metodu reikia apie 4 dienas, o naudojant PGR mikrobą galima aptikti per 4-5 valandas. Naudojant PGR technologiją, galima aptikti patogenus, tokius kaip chlamidijos, neinvaziniuose mėginiuose, pavyzdžiui, šlapimo mėginiuose. PGR metodas ypač efektyvus diagnozuojant sunkiai kultivuojamas, nekultūrinamas ir persistuojančias mikroorganizmų formas, su kuriomis dažnai susiduriama esant latentinėms ir lėtinėms infekcijoms, nes šis metodas leidžia išvengti sunkumų, susijusių su tokių mikroorganizmų auginimu laboratorijoje. n Galimybė laikyti
stebėti ir vertinti terapijos efektyvumą, ypač sergant virusinėmis ligomis. n Galimybė aptikti
atskiri virusų ir bakterijų potipiai ir padermės. n Gebėjimas apibrėžti
kelių tipų patogenai (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonasvaginalis, Ureaplasmaurealyticum) iš vieno mėgintuvėlio su biologine medžiaga. Šis metodas pagal darbo intensyvumą palyginamas su klasikiniais metodais (fermentinis imunologinis tyrimas, imunofluorescencija ir kt.), tačiau suteikia patikimesnę diagnostinę informaciją, leidžiančią klinikinėje medžiagoje tiesiogiai aptikti infekcinio sukėlėjo DNR ar RNR. Todėl PGR metodas kartu su kultūriniu metodu pripažįstamas „auksiniu standartu“ diagnozuojant infekcines ligas. 5. PGR METODO APRIBOJIMAI
· Reakcijos metu amplifikuojama tiek gyvo, tiek negyvo mikroorganizmo DNR. · Kryžminės reakcijos galimybė Pradmenų parinkimas grindžiamas turimomis žiniomis apie tam tikro ir panašių mikroorganizmų genomą. Teoriškai yra galimybė, kad tas pats fragmentas atsiras ir kituose mikroorganizmuose, kurių genomas šiuo metu nėra iššifruotas ir kurių kryžminio reaktyvumo galimybė nebuvo ištirta. Tokių mikroorganizmų buvimas mėginyje gali lemti klaidingai teigiamą tyrimo rezultatą. · Mikroorganizmų kintamumas Nors kuriant bandymo sistemą amplifikacijai naudojamas genomo fragmentas parenkamas iš labai konservuoto regiono, mikroorganizmų kintamumas gali lemti tai, kad kai kurie tiriamo patogeno genotipai ar padermės gali įgyti mutacijų amplifikuojamame genomo regione, ir taip tampa nepagaunamas šiam bandymui. Paskutiniai du punktai yra svarbūs PGR diagnostikos kūrėjams. Dabar buvo sukurti standartai, reglamentuojantys bandymų apimtį (įskaitant kryžminio reaktyvumo tyrimus, taip pat žinomų aptinkamo patogeno padermių tyrimus), kuriuos bandymų sistema turi išlaikyti prieš patekdama į rinką. 6. PGR METODO TAIKYMAS polimerazės diagnozė infekcinė liga PGR naudojamas daugelyje sričių analizei ir moksliniams eksperimentams: 1. kriminalistika PGR naudojama vadinamiesiems „genetiniams pirštų atspaudams“ palyginti. Reikalingas genetinės medžiagos mėginys iš nusikaltimo vietos – kraujo, seilių, spermos, plaukų ir kt. Jis lyginamas su įtariamojo genetine medžiaga. Užtenka labai mažo DNR kiekio, teoriškai – vienos kopijos. DNR supjaustoma į fragmentus, tada amplifikuojama PGR. Fragmentai atskiriami DNR elektroforezės būdu. Gautas DNR juostų vietos vaizdas vadinamas genetiniu pirštų atspaudu. 2. nustatant tėvystę Analizuojant PGR amplifikuotų DNR fragmentų elektroforezės rezultatus tėvas-vaikas-mama, nustatoma, kad vaikas paveldės kai kurias abiejų tėvų genetinio atspaudo ypatybes, kurios suteikia unikalų atspaudą. Nors „genetiniai pirštų atspaudai“ yra unikalūs (išskyrus identiškų dvynių atvejus), šeimos ryšius vis tiek galima užmegzti padarius kelis tokius pirštų atspaudus. Tas pats metodas su nedideliais pakeitimais gali būti taikomas evoliuciniams ryšiams tarp organizmų nustatyti. 3. medicininė diagnostika PGR leidžia žymiai pagreitinti ir palengvinti paveldimų ir virusinių ligų diagnostiką. Dominantis genas amplifikuojamas PGR, naudojant tinkamus pradmenis, o tada sekvenuojamas, kad būtų nustatytos mutacijos. Virusinės infekcijos gali būti aptiktos iškart po užsikrėtimo, likus savaitėms ar mėnesiams iki ligos simptomų atsiradimo. 4. genų klonavimas Genų klonavimas – tai genų išskyrimo ir dėl genų inžinerijos manipuliacijų didelio kiekio tam tikro geno produkto gavimo procesas. PGR naudojamas amplifikuoti geną, kuris vėliau įterpiamas į vektorių, DNR gabalėlį, pernešantį svetimą geną į tą patį organizmą arba į kitą organizmą, kurį lengva auginti. Kaip vektoriai, pavyzdžiui, naudojamos plazmidės arba virusinė DNR. Genų įterpimas į svetimą organizmą dažniausiai naudojamas šio geno produktui – RNR arba dažniausiai baltymui gauti. Tokiu būdu pramoniniais kiekiais gaunama daug baltymų, skirtų naudoti žemės ūkyje, medicinoje ir kt. 5. DNR sekos nustatymas Atliekant sekos nustatymo metodą, naudojant fluorescenciniu arba radioaktyviu būdu žymėtus dideoksinukleotidus, PGR yra neatsiejama dalis, nes būtent polimerizacijos metu į DNR grandinę įterpiami nukleotidų dariniai, pažymėti fluorescencine arba radioaktyvia žyme. Tai sustabdo reakciją, leidžiančią nustatyti konkrečių nukleotidų padėtis po sintezuotų sruogų atskyrimo gelyje. 6. mutagenezė Šiuo metu PGR tapo pagrindiniu metodu atliekant mutagenezę (įvedant pokyčius DNR nukleotidų sekoje). PGR naudojimas leido supaprastinti ir pagreitinti mutagenezės procedūrą, taip pat padaryti ją patikimesnę ir atkuriamą. 7. infekcinių ligų diagnostika PGR metodo panaudojimas diagnozuojant tiek bakterinio, tiek virusinio pobūdžio infekcines ligas turi didelę reikšmę sprendžiant daugelį mikrobiologijos ir epidemiologijos problemų. Šio metodo naudojimas taip pat prisideda prie fundamentinių tyrimų plėtotės lėtinių ir mažai ištirtų infekcinių ligų srityje. 8. virusinių ligų diagnostika Išsamiausią PGR naudą diagnozuojant virusines ligas galima įrodyti pažvelgus į hepatito C viruso (HCV) sukeltą infekcinį procesą. PGR turi ypatingą diagnostinę vertę nustatant šį virusą dėl šių priežasčių: ) HCV auginimo metodo nebuvimas; 2) antigeninės diagnostikos rinkinių nėra; 3) antikūnų prieš HCV susidarymo reakcija yra tokia lėta, kad ūminės infekcijos fazės metu diagnozė paprastai negali būti nustatyta. Todėl PGR technologijos naudojimas diagnozuojant, gydymo kokybės kontrolei ir su HCV susijusio sergamumo epidemiologinei analizei tampa visuotinai pripažintas. Tuo pačiu metu tik PGR technologija leidžia išspręsti šiuos uždavinius: 1) diagnozuoti ūminę infekciją pavėluotai nustačius antikūnus prieš HCV; 2) atlieka lėtinio hepatito C etiologinę diagnostiką pacientams, kurių imunitetas nusilpęs; 3) įvertinti antivirusinio gydymo efektyvumą; 4) nustatyti viremiją kraujo donorams, kurių aminotransferazių kiekis yra normalus; 5) nustatyti galimą kraujo produktų užterštumą; 6) įvertinti HCV pasiskirstymo platumą. 9. PGR taikymas pulmonologijoje ir ftiziologijoje Dažna atipinės pneumonijos, pasikartojančio lėtinio bronchito priežastis yra mikoplazmos ir chlamidijos. Šių patogenų diagnozė tradiciniais mikroskopijos ir kultūros metodais yra neveiksminga. PGR leidžia ne tik diagnozuoti chlamidijas ir mikoplazmozę, bet ir atlikti patogeno (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae) rūšies identifikavimą. PGR metodo naudojimas gali žymiai pagerinti ankstyvą tuberkuliozės diagnostiką. Šiuo metu yra sukurti ir rinkoje pasirodė PGR rinkiniai, skirti mikobakterijų atsparumui antibiotikams nustatyti. 10. PGR taikymas kraujo tarnybos praktikoje Donoro kraujo tyrimas dėl hepatito, sifilio, ŽIV serologiniais metodais neatmeta pavojaus panaudoti užkrėstą kraują dėl tam tikro seroneigiamo laikotarpio sergant šiomis ligomis, kurios gali trukti iki kelių savaičių nuo patogeno atsiradimo kraujo. Veiksmingiausias kraujo tyrimo, siekiant nustatyti šių patogenų buvimą, metodas yra PGR metodas. 11. PGR taikymas neonatologijoje Nėštumo metu vaisius gali užkrėsti daug mikroorganizmų. Tai citomegalovirusas, toksoplazma, herpeso virusas, raudonukės virusas, mikoplazma, chlamidijos ir kt. Serologinių tyrimų naudojimas šioms naujagimių infekcijoms nustatyti yra neveiksmingas, nes vaiko imuninė sistema susiformuoja per kelis mėnesius, o buvimas. infekcinio sukėlėjo, negali būti kartu su specifinių antikūnų gamyba. Kita vertus, motinos IgG antikūnų, galinčių pereiti placentos barjerą, naujagimio kraujyje gali būti ilgą laiką. Taigi specifinio IgG buvimas vaikui pirmaisiais gyvenimo mėnesiais nerodo ligos sukėlėjo. PGR analizės naudojimas žymiai padidina naujagimių infekcijų, įskaitant prenatalinę stadiją, diagnozavimo galimybes. 12. PGR taikymas uroginekologinėje praktikoje Tarp urogenitalinį traktą pažeidžiančių infekcijų sukėlėjų pastaruoju metu daug dėmesio skiriama latentinių ir lėtinių infekcijų sukėlėjams – chlamidijoms, mikoplazmoms. Šių sukėlėjų sukeliamoms ligoms būdingas klinikinių simptomų neryškumas, lėtinė eiga, dažnai sukelianti reprodukcinių funkcijų pažeidimus – persileidimą, nevaisingumą. Daugybė PGR metodo panaudojimo Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum aptikti tyrimų, atliktų didelėse įvairių šalių klinikose, parodė didelį šio metodo efektyvumą. Pripažįstama, kad jautrumo ir efektyvumo požiūriu PGR yra pranašesnis už kultūrinį metodą, priimtą kaip „aukso standartą“. IŠVADA
Taigi PGR technologija yra galingas įrankis, suteikiantis galimybę tirti ir diagnozuoti lėtinius infekcinius procesus, infekcinių ligų sukėlėjų ekologiją. PGR diagnostikos metodas papildo jau esamus mikrobiologinės diagnostikos metodus, kokybiškai pakeičia taikomųjų medicinos mikrobiologijos ir epidemiologijos problemų sprendimo metodiką. Atsižvelgdami į tai, kas išdėstyta, suformuluosime infekcinės patologijos tyrimų sritis, kurių sprendime PGR pradeda vaidinti pagrindinį vaidmenį. Lėtinių infekcinių ligų, kurias sukelia bakterijų ar virusų išlikimas, diagnostika. Tai yra akivaizdžiausias PGR taikymas diagnostikos tikslais. PGR yra veiksmingiausias būdas nustatyti ir tirti patogenus, kurie būdami „nekultūringoje“ būsenoje gali ten išlikti, išgyvendami nepalankias išorines sąlygas. PGR leidžia nustatyti lėtai augančių ir sunkiai kultivuojamų bakterijų atsparumą antibiotikams. Perspektyvios PGR diagnostikos praktinio panaudojimo sritys yra šios: onkologinių ligų diagnostika; Leukemijos ir limfomų diagnostika; Krūties vėžio diagnozė Kitų piktybinių ligų diagnostika; Gerybinių ir piktybinių navikų DNR diagnostiką riboja nedidelis, bet augantis informacijos kiekis apie su šiomis ligomis susijusius genus; Genetinių ligų diagnostika. Genetinių ligų diagnozė gali išsivystyti tik atlikus išsamius mokslinius žmogaus genomo tyrimus. Tačiau medikų bendruomenė jau suprato, kaip svarbu ištirti ligų genetinį pagrindą, taip pat galimybę diagnozuoti ligą ir pradėti gydymą dar nepasireiškus jos simptomams; Asmens tapatybė: teismo medicina, teismo ekspertizė; organų ir audinių transplantacija; tėvystės apibrėžimas. Ekspertai šią tendenciją DNR diagnostikos rinkoje vertina kaip vieną didžiausių ir greičiausiai augančių;
Polimerazės grandininė reakcija (PGR)
PGR metodo esmė. DNR polimerazė
Polimerazės grandininė reakcija – eksperimentinis molekulinės biologijos metodas, leidžiantis pasiekti reikšmingą mažų tam tikrų nukleorūgščių fragmentų koncentracijų padidėjimą biologinėje medžiagoje. Šis DNR kopijų skaičiaus didinimo procesas vadinamas stiprinimas. DNR kopijavimas PGR metu atliekamas specialiu fermentu - polimerazė. DNR polimerazė (3 pav.) – tai fermentas, dalyvaujantis DNR replikacijoje (DNR amplifikacijoje gyvuose organizmuose). Šios klasės fermentai katalizuoja dezoksiribonukleotidų polimerizaciją išilgai DNR nukleotidų grandinės, kurią fermentas „perskaito“ ir naudoja kaip šabloną. Naujo nukleotido tipas nustatomas pagal komplementarumo su šablonu, iš kurio atliekamas skaitymas, principą.
DNR polimerazė prideda laisvųjų nukleotidų prie 3 "surinktos grandinės galo. Dėl to grandinė pailgėja 5"-3 kryptimi. Nė viena iš žinomų DNR polimerazių nesugeba sukurti grandinės "nuo nulio": jos yra tik gali pridėti nukleotidus prie jau esančios 3"-hidroksilo grupės. Dėl šios priežasties reikia DNR polimerazės gruntas– trumpa nukleotidų seka (dažniausiai 20–25), papildanti tiriamo geno galines dalis – prie kurios ji galėtų pridėti pirmąjį nukleotidą. Pradmenys visada susideda iš DNR ir RNR bazių, o pirmosios dvi bazės visada yra RNR bazės. Pradmenis sintetina kitas fermentas - primasas. Kitas fermentas yra helicase- būtinas DNR dvigubos spiralės išvyniojimui susidarant viengrandei struktūrai, kuri užtikrina abiejų grandinių replikaciją pagal pusiau konservatyvų DNR replikacijos modelį.
Kai kurios DNR polimerazės taip pat turi galimybę ištaisyti klaidas naujai surinktoje DNR grandinėje. Jei aptinkama neteisinga nukleotidų pora, DNR polimerazė pasisuka vienu žingsniu atgal, pašalina iš grandinės netinkamą nukleotidą, tada į jo vietą įterpia tinkamą, o po to replikacija tęsiasi kaip įprasta.
PGR atlikimas
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) – tai DNR amplifikacijos metodas, leidžiantis per kelias valandas išskirti ir padauginti tam tikrą DNR seką milijardus kartų. Galimybė gauti daugybę vieno griežtai apibrėžto genomo regiono kopijų labai supaprastina esamo DNR mėginio tyrimą.
Kad polimerazės grandininė reakcija įvyktų, turi būti įvykdytos kelios sąlygos. Paprasčiausiu atveju PGR reikalingi šie komponentai:
DNR šablonas, kuriame yra amplifikuotinos DNR dalis.
Du pradmenys, papildantys norimo fragmento galus. (Dirbtinai susintetintų oligonukleotidų pora, dažniausiai 15–30 bp dydžio, identiškų tikslinės DNR atitinkamoms sritims. Jie atlieka pagrindinį vaidmenį formuojantis amplifikacijos reakcijos produktams. Tinkamai parinkti pradmenys užtikrina tyrimo specifiškumą ir jautrumą sistema.)
Termostabili DNR polimerazė. PGR naudojama polimerazė turi išlikti aktyvi aukštoje temperatūroje ilgą laiką, todėl naudojami iš termofilų išskirti fermentai - Thermus aquaticus (Taq polimerazė) ir kt.
Deoksinukleotido trifosfatai (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Mg 2+ jonai, reikalingi polimerazei veikti.
Buferinis tirpalas, užtikrinantis reikiamas reakcijos sąlygas – pH, tirpalo joninę stiprumą. Sudėtyje yra druskų, serumo albumino.
Kad reakcijos mišinys neišgaruotų, į mėgintuvėlį įpilama aukštai verdančio aliejaus, pavyzdžiui, vazelino. Jei naudojamas prietaisas su šildomu dangčiu, to nereikia.
Pirofosfatazės pridėjimas gali padidinti PGR reakcijos išeigą. Šis fermentas katalizuoja pirofosfato, šalutinio produkto, pridedant nukleotidų trifosfatų prie augančios DNR grandinės, hidrolizę į ortofosfatą. Pirofosfatas gali slopinti PGR reakciją.
Norint padauginti pradinės DNR kopijų skaičių, reikalinga ciklinė reakcija. Paprastai kiekvienas iš eilės kartojamas PGR ciklas susideda iš trijų etapų:
1. Denatūracija arba DNR „lydymas“. Dvigubos grandinės DNR šablonas kaitinamas iki 94–96 °C (arba 98 °C, jei naudojama ypač termostabili polimerazė) 0,5–2 minutes, kad DNR grandinės galėtų atsiskirti. Šis žingsnis vadinamas denatūravimu, nes nutrūksta vandenilio ryšiai tarp dviejų DNR grandžių. Kartais prieš pirmąjį ciklą (prieš pridedant polimerazę) reakcijos mišinys pašildomas 2–5 minutes, kad visiškai denatūruotų šabloną ir pradmenis. Šis požiūris vadinamas karšta pradžia, tai leidžia sumažinti nespecifinių reakcijos produktų kiekį.
2. Atkaitinimas – pradmenų prisijungimas prie šabloninės DNR. Kai sruogos atsiskiria, temperatūra lėtai mažinama, kad gruntai galėtų prisijungti prie viengubo šablono. Atkaitinimo temperatūra priklauso nuo grunto sudėties ir dažniausiai parenkama 50–65°C. Scenos laikas - 20 - 60 sekundžių. Neteisingai pasirinkus atkaitinimo temperatūrą, pradmenys prastai prisiriša prie šablono (aukštesnėje temperatūroje), arba susiriša netinkamoje vietoje ir atsiranda nespecifinių produktų (žemoje temperatūroje).
3. Sintezė (grandinės pailgėjimas). DNR polimerazė replikuoja šablono grandinę, naudodama pradmenį kaip „sėklą“. Polimerazė pradeda antrosios grandinės sintezę nuo 3" grunto galo, kuris prisijungė prie šablono ir juda palei šabloną. Pailgėjimo temperatūra priklauso nuo polimerazės. Dažniausiai naudojamos Taq ir Pfu polimerazės aktyviausios 72 °C. amplifikuojamo fragmento ilgis Paprastai pailgėjimo laikas yra viena minutė kiekvienai tūkstančiui bazinių porų. Pasibaigus visiems ciklams, dažnai atliekamas papildomas veiksmas galutinis pailgėjimas užbaigti visus viengrandžius fragmentus. Šis etapas trunka 7-10 minučių.
Vėliau denatūravimo, atkaitinimo ir pailgėjimo etapai kartojami daug kartų (30 ir daugiau kartų). Kiekviename cikle susintetintų DNR fragmento kopijų skaičius padvigubėja.
Visos reakcijos atliekamos mėgintuvėliuose, panardintuose į termostatą. Temperatūros režimo keitimas ir jo priežiūra vykdoma automatiškai.
Norint tiksliai suprasti, kaip vyksta tam tikro DNR segmento amplifikacija PGR metu, būtina aiškiai suprasti visų pradmenų ir jų papildomų sekų padėtį amplifikuojamose grandinėse kiekviename raunde. Pirmajame raunde kiekviena naujai susintetinta grandinė yra daug ilgesnė nei atstumas nuo jos pradmens 3" hidroksilo grupės iki antrajam pradmeniui komplementarios sekos galinio nukleotido. Tokios grandinės vadinamos "ilgais šablonais". ant jų vyks tolesnė sintezė.
Antrajame raunde dvigrandė DNR, susidedanti iš panašių ir naujai susintetintų (ilgo šablono) grandžių, vėl denatūruojama, o po to atkaitinama pradmenimis. Šio etapo sintezės metu vėl susintetinami „ilgi šablonai“, taip pat keletas gijų, kurių viename gale yra pradmuo, o kitame – seka, kuri papildo antrąjį pradmenį („trumpieji šablonai“). Trečiojo raundo metu visi anksčiau susidarę heterodupleksai vienu metu denatūruojami ir atkaitinami pradmenimis, o po to pakartojami. Vėlesniuose turuose „trumpųjų matricų“ atsiranda vis daugiau, o 30-ajame raunde jų skaičius jau yra 10 6 kartus didesnis nei pradinių grandinių arba „ilgų matricų“.
Specifinio reakcijos produkto kiekis (ribojamas pradmenų) teoriškai proporcingai didėja iki 2 n , kur n yra reakcijos ciklų skaičius. Tiesą sakant, kiekvieno ciklo efektyvumas gali būti mažesnis nei 100%, todėl iš tikrųjų:
kur P – produkto kiekis, E – vidutinis ciklo efektyvumas.
Auga ir „ilgųjų“ DNR kopijų skaičius, bet tiesiškai, todėl reakcijos produktuose dominuoja specifinis fragmentas. Reikalingo produkto augimą eksponentiškai riboja reagentų kiekis, inhibitorių buvimas ir šalutinių produktų susidarymas.
PGR yra labai jautrus metodas, todėl, jei tiriamajame mėginyje yra net nežymus DNR kiekis, kuris atsitiktinai pateko iš vieno reakcijos mišinio į kitą, galima gauti klaidingai teigiamus rezultatus. Dėl to būtina atidžiai kontroliuoti visus PGR naudojamus tirpalus ir indus.
Pagrindiniai grunto parinkimo principai.
Kuriant PGR testavimo sistemą, viena iš pagrindinių užduočių yra teisingas pradmenų pasirinkimas, kuris turi atitikti keletą kriterijų:
1. Gruntai turi būti specifiniai. Ypatingas dėmesys skiriamas 3" pradmenų galams, nes būtent nuo jų Taq polimerazė pradeda užbaigti komplementarią DNR grandinę. Jei jų specifiškumas yra nepakankamas, greičiausiai mėgintuvėlyje su reakcijos mišiniu įvyks nepageidaujami procesai. , būtent nespecifinės DNR (trumpų ar ilgų fragmentų) sintezė.Jis matomas elektroforezės metu sunkių ar lengvų papildomų juostų pavidalu.Tai apsunkina reakcijos rezultatų įvertinimą, nes lengva supainioti konkrečią amplifikacijos produktas su susintetinta svetima DNR. Kai kurie pradmenys ir dNTP sunaudojami nespecifinės DNR sintezei, todėl labai prarandamas jutimas.
2. Gruntai neturi formuoti dimerų ir kilpų, t.y. nereikėtų formuoti stabilių dvigubų sruogų, atkaitinant gruntus prie savęs ar vienas su kitu.
Pastaruoju metu sukurtas patikimas, itin jautrus ir greitas įvairių žmonių infekcinių ligų diagnostikos metodas. Šis metodas vadinamas „PGR analize“. Kas tai yra, kokia jo esmė, kokius mikroorganizmus jis gali atskleisti ir kaip teisingai jį vartoti, pasakysime mūsų straipsnyje.
Atradimų istorija
Taip pat PGR metodai naudojami diagnozuojant vėžį.
Metodo privalumai
PGR diagnostika turi keletą privalumų:
- Didelis jautrumas. Net ir esant tik kelioms mikroorganizmo DNR molekulėms, PGR analizė nustato infekcijos buvimą. Metodas padės sergant lėtinėmis ir latentinėmis ligomis. Dažnai tokiais atvejais mikroorganizmas yra kitaip nekultūringas.
- Tyrimui tinka bet kokia medžiaga, pavyzdžiui, seilės, kraujas, lytinių organų išskyros, plaukai, epitelio ląstelės. Dažniausias yra kraujo tyrimas ir urogenitalinės sistemos tepinėlis PGR.
- Ilgalaikis pasėlių auginimas nereikalingas. Automatizuotas diagnostikos procesas leidžia gauti tyrimo rezultatus po 4-5 valandų.
- Metodas yra beveik 100% patikimas. Užregistruoti tik pavieniai klaidingai neigiami rezultatai.
- Galimybė iš vieno medžiagos mėginio identifikuoti kelių rūšių patogenus. Tai ne tik pagreitina ligos diagnozavimo procesą, bet ir žymiai sumažina materialines išlaidas. Dažnai gydytojas skiria išsamią PGR analizę. Tyrimo, susidedančio iš šešių patogenų nustatymo, kaina yra apie 1500 rublių.
- Prieš dovanojant seiles, likus 4 valandoms iki medžiagos vartojimo reikia nevalgyti ir nevartoti vaistų. Prieš pat procedūrą praskalaukite burną virintu vandeniu.
- Aukščiau pateiktų taisyklių reikėtų laikytis ir imant mėginį iš vidinio skruosto paviršiaus. Po skalavimo rekomenduojama atlikti lengvą odos masažą, kad būtų išryškinta liaukos paslaptis.
- Šlapimas dažniausiai renkamas namuose. Norėdami tai padaryti, turite atlikti išsamų lytinių organų tualetą. Surinkite 50-60 ml šlapimo į sterilų plastikinį indą. Siekiant užtikrinti medžiagos grynumą, moterims rekomenduojama į makštį įkišti tamponą, o vyrams kuo toliau traukti odos raukšlę. Jūs negalite vartoti medžiagos menstruacijų metu.
- Norėdami paaukoti spermą, turite susilaikyti nuo lytinių santykių 3 dienas prieš rinkdami medžiagą. Medikai taip pat pataria nesilankyti pirtyje ir maudytis karštoje vonioje, gerti alkoholį ir aštrų maistą. Likus 3 valandoms iki analizės, turite susilaikyti nuo šlapinimosi.
- Pavyzdžiui, gimdant, jei PGR tyrimas atliekamas dėl chlamidijų, tiek moterims, tiek vyrams rekomenduojama 3 dienas lytiškai pailsėti. Prieš 2 savaites iki analizės negalima vartoti antibakterinių vaistų. Savaitę reikia nustoti naudoti intymius gelius, tepalus, makšties žvakutes, plovimą. Likus 3 valandoms iki tyrimo, turite susilaikyti nuo šlapinimosi. Menstruacijų metu medžiagos mėginiai nėra imami, tik praėjus 3 dienoms po kraujo nutekėjimo nutraukimo galima paimti urogenitalinį tepinėlį.
Kad PGR tyrimo rezultatai būtų patikimi, būtina atlikti analizę, laikantis rekomendacijų dėl išankstinio pasirengimo diagnozei:
PGR nėštumo metu
Besilaukiant kūdikio daugelis lytiniu keliu plintančių infekcijų yra itin pavojingos normaliam vaisiaus vystymuisi. LPL gali išprovokuoti intrauterinį augimo sulėtėjimą, persileidimą ar priešlaikinį gimdymą, įgimtus vaiko apsigimimus. Todėl labai svarbu ankstyvuoju nėštumo laikotarpiu atlikti PGR tyrimą. Registruojantis būtina išlaikyti analizę - iki 12 savaičių.
Medžiaga paimama iš gimdos kaklelio kanalo naudojant specialų šepetėlį. Procedūra neskausminga ir nekelia pavojaus kūdikiui. Paprastai nėštumo metu PGR metodu atliekama chlamidijų analizė, taip pat ureaplazmozė, mikoplazmozė, citomegalovirusas, herpesas, papilomos virusas. Toks tyrimų kompleksas vadinamas PGR-6.
PGR ŽIV diagnozei
Dėl to, kad metodas yra labai jautrus organizmo pokyčiams ir diagnozės sąlygoms, rezultatui įtakos gali turėti daug veiksnių. Todėl PGR analizė ŽIV infekcijai nustatyti nėra patikimas metodas, jos efektyvumas siekia 96-98%. Likusiais 2–4% atvejų testas duoda klaidingai teigiamus rezultatus.
Tačiau kai kuriose situacijose negalima išsiversti be PGR ŽIV diagnostikos. Paprastai jis skiriamas žmonėms, kurių ELISA rezultatas yra klaidingai neigiamas. Tokie rodikliai rodo, kad žmogus dar nesusikūrė antikūnų prieš virusą ir jų negalima aptikti daugkartiniam jų skaičiaus padidėjimui. Būtent tai galima pasiekti atliekant kraujo tyrimą PGR metodu.
Tokia diagnostika būtina ir pirmųjų gyvenimo metų vaikams, gimusiems iš ŽIV užsikrėtusios motinos. Šis metodas yra vienintelis būdas patikimai nustatyti vaiko statusą.
PGR hepatitui diagnozuoti
Polimerazės grandininės reakcijos metodas leidžia aptikti hepatito A, B, C viruso DNR dar gerokai prieš susiformuojant antikūnams prieš infekciją ar pasireiškus ligos simptomams. Hepatito C PGR analizė yra ypač efektyvi, nes 85% atvejų ši liga yra besimptomė ir, laiku negydant, pereina į lėtinę stadiją.
Laiku aptiktas patogenas padės išvengti komplikacijų ir ilgalaikio gydymo.
Išsamus PGR tyrimas
Išsami PGR analizė: tyrimas polimerinės grandininės reakcijos metodu, kuris apima kelių tipų infekcijų nustatymą vienu metu: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, citomegalovirusas, 1 ir 2 tipo herpes, gonorėja, papilomos virusas. Tokios diagnostikos kaina svyruoja nuo 2000 iki 3500 rublių. priklausomai nuo klinikos, naudojamų medžiagų ir įrangos, taip pat nuo analizės tipo: kokybinė ar kiekybinė. Ko reikia Jūsų atveju – nuspręs gydytojas. Kai kuriais atvejais pakanka tik nustatyti patogeno buvimą, kitais, pavyzdžiui, užsikrėtus ŽIV, svarbų vaidmenį atlieka kiekybinis titras. Diagnozuojant visus minėtus patogenus, tyrimas vadinamas „PGR-12 analize“.
Analizės rezultatų iššifravimas
Iššifruoti PGR analizę nėra sunku. Rodiklio yra tik 2 skalės – „teigiamas rezultatas“ ir „neigiamas rezultatas“. Nustačius patogeną, gydytojai gali 99% tikrumu patvirtinti ligos buvimą ir pradėti gydyti pacientą. Taikant kiekybinį infekcijos nustatymo metodą, atitinkamame stulpelyje bus nurodytas skaitinis aptiktų bakterijų rodiklis. Tik gydytojas gali nustatyti ligos laipsnį ir paskirti reikiamą gydymą.
Kai kuriais atvejais, pavyzdžiui, nustatant ŽIV infekciją PGR, esant neigiamam rezultatui, norint patvirtinti gautus rodiklius, reikia atlikti papildomus tyrimus.
Kur atlikti analizę?
Kur atlikti PGR analizę: valstybinėje klinikoje ar privačioje laboratorijoje? Deja, savivaldybių gydymo įstaigose įranga ir metodai dažnai yra pasenę. Todėl geriau teikti pirmenybę privačioms laboratorijoms su modernia įranga ir aukštos kvalifikacijos personalu. Be to, privačioje klinikoje rezultatų pasieksite daug greičiau.
Maskvoje daugelis privačių laboratorijų siūlo įvairių infekcijų PGR analizę. Pavyzdžiui, tokiose klinikose kaip Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro, atliekama PGR analizė. Tyrimo kaina nuo 200 rublių. vieno patogeno identifikavimui.
Galima daryti išvadą, kad infekcinių ligų diagnostika PGR metodu daugeliu atvejų yra greitas ir patikimas būdas aptikti patogeną organizme ankstyvose infekcijos stadijose. Tačiau vis tiek tam tikrais atvejais verta rinktis kitus diagnostikos metodus. Tik specialistas gali nustatyti tokio tyrimo poreikį. PGR analizės iššifravimas taip pat reikalauja profesionalaus požiūrio. Laikykitės gydytojo nurodymų ir nedarykite jums nereikalingų tyrimų.