Tiesioginiai ir netiesioginiai rifų metodai. Laboratorinė lytiniu keliu plintančių infekcijų diagnostika
Šiuo metu plačiai naudojami serologiniai tyrimai, kuriuose dalyvauja pažymėti AG arba AT-la. Tai apima imunofluorescencines reakcijas, radioimuninius ir fermentų imunologinius tyrimus.
Jie taikomi:
1) infekcinėms ligoms diagnozuoti, t.y. antikūnams nustatyti, naudojant žinomų konjuguotų (chemiškai sujungtų) antigenų rinkinį su įvairiomis žymėmis (fermentais, fluorochromo dažais);
2) nustatyti mikroorganizmą ar jo serovarą naudojant standartinius žymėtus diagnostinius antikūnus (greioji diagnostika).
Serumai ruošiami imunizuojant gyvūnus atitinkamais antigenais, tada išskiriami imunoglobulinai ir konjuguojami su šviečiančiais dažais (fluorochromais), fermentais ir radioizotopais.
Pažymėti SR specifiškumu nenusileidžia kitiems SR, o savo jautrumu lenkia visus SR.
Nėra susijusio turinio
Kaip etiketė naudojami šviečiantys fluorochromo dažai (fluorisceino izotiocianatas ir kt.).
Yra įvairių RIF modifikacijų. Ekspresinei infekcinių ligų diagnostikai – mikrobams ar jų antigenams aptikti tiriamojoje medžiagoje naudojamas RIF pagal Koonsą.
Pagal Koonsą yra du RIF metodai: tiesioginis ir netiesioginis.
Tiesioginiai RIF komponentai:
1) tiriama medžiaga (tuštinimasis, atskirtas nosiaryklės ir kt.);
2) pažymėtas specifinis imuninis serumas, turintis AT-la norimam antigenui;
3) izotoninis natrio chlorido tirpalas.
Tiriamosios medžiagos tepinėlis apdorojamas pažymėtu antiserumu.
Vyksta AG-AT reakcija. Liuminescencinis mikroskopinis tyrimas zonoje, kurioje yra lokalizuoti AG-AT kompleksai, atskleidžia fluorescenciją – liuminescenciją.
Netiesioginiai RIF komponentai:
1) tiriama medžiaga;
2) specifinis antiserumas;
3) antiglobulino serumas (AT-la prieš imunoglobuliną), pažymėtas fluorochromu;
4) Izotoninis natrio chlorido tirpalas.
Tiriamos medžiagos tepinėlis pirmiausia apdorojamas imuniniu serumu, kad būtų gautas norimas antigenas, o po to – žymėtu antiglobulino serumu.
Šviečiantys AG-AT kompleksai – pažymėti AT aptinkami naudojant fluorescencinį mikroskopą.
Netiesioginio metodo privalumas yra tas, kad nereikia ruošti plataus spektro fluorescencinių specifinių serumų, naudojamas tik vienas fluorescencinis antiglobulino serumas.
Taip pat išskiriama 4 komponentų netiesioginio RIF atmaina, kai papildomai įvedamas komplementas (jūrų kiaulytės serumas). Esant teigiamai reakcijai, susidaro AG-AT kompleksas - pažymėtas - AT-komplementas.
RIF yra pagrįstas bakterijų, riketsijų ir virusų antigenų deriniu su specifiniais antikūnais, paženklintais fluorescenciniais dažais (fluoresceino izotiocianatu, rodaminu, B-izotiocianitu, lizatinrodaminu B-200, sulfochloridu ir kt.), turinčiais reaktyvias grupes (sulfochloridas, isotichloridas ir kt.). .) . Šios grupės susijungia su antikūnų molekulių laisvosiomis amino grupėmis, kurios, apdorojamos fluorochromu, nepraranda savo specifinio afiniteto atitinkamam antigenui. Susidarę AG-AT kompleksai fluorescenciniu mikroskopu tampa aiškiai matomomis, ryškiai šviečiančiomis struktūromis (7 pav.). RIF gali aptikti nedidelį kiekį bakterijų ir virusų antigenų. RIF metodas naudojamas dviem versijomis: tiesioginiu ir netiesioginiu.
Tiesioginis metodas pagrįstas tiesioginiu antigeno susiejimu su pažymėtu antikūnu. Netiesioginis metodas pagrįstas faziniu AG-AT komplekso aptikimu naudojant fluorescencinius dažus. Pirmasis etapas susideda iš tam tikro antigeno imuninių kompleksų su specifiniais antikūnais susidarymo. Antrasis etapas – šio komplekso identifikavimas apdorojant jį žymėtu antigamaglobulinu.
RIF privalumas – paprastumas, didelis jautrumas, rezultato gavimo greitis. RIF naudojamas kaip gripo, dizenterijos, maliarijos, maro, tuliaremijos, sifilio ir kt. ankstyvos ekspresinės diagnostikos metodas. Tokiam tyrimui atlikti naudojamas liuminescencinis mikroskopas.
Radioimuninis tyrimas (RIA)
RIA yra vienas jautriausių imunodiagnostikos metodų. Jis naudojamas hepatito B viruso antigenui nustatyti pacientams, sergantiems virusiniu hepatitu. Norėdami tai padaryti, į tiriamąjį serumą pridedamas etaloninis serumas (serumas, kuriame yra antikūnų prieš hepatito B virusą). Mišinys inkubuojamas 1-2 dienas 40 °C temperatūroje, tada pridedamas etaloninis antigenas (antigenas, pažymėtas 125 J izotopu) ir inkubuojama dar 24 valandas. Į gautą antigeno-antikūno kompleksą pridedami nusodinantys antiimunoglobulinai prieš etaloninius serumo baltymus, todėl susidaro nuosėdos (8 pav.). Į rezultatą atsižvelgiama pagal skaitiklio užregistruotų impulsų buvimą nuosėdose ir jų skaičių. Jei tiriamajame serume yra antigeno, prijungto prie specifinių antikūnų, pastarieji nesijungia su žymėtu antigenu, todėl nuosėdose jo neaptinkama. Taigi RIA remiasi nustatyto antigeno ir žinomo žymėtojo antigeno kiekio konkurencinės sąveikos su antikūnų aktyviais centrais principu.Kaip žymėjimas naudojami radioaktyvūs izotopai.
Priklausomai nuo pastatymo technikos, išskiriami du RIA metodai.
1) Technika "skystoji fazė" (klasikinė RIA). Šios inscenizacijos technikos trūkumas yra poreikis
specialus laisvųjų ir surištų žymėtų antigenų (arba antikūnų) atskyrimas.
2) Technika "kieta fazė".
Žinomo specifiškumo AG arba AT jungiasi su sorbentais (kieta fazė) – polistireno šulinio sienelėmis arba plastikiniu vamzdeliu. Likę IC komponentai nuosekliai sorbuojami ant imobilizuoto AG (AT).
Atsižvelgiant į reakcijos pobūdį, išskiriami šie metodai:
1) Konkurencinis metodas – metodas, pagrįstas AG konkurencija.
Reakcijos komponentai:
a) aptinkamas AG (tiriamoji medžiaga – kraujas, skrepliai ir kt.);
b) radioizotopu paženklintas antigenas, identiškas tiriamajam antigenui;
c) žinomos koncentracijos specifiniai antikūnai, surišti su sorbentu;
d) standartinis AG (kontrolė);
e) buferinis tirpalas.
Pirma, tiriamas AG įvedamas į reakciją. Sorbento paviršiuje susidaro AG-AT kompleksas. Sorbentas nuplaunamas, po to įvedamas žymėtas AG Kuo didesnis tirto AG kiekis, tuo mažiau žymėtasis AG jungiasi su AT-m sorbento paviršiuje. Pažymėto antigeno koncentracija nustatoma matuojant reakcijos radioaktyvumą naudojant skaitiklius. Reakcijos radioaktyvumo reikšmė bus atvirkščiai proporcinga AG kiekiui tiriamajame mėginyje.
2) Nekonkurencinis metodas.
Reakcijos komponentai:
a) nustatytas AG;
b) žinomos koncentracijos specifinis AT-a, surištas
nye ant sorbento;
c) antikūnai, identiški surištam antikūnui, pažymėti
radioizotopas;
d) standartinis AG;
e) buferinis tirpalas.
Ištirtas AG pridedamas prie surištų antikūnų. Inkubacijos metu ant sorbento susidaro AG-AT kompleksai. Sorbentas nuplaunamas nuo laisvųjų komponentų ir pridedami žymėti antikūnai, kurie jungiasi prie laisvųjų AG-on valentų komplekse. Radioaktyvumo kiekis proporcingas tiriamo AG koncentracijai.
3) „Sumuštinio metodas“ (netiesioginis metodas) – labiausiai paplitęs metodas.
Komponentai:
a) tiriamasis serumas (arba tiriamasis AG);
b) AG, surištas ant sorbento (arba AT-la, surištas ant sorbento, nustatant AG-a);
c) diagnostinių antikūnų prieš imunoglobulinus, paženklintus radioizotopais;
d) kontroliniai serumai (arba antigenai);
e) buferiniai tirpalai.
Tirti Abs (arba AG) reaguoja su kietosios fazės AG (AT), po to inkubatas pašalinamas ir į reakciją įvedami žymėti antiglobulino Abs, kurie jungiasi su specifiniais AG-AT kompleksais sorbento paviršiuje. Reakcijos radioaktyvumo dydis yra tiesiogiai proporcingas tiriamo AT (arba AG) kiekiui.
RIA pranašumai:
1) didelis specifiškumas ir jautrumas;
2) nustatymo technikos paprastumas;
3) rezultatų kiekybinio įvertinimo tikslumas;
4) lengva automatizuoti.
Trūkumas: radioaktyviųjų izotopų naudojimas.
Nėra susijusio turinio
ELISA metodas (ELISA)
Metodas naudojamas antigenams aptikti naudojant atitinkamus antikūnus, konjuguotus su žymėtu fermentu (krienų peroksidaze, b-galaktoze arba šarmine fosfataze). Sujungus antigeną su fermentu pažymėtu imuniniu serumu, į mišinį pridedamas substratas ir chromogenas. Substratą skaido fermentas, o jo skilimo produktai sukelia cheminę chromogeno modifikaciją. Tokiu atveju chromogenas pakeičia spalvą – spalvos intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas surištų antigenų ir antikūnų molekulių skaičiui (9 pav.).
Labiausiai paplitęs yra kietosios fazės ELISA, kai vienas iš imuninio atsako komponentų (antigenas arba antikūnas) adsorbuojamas ant kieto nešiklio. Polistireno mikroplokštės naudojamos kaip tvirtas nešiklis. Nustatant antikūnus, į duobutes su adsorbuotu antigenu paeiliui pilamas pacientų kraujo serumas, fermentu paženklintas antiglobulino serumas, fermento ir chromogeno substrato tirpalų mišinys. Kiekvieną kartą, pridėjus kitą komponentą, neprisirišę reagentai pašalinami iš šulinių kruopščiai nuplaunant. Esant teigiamam rezultatui, pasikeičia chromogeno tirpalo spalva. Kietosios fazės nešiklis gali būti jautrinamas ne tik antigenu, bet ir antikūnu. Tada norimas antigenas įvedamas į šulinėlius su sorbuotais antikūnais, įpilamas imuninis serumas prieš antigeną, paženklintą fermentu, o tada pridedamas fermento ir chromogeno substrato tirpalų mišinys.
ELISA metodu diagnozuojamos virusinės ir bakterinės patogenų sukeltos ligos.Kaip etiketė naudojami fermentai: peroksidazė, šarminė fosfatazė ir kt.
Reakcijos indikatorius yra fermentų gebėjimas sukelti spalvų reakcijas, kai jie veikiami atitinkamu substratu. Pavyzdžiui, peroksidazės substratas yra ortofenildiamino tirpalas.
Plačiausiai naudojama kietosios fazės ELISA. ELISA esmė panaši į RIA.
ELISA rezultatus galima įvertinti vizualiai ir matuojant optinį tankį spektrofotometru.
ELISA pranašumai yra šie:
Nėra kontakto su radioaktyviomis medžiagomis;
Atsakymo vertinimo metodų paprastumas;
Konjugatų stabilumas;
Lengvai pritaikomas automatizavimui.
Tačiau, palyginti su RIA, pastebimas mažesnis metodo jautrumas, tačiau kai kuriais atvejais jautrumas yra geresnis nei RIF ir RIM.
Kaip pavyzdžiai pateikti šie ELISA tipai:
konkurencinis tipas.
Paskyrimas.
Sukurta aptikti hepatito B viruso (HB3 Ad) paviršiaus antigeną serume ir plazmoje diagnozuojant virusinį hepatitą B ir nustatyti HB5 Ad pernešimą.
Komponentai:
1) tiriamosios medžiagos serumas arba kraujo plazma;
2) antikūnai prieš HB3 Ad, adsorbuoti polistireno mikroplokštelės šulinio paviršiuje;
3) konjugatas – pelės monokloniniai antikūnai prieš HB3 Ad, pažymėti peroksidaze,
4) ortofenilendiamino (OPD) substratas;
5) fosfatiniu buferiniu tirpalu;
6) kontroliniai serumai:
Teigiamas (serumas su HBe Ad);
Neigiamas (serumas be HBs reklamos). Progresas
1) Kontrolinio ir tiriamojo serumo įvedimas.
2) Inkubuojama 1 valandą 37°C temperatūroje.
3) Šulinių plovimas.
4) Konjugato įvedimas.
5) Inkubuojama 1 valandą 37°C temperatūroje.
6) Šulinių plovimas.
7) OFD įvedimas. Esant HBs Ad, tirpalas šulinėliuose pagelsta.
Į ELISA atsižvelgiama pagal optinį tankį naudojant fotometrą. Optinio tankio laipsnis bus atvirkščiai proporcingas tiriamo HBs Ad koncentracijai.
Mechanizmas
Reakcija vyksta trimis etapais:
1) HB3 Tiriamas serumo (plazmos) kraujospūdis jungiasi su homologiniais antikūnais, adsorbuotais šulinėlio paviršiuje. Susidaro IR AG-AT. (NVz Ad - agl \ NVz AT).
2) HBs Ad antikūnai, pažymėti peroksidaze, jungiasi prie likusių laisvųjų HBs Ad determinantų AG-AT komplekse. Susidaro AT-AG pažymėtų Abs kompleksas (an!1 HBs AT-HBs Ad-ap(1 HBs Abs, paženklintas peroksidaze).
3) OPD sąveikauja (su peroksidaze) su AT-AG-AT kompleksu ir atsiranda geltona spalva.
netiesioginis tipas
Tai yra pagrindinė tyrimo reakcija diagnozuojant ŽIV infekciją.
Tikslas: serologinė ŽIV infekcijos diagnostika – antikūnų prieš ŽIV antigenus nustatymas, Komponentai:
1) tiriamoji medžiaga – kraujo serumas;
2) sintetinis
Imunofluorescencinė reakcija – RIF (Koonso metodas) Yra trijų tipų tiesioginis metodas, netiesioginis metodas, su komplementu. Koonso reakcija yra greitas diagnostikos metodas mikrobų antigenams arba antikūnams aptikti.
Tiesioginis RIF metodas pagrįstas tuo, kad audinių antigenai arba mikrobai, apdoroti imuniniais serumais su fluorochromais paženklintais antikūnais, gali švytėti fluorescencinio mikroskopo UV spinduliuose. Bakterijos tepinėlyje, apdorotos tokiu liuminescenciniu serumu, švyti išilgai ląstelės periferijos žalio krašto pavidalu.
Netiesioginis RIF metodas susideda iš antigeno-antikūno komplekso identifikavimo naudojant
antiglobulino (anti-antikūno) serumas, pažymėtas fluorochromu. Norėdami tai padaryti, tepinėliai iš mikrobų suspensijos apdorojami antimikrobinio triušio diagnostinio serumo antikūnais. Tada antikūnai, kurie nėra surišti mikrobų antigenais, nuplaunami, o ant mikrobų likę antikūnai aptinkami apdorojant tepinėlį antiglobulino (anti-triušio) serumu, paženklintu.
fluorochromai. Dėl to susidaro kompleksinis mikrobas + antimikrobiniai triušio antikūnai + anti-triušio antikūnai, pažymėti fluorochromu. Šis kompleksas stebimas fluorescencinėje lempoje
mikroskopu, kaip ir tiesioginiu būdu.
23. Fermentinis imunologinis tyrimas Ingredientai, formuluotė, apskaita, įvertinimas. Naudojimo sritys.
I Radioimuninis tyrimas.
Radioimuninis metodas arba analizė (RIA) yra labai jautrus metodas, pagrįstas antigeno ir antikūno reakcija naudojant antigenus arba antikūnus, paženklintus radionuklidu (125J, 14C, 3H, 51Cr ir kt.). Po jų sąveikos susidaręs radioaktyvus imuninis kompleksas yra atskiriamas ir jo radioaktyvumas nustatomas atitinkamame skaitiklyje (beta arba gama spinduliuotė). Spinduliuotės intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas surištų antigenų ir antikūnų molekulių skaičiui.
pridėkite paciento serumą, antiglobulino serumą, pažymėtą fermentu, ir fermento substratą / chromogeną.
II. Nustatant antigeną, antigenas (pavyzdžiui, kraujo serumas su norimu antigenu) įvedamas į šulinėlius su sorbuotais antikūnais, įvedamas prieš jį diagnostinis serumas ir antriniai antikūnai (prieš diagnostinį serumą), pažymėti fermentu, ir tada fermento substratas/chromogenas.
24. Imuninės lizės reakcijos, taikymas. Komplemento surišimo reakcija. Ingredientai, formulavimas, apskaita, vertinimas. Taikymas.
Komplemento fiksavimo reakcija (RCC) susideda iš to, kad kai antigenai ir antikūnai atitinka vienas kitą, jie sudaro imuninį kompleksą, prie kurio komplementas (C) yra prijungtas per antikūnų Fc fragmentą, o komplementą jungia antigenas-antikūnas. kompleksas. Jei antigeno-antikūno kompleksas nesusidaro, komplementas lieka laisvas. RSK vykdoma dviem etapais 1 fazė - mišinio, kuriame yra antigenas + antikūnas + komplementas, inkubavimas, 2 fazė (indikatorius) - laisvo komplemento nustatymas mišinyje, pridedant prie jo hemolizinę sistemą, susidedančią iš avino eritrocitų ir hemolizinio serumo, kuriame yra antikūnų. jiems. 1-oje reakcijos fazėje, kai susidaro antigeno-antikūno kompleksas, įvyksta komplemento surišimas, o vėliau 2-oje fazėje antikūnais įjautrintų eritrocitų hemolizė nevyksta (reakcija teigiama). Jei antigenas ir antikūnas nesutampa (tiriamame mėginyje nėra antigeno ar antikūno), komplementas lieka laisvas ir 2-oje fazėje prisijungs prie eritrocitų-antieritrocitų antikūnų komplekso, sukeldamas hemolizę (neigiamą reakciją).
25. Ląstelinio imuninio atsako formavimosi dinamika, jo apraiškos. Imunologiniai
atmintis.
Imuninis ląstelių atsakas (CIO) yra sudėtinga daugiakomponentė imuninės sistemos reakcija, kurią sukelia svetimas antigenas (T-ląstelių epitopai). Įgyvendina imuniteto T sistema. KIO etapai
1. APC Antigen Capture
2. Procesorius. AG proteasomose.
3. Sudėtinio peptido + MHC I ir II klasės susidarymas.
4. Papildykite transportavimą į APC membraną.
5. Komplemento atpažinimas, kurį atlieka AG specifiniai T pagalbininkai 1
6. APC ir T-pagalbininkų 1 aktyvinimas, IL-2 ir gama-interferono išsiskyrimas E-pagalbininkų1. Proliferacija ir diferenciacija nuo AG priklausomų T-limfocitų srityje.
7. Skirtingų populiacijų subrendusių T-limfocitų ir atminties T-limfocitų susidarymas.
8. Subrendusių T limfocitų sąveika su AH ir galutinio efektoriaus realizavimas.
KIO apraiškos:
antiinfekcinis AI:
antivirusinis,
antibakterinis (tarpląstelėje esančios bakterijos);
IV ir I tipo alergijos;
priešnavikinis IO;
persodinti AI;
imunologinė tolerancija;
imunologinė atmintis;
autoimuniniai procesai.
26. T-limfocitų reguliacinių ir efektorinių subpopuliacijų apibūdinimas. Pagrindinis
žymekliai. T-ląstelių receptorius (TCR). Genetinė TCR įvairovės kontrolė
T-limfocitai yra antra svarbi limfocitų populiacija, kurios pirmtakai susidaro kaulų čiulpuose ir migruoja tolesniam brendimui ir
diferenciacija į užkrūčio liauką (pavadinimas „T-limfocitas“ atspindi priklausomybę nuo užkrūčio liaukos, kaip pagrindinė ankstyvojo brendimo stadijos vieta).
Pagal biologinio aktyvumo spektrą T-limfocitai yra reguliuojamosios ir efektorinės ląstelės, užtikrinančios imuniteto T sistemos adaptacinę funkciją. Jie negamina antikūnų molekulių. TCR yra membraninė molekulė, kuri skiriasi nuo HCR, tačiau yra struktūriškai ir funkciškai panaši į antikūnus.
TCR – specifinis AG. receptorius. Tai pagrindinė Ig superšeimos molekulė. Jį sudaro 3 dalys: supramembraninė, membraninė ir citoplazminė. TCR uodegą sudaro 2 rutulinės alfa ir beta molekulės, turinčios kintamus ir pastovius domenus (Vα ir Vβ, Сα ir Сβ).
Vα ir Vβ sudaro aktyvų TCR kompleksą. Yra 3 hiperkintamieji regionai – pastovūs deterministiniai regionai (CDO). KDO funkcija yra T ląstelių peptidų atpažinimas ir surišimas, t.y. AG lemiančios grupės. TCR tvirtai sėdi ant ląstelės ir jos citoplazminė uodega, citoplazminė dalis, dalyvauja vykdant inf. Branduolys jo sąveikos su AG metu. Maždaug 90% TCR. Jie turi alfa ir beta grandines, o maždaug 10% - gama ir delta grandines.
TCR yra genetiškai užkoduotas. α ir γ grandines, analogiškai su IG lengvosiomis grandinėmis, koduoja V, G ir C genai, o β ir δ, pagal analogiją su IG sunkiosiomis grandinėmis, V, G, E. α ir γ 7 chromosomoje, o β ir δ 14 chromosomoje.
CD-3 receptorius yra papildoma struktūra, Ig molekulė. Jį sudaro 3 transmembraniniai baltymai: εδ, εγ ir dimer-zeta., supramembraninis, vembraninis ir citozolinis uodega. Jie sudaro vieną kompleksą su TCR, kuris užtikrina specifinių AG signalų perdavimą ląstelės branduoliui.
CD4 ir CD8. Jie išreiškiami kartu su TCR arba atskirai nuo jo. Jie atlieka koreceptorių funkciją. Jie sustiprina sukibimą su AG pateikiančia ląstele. Jie užtikrina specifinio AG signalo laidumą ląstelės branduoliui.
T-limfocitai skirstomi pagal atpažinimo tipą, MOLEKULĖ:
CD4 rec. Peptidas MHC 2 klasė
CD8 peptidas + MHC 1 klasė
Pagrindinių T-limfocitų subpopuliacijų charakteristikos: T-limfocitų populiacija gali būti suskirstyta į tris klases:
A. Pagalbininkai, PHT efektoriai (CD 4+) ir citotoksiniai slopintuvai (CD 8+);
B. Nestimuliuotos (CD 45 RA+) ir atminties ląstelės (CD 45 RO+);
C. 1 tipas – (IL-2, INF-gama, TNF-beta gaminantis);
2 tipas – (gamina IL-4, IL-5, IL-6, IL9, IL 10).
Šis metodas naudoja liuminescencijos reiškinį.
Liuminescencijos reiškinio esmė slypi tame, kad tam tikrų medžiagų molekulėms sugėrus įvairių rūšių energiją (šviesos, elektros ir kt.), jų atomai pereina į sužadinimo būseną, o tada grįžta į pradinę būseną. , skleidžia absorbuotą energiją šviesos spinduliuotės pavidalu.
RIF liuminescencija pasireiškia fluorescencijos forma - tai švytėjimas, kuris atsiranda apšvitinimo jaudinančia šviesa momentu ir sustoja iškart po to, kai jis baigiasi.
Daugelis medžiagų ir gyvų mikroorganizmų turi savo fluorescenciją (vadinamąją pirminę), tačiau jos intensyvumas yra labai mažas. Medžiagos, kurios turi intensyvią pirminę fluorescenciją ir yra naudojamos nefluorescuojančioms medžiagoms suteikti fluorescencinių savybių, vadinamos fluorochromais. Tokia sukelta fluorescencija vadinama antrine.
Fluorescencijai sužadinti fluorescencinėje mikroskopijoje dažniausiai naudojama ultravioletinė arba mėlynai violetinė spektro dalis (bangos ilgis 300-460 nm). Šiems tikslams laboratorijose yra įvairių modelių liuminescenciniai mikroskopai - ML-1-ML-4, "Lumam".
Virusologinėje praktikoje naudojami du pagrindiniai fluorescencinės mikroskopijos metodai: fluorochromizacija ir fluorescenciniai antikūnai (arba RIF).
Fluorochromizacija- tai preparatų apdorojimas fluorochromu, siekiant padidinti jų liuminescencijos stiprumą ir kontrastą. Didžiausią susidomėjimą kelia fluorochromo akridino apelsinas, sukeliantis polichromatinę nukleorūgščių fluorescenciją. Taigi, kai preparatai apdorojami šiuo fluorochromu, dezoksiribonukleorūgštis ryškiai fluorescuoja žaliai, o ribonukleorūgštis - rubino raudonai.
RIF metodas susideda iš to, kad antikūnai, prijungti prie fluorochromo, išlaiko galimybę užmegzti specifinį ryšį su homologiniu antigenu. Gautas antigeno + antikūno kompleksas dėl jame esančio fluorochromo aptinkamas fluorescenciniu mikroskopu būdingu švytėjimu.
Antikūnams gauti naudojami labai aktyvūs hiperimuniniai serumai, iš kurių išskiriami antikūnai ir paženklinami fluorochromu. Dažniausiai naudojami fluorochromai yra FITC-fluoresceino izotiocianatas (žalia šviesa) ir PCX-rodamino sulfochloridas (raudona šviesa). Antikūnas, pažymėtas fluorochromu, vadinamas konjugatu.
Preparatų paruošimo ir dažymo būdas yra toks:
- paruošti tepinėlius, atspaudus iš organų arba ant dengiamųjų stiklelių – užkrėstų ląstelių kultūrą ant stiklelių; Taip pat galima naudoti histosekcijas;
- preparatai džiovinami ore ir fiksuojami atšaldytame acetone kambario temperatūroje arba minus 15 °C temperatūroje (nuo 15 minučių iki 4-16 valandų);
- nudažyti tiesioginiu arba netiesioginiu būdu; vesti įrašus po fluorescenciniu mikroskopu pagal švytėjimo intensyvumą, įvertintą kryželiais.
Lygiagrečiai paruoškite ir nudažykite preparatus iš sveiko gyvūno – kontrolę.
Yra du pagrindiniai fluorescencinių antikūnų taikymo būdai: tiesioginis ir netiesioginis.
Tiesioginis metodas (vienas žingsnis). Konjugatas (fluorescencinis serumas su įtariamu virusu) uždedamas ant fiksuoto preparato, 30 minučių inkubuojamas 37 ° C temperatūroje drėgnoje kameroje. Tada vaistas nuo nesurišto konjugato nuplaunamas fiziologiniu tirpalu (pH 7,2 - 7,5), užtepamas ore išdžiovintas, nefluorescencinis aliejus ir tiriamas mikroskopu.
Tiesioginis metodas leidžia aptikti ir identifikuoti antigeną. Norėdami tai padaryti, kiekvienam virusui turite turėti fluorescencinį serumą.
Netiesioginis metodas (dviejų etapų). Ant fiksuoto preparato uždedamas nežymėtas serumas, kuriame yra antikūnų prieš įtariamą virusą, inkubuojamas 30 minučių 37 °C temperatūroje, neprisijungę antikūnai nuplaunami. Ant preparato užtepamas fluorescencinis anti-rūšinis serumas, atitinkantis gyvūno tipą, kuris gamina homologinius antivirusinius antikūnus, ir inkubuojamas 30 minučių 37 °C temperatūroje. Tada vaistas nuplaunamas nuo nesurištų žymėtų antikūnų, džiovinamas ore, užtepamas nefluorescencinis aliejus ir tiriamas fluorescenciniu mikroskopu.
Antirūšiniai serumai gaunami imunizuojant gyvūnus tų rūšių globulinais, kurie yra antivirusinių antikūnų gamintojai. Taigi, jei antivirusiniai antikūnai buvo gauti ant triušių, tada naudojamas fluorescencinis anti-triušio serumas.
Netiesioginis metodas leidžia ne tik aptikti ir identifikuoti antigeną, bet ir aptikti bei nustatyti antikūnų titrą. Be to, šiuo metodu galima aptikti įvairių virusų antigenus su vienu pažymėtu serumu, nes jis pagrįstas anti-rūšinių serumų naudojimu. Dažniau naudojami serumai prieš triušius, galvijus, arklius ir serumai nuo jūrų kiaulyčių globulinų.
Buvo sukurtos kelios netiesioginio metodo modifikacijos. Komplemento metodas nusipelno didžiausio dėmesio. Metodas susideda iš inaktyvuoto nefluorescencinio specifinio serumo ir jūrų kiaulytės komplemento uždėjimo ant fiksuoto preparato, 30 minučių palaikymo 37 °C temperatūroje, nuplaunant ir antigeno + antikūno + komplemento komplekso aptikimas, naudojant fluorescencinį antikomplementarinį serumą. 30 minučių palaikius 37 °C temperatūroje, nuplaunamas, išdžiovinamas ore ir tiriamas fluorescenciniu mikroskopu.
RIF privalumai: didelis specifiškumas ir jautrumas; nustatymo technikos paprastumas; reikalingas minimalus komponentų skaičius. Tai greitas diagnostikos metodas, nes atsakymą galite gauti per kelias valandas. Trūkumai – subjektyvumas vertinant liuminescencijos intensyvumą ir, deja, kartais fluorescenciniai serumai būna prastos kokybės. Šiuo metu RIF plačiai naudojamas diagnozuojant virusines gyvūnų ligas.
Jei radote klaidą, pažymėkite teksto dalį ir spustelėkite Ctrl + Enter.
Imunofluorescencinė reakcija, kurią 1942 m. atrado Koonsas, nėra naujas tyrimo metodas. Tačiau atsiradus hibridomos technologijoms, kurios leido gauti monokloninius antikūnus, šiai reakcijai suteikė „antrąjį gyvenimą“, nes jų naudojimas leido kelis kartus padidinti šios reakcijos jautrumą ir specifiškumą.
Ir šiandien mes jums išsamiai papasakosime apie tiesioginės ir netiesioginės imunofluorescencijos (RIF) reakciją kaip Koons diagnostikos metodą suaugusiems vyrams ir moterims nėštumo metu.
Kas yra imunofluorescencinė reakcija
Suteikdama puikią galimybę greitai gauti tikslią diagnozę, imunofluorescencinė reakcija leidžia nustatyti sukėlėjo buvimą patologinėje medžiagoje. Tam naudojamas tepinėlis iš medžiagos, kuri yra specialiai apdorota pažymėtu FITC (fluoresceino izotiocianatu) ir tiriama kaip heterogeninė analizė.
Rezultatui gauti naudojamas fluorescencinis mikroskopas, kurio optinėje sistemoje yra šviesos filtrų rinkinys, suteikiantis preparatui tam tikro bangos ilgio mėlynai violetinę arba ultravioletinę šviesą. Ši sąlyga leidžia fluorochromui šviesti tam tikru diapazonu. Tyrėjas įvertina švytėjimo savybes, pobūdį, objektų dydį ir jų santykinę padėtį.
Kam jis priskirtas
Imunofluorescencinės reakcijos atlikimas gali būti paskirtas diagnozuojant daugelį virusinių ligų. Visų pirma, būtina atlikti išsamų tyrimą, siekiant nustatyti šiuos veiksnius:
- viruso buvimas organizme;
- salmonelių infekcija;
- tam tikrų antigenų buvimas organizme;
- atskleidžiama organizmo užsikrėtimo chlamidijomis, mikoplazmomis ir kitais mikroorganizmais, galinčiais sukelti žmogaus virusines ligas, tikimybė;
- gyvūnų virusinių ligų diagnostika.
Šios indikacijos leidžia panaudoti imunofluorescencinę reakciją nustatant įvairaus pobūdžio virusines žmogaus ir gyvūnų organizmo ligas.
Tikslai
Kadangi šis diagnostikos metodas turi daug privalumų, tarp kurių yra didelis efektyvumas, greitis atlikimas ir rezultatų gavimas, taip pat daugybės kontraindikacijų nebuvimas, jis naudojamas virusinių infekcijų buvimui organizme nustatyti. Todėl šią analizę galima skirti tiek diagnozei nustatyti, tiek patikslinti, kurios pagrindu paskiriamas gydymo režimas.
Procedūra nesukelia diskomforto, jai reikia paimti medžiagą analizei, kuri paimama iš bet kokio kūno skysčio: seilių, skreplių, gleivinės paviršiaus įbrėžimų. Taip pat galima paimti kraują analizei. Imunofluorescencinės reakcijos dažnį nustato gydantis gydytojas, kuriam reikia gauti duomenis apie organizme vykstančių procesų dinamiką.
Kadangi ši analizė nekenkia nei organizmui, nei bendrai žmogaus savijautai, prireikus ją galima skirti.
Tokios procedūros rūšys
Šiandien naudojamos kelios šios analizės atmainos, kurių kiekviena turi nemažai specifinių savybių ir leidžia susidaryti kuo išsamesnį organizme vykstančių procesų vaizdą.
Imunofluorescencinės reakcijos yra šios:
- - vienas iš sparčiausiai besivystančių diagnostikos tipų, ši analizė leidžia gauti kiekybinius duomenis nenaudojant serijinių skiedimų. Naudojant gautus skysčio optinio tankio matavimus galima tiksliai nustatyti norimo komponento koncentracijos lygį. Plačios šio tipo analizės galimybės išnaudojamos, kai jos įgyvendinimui naudojami monokloniniai antikūnai, leidžiantys nustatyti infekcinio proceso fazę, jo sunkumą;
- DNR diagnostika- šis metodas pagrįstas papildomu nukleotidų surišimu, kuriam gali būti naudojami skysčiai, tokie kaip seilės, kraujas, smegenų skystis, šlapimas, skrepliai, biopsijos mėginiai ir kraujas. Šis metodas efektyviausiai nustato papilomos virusų buvimą organizme, tačiau daugelis šiuolaikinių tyrimų sistemų kartais gali duoti klaidingai teigiamus ir klaidingai neigiamus rezultatus. Jų priežastis gali būti specifinės DNR analizei skirtų skysčių mėginių užteršimas, kurio buvimas gali turėti įdėtą arba bendrą pobūdį;
- imunochromatografija- šio patologinės aplinkos ir virusų buvimo organizme nustatymo metodo specifiškumas yra žymėtų antikūnų naudojimas reakcijos metu. Šis diagnostikos metodas naudojamas A grupės streptokokų infekcijos proceso aktyvumo laipsniui nustatyti, taip pat šių tipų chlamidijoms: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia from Oxoid. Turinčios didžiausią jautrumą, testavimo sistemos, pagrįstos šia tyrimo metodika. dažniausiai naudojami kaip orientacijos testas.
Išvardintos veislės pasižymi elgesio ypatybėmis ir specifinėmis rezultatų charakteristikomis, tačiau visomis jomis siekiama gauti duomenis apie patologinių mikroorganizmų ir virusų buvimą organizme, taip pat apie jų dauginimosi ir aktyvumo laipsnį.
Indikacijos atlikti
Norint nustatyti bet kokią patologinę aplinką organizme, gali būti paskirta imunofluorescencinė reakcija.
Šio tipo diagnostikos metu nustatomos chlamidijos, trichomonadai, gonokokai ir, taip pat visų rūšių lamblijos. ir, ir kitoms ligoms taip pat reikalingas RIF. Gydytojo paskyrimas jo įgyvendinimui yra privalomas.
Kontraindikacijos laikymui
Kadangi šiai reakcijai reikia bet kokio tipo kūno skysčių, jų paėmimas paprastai nėra sunkus ir nėra kontraindikacijų imunofluorescencinei reakcijai atlikti. Tačiau nėštumo metu ir jaunesniems nei 6 mėnesių vaikams mėginiai tyrimams imami laikantis didžiausių atsargumo priemonių.
Kontraindikacijų nebuvimas leidžia atlikti tokio tipo diagnozę, kai gydytojas skiria visiems pacientams. Jo saugumas užtikrinamas naudojant dezinfekuotą instrumentą ir vienkartinius švirkštus.
Pasiruošimas procedūrai
Nėra šios analizės medžiagos paėmimo ypatybių. Kraujas jam imamas tuščiu skrandžiu, kad jame nebūtų daug medžiagų, galinčių pakeisti tikrąjį liudijimą ir pateikti klaidingą vaizdą.
Kaip vyksta mėginių ėmimas
Kadangi analizei atlikti nereikia specialaus pasiruošimo, tik valgyti likus 12 valandų iki jos ir atmetus vaistų vartojimo nebuvimą, tiriamoji medžiaga imama kaip įprastas kūno skysčio paėmimas analizei.
Subjektyvūs pojūčiai procedūros metu gali skirtis priklausomai nuo jautrumo.
Rezultatų iššifravimas
Šiuolaikinių bandymų sistemų naudojimas leidžia gauti tiksliausius analizės rezultatus. Rezultatui iššifruoti naudojami šie duomenys:
- fluorescencijos intensyvumo laipsnis;
- fluorescencinis atspalvis;
- objekto švytinčio proceso periferinis pobūdis;
- morfologijos charakteristikos, patogeno vieta paimtame tiriamosios medžiagos tepinėlyje ir jo matmenys.
Tiriant didelius objektus (pvz., Gardenerella, Trichomonas, virusų jau paveiktas ląsteles), aukščiau išvardyti kriterijai leidžia gauti patikimiausius rezultatus. Tačiau elementarių mikoplazmų ir chlamidijų kūnų dydžiai yra ties fluorescencinio mikroskopo skiriamosios gebos riba, todėl tai apsunkina.
sunku gauti tikslų rezultatą, nes periferinis švytėjimas praranda dalį savo intensyvumo. Likusių kriterijų nebepakanka tiksliai identifikuoti tiriamus mikroorganizmus. Dėl šios priežasties specialistams, atliekantiems tokio pobūdžio tyrimus, keliami specialūs reikalavimai: jų kvalifikacijos lygis turi būti pakankamas operuoti turimais duomenimis.
Dėl šios priežasties tik atitinkamą kvalifikaciją turintis gydytojas gali atlikti gautos analizės dekodavimą. Apie RIF tyrimo kainą skaitykite žemiau.
Vidutinė kaina
Imunofluorescencinio tyrimo kaina priklauso nuo gydymo įstaigos vietos ir lygio, taip pat nuo analizę atliekančio specialisto kvalifikacijos. Šiandien kaina svyruoja nuo 1280 iki 2160 rublių.
Toliau pateiktame vaizdo įraše sužinosite daugiau apie imunologines reakcijas:
Yra dvi RIF (Coons reakcijos) nustatymo parinktys – tiesioginės ir netiesioginės imunofluorescencinės reakcijos.
Tiesioginis RIF yra paprasta vieno žingsnio reakcija, bet kadangi tam reikia daug
pažymėtų antimikrobinių serumų, tai rečiau jis yra netiesioginis, kurio gamybą užtikrina vienas žymėtas antiserumas.
Netiesioginis RIF yra dviejų pakopų reakcija, kurios metu antigenas pirmiausia sujungiamas su nežymėto tipo serumu, o tada susidaręs antigeno-antikūno imuninis kompleksas yra apdorojamas FITC pažymėtu antiserumu, kuriame yra antikūnų prieš šio komplekso imunoglobuliną. Paprastai I formavimo stadijoje imuninis triušio serumas, gautas imunizuojant gyvūnus atitinkamu mikroorganizmu, naudojamas kaip rūšies serumas, o II stadijoje – FITC pažymėtas asilų ar kitų gyvūnų, imunizuotų triušio gama globulinais, serumas prieš triušius. 9 pav.).
Tiesioginis RIF nustatymas. Ant neriebaus stiklelio iš tiriamosios medžiagos daromi ploni tepinėliai, o iš organų ir audinių – tepinėliai-atspaudai. Preparatai išdžiovinami, fiksuojami, ant jų užtepamas liuminescencinis serumas, paimtas darbiniu atskiedimu, ir 20-30 minučių dedamas į drėgną kamerą 37 °C temperatūroje (25-40 minučių - kambario temperatūroje). Tada, norint pašalinti fluorescencinių antikūnų perteklių, preparatas 10-15 minučių plaunamas buferiniu izotoniniu natrio chlorido tirpalu, po to 10 minučių skalaujamas distiliuotu arba tekančiu vandeniu. Išdžiovinkite kambario temperatūroje ir ištirkite fluorescenciniu mikroskopu, naudojant panardinimo į aliejų sistemą.
Bakterijų ląstelių specifinės fluorescencijos intensyvumui įvertinti naudojama keturių pliusų skalė: „++++“, „+++“ – labai ryški ir ryški; „++“, „+“ – ryški ir silpna storosios žarnos žalia ląstelių fluorescencija. Privalomos trys kontrolinės medžiagos: 1) gydymas homologinių bakterijų fluorescenciniais antikūnais (teigiama kontrolė); 2) heterologinė kultūra (neigiama kontrolė); 3) neužkrėstos medžiagos (neigiama kontrolė).
Antikomplementarus RIF. Reakcija yra CSC modifikacija, kurioje antikomplementariniai antikūnai, pažymėti FITC, tarnauja kaip indikatoriaus sistema (10 pav.).
Netiesioginis antikomplementarinis RIF nustatomas taip: antigeno preparatas ruošiamas ant stiklelio, kaip ir RIF, bet I etape jis apdorojamas ne vienu imuniniu serumu, o jo mišiniu su jūrų kiaulytės komplementu, o II stadijoje. su antiserumu, kuriame yra FITC pažymėtų antikūnų, skirtų komplementuoti . Plačiai paplitęs anti-komplementarus RIF naudojimas ribojamas dėl to, kad sunku gauti anti-komplementarius antikūnus ir tai, kaip jie yra „ženklinami“.