Esant teigiamam RSC eksperimente stebimas. Komplemento fiksavimo reakcija

Komplemento fiksavimo reakcija (RCC) pagrįsta tuo, kad specifinis antigeno-antikūno kompleksas visada adsorbuoja (suriša) komplementą ant savęs.

Ši reakcija plačiai naudojama nustatant antigenus ir infekcijų, ypač ligų *, kurias sukelia spirochetai (Wassermann reakcija), riketsijos ir virusai, serodignozuoti.

RSK yra sudėtinga serologinė reakcija. Tai apima komplementą ir dvi antigenų-antikūnų sistemas. Iš esmės tai yra dvi serologinės reakcijos.

Pirmoji sistema, pagrindinė, susideda iš antigeno ir antikūno (viena žinoma, kita ne). Prie jo pridedamas tam tikras papildo kiekis. Kai šios sistemos antigenas ir antikūnas sutampa, jie sujungs ir suriš komplementą. Gautas kompleksas yra smulkiai išsklaidytas ir nesimato.

Šio komplekso susidarymas yra žinomas antrosios hemolizinės arba indikatorinės sistemos pagalba. Jį sudaro avių eritrocitai (antigenas) ir atitinkamas hemolizinis serumas (antikūnas), t.y. paruoštas imuninis kompleksas. Šioje sistemoje eritrocitų lizė gali vykti tik esant komplementui. Jei komplementas yra surištas su pirmąja sistema (jei joje atitinka antigeną ir antikūną), antroje sistemoje hemolizės nebus - nes nėra laisvo komplemento. Hemolizės nebuvimas (vamzdelio turinys drumstas arba vamzdelio apačioje yra eritrocitų nuosėdų) registruojamas kaip teigiamas RSK rezultatas.

Jei pirmoje sistemoje antigenas nesutampa su antikūnu, tai imuninis kompleksas nesusidaro ir komplementas liks laisvas! Likęs laisvas, komplementas dalyvauja antroje sistemoje, sukeldamas hemolizę - RSK rezultatas yra neigiamas (vamzdelių turinys yra skaidrus - „lako kraujas“).

Komplemento fiksavimo reakcijos komponentai:

Antigenas – dažniausiai lizatas, ekstraktas, haptenas; rečiau padėkite ragelį.

1.Paciento sistemos antikūnų serumas
2. Komplementas – jūrų kiaulytės serumas

3. Antigenas – avies eritrocitai

4.Antikūnas – hemolizinas į avino eritrocitus

5. Izotoninis tirpalas

Atsižvelgiant į tai, kad RSC dalyvauja daug sudėtingų komponentų, jie turi būti iš anksto titruojami ir paimami į reakciją tiksliais kiekiais ir vienodais tūriais: 0,5 arba 0,25, rečiau 0,2 ml. Atitinkamai, visas eksperimentas atliekamas 2,5, 1,25 arba 1,0 ml tūriais (didesni kiekiai suteikia tikslesnį rezultatą). Reakcijos komponentų titravimas atliekamas tokiu pat tūriu kaip ir eksperimentas, trūkstamas sudedamąsias dalis pakeičiant izotoniniu tirpalu.

Ingredientų paruošimas

Hemolizinis serumas (hemolizinas). Serumas skiedžiamas 3 kartus mažiau nei jo titras (žr. p. 211). Paruoškite viso eksperimento bendrą serumo praskiedimą, kurio tūris nustatomas padauginus serumo tūrį viename mėgintuvėlyje (pavyzdžiui, 0,5 ml) iš mėgintuvėlių skaičiaus, šiek tiek didesnio už jų skaičių eksperimente.

2. Avių eritrocitai. Paruoškite 3 % nuplautų avių eritrocitų suspensiją (žr. p. 211) visam eksperimento mėgintuvėlių skaičiui. Norint paruošti hemolizinę sistemą, 30 minučių prieš įtraukiant ją į eksperimentą, sumaišomi vienodi tūriai praskiestos hemolizino ir eritrocitų suspensijos, įpilant serumo į eritrocitus, kruopščiai sumaišoma ir inkubuojama 30 minučių 37°C temperatūroje.

3. Komplementas paprastai skiedžiamas santykiu 1:10. prieš kiekvieną eksperimentą jis turi būti titruojamas. Komplemento titras yra mažiausias jo kiekis, įdėjus į hemolizinę sistemą, pilna hemolizė įvyksta per 1 valandą 37°C temperatūroje. Komplemento titravimo schema pateikta 21 lentelėje.

Dėmesio! Komplimentas titruojamas tokiu pat tūriu kaip ir pagrindinis eksperimentas, trūkstamus ingredientus pakeičiant izotoniniu tirpalu.

Rezultatų apskaita. Kontrolinėse bandelėse neturėtų būti net hemolizės pėdsakų, nes vienam iš jų trūksta komplemento, o kitam – hemolizino. Kontrolė rodo, kad komponentuose nėra hemotoksinių reakcijų (gebėjimo spontaniškai lizuoti eritrocitus).

Lentelėje. Pavyzdžiui, komplemento titras praskiedus santykiu 1:10 yra 0,15 ml. Eksperimente komplemento aktyvumas gali sumažėti dėl jo nespecifinės adsorbcijos kitų reakcijos komponentų, todėl eksperimentui komplemento kiekis didinamas: imama dozė, kuri atitinka titrą. Tai yra darbinė dozė. Pateiktame pavyzdyje jis yra lygus 0,2 komplemento praskiedus santykiu 1:10. Kadangi visi CSC dalyvaujantys komponentai turi būti imami vienodais kiekiais (mūsų pavyzdyje tai yra 0:5 ml), į darbinę komplemento dozę (0,2 ml 1:10) būtina pridėti 0,3 ml izotoninio tirpalo. Visą patirtį, kiekvieno iš jų tūris (papildomas ir izotoninis tirpalas.

Viso eksperimento metu kiekvieno iš jų (komplemento ir izotoninio fiziologinio tirpalo) tūris padauginamas iš CSC dalyvaujančių mėgintuvėlių skaičiaus. Pavyzdžiui, norint atlikti eksperimentą 50 mėgintuvėlių, reikia paimti 10 ml 1:10 komplemento (0,2 ml x 50) ir 15 ml izotoninio tirpalo (0,3 ml x 50).

4. Antigenas dažniausiai gaunamas jau paruoštas, nurodant jo titrą, t.y. kiekis, kuris, praskiedus antigeną, turi būti 1 ml. pavyzdžiui, esant 0,4 titrai, jis praskiedžiamas 0,96 ml izotoninio fiziologinio tirpalo. Eksperimente imu antigeno kiekį, lygų pusei titro (0,5 ml). Tai jo darbinė dozė. Pasakykite visą antigeno praskiedimą visam bandymui, padaugindami 0,5 ml iš mėgintuvėliuose esančių mėgintuvėlių skaičiaus.

5. Antikūnas – paciento serumas. Šviežias serumas inaktyvuojamas prieš eksperimentą, kad būtų sunaikintas jame esantis komplementas. Norėdami tai padaryti, jis 30 minučių kaitinamas 56 ° C temperatūroje vandens vonioje arba inaktyvatoriuje su termostatu. Pageidautina pastarasis metodas: jis pašalina serumo perkaitimo, t.y. jo denatūravimo, galimybę. Denatūruoti serumai netinka tyrimui. Paciento serumas dažniausiai naudojamas praskiestas santykiu 1:10 – 1:160.

Lentelė Nr.14

Ingredientai, ml	mėgintuvėliai
patirtį	kontrolė
										Hemolizinė sistema	eritrocitai
Izotoninis tirpalas	1,45	1,4	1,35	1,3	1,25	1,2	1,15	1,1	1,05	1,0	1,5	1,5
Papildymas 1:10	0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3	0,35	0,4	0,45	0,5	―	0,5
Hemolizinė sistema	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	―
3% avies eritrocitų suspensija	―	―	―	―	―	―	―	―	―	―	―	0,5
Mėgintuvėliai kruopščiai sukratomi ir 1 valandą inkubuojami 37°C temperatūroje.
rezultatas	Nėra hemolizės	Hemolizė	Nėra hemolizės

Imuniniai serumai dažniausiai ruošiami pramoninėmis sąlygomis ir išleidžiami inaktyvuoti. Jie veisiami 1:50 ir daugiau.

Visi komponentai ruošiami su nedideliu pertekliumi.

Ingredientai, ml	mėgintuvėliai

Patirties kontrolė
	serumas	antigenas	Hemolizinė sistema	Papildyti darbine doze
½
1 fazės izotoninis fiziologinis tirpalas	―	0,5	0,5	1,5	1,25	1,0	0,5
Išbandytas serumas praskiestas santykiu 1:10	0,5	0,5	―	―	―	―	―
Antigenas darbinėje dozėje	0,5		0,5	―	―	―	―
Papildykite darbine doze santykiu 1:10	0,5	0,5	0,5	―	0,25	0,5	1,0
Mėgintuvėliai kruopščiai sukratomi ir inkubuojami 37 °C temperatūroje 45 min. 1 val. arba 4 °C 18 val.
2 fazės hemolizinė sistema	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Mėgintuvėliai kruopščiai sukratomi ir inkubuojami 37 °C temperatūroje iki visiškos hemolizės 2, 3, 6 ir 7 mėgintuvėliuose.
Rezultatas	Teigiamas arba neigiamas	―	―	++++	(+)	―	―

Lentelė Nr.15

Pagrindinės patirties vedimas

Kuriant eksperimentą, tai nepaprastai; svarbi sudedamųjų dalių įdėjimo tvarka. Eksperimentas atliekamas dviem etapais.

I fazė. Į mėgintuvėlius pilamas reikiamas izotoninio natrio chlorido tirpalo kiekis, po to reikiamas tūris praskiesto serumo ir tame pačiame tūryje darbinės antigeno ir komplemento dozės. Patirtį būtinai lydi visų joje dalyvaujančių ingredientų: serumo, antigeno, hemolizinės sistemos ir komplemento kontrolė.

Mėgintuvėliai kruopščiai sukratomi ir inkubuojami 37°C temperatūroje 45 min-1 val. arba 4°C temperatūroje ("CSC šaltyje") 18 val. Per tą laiką, esant specifiniam kompleksui, vyksta komplemento fiksacija. Vykdant reakciją „šaltyje“ žymiai padidėja jos jautrumas ir specifiškumas.

II etapas Inkubavimo pabaigoje į visus mėgintuvėlius įpilama 1 ml hemolizinės sistemos, kuri prieš tai 30 minučių laikoma termostate (įjautrinta). Vamzdžiai suplakami ir įdedami atgal į termostatą.

Buhalterinės apskaitos rezultatas apie val. Mėgintuvėliai paliekami termostate iki visiškos hemolizės 2, 3, 6 ir 7 mėgintuvėliuose (serumo, antigeno ir komplemento kontrolė vienai ir dviem dozėms). Visų pirma, hemolizė įvyks 7-ajame mėgintuvėlyje, kuriame yra dvigubas komplemento kiekis. Po to, kai šiame mėgintuvėlyje įvyksta hemolizė ir jo turinys tampa visiškai skaidrus, turite atidžiai stebėti likusias kontrolės priemones. Kai tik skystis 2-ame, 3-ame ir 6-ame mėgintuvėliuose tampa skaidrus, nedelsdami nuimkite stelažą su mėgintuvėliais nuo termostato. Tai, kad eksperimentas nebuvo laikomas termostate ilgiau nei būtina, rodo nedidelis drumstumas (nepilna hemolizė) 5-ajame mėgintuvėlyje - jame yra tik pusė darbinės komplemento dozės ir visiška hemolizė, tinkamai nustačius eksperimentas negali būti.

Hemolizė serume ir antigenų kontroliniuose mėginiuose (2 ir 3 mėgintuvėliuose) rodo, kad jų dozės buvo parinktos teisingai ir nei serumas, nei komplemento antigenas savaime nesijungia.

Kontroliuojant hemolizinę sistemą (4 vamzdelis), jei ji tinkamai veikia, neturėtų būti net hemolizės pėdsakų – trūksta komplemento.

Įsitikinus, kad kontrolė buvo atlikta teisingai, galima atsižvelgti į patirtį. Hemolizės nebuvimas mėgintuvėliuose yra laikomas teigiamu reakcijos rezultatu. Tai rodo, kad serume yra antikūnų, kurie yra specifiniai paimtam antigenui. Jų suformuotas kompleksas surišo komplementą ir neleido jam dalyvauti hemolizės reakcijoje. Jei mėgintuvėliuose įvyksta hemolizė, reakcijos rezultatas vertinamas kaip neigiamas. Šiuo atveju tarp antigeno ir antikūno nėra korespondencijos, komplementas nėra surištas ir dalyvauja hemolizės reakcijoje.

Lygiagrečiai su paciento serumu tas pats eksperimentas atliekamas su žinomu teigiamu serumu (tai yra su serumu, kuriame yra antikūnų prieš tam tikrą antigeną) ir žinomu neigiamu, kuriame nėra specifinių antikūnų. Teisingai nustačius eksperimentą, pirmuoju atveju hemolizė turėtų būti uždelsta, o antruoju atveju - hemolizė.

Reakcijos intensyvumas išreiškiamas taip:

Visiškas hemolizės uždelsimas. Eritrocitai sudaro vienodą drumstumą arba nusėda į dugną. Tokiu atveju skystis mėgintuvėlyje tampa bespalvis;

Lizuoja apie 25% eritrocitų. Nuosėdos mažesnės, virš jų esantis skystis švelniai rausvas. RSC rezultatas taip pat vertinamas kaip aštriai teigiamas;

Lizuoja apie 50% eritrocitų. Nuosėdos nedidelės, skystis rausvas. Teigiamas RSK rezultatas;

Lizuoja apie 75% eritrocitų. Nereikšmingos nuosėdos, virš jų intensyvios spalvos skystis. Abejotinas RSK rezultatas;

Visi eritrocitai buvo lizuojami. Skystis yra intensyvios spalvos ir visiškai skaidrus. Neigiamas RSK rezultatas.

Laboratorinė beveik visų infekcinių ligų diagnostika paremta serologinių reakcijų metodais nustatant paciento kraujyje antikūnus, kurie gaminami prieš patogeno antigenus. Jie pradėjo medicinos praktiką nuo XIX amžiaus pabaigos iki XX amžiaus pradžios.

Mokslo raida padėjo nustatyti mikrobų antigeninę struktūrą ir jų toksinų chemines formules. Tai leido sukurti ne tik gydomuosius, bet ir diagnostinius serumus. Jie gaunami laboratoriniams gyvūnams skiriant susilpnintų patogenų. Po kelių dienų poveikio iš triušių ar pelių kraujo ruošiami preparatai, kuriais serologiniais tyrimais nustatomi mikrobai ar jų toksinai.

Išorinis tokios reakcijos pasireiškimas priklauso nuo jos nustatymo sąlygų ir nuo antigenų būklės paciento kraujyje. Jei mikrobų dalelės yra netirpios, jos nusėda, lizuojasi, jungiasi arba imobilizuojasi serume. Jei antigenai yra tirpūs, atsiranda neutralizacijos arba nusodinimo reiškinys.

Agliutinacijos reakcija (RA)

Serologinė agliutinacijos reakcija yra labai specifinė. Tai paprasta atlikti ir pakankamai vaizdinė, kad būtų galima greitai nustatyti antigenų buvimą paciento kraujo serume. Jis naudojamas Vidal reakcijai (vidurių šiltinės ir paratifos diagnozei) ir Weigl (vidurių šiltinei) nustatyti.

Jis pagrįstas specifine žmogaus antikūnų (arba agliutininų) ir mikrobinių ląstelių (agliutenogenų) sąveika. Po jų sąveikos susidaro dalelės, kurios nusėda. Tai teigiamas ženklas. Reakcijai nustatyti gali būti naudojami gyvi arba nužudyti mikrobų agentai, grybai, pirmuonys ir somatinės ląstelės.

Chemiškai reakcija skirstoma į du etapus:

Specifinis antikūnų (AT) ryšys su antigenais (AG).
Nespecifinis - AG-AT konglomeratų nusodinimas, tai yra agliutinato susidarymas.

Netiesioginė agliutinacijos reakcija (IPHA)

Jo gamybai naudojami išgryninti avies eritrocitai ir žmogaus raudonieji kraujo kūneliai, iš anksto apdoroti antikūnais arba antigenais (priklauso nuo to, ką tiksliai nori rasti laborantas). Kai kuriais atvejais žmogaus raudonieji kraujo kūneliai yra gydomi imunoglobulinais. Serologinės eritrocitų reakcijos laikomos įvykusiomis, jei jos nusėdo ant vamzdelio dugno. Apie teigiamą reakciją galime kalbėti, kai ląstelės išsidėsčiusios apversto skėčio pavidalu, užimančios visą dugną. Neigiama reakcija skaičiuojama, jei eritrocitai nusėda stulpelyje arba mygtuko pavidalu dugno centre.

Kritulių reakcija (RP)

Šio tipo serologiniai tyrimai naudojami itin mažoms antigenų dalelėms aptikti. Tai gali būti, pavyzdžiui, baltymai (ar jų dalys), baltymų junginiai su lipidais ar angliavandeniais, bakterijų dalys, jų toksinai.

Serumai reakcijai gauti dirbtinai užkrečiant gyvūnus, dažniausiai triušius. Šiuo metodu galite gauti absoliučiai bet kokį nusodinantį serumą. Serologinių kritulių reakcijų nustatymas yra panašus į agliutinacijos reakcijų veikimo mechanizmą. Serume esantys antikūnai jungiasi su antigenais ir sudaro dideles baltymų molekules, kurios nusėda ant mėgintuvėlio dugno arba ant substrato (gelio). Šis metodas laikomas labai specifiniu ir gali aptikti net nereikšmingus medžiagos kiekius.

Naudojamas marui, tuliaremijai, juodligei, meningitui ir kitoms ligoms diagnozuoti. Be to, jis dalyvauja teismo medicinos ekspertizėje.

gelyje

Serologinės reakcijos gali būti atliekamos ne tik skystoje terpėje, bet ir agaro gelyje. Tai vadinama difuziniu kritulių metodu. Su jo pagalba tiriama sudėtingų antigeninių mišinių sudėtis. Šis metodas pagrįstas antigenų chemotaksiu prieš antikūnus ir atvirkščiai. Gelyje jie skirtingais greičiais juda vienas kito link ir, susitikę, formuoja kritulių linijas. Kiekviena eilutė yra vienas AG-AT rinkinys.

Egzotoksino neutralizavimo reakcija su antitoksinu (RN)

Antitoksiniai serumai gali neutralizuoti egzotoksino, kurį gamina mikroorganizmai, poveikį. Šios serologinės reakcijos yra pagrįstos tuo. Mikrobiologija šiuo metodu titruoja serumus, toksinus ir toksoidus bei nustato jų gydomąjį aktyvumą. Toksinų neutralizavimo galią lemia įprasti vienetai – AE.

Be to, šios reakcijos dėka galima nustatyti egzotoksino rūšį ar tipą. Tai vartojama sergant difterija, botulizmu. Tyrimas gali būti atliekamas tiek ant stiklo, tiek gelyje.

Lizės reakcija (RL)

Į paciento organizmą patenkantis imuninis serumas, be pagrindinės pasyvaus imuniteto funkcijos, turi ir lizuojančių savybių. Jis gali ištirpinti mikrobų agentus, ląstelių svetimkūnius ir virusus, kurie patenka į paciento kūną. Atsižvelgiant į serume esančių antikūnų specifiškumą, išskiriami bakteriolizinai, citolizinai, spirochetolizinai, hemolizinai ir kt.

Šie specifiniai antikūnai vadinami „komplementais“. Jis randamas beveik visuose žmogaus kūno skysčiuose, turi sudėtingą baltymų struktūrą ir yra itin jautrus temperatūros kilimui, drebėjimui, rūgščių poveikiui ir tiesioginiams saulės spinduliams. Tačiau išdžiovintas jis gali išlaikyti savo lizuojančias savybes iki šešių mėnesių.

Yra tokių serologinių reakcijų tipų:

Bakteriolizė;

Hemolizė.

Bakteriolizė atliekama naudojant paciento kraujo serumą ir specifinį imuninį serumą su gyvais mikrobais. Jei kraujyje yra pakankamai komplemento, tyrėjas matys, kad bakterijos lizuojasi, ir reakcija bus laikoma teigiama.

Antroji serologinė kraujo reakcija – paciento eritrocitų suspensija apdorojama serumu, kuriame yra hemolizinų, kurie aktyvuojami tik esant tam tikram komplimentui. Jei yra, tada laborantas stebi raudonųjų kraujo kūnelių tirpimą. Ši reakcija plačiai naudojama šiuolaikinėje medicinoje nustatant komplemento titrą (tai yra mažiausią jo kiekį, kuris provokuoja eritrocitų lizę) kraujo serume ir komplemento fiksacijos tyrimui. Tokiu būdu atliekama serologinė sifilio reakcija -

Komplemento fiksavimo reakcija (CFR)

Ši reakcija naudojama siekiant nustatyti antikūnus prieš infekcinį agentą paciento kraujo serume, taip pat nustatyti patogeną pagal jo antigeninę struktūrą.

Iki šiol aprašėme paprastas serologines reakcijas. RSK laikoma sudėtinga reakcija, nes joje sąveikauja ne du, o trys elementai: antikūnas, antigenas ir komplementas. Jo esmė slypi tame, kad antikūno ir antigeno sąveika vyksta tik esant komplemento baltymams, kurie adsorbuojami susidariusio AG-AT komplekso paviršiuje.

Patys antigenai, pridėjus komplemento, patiria reikšmingų pokyčių, kurie parodo reakcijos kokybę. Tai gali būti lizė, hemolizė, imobilizacija, baktericidinis arba bakteriostatinis poveikis.

Pati reakcija vyksta dviem etapais:

Antigeno-antikūno komplekso susidarymas, kuris nėra vizualiai matomas tyrėjui.
Antigeno pakeitimas veikiant komplementui. Šią fazę dažniausiai galima atsekti plika akimi. Jei reakcija vizualiai nematoma, tuomet pokyčiams nustatyti naudojama papildoma indikatorių sistema.

indikatorių sistema

Ši reakcija pagrįsta komplemento fiksavimu. Išgryninti avino eritrocitai ir hemolizinis serumas be komplemento į mėgintuvėlį įpilami praėjus valandai po RSC nustatymo. Jei mėgintuvėlyje lieka nesurišto komplemento, jis prisijungs prie AG-AT komplekso, susidarančio tarp avies kraujo ląstelių ir hemolizino, ir paskatins juos ištirpti. Tai reikš, kad RSK yra neigiamas. Jei eritrocitai liko nepažeisti, tada reakcija yra teigiama.

Hemagliutinacijos reakcija (RHA)

Yra dvi iš esmės skirtingos hemagliutinacijos reakcijos. Vienas iš jų yra serologinis, jis naudojamas kraujo grupėms nustatyti. Šiuo atveju eritrocitai sąveikauja su antikūnais.

Ir antroji reakcija netaikoma serologinei, nes raudonieji kraujo kūneliai reaguoja su virusų gaminamais hemagliutininais. Kadangi kiekvienas patogenas veikia tik specifinius eritrocitus (vištieną, avis, beždžionę), šią reakciją galima laikyti labai specifine.

Galite nustatyti, ar reakcija yra teigiama, ar neigiama pagal kraujo ląstelių vietą mėgintuvėlio apačioje. Jei jų raštas primena apverstą skėtį, vadinasi, norimas virusas yra paciento kraujyje. O jei visi eritrocitai susiformavo kaip monetos stulpelis, vadinasi, norimų ligų sukėlėjų nėra.

Hemagliutinacijos slopinimo reakcija (HITA)

Tai labai specifinė reakcija, leidžianti nustatyti virusų tipą, tipą arba specifinių antikūnų buvimą paciento kraujo serume.

Jo esmė slypi tame, kad į mėgintuvėlį su tiriamąja medžiaga įdėti antikūnai neleidžia antigenams nusodinti ant eritrocitų ir taip sustabdo hemagliutinaciją. Tai yra kokybinis specifinio specifinio dominančio viruso antigenų buvimo kraujyje požymis.

Imunofluorescencinė reakcija (RIF)

Reakcija pagrįsta gebėjimu aptikti AG-AT kompleksus po jų apdorojimo fluorochromo dažais. Šis metodas yra lengvai valdomas, nereikalauja grynosios kultūros izoliavimo ir užima mažai laiko. Tai būtina norint greitai diagnozuoti infekcines ligas.

Praktiškai šios serologinės reakcijos skirstomos į du tipus: tiesiogines ir netiesiogines.

Tiesioginis RIF yra pagamintas naudojant antigeną, kuris buvo iš anksto apdorotas fluorescenciniu serumu. Ir netiesiogiai, vaistas pirmiausia yra apdorojamas įprastine diagnostine medžiaga, kurioje yra dominančių antikūnų antigenų, o po to vėl užtepamas liuminescencinis serumas, būdingas AG-AT komplekso baltymams, ir mikroskopuojant tampa matomos mikrobų ląstelės.

Komplemento fiksavimo reakcija(RSK) yra sudėtinga dviejų pakopų serologinė reakcija. Jame naudojami penki ingredientai, sudarantys dvi sistemas: antigenas, antikūnas, komplementas (pirmoji sistema); avių eritrocitai, įjautrinti (gydomi) hemoliziniu serumu, turinčiu jiems specifinių antikūnų (antroji, arba indikatorinė, hemo sistema). Šiuo atveju antikūno sąveika su antigenu pirmoje reakcijos stadijoje sukelia imuninio komplekso, kuris adsorbuoja komplementą, susidarymą, tačiau to neįmanoma aptikti vizualiai. Antrame etape hemo sistema naudojama kaip komplemento prisijungimo prie antigeno-antikūno komplekso indikatorius, kuris, būdamas imuninis kompleksas, taip pat gali jį adsorbuoti. Galiausiai yra dvi galimos reakcijos pasekmės. Jei antikūnas ir antigenas atitinka vienas kitą, o susidaręs kompleksas adsorbuoja komplementą, hemo sistemos eritrocitų lizė neįvyks. Jei antikūnas nesutampa su antigenu ir atvirkščiai, likęs laisvas komplementas prisijungs prie hemo sistemos ir sukels hemolizę.

Kaip ir kiti serologiniai tyrimai, RSK gali būti naudojamas aptikti specifinius antikūnus prieš žinomą antigeną arba aptikti antigeną prieš žinomus antikūnus.

Bendrosios RSC ingredientų charakteristikos.

1. TYRIMO SERUMAS prieš nustatant reakciją 30 minučių kaitinamas vandens vonioje, kad būtų inaktyvuotas jo paties komplementas, ir skiedžiamas nuo 1:5.

2. ANTIGENAS gali būti bakterijų kultūros, jų lizatai, virusai ir virusų turinčios medžiagos, patologiškai pakitusių organų ir audinių lipidų ekstraktai.

3. KOMPLEMENTAS – eksperimento dieną gautas jūrų kiaulytės serumas. Šiuo metu naudojamas pramoninis sausas papildas.

4. HEMOLITINĖ SISTEMA susideda iš vienodais kiekiais sumaišyto hemolizinio serumo ir 3 % avių eritrocitų suspensijos su nuosėdomis. Norint įjautrinti eritrocitus hemolizinais, mišinys 30 minučių laikomas termostate 37°C temperatūroje.

Pagrindinio RSC eksperimento pareiškimas. SERUMAS, ANTIGENAS IR KOMPLEMENTAS dedamas į 1 mėgintuvėlį, vietoj antigeno (SERUMO KONTROLĖ) įpilama serumo, komplemento ir izotoninio natrio chlorido tirpalo, į trečią mėgintuvėlį pilamas antigenas, komplementas ir tas pats natrio chlorido tirpalas (ANTIGENO KONTROLĖ). Mėgintuvėliai 1 valandai dedami į 37°C temperatūros termostatą. Tuo pačiu metu paruošiama hemolizinė sistema, kuri, nuėmus stovą nuo termostato, pridedama prie visų trijų vamzdelių. Hemo sistemą sumaišius su trijų mėgintuvėlių ingredientais, pastarieji vėl dedami į termostatą 1 valandai, o praėjus šiam laikui atsižvelgiama į RSC rezultatus.

Atsižvelgiant į RSC, reakcijos intensyvumas nurodomas pliusais: "++++" - ryškiai teigiama reakcija su visišku hemolizės uždelsimu, mėgintuvėlyje esantis skystis yra bespalvis, visi eritrocitai nusėdę į dugną; „+++“, „++“ – teigiama reakcija, kuriai būdingas skysčio spalvos padidėjimas dėl hemolizės ir eritrocitų skaičiaus sumažėjimas nuosėdose; "+" - silpnai teigiama reakcija, skystis yra intensyvios spalvos, vamzdelio apačioje yra nedidelis kiekis raudonųjų kraujo kūnelių. Neigiamą reakciją rodo ženklas „-“, kol stebima visiška hemolizė, skystis mėgintuvėlyje yra intensyviai rausvos spalvos („lako kraujas“).

RSK yra labai sudėtinga, bet labai jautri specifinė reakcija. Jis plačiai naudojamas sifilio, lėtinės gonorėjos, kokliušo, aktinomikozės, visų riketsiozių ir virusinių infekcijų diagnostikai.

Susietas imunosorbento tyrimas.

Metodą aštuntojo dešimtmečio pradžioje savarankiškai sukūrė trys mokslininkų grupės. Metodas panašus į RIA, tačiau jis pagrįstas Ag arba Ab, kuris patenka į reakciją su fermentu, žymėjimu. Vzd žymes su substratu dažniausiai lydi terpės spalvos pasikeitimas. Šiuo metu yra sukurta daugybė šio metodo modifikacijų, tačiau plačiausiai naudojamas heterogeninis ELISA tyrimas kietojoje fazėje (kietos fazės). Išskirti:

1) TIESIOGINĖ KIETOS FAZĖS ELISA. Tokiu atveju:

1. Serumas su Ab inkubuojamas su Ag, fiksuotu ant kieto substrato (dažniausiai tai yra plastikinė mikroplokštelė).

2. Ag nesurištas Ab pašalinamas pakartotinai plaunant.

3. Fermentu pažymėtas serumas pridedamas prie Ab surišto Ag.

4. Nustatykite žymeklio fermento, prijungto prie At, skaičių.

2) KONKURENCINGA KIETOS FAZĖS ELISA.

1. Pridedamas serumas. Jei jame yra specifinių Abs, jie jungiasi su Ag, pritvirtintu ant kieto pagrindo. Jei konkrečių Abs nėra, tai Ag nėra susietas.

2. Pridedant antikūnus, būdingus fiksuotam Ag, pirmuoju atveju jie neturės su kuo sąveikauti (dauguma Ag jau yra surišti) Þ žymeklio kiekis mažas. Antruoju atveju specifiniai Abs prisijungs prie Ag, ir jie nebus nuplauti skalbimo metu Þ didelis žymeklio kiekis.

Panašiai, galbūt. ANTIKŪNAI yra fiksuoti, o įvairios įmonės gamina būtent tabletes su jau fiksuota At.

Palyginti su klasikiniais antigenų aptikimo metodais, šis metodas leidžia tiesiogiai registruoti jų sąveiką su antikūnais, o ne antrines apraiškas (agliutinaciją, nusodinimą ar hemolizę). Metodas labai JAUTRUS (pakanka 1ng/ml koncentracijos).

Nustatykite: chlamidijos, klostridijos, ŽIV ir kt.

8. Fagocitozės reakcija.

Fagocitozę vykdo mikrofagai ir makrofagai. Fagocitozės stadijos: priartėjimas, klijavimas, panardinimas, virškinimas.

Fagocitinių ląstelių funkcinio aktyvumo įvertinimas.

Kiekis granulocitų ir monocitų fagocitinis aktyvumas vertinamas visame kraujyje, leukocitų suspensijoje arba praturtintose fagocitinių ląstelių frakcijose. Kaip standartiniai fagocitozės objektai naudojamos 1,0–2,0 μm skersmens monodispersinės latekso dalelės, karščiu žudytų bakterijų ar į mieles panašių grybų suspensija.

Fagocitai sumaišomi su fagocituota medžiaga santykiu 1:10 arba 1:100 ir inkubuojami 37 °C temperatūroje 30 min., nuolat maišant. Tada mėgintuvėliai centrifuguojami, o nuosėdos pakartotinai suspenduojamos kraujo serumo laše, kad būtų paruoštas tepinėlis. Tepinėliuose, fiksuotuose May-Chryunwald dažu ir nudažytuose pagal Romanovsky-Giemsa metodą, apskaičiuojamas fagocitinių ląstelių procentas (FP – fagocitinis indeksas) ir absorbuotų dalelių skaičius 1 ląstelėje (PF – fagocitinis skaičius).

Sveikam žmogui FP=40-80%, FC=1-5.

9. Diagnostika.

Diagnostika yra tam tikrų mikrobinių ląstelių, nužudytų kaitinant arba formalinu, suspensija, kurioje yra žinomas ląstelių kiekis tūrio vienete. Gyvų bakterijų suspensijos taip pat gali būti naudojamos kaip antigenas. Reakcijos reiškinys pasireiškia iš anksto po dviejų valandų (esant 37 0 C), galutinis rezultatas atsižvelgiama į kambario temperatūrą po 18-20 valandų. Diagnostikai teigiamą reakciją domina tik tam tikras serumo titras, kuris tarnauja kaip diagnostika. Taigi, sergant brucelioze, diagnostinis titras yra 1:200, o su tula-remia - 1:100. Norint nustatyti antikūnus, galima atlikti ekspresines agliutinacijos reakcijas (apskaitos laikas yra kelios minutės). Pavyzdžiui: 1. Kraujo lašo reakcija sergant tuliaremija. Ant specialios stiklinės paciento viso kraujo lašas užlašinamas lašeliu distiliuoto vandens (skirto hemolizei) ir lašeliu tularemia diagnosticum. Reakcija įvyksta per 1-2 minutes, aiškiai matomi agliutinatai balkšvų gabalėlių pavidalu. 2. Bruceliozės stiklui atliekama ekspresinė agliutinacijos reakcija pagal Heddelsoną.

Šios reakcijos neleidžia nustatyti antikūnų kiekio serume.b) identifikuoti gryną infekcinių ligų sukėlėjų kultūrą. Šiuo tikslu imunodiagnostinė

agliutinuojantys serumai, pagaminti vakcinų ir serumų institutų imunizuojant gyvūnus ištisomis mikrobų ląstelėmis. Siekiant patikimumo, geriau naudoti adsorbuotus serumus, kad juose būtų tik antikūnai, atitinkantys tam tikrą mikroorganizmo tipą ar tipą.

Imuninių serumų gavimo principai.

Imuninis serumas (antiserumas) yra kraujo serumas, kuriame yra antikūnų prieš tam tikrą antigeną. Daugeliu atvejų imuniniai (diagnostikos) serumai prieš mikrobų, audinių ir kitus antigenus gaunami eksperimentiniu būdu, imunizuojant gyvūnus atitinkamais antigenais.

Tarp pagrindinių reikalavimų antiserumui yra didelis jų specifiškumas ir pakankamas antikūnų kiekis. Pagal specifiškumą išskiriami polivalentiniai (polispecifiniai) ir monovalentiniai (monospecifiniai) antiserumai. Daugiavalenčiuose serumuose yra antikūnų prieš daugelį antigenų, monospecifiniuose – prieš vieną specifinį antigeną. Galite gauti monospecifinius serumus:

1) naudojant labai išgrynintus antigenus gyvūnams imunizuoti,

2) natūralių serumų išvalymas nuo nepageidaujamo specifiškumo antikūnų.

Šiam naudojimui:

1) imunoafiniteto metodas, pagrįstas tam tikro specifiškumo antikūnų surišimu su atitinkamais antigenais, imobilizuotais ant kietosios fazės nešiklio, po to atskiriant susidariusius AG-AT kompleksus ir išskiriant antikūnus;

2) adsorbcijos būdas pagal Castellani. Šiuo tikslu mikroorganizmai, kuriuose yra visų grupių antigenų, paeiliui pridedami prie natūralaus imuninio serumo, kuriame yra grupei specifinių kryžmiškai reaguojančių antikūnų, taip adsorbuojant homologinius antigenus.

kūnas. Tokiuose adsorbuotuose monospecifiniuose antiserumuose yra antikūnų prieš įvairius antigeno molekulės determinantus, kurie savo klasėje (poklasyje) yra nevienalyčiai.

Komplemento fiksacijos testas (CFR) ir ilgalaikė komplemento fiksavimo reakcija (RDSC)

KOMPLEMENTO SUJUNGIMO REAKCIJA (RSK) IR ILGALAIKĖ KOMPLEMENTO SUJUNGIMO REAKCIJA (RDSK)

KOMPLEMENTO SURIJIMO REAKCIJA, RSK, Bordet-Jangu reakcija [pavadinta bakteriologų J. Bordet ir O. Gengou vardu, 1901], labai specifinė ir labai jautri serologinė. reakcija, pagrįsta antigeno-antikūno komplekso savybe fiksuoti laisvą komplementą.

Komplementas (komplemento sistema) (iš lat.complementum – papildymas), gyvūnų ir žmonių kraujo serume esančių rutulinių baltymų grupė, kuri yra organizmo imuninės sistemos dalis. Ją užkrečiančioms bakterijoms ar virusams patekus į organizmą tam tikri toksinai arba atsiradus jų pačių transformuotoms ląstelėms, aktyvuojamas komplementas, ko pasekoje tikslinės ląstelės lizuojamos (sunaikinamos), neutralizuojami toksinai ir virusai. Todėl komplemento sistema kartu su makrofagais laikoma organizmo imuninės gynybos riba.

Ši reakcija plačiai naudojama nustatant antigenus ir infekcijų, ypač spirochetų (Wassermanno reakcija), riketsijos ir virusų sukeltų ligų, serodiagnostiką.

RSK yra sudėtinga serologinė reakcija. Tai apima komplementą ir dvi antigenų-antikūnų sistemas. Iš esmės tai yra dvi serologinės reakcijos.

Pirmoji sistema – pagrindinė – susideda iš antigeno ir antikūno (viena žinoma, kita ne). Prie jo pridedamas tam tikras papildo kiekis. Kai šios sistemos antigenas ir antikūnas sutampa, jie sujungs ir suriš komplementą. Gautas kompleksas yra smulkiai išsklaidytas ir nesimato.

komplemento fiksavimo reakcijos serodiagnostika

Šio komplekso susidarymas yra žinomas antrosios hemolizinės arba indikatorinės sistemos pagalba. Jai priklauso avių eritrocitai (antigenas) ir juos atitinkantis hemolizinis serumas (antikūnas), t.y. paruoštas imuninis kompleksas. Šioje sistemoje eritrocitų lizė gali vykti tik esant komplementui. Jei komplementas yra surištas su pirmąja sistema (jei joje atitinka antigeną ir antikūną), antroje sistemoje hemolizės nebus - nes nėra laisvo komplemento. Hemolizės nebuvimas (vamzdelio turinys drumstas arba apačioje yra eritrocitų nuosėdų) registruojamas kaip teigiamas RSK rezultatas.

Jei pirmoje sistemoje antigenas nesutampa su antikūnu, tai imuninis kompleksas nesusidaro ir komplementas lieka laisvas. Likęs laisvas, komplementas dalyvauja antroje sistemoje, sukelia hemolizę – RSC rezultatas neigiamas (vamzdelių turinys skaidrus – „lako kraujas“).

Komplemento fiksavimo reakcijos komponentai:

1. Antigenas – dažniausiai lizatas, ekstraktas, haptenas; rečiau mikroorganizmų suspensija

2. Antikūnas – paciento serumas

3. Komplementas – jūrų kiaulytės serumas

4. Antigenas – avies eritrocitai Hemolizinė sistema

5. Antikūnas – hemolizinas avies eritrocitams

6. Izotoninis tirpalas

Ingredientų paruošimas

1. Serumas praskiedžiamas 3 kartus mažiau nei jo titras. Paruoškite viso eksperimento bendrą serumo praskiedimą, kurio tūris nustatomas padauginus serumo tūrį viename mėgintuvėlyje (pavyzdžiui, 0,5 ml) iš mėgintuvėlių skaičiaus, šiek tiek didesnio už jų skaičių eksperimente. Skysčio perteklius būtinas ruošiant visus reakcijos komponentus: dalis jo lieka ant mėgintuvėlių, kolbų, pipečių sienelių. Atskiesto hemolizino ir eritrocitų suspensijos tūriai, įpilant serumo į eritrocitus, gerai išmaišomi ir inkubuojami 30 min 37°C temperatūroje (jautrina).

2. Avių eritrocitai. Visiems eksperimento mėgintuvėliams paruošiama 3 % nuplautų avių eritrocitų suspensija. Norint paruošti hemolizinę sistemą, likus 30 minučių iki jos įtraukimo į eksperimentą, vienodi tūriai avino eritrocitų sumaišomi su antikūnu prieš juos.

3. Komplementas paprastai skiedžiamas santykiu 1:10. Prieš kiekvieną eksperimentą jis turi būti titruojamas. Komplemento titras yra mažiausias jo kiekis, įdėjus į hemolizinę sistemą, pilna hemolizė įvyksta per 1 valandą 37°C temperatūroje.

4. Antigenas dažniausiai gaunamas jau paruoštas, nurodant jo titrą, t.y. kiekis, kuris, praskiedus antigeną, turi būti 1 ml. Pavyzdžiui, esant 0,4 titrai, jis praskiedžiamas 0,96 ml izotoninio tirpalo. Remiantis patirtimi, paimkite antigeno kiekį, lygų pusei titro (0,5 ml). Tai jo darbinė dozė. Paruoškite viso eksperimento viso antigeno praskiedimą, padaugindami 0,5 ml iš eksperimento mėgintuvėlių skaičiaus.

Komplemento fiksavimo reakcijos (RSC) teiginys.

Reakcija įpilama į 1 kub. cm (0,2 kub. cm kiekvieno komponento).

Tiriamasis serumas tiriamas praskiedus santykiu 1:5 ir 1:10 (serumo dozė yra 0,04 cc ir 0,02 cc su specifiniu antigenu, praskiedus santykiu 1:5 su kontroliniu antigenu (specifiškumui) ir be antigenas (dėl antikomplementarumo).

Bandomasis ir kontrolinis serumas inaktyvuojamas reakcijos dieną praskiestas 56-65°C temperatūroje (priklausomai nuo gyvūno tipo) 30 minučių. (taip pat RDSC).

Abu reakcijos etapai vykdomi 37-38°C vandens vonelėje, bakteriolitinė sistema palaikoma 60 min., antrasis reakcijos etapas (su hemolizine sistema) – 20 min.

Pagrindinės RSK patirties valdikliai:

teigiamas serumas, praskiestas santykiu 1:5 be antigeno ir su kontroliniu antigenu; praskiedus nuo 1:5 iki titro su specifiniu antigenu;

neigiamas serumas praskiedimu 1:5 ir 1:10 su specifiniu antigenu, praskiedimu 1:5 su kontroliniu antigenu ir be antigeno - specifiniai ir kontroliniai antigenai dviguba dozė - antikomplementarumui (komplementas +) ir hemotoksiškumui (komplementas) );

hemolizinė sistema dėl hemotoksiškumo (komplementas).

Rezultatų apskaita. Kontrolinėse medžiagose neturėtų būti net hemolizės pėdsakų, nes viename iš jų nėra komplemento, o kitame nėra hemolizino. Kontrolė rodo, kad komponentuose nėra hemotoksinių reakcijų (gebėjimo spontaniškai lizuoti eritrocitus).

Eksperimente komplemento aktyvumas gali sumažėti dėl jo nespecifinės adsorbcijos kitų reakcijos komponentų, todėl eksperimentui didinamas komplemento kiekis: imama dozė, atitinkanti titrą. Tai yra darbinė dozė.

Yra įvairių RSC pastatymo variantų: klasikinis. nustatymo metodas makro- ir mikrovariantų pavidalu, ilgalaikės komplemento fiksacijos (RDSC) reakcija šaltyje, kiekių metodas. RSC 50% jautrintų eritrocitų hemolizės ir kt. Daugeliui ligų diagnozuoti naudojamas jautresnis metodas – RDSC.

Ilgalaikės komplemento fiksacijos (RDSC) reakcijos teiginys.

Pirmoji reakcijos fazė vykdoma šaldytuve 2-6°C temperatūroje 16-18 valandų, antroji fazė vandens vonioje 20 minučių 37-38°C temperatūroje.

Komplementas naudojamas darbiniame praskiedime 1:25 arba 1:30 (nustatant jo darbinį praskiedimą).

Pirmą dieną pagrindiniam eksperimentui išpilstomas serumas ir antigenas. Reakcija įpilama į 1 kub. cm (0,2 kub. cm kiekvieno komponento). RDSC valdikliai yra tokie patys kaip ir RSC nustatymuose.

Tada papildykite 0,2 kub. cm, priklausomai nuo jo darbinio praskiedimo, mėgintuvėliai suplakami ir dedami į šaldytuvą 16-18 val. 2-6°C temperatūroje.

Kitą dieną stelažai su pirmąja faze išimami iš šaldytuvo ir palaikius 20-30 min. kambario temperatūroje hemolizinė sistema supilama į visus mėgintuvėlius doze (pateiktame pavyzdyje 0,6 kub.cm). Lentynos suplakamos ir dedamos į vandens vonią 20 min. 37-38°C temperatūroje.

Pagrindinio eksperimento RDSC schema pateikta 3 lentelėje.

Atsižvelgiant į RSC rezultatus, RDSC atliekamas du kartus: pirmą kartą - iškart po vandens vonios, antrą kartą - eritrocitams nusėdus ant mėgintuvėlio dugno (3-4 val. po vandens vonios) arba kitą kartą. per dieną, laikant šaldytuve nuo 2 °C iki 6 °C temperatūroje.

Norint objektyviai nustatyti reakcijos rezultatus, rekomenduojama įvertinti hemolizės procentą. Tam iš reakcijos parenkami 5 mėgintuvėliai su pilna (100%) hemolize ir iš jų skystis pilamas į vieną mėgintuvėlį. Iš jo ruošiami skiedimai su mažesniu hemolizės procentu, vadinamoji „Standartinė“ skalė.

Hemolizės laipsnis mėgintuvėliuose su tyrimo serumu nustatomas lyginant su hemolizės laipsniu „standartiniuose“ mėgintuvėliuose, o hemolizės procentas išreiškiamas kryžmelėmis.

Vėlavimo laipsnis yra atvirkščiai proporcingas eritrocitų hemolizės procentinei daliai:

++++ (4 kryželiai) - ne hemolizės, supernatantas skystis skaidrus, bespalvis;

+++ (3 kryžiai) - 25% eritrocitų hemolizė;

++ (2 kryžiai) - 50% eritrocitų hemolizė;

+ (1 kryžius) - 75% eritrocitų hemolizė;

(minusas) - pilna eritrocitų hemolizė, nėra nuosėdų, skystis intensyviai nusidažęs hemoglobinu.

RSK, RDSK rezultatų vertinimas.

Tiriamasis serumas vertinamas praskiedus 1:5 ir 1:10 (0,04 cc, 0,02 cc) su pilna eritrocitų hemolize kontroliniame serume be antigeno ir su kontroliniu antigenu.

Teigiama reakcija vertinama, kai eritrocitų hemolizė atitolinama 3-4 kryžmelėmis praskiedus santykiu 1:10.

Abejotina - su eritrocitų hemolizės uždelsimu 1 kryžmeliu, praskiedus serumą 1:10, ir nuo 2 iki 4 kryžmelių, praskiedus 1:5.

Neigiamas - su visiška eritrocitų hemolize serumo praskiedimu santykiu 1:5 ir 1:10.

Ypatingas CSC pranašumas yra tas, kad jame dalyvaujančio antigeno pobūdis (kūnelio ar tirpaus) neturi reikšmės, nes komplementas jungiasi prie bet kurio su IgG ir IgM susijusio antikūno Fc fragmento, neatsižvelgiant į jo antikūno specifiškumą. Be to, CSC yra labai jautrus: leidžia aptikti 10 kartų mažesnį antikūnų kiekį nei, pavyzdžiui, nusodinimo reakcijoje. RSC 1901 metais pasiūlė J. Bordet ir O. Zhang. Jis pagrįstas dviem komplemento savybėmis:

1) gebėjimas prisijungti prie „antigeno + antikūno“ komplekso;

2) eritrocitų, naudojamų hemoliziniam serumui gauti, lizė.

RSK yra suskirstytas į du etapus, ir jame atitinkamai dalyvauja dvi sistemos - eksperimentinė, arba diagnostinė, ir indikatorinė. Diagnostinę sistemą sudaro tiriamasis (arba diagnostinis) serumas, kuris 30 minučių kaitinamas 56 °C temperatūroje prieš pradedant reakciją, kad būtų inaktyvuotas jame esantis komplementas ir antigenas.

Prie šios sistemos pridedamas standartinis papildymas. Jo šaltinis yra šviežios arba džiovintos jūrų kiaulytės išrūgos. Mišinys vieną valandą inkubuojamas 37 °C temperatūroje. Jei tiriamajame serume yra antikūnų, jie sąveikaus su pridėtu antigenu, o susidarę antigeno + antikūnų kompleksai suriš pridėtą komplementą. Jei serume nėra antikūnų, antigeno + antikūno kompleksas nesusidarys, o komplementas liks laisvas.

Šiame reakcijos etape paprastai nėra matomų komplemento fiksacijos apraiškų. Todėl norint išsiaiškinti, ar įvyko komplemento fiksacija, ar ne, pridedama antroji indikatorių sistema (inaktyvuotas hemolizinis serumas + avino eritrocitai), o visų CSC komponentų mišinys vėl inkubuojamas 37 °C temperatūroje 30-60 min. po to įvertinami reakcijos rezultatai. Naudodami išmanųjį telefoną (pavyzdžiui, tokį) galite apskaičiuoti tikslų reakcijos laiką. Jei komplementas yra surištas pirmoje stadijoje, diagnostinėje sistemoje, t. y. paciento serume yra antikūnų, o komplementą surišo kompleksas „antikūnas + antigenas“, eritrocitų lizės nebus – RSC teigiamas. : skystis bespalvis, nuosėdos yra mėgintuvėlio apačioje eritrocitai.

Jei serume nėra specifinių antikūnų ir diagnostinėje sistemoje nevyksta komplemento surišimas, t.y. RSK yra neigiamas, tai diagnostinėje sistemoje nesuvartotas komplementas prisijungia prie indikatorinės sistemos komplekso „eritrocitai + antikūnai“ ir vyksta hemolizė. : mėgintuvėlyje „lako kraujas“, nėra eritrocitų nuosėdų. CSC intensyvumas vertinamas keturių kryžių sistema, atsižvelgiant į hemolizės uždelsimo laipsnį ir eritrocitų nuosėdų buvimą. Reakciją lydi atitinkamos kontrolės priemonės: serumo kontrolė (be antigeno) ir antigeno kontrolė (be serumo), nes kai kurie serumai ir kai kurie antigenai turi antikomplementarų poveikį. Prieš nustatant RSK, visi su ja susiję komponentai, išskyrus tiriamą serumą ar antigeną, yra kruopščiai titruojami.

Ypač svarbu į reakciją įvesti tikslią komplemento dozę, nes jo trūkumas ar perteklius gali sukelti klaidingus rezultatus. Komplemento titras yra mažiausias kiekis, kuris, esant darbinei hemolizinio serumo dozei, užtikrina visišką eritrocitų ištirpimą. Norint nustatyti pagrindinį eksperimentą, imama komplemento dozė, padidinta 20-25%, palyginti su nustatytu titru. Hemolizinio serumo titras yra didžiausias jo praskiedimas, kuris, sumaišytas su lygiu tūriu 10% komplemento tirpalo, per 1 valandą visiškai hemolizuoja atitinkamą eritrocitų dozę 37 ° C temperatūroje.

Netiesioginė hemolizės reakcija naudojama kaip pagreitintas specifinių antikūnų nustatymo metodas. Eritrocitai naudojami kaip antigenų nešėjai. Esant specifiniams antikūnams paciento serume, įjautrinti eritrocitai lizuojami esant komplementui.

Neradote tinkamos informacijos? Jokiu problemu! Naudokite svetainės paiešką viršutiniame dešiniajame kampe.