Virusologinių tyrimų metodai. Virusologinis tyrimas

Virusologiniai tyrimai Infekcinių ligų klinikoje tampa vis svarbesni, o tai visų pirma lemia didėjantis virusinio pobūdžio infekcijų, kurių klinika ne visada būdinga, dalis. Tuo pačiu metu greiti ir patikimi virusologinės diagnostikos metodai nėra sukurti visoms infekcinėms ligoms, daugelis jų yra daug pastangų reikalaujantys, reikalaujantys specialių sąlygų, eksperimentinių gyvūnų, maistinių medžiagų, apmokyto personalo. Šiuo metu virusinėms infekcijoms diagnozuoti naudojami 3 pagrindiniai tyrimų tipai.
1. Mikroskopinis infekcinės medžiagos tyrimas, siekiant nustatyti viruso antigeną arba patognomoninius audinių pokyčius. Diagnostikos tikslais tiesioginis mikroskopinis pacientų infekcinės medžiagos tyrimas taikomas ribotam skaičiui virusinių infekcijų (pasiutligės, vėjaraupių, geltonosios karštinės, pūslelinės ir kt.). Metodas, pagrįstas viruso antigeno aptikimu naudojant fluorescencinius antikūnus, tapo plačiau pritaikytas. Imunofluorescencijos metodas gali būti patikimas tik tuo atveju, jei griežtai laikomasi visų techninių reikalavimų.
2. Virusologiniai metodai.
3. Serologiniai tyrimai, skirti nustatyti antikūnų titro padidėjimą ligos eigoje. Laboratorijoje labiau prieinami serologinio tyrimo metodai.
Šiems tyrimams būtina paimti kraujo serumą ūminiu ligos periodu ir sveikimo laikotarpiu (suporuoti serumai). Kraujo mėginiai serologiniams tyrimams imami steriliai, be antikoaguliantų ir konservantų.
Pagrindiniai virusologinių tyrimų etapai yra virusų išskyrimas, jų identifikavimas, pagrindinių biologinių savybių apibūdinimas. Šiuo metu nėra vieno metodo, kaip atskirti skirtingas virusų grupes. Taip yra visų pirma dėl jų savybių ir auginimo už šeimininko ribų ypatybių įvairovės. Tyrimui naudojami biosubstratai (išplovimai iš gleivinės, kraujo ir jo komponentų, smegenų skysčio, šlapimo ir išmatų, organų ir audinių biopsijos mėginiai arba jų gabaliukai, paimti skrodimo metu), kurie specialiai apdorojami, po to praeina. medžiaga. Tyrimams paimta medžiaga turi būti laikoma nuo -20 °C iki -70 °C temperatūroje. Atsižvelgiant į preliminarią diagnozę, medžiagos apdorojimas turi savo ypatybes, tačiau visais atvejais turėtų būti gaunamas substratas, kuris būtų maksimaliai išvalytas nuo gleivių, organų ir audinių ląstelių ar jų fragmentų, bakterijų priemaišų. Tai pasiekiama tiriamąją medžiagą homogenizuojant specialiu aparatu arba šlifuojant porcelianiniame skiedinyje šaltai su kvarciniu stiklu (organų ir audinių gabalėliais), pridedant sterilaus atšaldyto (+4 C) 0,9 %

natrio chlorido tirpalu, kad gautųsi 10-30% suspensija, o po to centrifuguojama 1500-3000 aps./min 10-15 minučių. Taip gautas supernatantas naudojamas tolesniems tyrimams.
Prieš intensyviai plėtojant ir įvedant į plačią audinių ir ląstelių kultūros metodą, buvo naudojamas eksperimentinių gyvūnų arba vištų embrionų užkrėtimas. Šie metodai vis dar naudojami ir šiandien. Virusų aptikimas naudojant gyvūnus yra tinkamiausias tais atvejais, kai eksperimento metu galima atkurti tipišką infekcinės ligos vaizdą arba atskirus jos pasireiškimus. Taigi, arbovirusų ir Coxsackie grupių patogenus galima aptikti užsikrėtus žindomų pelių smegenyse, gripą – užkrėtus vištų embrionus arba į nosį suleidus tiriamąją medžiagą pelėms. Pastaraisiais metais virusologijos laboratorijose plačiausiai taikomas ląstelių ir audinių kultūros metodas, leidžiantis išskirti adenovirusus, herpeso virusus, respiracinį sincitinį virusą, miksovirusus ir kt., o etiologinę ligos diagnostiką atlikti jau klinikoje. pirmieji tyrimo etapai. To pagrindas yra gerai ištirtos daugumos virusų ir ląstelių sąveikos citologinės savybės. Taigi, HeLa, Hep-2 ląstelių užkrėtimas medžiaga, kurioje yra 2 tipo adenoviruso, jau 3 dieną sukelia vieno sluoksnio ląstelių augimo modelio pasikeitimą ir tipiškų ląstelių atsiradimą vynuogių kekių pavidalu ir kt. , kurios yra gerai apibrėžtos įprastu šviesos mikroskopu esant mažam padidinimui.
Išskirtinę reikšmę infekcinės ligos etiologinei diagnostikai turi viruso išskyrimo iš tiriamosios medžiagos standartizavimas, kuris šiame darbo etape apima genetiškai grynų linijinių gyvūnų naudojimą, atsižvelgiant į jų fenotipines (pirmiausia amžiaus) ypatybes. Taip yra visų pirma dėl to, kad įvairių genetinių linijų ir amžiaus eksperimentiniai gyvūnai yra nevienodo laipsnio jautrūs virusams. Taigi pelių intracerebrinės infekcijos metu neurotropine gripo viruso WSN paderme BALB/c, A, CBA ir outbred gyvūnų linijos pasižymėjo didžiausiu jautrumu, toks pat modelis buvo nustatytas ir intranazalinio tiriamosios medžiagos skyrimo atvejais. Norint gauti galutinius viruso išskyrimo rezultatus, būtina atlikti preliminarų gyvūnų, vištų embrionų, ląstelių ir audinių kultūrų tyrimą dėl latentinių virusų nešiotojų. Labai plačiai laboratorinėje praktikoje naudojami viščiukų embrionai gali būti užkrėsti paukščių leukemijos virusais, paukščių encefalomielitu, infekciniu sinusitu, psitakoze, Niukaslio liga, kai kurių bakterinių infekcijų (paratifo ir kt.) sukėlėjais, taip pat mikoplazmomis. Dar daugiau bakterijų ir ypač virusinių agentų sugeba spontaniškai užkrėsti ląstelių ir audinių kultūras ir jose išgyventi. Jų buvimas daro didelę įtaką tiriamos medžiagos vertinimui. Kai kurios mikoplazmų rūšys ląstelių kultūroje
gali sukelti hemagliutinaciją ir hemadsorbciją ir net suformuoti apnašas po agaro danga, panašias į susidariusius virusus. Nemaža reikšmės turi ir vieno tipo ląstelių kultūrų užterštumas kitomis, dažniausiai tai siejama su HeLa ląstelėmis ir pastebima dirbant su skirtingų tipų kultūromis toje pačioje patalpoje, blogai apdorojant laboratorinius stiklinius indus ir pan. ląstelių kultūrų užteršimas arba gyvūnų užsikrėtimas bakteriniais sukėlėjais, pvz., paprastai tai pasireiškia gana aiškiai (vieno sluoksnio ląstelės augimo modelio pokyčiai, auginimo terpės savybės, vištų embrionų ar gyvūnų mirtis su tam tikrais simptomais ir pan.) ir nesukelia ypatingų sunkumų vertinant rezultatus. Sudėtingesnė situacija yra su latentinėmis infekcijos formomis, kai reikia naudoti serologinius ir kitus metodus. Į šiuos nurodymus reikia atsižvelgti dirbant virusologui, ypač atliekant neaiškių ligos atvejų etiologinę diagnozę.

Ūminių žarnyno infekcijų diagnozė nustatoma remiantis klinikiniais ir epidemiologiniais duomenimis, su privalomu laboratoriniu patvirtinimu. Be laboratorinio patvirtinimo, ūmių žarnyno infekcijų diagnozė gali būti nustatyta tik tais atvejais, kai yra aiškiai nustatyti epidemiologiniai duomenys (infekcijos židiniuose ir daugumos pacientų laboratoriniuose iššifruotuose grupiniuose ligų protrūkiuose).

Galutinei diagnozei nustatyti naudojami bakteriologiniai, virusologiniai ir serologiniai tyrimo metodai.Koprologinis metodas, o taip pat sigmoidoskopijos (šigeliozei) rezultatai yra antrinės reikšmės.

aš. Bakteriologinis metodas turi didžiausią reikšmę AII, kurią sukelia bakterinė flora (invazinis ir sekrecinis viduriavimas). Geriausi rezultatai pasiekiami sėjant išmatas tiesiai prie paciento lovos, prieš skiriant antibiotikų terapiją ir per pirmąsias dvi valandas nuo mėginio paėmimo momento pristatomas į bakteriologinę laboratoriją. Tyrimui būtina pasirinkti daleles, kuriose yra patologinių priemaišų, bet ne kraujo. Biomedžiaga sėjama ant selektyvios Ploskirevo, Levino ir kitų terpių. Teigiamų rezultatų dažnis (patogeno inokuliacija ir jo identifikavimas), net ir esant tipiškoms AII klinikinėms apraiškoms. Neviršija 70-80%.

II. Serologiniai metodai diagnostika, kaip taisyklė, naudojama abejotinais atvejais ir esant neigiamiems išmatų bakteriologinio tyrimo rezultatams. Pirmųjų mėnesių vaikams gyvybei, tai neinformatyvu, bet visais atvejais svarbus antikūnų titro padidėjimas 4 ir daugiau kartų. Jie atliekami dviem kryptimis – nustatomas specifinių antikūnų titras paciento kraujo serume ir antigenas išmatose.

Specifinių antikūnų titrui nustatyti dažniausiai naudojamas RNHA, rečiau RPHA ar RA. Kaip antigenai imama kasdieninės bakterijų kultūros (RA) arba eritrocitų diagnostikos suspensija. ( RPGA, RNGA). Patikimesnis turėtų būti laikomas antikūnų titrų padidėjimu ligos dinamikoje. Specifiniai antikūnai sergančiojo AII kraujyje atsiranda 3-5 ligos dieną ir iki maksimumo padaugėja per 2-3 savaites, o vėliau palaipsniui mažėja. Mažiems vaikams, ypač turintiems pakitusį premorbidinį foną, specifinių antikūnų kraujyje neaptinkama arba jų titrai yra žemi (1:50 – 1:100).

Esant tipiniams klinikiniams simptomams ir nustačius specifinių antikūnų diagnostinį titrą (1:200) ir didesnį su atitinkamu diagnostiku) arba padidėjus jų titrui ligos dinamikoje, klinikinė žarnyno infekcijos diagnozė turėtų būti atliekama. laikoma nustatyta, net jei ligos sukėlėjas nepasisėja iš paciento išmatų.

III. Greitosios diagnostikos metodaiŽarnyno infekcijos grindžiamos patogeno antigeno (bakterijos ar viruso) aptikimu iš išmatų, kuriems taikomas tiesioginis liuminescencinių antikūnų (PMLA) metodas arba imunoadsorbcijos metodas – anglies aglomeracijos reakcija (RCA). Preliminarų rezultatą galima gauti per 2-3 valandas, galutinį – per dieną. Metodo specifiškumas yra 82-94,6%.

Pastaraisiais metais greitam viduriavimo diagnozavimui buvo naudojamas su fermentais susietas imunosorbentinis tyrimas (ELISA) ir latekso agliutinacija (RLA).

Virusinio viduriavimo etiologinis dekodavimas atliekamas naudojant virusologinius ir bakteriologinius metodus.

Optimalus virusų išmatose aptikimo laikotarpis laikomas nuo 1 iki 4 ligos dienų, nors ligos sukėlėjas dažnai išlieka ilgiau.

Pagrindinis naudojamas metodas yra elektroninės mikroskopijos metodas, leidžiantis pagal morfologines savybes nustatyti platų spektrą virusinių agentų, sukeliančių gastroenteritą.

Taip pat naudojama imunoelektroninė mikroskopija (remiantis viruso dalelių gebėjimu, esant homologiniams ar sveikstantiems serumams, formuoti rotaviruso dalelių agregatus su imunoglobulinais).

Tarp serodiagnostikos metodų tradiciniai yra neutralizacijos reakcija, hemagliutinacijos slopinimas, komplemento fiksacija.Antikūnų padidėjimas poriniuose serumuose turi retrospektyvinę reikšmę rotavirusinės infekcijos diagnozei. Rotavirusams ar jų antigenams aptikti naudojama ELISA, difuzinis nusodinimas, latekso agliutinacija, koagliutinacijos reakcija.

Praktiniame darbe IFA užėmė plačiausią vietą – rotaviruso antigenų išskyrimas koprofiltruose. Šiuos metodus geriau naudoti dinamikoje (pirmąją hospitalizacijos dieną ir po klinikinio pasveikimo).

Siekiant pašalinti AII bakterinę etiologiją, bakteriologinis išmatų tyrimas taip pat atliekamas sėjant ant maistinių medžiagų.

sigmoidoskopija metodas vaikams taikomas retai, daugiausia siekiant nustatyti užsitęsusio bakterijų išsiskyrimo priežastį ir diagnozuoti užsitęsusias ir lėtines ligos formas. Šis tyrimo metodas leidžia įvertinti tik distalinės žarnos gleivinės morfologinių pakitimų pobūdį, tačiau negali būti naudojamas žarnyno infekcijos etiologinei diagnozei nustatyti.

Indikacijos instrumentiniam tyrimui (ultragarsinis, pilvo organų rentgeno tyrimas, FGS) sergant ūminėmis žarnyno infekcijomis yra diferencinės diagnostikos poreikis su chirurginėmis pilvo organų ligomis (invaginacija, apendicitu), somatinėmis ligomis (gastritu, pepsine opa, cholecistopankreatitas ir kt.) ir virškinimo trakto funkciniai sutrikimai.

Klinikinės toksikozės formos (neurotoksikozė, toksikozė su eksikoze, TSS), jos laipsnio (stadijos), dehidratacijos tipo, sergant vaikų infekciniu viduriavimu, nustatymas ir skubi pagalba.

15.1. Mikrobiologinių ir imunologinių laboratorijų charakteristikos

Visi darbai su mikrobais atliekami laboratorijose, kurios, priklausomai nuo pagrindinių užduočių, gali būti tiriamosios, diagnostikos ar gamybos.

Sveikatos priežiūros sistema turi:

Bendrosios ar specialiosios (biocheminės, bakteriologinės, imunologinės, citologinės ir kt.) tipo klinikinės diagnostikos laboratorijos, kurios yra ligoninių, poliklinikų, ambulatorijų ir kitų gydymo įstaigų dalis;

Valstybinės sanitarinės ir epidemiologinės priežiūros (GSN) bakteriologinės laboratorijos;

GOS sanitarinės ir bakteriologinės laboratorijos;

GOS sanitarinės-chemijos laboratorijos;

Centrinės (TsNIL), probleminės, šakinės, edukacinės universitetų laboratorijos;

Specializuotos laboratorijos (ypač pavojingų infekcijų ir kt.).

Šiuo metu laboratorijos ir didesnės laboratorinės įstaigos (katedros, institutai, gamybos įmonės) dažniausiai yra specializuotos ir dirba su viena ar kita mikrobų grupe.

Su virusais užsiimama virusologijos laboratorijose, turinčiose atitinkamą įrangą ir taikančiose specialius tyrimo metodus. Yra mikologijos ir protozoologijos laboratorijos. Specializuotas personažas

taip pat įsigyjamos bakteriologinės laboratorijos, kuriose dirbama su tam tikromis bakterijų grupėmis, pavyzdžiui, riketsinėmis, tuberkuliozinėmis, leptospiralinėmis, anaerobinėmis ir kt. Imunologiniai tyrimai atliekami imunologinėse laboratorijose, nors tam tikros rūšies tyrimai gali būti atliekami ir mikrobiologinėse. laboratorijos, pavyzdžiui, infekcinių ligų serodiagnostika.

Laboratoriniai darbai su patogeniniais mikrobais atliekami specialiai įrengtose laboratorijose, kurios užtikrina darbo režimą ir saugos priemones, kurios pašalina galimybę užsikrėsti personalą ir mikrobų nutekėjimą už laboratorijos ribų.

Poreikis aiškiai reguliuoti darbo sąlygas su mikrobais, kurie įvairaus laipsnio pavojingi laboratorijos darbuotojams ir aplinkiniams gyventojams, paskatino sukurti mikrobų klasifikaciją, suskirstant juos į 4 grupes pagal jų biologinio pavojingumo laipsnį (PSO klasifikacija). ). Rusijoje pagal PSO rekomendacijas patogeniniai mikrobai taip pat skirstomi į 4 grupes: 1 grupė – ypač pavojingų infekcijų sukėlėjai; 2 grupė – labai užkrečiamų žmonių epideminių ligų sukėlėjai; 3 grupė - infekcinių ligų sukėlėjai, priskirti nepriklausomoms nosologinėms grupėms; 4 grupė – sąlyginai patogeniški mikrobai – oportunistinių infekcijų sukėlėjai. Rusijoje priimtas mikrobų grupių numeravimas atvirkštine tvarka skiriasi nuo PSO klasifikacijos, kur mažiausio patogeniškumo mikrobai priklauso 1 grupei, o ypač pavojingi – 4 grupei.

Pagal mikrobų suskirstymą į grupes pagal biologinio pavojingumo laipsnį, laboratorijos taip pat skirstomos į kategorijas. Pagal PSO nomenklatūrą yra 3 mikrobiologinių laboratorijų kategorijos:

Bazinės (bazinės arba bendrosios) laboratorijos, kuriose dėl specifinių darbo ypatumų gali būti įrengtos įvairios apsaugos priemonės;

Apsaugos (izoliuotos) laboratorijos ir specialaus režimo laboratorijos (maksimaliai izoliuotos).

Darbo saugumas visų kategorijų laboratorijose užtikrinamas laikantis darbo laboratorijoje tvarkos ir taisyklių, įvykdant laboratorijos patalpoms ir jų įrangai keliamus reikalavimus, aprūpinant laboratorijas atitinkama įranga.

darbuotojų sveikatos stebėjimas, medicininė priežiūra, darbuotojų saugos mokymas ir mokymas laboratorijoje.

15.2. Mikrobiologinių ir imunologinių laboratorijų įranga

Bazinės laboratorijos patalpos turi būti erdvios, kad būtų užtikrintas saugus laboratorinių darbų atlikimas. Sienos, lubos ir grindys turi būti lygaus, lengvai valomo paviršiaus, nepralaidžios skysčiams ir atsparios dažniausiai laboratorijoje naudojamoms dezinfekavimo priemonėms. Darbo stalų paviršius turi būti atsparus vandeniui, atsparus dezinfekavimo priemonėms, rūgštims, šarmams, organiniams tirpikliams ir vidutiniam karščiui. Laboratoriniai baldai turi būti patvarūs. Vieta po stalais ir tarp baldų turi būti lengvai pasiekiama valymui. Laboratorijoje turi būti autoklavas atliekoms dezinfekuoti.

Bazinė laboratorinė įranga turi apriboti arba užkirsti kelią mikrobiologo sąlyčiui su infekcine medžiaga, turi būti pagaminta iš patvarių medžiagų, nepralaidi skysčiams ir atspari korozijai. Įranga turi būti suprojektuota ir sumontuota taip, kad ją būtų galima lengvai išvalyti, nukenksminti ir patikrinti.

Laboratorijoje yra mikroskopas, autoklavas, termostatai, džiovinimo, sterilizavimo spintos, serumo krešėjimo aparatas, distiliatorius, centrifugos, laboratorinės svarstyklės, pH matuoklis, FEC, magnetinė maišyklė, plovimo vonia.

Laboratorijos darbo patalpose turi būti tiekiamas šaltas ir karštas vanduo, elektra, vakuumas, deguonis, aukšto slėgio oras ir kt. Kai kurios spintos yra su dėžėmis ir dūmų gaubtais.

Privalomos patalpos – žarnyno ir lašelinių infekcijų laboratorijos, sanitarinės ir bakteriologinės, serologinės, taip pat pagalbinės patalpos: vidutinė viryklė, skalbimo kambarys, sterilizavimo patalpa (švari ir nešvari), registratūra, sandėliukai, vonios kambarys darbuotojams, vivarium. Laboratorijose, kuriose yra mikroorganizmų gabenimo tyrimų taškai, jie papildomai įrengs priėmimo kambarį, gydymo kambarį, tualetus mėginiams paimti.

medžiaga. Patalpas sutvarkykite taip, kad nešvarūs ir švarūs upeliai nesikirstų ir nesiliestų.

Kalbant apie saugių laboratorijų patalpas, turi būti laikomasi tų pačių reikalavimų, kaip ir bazinei laboratorijai. Be to, tokio tipo laboratorijos turėtų būti atskirtos nuo tų pastato dalių, kuriose nėra ribojamas darbuotojų judėjimas. Rankų plovimo patalpose turi būti įrengti įrenginiai, leidžiantys atverti vandenį kojos pedalu arba alkūne. Langai turi būti uždaryti ir sandarūs. Įėjimo į laboratorijų patalpas durys turi būti savaime užsidarančios ir rakinamos. Ištraukiamoji ventiliacija suprojektuota taip, kad patalpose, kuriose yra didžiausia infekcijos rizika, būtų sukurtas mažiausias slėgis. Tokiu atveju oras judės iš pagalbinių patalpų pagrindinės darbo patalpos kryptimi. Išmetamas oras į aplinką patenka tik perfiltravus per bakterinius filtrus. Įrengdami aukšto saugumo laboratorijas įranga, jos vadovaujasi rekomendacijomis, parengtomis pagrindinėms laboratorijoms, pridedant, kad visi darbai su infekcinėmis medžiagomis jose atliekami apsauginėse dėžėse. Maksimaliai izoliuotų laboratorijų režime yra daugybė funkcijų, užtikrinančių maksimalią biologinę personalo, visuomenės ir aplinkos saugą. Įėjimas į laboratoriją ir išėjimas iš jos vykdomi per sanitarinį patikrinimo punktą. Prie įėjimo privaloma visiškai persirengti specialiais drabužiais, išeinant, prieš persirengiant, privaloma tikslinga personalo dezinfekcija (dušas, dezinfekcijos priemonės). Boksas naudojamas siekiant sumažinti infekcinių medžiagų patekimo į aplinką riziką. Naudojant dėžės (stalviršis, laminatas) sukuria fizines kliūtis, kad būtų išvengta galimo dirbančio personalo kontakto su infekcine medžiaga.

15.3. Darbo mikrobiologinėje laboratorijoje taisyklės

Pagrindinės darbo bazinėje laboratorijoje taisyklės yra šios:

Draudimas dirbti su pipete naudojant burną;

Draudimas darbo vietose valgyti, gerti, rūkyti, laikyti maistą ir naudoti kosmetiką;

Švaros ir tvarkos palaikymas;

Darbo paviršių dezinfekavimas bent kartą per dieną ir po kiekvieno kontakto su infekcine medžiaga;

Darbuotojams plauti rankas po darbo su infekcine medžiaga, gyvūnais, prieš išeinant iš laboratorijos;

Visus darbus atlikti taip, kad būtų sumažinta aerozolių susidarymo galimybė;

Visų užkrėstų medžiagų nukenksminimas prieš šalinant arba pakartotinai naudojant.

15.4. Infekcinių ligų mikrobiologinės diagnostikos principai

Laboratorinėje infekcinių ligų diagnostikoje svarbiausią vietą užima specifinė mikrobiologinė diagnostika, kuri atliekama bakteriologinėse, virusologinėse, imunologinėse ir kitose laboratorijose. Jį sudaro trys etapai: ikianalitinis, analitinis ir poanalitinis.

Pirmasis mikrobiologinės diagnostikos etapas yra ikianalitinis, įskaitant medžiagos paėmimą tyrimams. Tiriamos medžiagos pasirinkimą lemia infekcinės ligos patogenezė ir klinikinis vaizdas. Tiriamoji medžiaga paimama, jei įmanoma, aseptinėmis sąlygomis, dedama į sterilų indą ir kuo greičiau (geriausia per 1 valandą) pristatoma į laboratoriją. Kai kuriais atvejais medžiaga sėjama prie paciento lovos. Kartais leidžiama trumpai laikyti medžiagą reguliuojamomis sąlygomis. Prie tiriamos medžiagos pridedamas dokumentas, kuriame turi būti nurodytas paėmimo laikas, medžiagos pobūdis, šaltinis, tiksliai nustatytas tyrimo tikslas.

Medicininės mikrobiologijos tyrimų medžiaga yra įvairūs biologiniai ir patologiniai kūno skysčiai (kraujas, pūliai, šlapimas, skrepliai, smegenų skystis, išmatos, vėmalai, praplovimai ir kt.) ir audiniai – biopsijos medžiaga iš gyvo ar skrodimo iš lavono. Sanitarinėje mikrobiologijoje tyrimams paimami aplinkos objektai (oras, vanduo, maistas ir kt.) arba iš jų tepinėliai. Imant medžiagą

atliekant mikrobiologinius tyrimus, reikia laikytis šių taisyklių:

Medžiaga paimama tiesiai iš infekcijos šaltinio arba tiriamos atitinkamos išskyros (pūliai, šlapimas, tulžis ir kt.);

Medžiagos kiekio turėtų pakakti tyrimui atlikti ir, jei reikia, jį pakartoti;

Medžiaga imama, jei įmanoma, pradiniu ligos periodu, nes būtent šiuo laikotarpiu ligos sukėlėjai išskiriami dažniau, jų yra daugiau, jie turi tipiškesnę lokalizaciją;

Medžiaga paimama prieš pradedant antimikrobinę chemoterapiją arba praėjus tam tikram laikui po antibakterinio vaisto vartojimo, būtino jo pasišalinimui iš organizmo;

Būtina užkirsti kelią galimybei patekti į antimikrobinių preparatų (dezinfekcijų, antiseptikų, antibiotikų) medžiagą;

Medžiaga turi būti gabenama į laboratoriją kuo greičiau tokiomis sąlygomis, kurios neleidžia žūti nestabilių mikrobų rūšių, arba patalpintos į specialias transportavimo terpes;

Transportuojant būtina laikytis visų biologinės saugos taisyklių;

Prie medžiagos pridedamas lydraštis, kuriame pateikiama pagrindinė informacija, reikalinga mikrobiologiniam tyrimui atlikti (pavardė, vardas, paciento patronimas, ligos istorijos numeris, klinikinė diagnozė ir kt.).

15.5. Mikrobiologinės diagnostikos metodai

Analitinė stadija apima mikroskopinius, kultūrinius, biologinius, serologinius ir alergologinius mikrobiologinės diagnostikos metodus.

Mikroskopinis metodas susideda iš preparatų (natūralių arba dažytų paprastais ar sudėtingais metodais) paruošimas iš tiriamos medžiagos ir jų mikroskopavimas naudojant įvairių tipų mikroskopinę įrangą (šviesos, tamsiojo lauko, fazinio kontrasto, liuminescencinę, elektroninę ir kt.). Bakteriologijoje mikroskopinis metodas vadinamas bakterioskopiniu, virusologijoje – viroskopija.

Kultūros metodas Tai apima tiriamosios medžiagos inokuliavimą į dirbtines maistines terpes, ląstelių kultūras arba vištienos embrionus, siekiant išskirti ir identifikuoti gryną patogeno ar patogenų kultūrą. Bakteriologijoje kultūros metodas vadinamas bakteriologinis, mikologijoje - mikologinis, protozoologijoje - protozoologinis, virusologijoje - virusologinis.

biologinis metodas (eksperimentinis arba biologinis tyrimas) apima jautrių laboratorinių gyvūnų ar kitų biologinių objektų (vištų embrionų, ląstelių kultūrų) užkrėtimą tiriamąja medžiaga. Iš jo išskiriama grynoji patogeno kultūra, nustatoma toksino rūšis, antimikrobinių chemoterapinių vaistų aktyvumas ir kt.

Serologinis metodas Tai yra specifinių antikūnų titro nustatymas paciento kraujo serume, rečiau – mikrobinio antigeno aptikimas tiriamojoje medžiagoje. Šiuo tikslu naudojami imuniniai atsakai.

Alergologinis metodas Tai yra infekcinės alergijos (HRT) diagnostikos mikrobų vaistų alergeno nustatymas. Tuo tikslu atliekami odos alergijos tyrimai su atitinkamais alergenais.

Šių metodų diagnostinė vertė yra nevienoda. Pagrindinis mikrobiologinės diagnostikos metodas yra bakteriologinis metodas, nes leidžia išskirti ir identifikuoti mikrobą sukėlėją, t.y. pagrindinė ligos priežastis. Likę metodai yra mažiau informatyvūs, nes jie leidžia aptikti pokyčius organizme dėl jame esančio mikrobo. Antra pagal svarbą serologinis metodas, kadangi antigeno ir antikūno sąveika pasižymi dideliu specifiškumu. Kitų trijų metodų informacijos turinys yra mažas ir dažniausiai naudojami kaip bakteriologinių ir serologinių metodų papildymas. Taigi tiriamos medžiagos mikroskopavimas ne visada leidžia mikroskopu pamatyti ir identifikuoti mikrobus. Juos galima aptikti tik tada, kai medžiaga yra labai jais užteršta. Net ir radus bakterijas po mikroskopu, neįmanoma jų morfologiškai identifikuoti pagal rūšį. Kaip žinoma, visų rūšių bakterijų įvairovė yra sumažinta iki 4 pagrindinių morfologinių formų: kokų, lazdelių, vingiuotų ir šakojančių formų. Todėl, anot mikro

Skopinėje nuotraukoje pastebėtos bakterijos gali būti labai preliminariai priskiriamos dideliam taksonui, pavyzdžiui, gramteigiamiems kokiams. Tik pavieniais atvejais, kai bakterijos turi unikalią morfologiją, gali mikroskopiškai nustatyti jų gentis. Mikroskopinio grybų ir pirmuonių metodo informacijos turinys yra didesnis, nes grybai ir pirmuonys, būdami eukariotai, turi didesnius dydžius ir būdingesnę morfologiją.

Biologinio metodo diagnostikos galimybes riboja tai, kad laboratoriniai gyvūnai yra atsparūs daugumai žmogaus antroponozinių infekcijų sukėlėjų, todėl juose neįmanoma sukelti eksperimentinės infekcijos.

Alergologinio metodo galimybes riboja tai, kad dauguma žmogaus organizme esančių mikrobų PHT nesukelia.

Kadangi mikrobiologiniai tyrimai yra viena brangiausių laboratorinių tyrimų rūšių, mikrobiologui tenka užduotis kuo mažiau laiko, pastangų ir pinigų atlikti patikimą mikrobiologinę diagnozę. Todėl diagnozei nustatyti naudojami 1-5 diagnostikos metodai, kad pasirinktas metodų kompleksas garantuotų teisingą atsakymą.

Ypač svarbūs yra greitosios diagnostikos metodai, leidžiantys atlikti mikrobiologinę diagnozę per trumpą laiką (nuo kelių minučių iki kelių valandų) nuo tiriamosios medžiagos pristatymo į laboratoriją momento. Ekspresiniai metodai yra RIF, ELISA, RIA, PGR, biolustų naudojimas, chromatografija ir kt. Anaerobinių infekcijų diagnostikos ypatumai aprašyti disko medžiagoje.

Kartu su tradiciniais klasikiniais mikrobiologinės diagnostikos metodais, pastaraisiais metais vis svarbesni tampa molekulinės biologinės diagnostikos metodai (DNR zondai, PGR, ligazės grandininė reakcija – LCR, chromatografija, elektroforezė, imunoblotas, biolustai ir kt.).

Molekulinės biologinės diagnostikos metodai yra pagrįsti tam tikrai mikrobų rūšiai būdingos DNR ir RNR identifikavimu ir apima hibridizaciją, pagrįstą DNR zondais, ir diagnostiką, pagrįstą PGR.

poanalitinis mikrobiologinės diagnostikos etapas susideda iš laboratorinių tyrimų rezultatų klinikinio interpretavimo. Kartu gydantis gydytojas turėtų įvertinti iš paciento išskirtų mikrobų etiologinę reikšmę, koreguoti pacientui skiriamą empirinę antimikrobinę chemoterapiją pagal mikrobiologinio stebėjimo duomenis ir kt.

15.5.1. Bakterinių infekcijų mikrobiologinės diagnostikos metodai

Bakteriologijoje patogenui aptikti tiriamojoje medžiagoje naudojami bakterioskopiniai, bakteriologiniai ir biologiniai metodai.

Bakterioskopinio metodo privalumai – paprastumas, greitis, ekonomiškumas. Tačiau jo naudojimas yra ribotas, nes jis gali būti naudojamas tik tuo atveju, jei yra kokių nors morfologinių ar spalvinių patogeno požymių ir jo pakankamas kiekis tiriamojoje medžiagoje. Šis metodas yra orientacinis.

Pagrindinis ir tiksliausias bakterinių infekcijų diagnostikos metodas yra bakteriologinis, kuris naudojamas beveik visoms ligoms, nepaisant jo trūkumų: tyrimo trukmės (nuo 4-5 dienų iki 2 mėnesių), pavojaus (nes patogeno grynoji kultūra). kaupiasi), palyginti didelė kaina. Jei tikimasi, kad tiriamojoje medžiagoje patogeno bus pakankamai, medžiaga sėjama į tankią maistinę terpę, kad būtų gautos izoliuotos kolonijos. Esant mažam mikrobų kiekiui, tiriamoji medžiaga pirmiausia sėjama į skystą maistinę terpę – sodrinimo terpę. Išskirta grynoji kultūra identifikuojama pagal morfologines, tinktūrines, kultūrines, biochemines, antigenines ir toksikogenines savybes (priklausomai nuo patogeno tipo). Išvardytų savybių apibrėžimas leidžia nustatyti patogeno tipą. Epidemiologinio žymėjimo tikslais atliekamas intraspecifinis izoliuotos kultūros identifikavimas: nustatomas jos fagovaras, biovaras ir kt.. Be to, norint skirti racionalų gydymą, paprastai nustatomas išskirtos kultūros jautrumas antibiotikams.

Mikrobiologinėje diagnozuojant ligas, kurias sukelia oportunistiniai mikrobai, normalios mikrofloros atstovai, privaloma nustatyti patogenų skaičių tiriamojoje medžiagoje.

Biologinis metodas yra neekonomiškas, nežmoniškas, todėl taikomas ribotai. Baltosios pelės, jūrų kiaulytės, triušiai, beždžionės ir kiti gyvūnai naudojami kaip eksperimentiniai gyvūnai.

Infekcinės ligos diagnozę galima nustatyti ir serologiniu metodu, kuris leidžia aptikti arba specifinius antikūnus paciento serume, arba specifinius antigenus tiesiogiai tiriamojoje medžiagoje. Antikūnai prieš ligos sukėlėją, kaip taisyklė, atsiranda pirmos ligos savaitės pabaigoje. Negalėjimas jų aptikti pirmosiomis ligos dienomis yra rimtas metodo trūkumas, ypač tais atvejais, kai liga yra ūmi. Be to, daugeliui ligų reikia ištirti antikūnų susidarymo dinamiką ir nustatyti antikūnų skaičiaus padidėjimą, o tai taip pat neleidžia greitai diagnozuoti. Metodo trūkumas yra tas, kad jis negali tiksliai nustatyti patogeno ir nustatyti jo antibiogramą. Tačiau kartu tai visiškai saugus, palyginti nebrangus metodas, leidžiantis per trumpą laiką nustatyti diagnozę. Šiuo metu, sergant daugeliu ligų, nustatomas ne tik imunoglobulinų kiekis, bet ir jų klasės.

Kai kurių ligų atveju serologinis metodas naudojamas specifiniams antigenams aptikti tiriamojoje medžiagoje. Kadangi specifiniai antigenai, sudarantys patogeną, yra patologinėje medžiagoje nuo pirmųjų ligos minučių, šis serologinio metodo variantas naudojamas pagreitintai (pirmąją ligos dieną) ar net aiškiai (per kelias valandas) diagnozuoti. užkrečiamos ligos.

Kaip pagalbinė priemonė nedidelėje infekcinių ligų grupėje naudojamas alergologinis metodas, leidžiantis nustatyti padidėjusį jautrumą konkrečiam antigenui (alergenui), kuris yra ligos sukėlėjas.

15.5.2. Virusinių infekcijų mikrobiologinės diagnostikos metodai

Virusologijoje virusinių infekcijų laboratorinės diagnostikos metodai turi savo specifiką, atsižvelgiant į virusų biologijos ypatybes. Laboratorinei diagnostikai taikomi viroskopiniai, virusologiniai ir serologiniai metodai.

Viroskopijos metodas susideda iš viruso aptikimo tiriamojoje medžiagoje mikroskopu. Dažniau naudojamas elektroninis, rečiau fluorescencinis mikroskopas. Dėl nereikšmingo virusų dydžio šviesos mikroskopija praktiškai nenaudojama. Tik dideliems virusams aptikti, naudojant superdažymo metodus, galima naudoti šviesos mikroskopą. Be to, šviesos mikroskopo pagalba galima aptikti tarpląstelinius inkliuzus, kurie susiformuoja paveiktose ląstelėse tam tikrų infekcijų metu.

Virusologinis metodas apima jautraus biologinio modelio (laboratorinių gyvūnų, viščiukų embrionų ar ląstelių kultūrų) užkrėtimą tiriamąja medžiaga, nurodant virusą ir vėlesnį jo identifikavimą. Kai laboratoriniai gyvūnai yra užsikrėtę, virusai paprastai nurodomi atsižvelgiant į klinikinį ligos vaizdą, patologinius ir anatominius pokyčius ir galiausiai, pavyzdžiui, naudojant hemagliutinacijos reakciją. Ta pati reakcija leidžia aptikti virusus vištienos embrione, kuris paprastai nerodo matomų pokyčių atsivėrimo metu. Ląstelių kultūroje viruso buvimą lemia citopatinis veikimas (įskaitant tarpląstelinių inkliuzų susidarymą), hemadsorbcija, apnašų susidarymo reiškinys, hemagliutinacijos reakcija ir indikatoriaus spalvos pasikeitimo nebuvimas. Viruso identifikavimas atliekamas naudojant serologinius tyrimus (RPGA, RTGA, RN, RSK, ELISA ir kt.). Virusologinis metodas leidžia tiksliai nustatyti patogeno pobūdį, tačiau tam reikia pakankamai laiko (5-7 ar daugiau dienų), didelių materialinių išlaidų ir yra nesaugu.

Serologinio metodo bruožas virusologijoje yra porinių serumų tyrimas. Pirmasis serumas paimamas iš paciento ūminiu periodu ligos pradžioje, laikomas 4-8 °C temperatūroje, o antrasis serumas imamas po 10-14 dienų. Serumai

tyrinėti tuo pačiu metu. Ligą liudija serokonversija, t.y. antikūnų titro padidėjimas antrajame serume, palyginti su pirmuoju. 4 ar daugiau kartų serokonversija yra diagnostinė. Kadangi daugelis virusinių ligų yra ūminės, šis serologinio metodo variantas dažniausiai naudojamas retrospektyviai diagnostikai.

Pagrindinis virusinių infekcijų laboratorinės diagnostikos metodas yra virusologinis.

Virusinių ligų pagreitinta ir ekspresinė diagnostika atliekama taip pat, kaip ir bakterinių infekcijų atveju.

15.5.3. Mikrobiologinės mikozių diagnostikos ypatybės

Mikroskopinis metodas dažniausiai naudojamas grybelinėms infekcijoms diagnozuoti. Mikologinis metodas susideda iš patologinės medžiagos sėjimo ant specialių maistinių medžiagų, grynos patogeno kultūros išskyrimo ir identifikavimo pagal morfologines, kultūrines ir biochemines savybes. Šio metodo bruožas yra jo trukmė - kelios savaitės dėl lėto grybų augimo. Aptikti antikūnus serologinio tyrimo metu galima nuo 2-4 ligos savaitės. Sergant kai kuriomis ligomis, tiriamojoje medžiagoje aptinkami specifiniai antigenai. Alergologinis metodas naudojamas retai. Dažnai, sergant mikozėmis, naudojamas histologinis metodas, kurį sudaro grybelio elementų (sporų, konidijų galvučių ir kt.) aptikimas grybelių paveiktuose organuose ir audiniuose. Tam ruošiami histologiniai ploni arba itin ploni audinių pjūviai, dažomi specialiais histologiniais ir histocheminiais metodais, tiriami naudojant šviesą ir, jei reikia, elektroninę mikroskopiją.

15.5.4. Pirmuonių infekcijų mikrobiologinės diagnostikos ypatumai

Patologinės medžiagos mikroskopinis tyrimas susideda iš natūralių preparatų ("storo lašo") ir tepinėlių, dažytų Romanovskio-Giemsa metodu, paruošimo ir yra pagrindinis pirmuonių sukeltų ligų diagnostikos metodas. Kai kuriais atvejais naudojami serologiniai ir alergologiniai diagnostikos metodai.

15.6. Žmogaus ligų imunologinės diagnostikos principai

Imunodiagnostika – imunologijos skyrius, tiriantis ir plėtojantis infekcinių ir neinfekcinių ligų, susijusių su imuninės sistemos veikla, diagnostikos metodus.

Daugelis infekcinių ligų šiuo metu patyrė reikšmingų pokyčių, o tai rodo lengvų, ištrintų ir besimptomių formų dalies padidėjimas, alerginio komponento padidėjimas ir dažnas mišrių infekcijų dažnis. Tai apsunkina tradicinę ligų diagnostiką, todėl didėja imunodiagnostikos, skirtos patogenų antigenų ar specifinių imuninių poslinkių paciento organizme paieškai, svarba.

Pagal imunoreaktyvumą (imuninę būklę, imuninį profilį) supraskite imuninės sistemos gebėjimą reaguoti į imuninį atsaką tam tikru metu. Jam būdinga imunoglobulinų koncentracija, limfocitų ir leukocitų skaičius, T ir B ląstelių santykis bei funkciniai rodikliai, ypač imunokompetentingų ląstelių gebėjimas reaguoti į stimuliaciją.

15.7. Laboratorinių tyrimų kokybės kontrolė

Svarbus mikrobiologinės ir imunologinės laboratorijos darbo elementas – gauti tikslius ir palyginamus tyrimų rezultatus, kuriems atlikti būtina kontroliuoti tyrimų kokybę. Kokybės kontrolė gali būti vidinė arba išorinė.

Intralaboratorinė kokybės kontrolė - kontrolės priemonių, kurias atskiroje laboratorijoje atlieka šios laboratorijos darbuotojai ir kuriomis siekiama užtikrinti tinkamą laboratorijos darbo kokybės lygį, sistema.

Išorinė kokybės kontrolė - kontrolės priemonių sistema, kurią ekspertų grupės atlieka pagal vieningą laboratorinių tyrimų federalinę išorės kokybės vertinimo sistemą (FSVOK) ir kuriomis siekiama užtikrinti teisingą laboratorinių tyrimų gamybos technologinių procesų organizavimą.

Federalinė išorinio laboratorinių tyrimų kokybės vertinimo sistema susideda iš skyrių, kurių kiekvienas yra

atliekamas tam tikros rūšies laboratorinių tyrimų kokybės įvertinimas. FSVOK struktūra apima ekspertų grupes išorinės kokybės kontrolės plėtrai ir įgyvendinimui įvairių rūšių laboratoriniuose tyrimuose.

Savęs lavinimo (savikontrolės) užduotys

A.Įvardykite mikrobiologinio tyrimo metodą, leidžiantį nustatyti patogeno tipą:

1. Alergiškas.

2. Mikroskopinis.

3. Kultūrinis.

4. Biologinis.

B.Įvardykite pagrindinę bakteriologinio tyrimo metodo užduotį.

b.Serumas iš paciento, kuriam įtariama virusinė infekcija, buvo paimtas 7 ligos dieną, kuriame buvo rasta specifinių antivirusinių antikūnų. Įvertinti tyrimo rezultato patikimumą.

G.Įvardykite laboratorijos tipą, į kurią turėtų būti siunčiama medžiaga iš paciento, kuriam įtariama ypač pavojinga infekcija.

Virusologinių tyrimų metodai— virusų biologijos tyrimo ir jų identifikavimo metodai. Virusologijoje plačiai naudojami molekulinės biologijos metodai, kurių pagalba buvo galima nustatyti viruso dalelių molekulinę struktūrą, kaip jos prasiskverbia į ląstelę ir virusų dauginimosi ypatumus, pirminę virusinių nukleorūgščių struktūrą. ir baltymai. Kuriami virusų nukleorūgščių ir baltymų aminorūgščių sudedamųjų elementų sekos nustatymo metodai. Atsiranda galimybė susieti nukleorūgščių ir jų koduojamų baltymų funkcijas su nukleotidų seka ir nustatyti tarpląstelinių procesų, vaidinančių svarbų vaidmenį virusinės infekcijos patogenezėje, priežastis.

Virusologiniai tyrimo metodai taip pat pagrįsti imunologiniais procesais (antigeno sąveika su antikūnais), viruso biologinėmis savybėmis (gebėjimu hemagliutinuotis, hemolize, fermentiniu aktyvumu), viruso sąveikos su ląstele šeimininke ypatumais (citopatinės ląstelės prigimtimi). poveikis, tarpląstelinių intarpų susidarymas ir kt.) .

Virusinių infekcijų diagnostikoje, auginant, išskiriant ir identifikuojant virusus, taip pat ruošiant vakcinų preparatus, plačiai taikomas audinių ir ląstelių kultūros metodas. Naudojamos pirminės, antrinės, stabilios ištisinės ir diploidinės ląstelių kultūros. Pirminės kultūros gaunamos išsklaidant audinius proteolitiniais fermentais (tripsinu, kolagenaze). Ląstelių šaltinis gali būti žmogaus ir gyvūnų embrionų audiniai ir organai (dažniau inkstai). Ląstelių suspensija maistinėje terpėje dedama į vadinamuosius čiužinius, butelius arba Petri lėkštes, kur, prisitvirtinus prie indo paviršiaus, ląstelės pradeda daugintis. Virusinei infekcijai dažniausiai naudojamas vienas ląstelių sluoksnis. Maistinis skystis nupilamas, viruso suspensija įvedama tam tikrais praskiedimais, o po kontakto su ląstelėmis įpilama šviežios maistinės terpės, dažniausiai be serumo.

Daugumos pirminių kultūrų ląstelės gali būti subkultūros ir vadinamos antrinėmis kultūromis. Toliau perduodant ląsteles, susidaro į fibroblastus panašių ląstelių, galinčių greitai daugintis, populiacija, kurių dauguma išlaiko pradinį chromosomų rinkinį. Tai vadinamosios diploidinės ląstelės. Serijiniu būdu auginant ląsteles, gaunamos stabilios ištisinės ląstelių kultūros. Persėjimų metu atsiranda greitai besidalijančios vienarūšės ląstelės su heteroploidiniu chromosomų rinkiniu. Stabilios ląstelių linijos gali būti vienasluoksnės ir suspensijos. Vienasluoksnės kultūros auga ištisinio sluoksnio pavidalu ant stiklo paviršiaus, suspensinės kultūros auga suspensijų pavidalu įvairiuose induose naudojant maišytuvus. Yra daugiau nei 400 ląstelių linijų, gautų iš 40 skirtingų gyvūnų rūšių (įskaitant primatus, paukščius, roplius, varliagyvius, žuvis, vabzdžius) ir žmones.

Atskirų organų ir audinių gabalai (organų kultūros) gali būti auginami dirbtinėse maistinėse terpėse. Tokio tipo kultūros išsaugo audinių struktūrą, o tai ypač svarbu išskiriant ir pernešant virusus, kurie nesidaugina nediferencijuotose audinių kultūrose (pavyzdžiui, koronavirusai).

Užkrėstose ląstelių kultūrose virusus galima aptikti pagal ląstelių morfologijos pokyčius, citopatinį poveikį, kuris gali būti specifinis, inkliuzų atsiradimą, nustatant viruso antigenus ląstelėje ir kultūros skystyje; viruso palikuonių biologinių savybių kultūros skystyje nustatymas ir virusų titravimas audinių kultūroje, viščiukų embrionuose ar jautriuose gyvūnuose; aptinkant atskiras virusines nukleorūgštis ląstelėse molekulinės hibridizacijos būdu arba nukleorūgščių grupes citocheminiu metodu, naudojant fluorescencinę mikroskopiją.

Virusų išskyrimas yra sunkus ir ilgas procesas. Ji atliekama siekiant nustatyti tarp gyventojų cirkuliuojančio viruso tipą ar variantą (pavyzdžiui, nustatyti gripo viruso seroviantą, laukinį ar vakcininį poliomielito viruso padermę ir pan.); tais atvejais, kai būtina imtis skubių epidemiologinių priemonių; kai atsiranda naujų virusų tipų ar variantų; jei reikia, patvirtinti preliminarią diagnozę; virusų indikacijai aplinkos objektuose. Išskiriant virusus, atsižvelgiama į jų išlikimo žmogaus organizme galimybę, taip pat į mišrios infekcijos, kurią sukelia du ar daugiau virusų, atsiradimą. Iš vieno viriono gauta genetiškai vienalytė viruso populiacija vadinama viruso klonu, o jo gavimo procesas – klonavimu.

Virusams išskirti naudojami imlių laboratorinių gyvūnų infekcija, vištų embrionai, tačiau dažniausiai naudojama audinių kultūra. Viruso buvimą dažniausiai lemia specifinė ląstelių degeneracija (citopatinis poveikis), simpplastų ir sincitų susidarymas, intraląstelinių inkliuzų aptikimas, taip pat specifinis antigenas, aptiktas naudojant imunofluorescenciją, hemadsorbciją, hemagliutinaciją (hemagliutinuojančių virusų atveju) ir kt. . Šiuos požymius galima aptikti tik po 2–3 viruso perdavimų.

Daugeliui virusų, tokių kaip gripo virusai, išskirti naudojami viščiukų embrionai, kai kuriems Coxsackie virusams ir daugeliui arbovirusų išskirti naudojamos naujagimių pelės. Išskirtų virusų identifikavimas atliekamas serologiniais tyrimais ir kitais metodais.

Dirbant su virusais nustatomas jų titras. Virusų titravimas dažniausiai atliekamas audinių kultūroje, nustatant didžiausią viruso turinčio skysčio praskiedimą, kuriam esant vyksta audinių degeneracija, susidaro inkliuzai ir virusui būdingi antigenai. Apnašų metodas gali būti naudojamas titruoti daugybę virusų. Plokštelės arba neigiamos virusų kolonijos yra vieno sluoksnio audinių kultūros, padengtos agaru, virusų sunaikintų ląstelių židiniai. Kolonijų skaičiavimas leidžia kiekybiškai analizuoti virusų infekcinį aktyvumą, remiantis tuo, kad viena infekcinio viruso dalelė sudaro vieną plokštelę. Plokštelės identifikuojamos nudažant kultūrą gyvybiškai svarbiais dažais, dažniausiai neutralia raudona spalva; apnašos neadsorbuoja dažų, todėl matomos kaip šviesios dėmės nudažytų gyvų ląstelių fone. Viruso titras išreiškiamas apnašas formuojančių vienetų skaičiumi 1 ml.

Virusų gryninimas ir koncentravimas paprastai atliekamas diferencine ultracentrifugavimu, po kurio centrifuguojama koncentracijos arba tankio gradientais. Virusams išvalyti naudojami imunologiniai metodai, jonų mainų chromatografija, imunosorbentai ir kt.

Laboratorinė virusinių infekcijų diagnostika apima patogeno ar jo komponentų aptikimą klinikinėje medžiagoje; viruso išskyrimas iš šios medžiagos; serodignozė. Laboratorinės diagnostikos metodo pasirinkimas kiekvienu individualiu atveju priklauso nuo ligos pobūdžio, ligos laikotarpio ir laboratorijos galimybių. Šiuolaikinė virusinių infekcijų diagnostika remiasi ekspresiniais metodais, leidžiančiais gauti atsaką praėjus kelioms valandoms po klinikinės medžiagos paėmimo ankstyvosiose ligos stadijose, tai yra elektroninė ir imuninė elektroninė mikroskopija, taip pat imunofluorescencija, molekulinės hibridizacijos metodas, lgM klasės antikūnų aptikimas ir kt.

Neigiamai nudažytų virusų elektroninė mikroskopija leidžia diferencijuoti virusus ir nustatyti jų koncentraciją. Elektroninės mikroskopijos naudojimas diagnozuojant virusines infekcijas apsiriboja tais atvejais, kai viruso dalelių koncentracija klinikinėje medžiagoje yra pakankamai didelė (10 5 iš 1). ml ir aukštesnis). Metodo trūkumas yra nesugebėjimas atskirti virusų, priklausančių tai pačiai taksonominei grupei. Šis trūkumas pašalinamas naudojant imuninę elektroninę mikroskopiją. Metodas pagrįstas imuninių kompleksų susidarymu, kai į viruso daleles pridedamas specifinis serumas, tuo pačiu metu vykstant viruso dalelių koncentracijai, kuri leidžia jas identifikuoti. Metodas taip pat naudojamas antikūnams aptikti. Ekspresinės diagnostikos tikslais atliekamas audinių ekstraktų, išmatų, skysčio iš pūslelių, nosiaryklės paslapčių tyrimas elektroniniu mikroskopu. Elektroninė mikroskopija plačiai naudojama viruso morfogenezei tirti, jos galimybės plečiamos naudojant žymėtus antikūnus.

Molekulinės hibridizacijos metodas, pagrįstas virusui būdingų nukleorūgščių aptikimu, leidžia aptikti pavienes genų kopijas ir neturi lygių pagal jautrumą. Reakcija pagrįsta komplementarių DNR arba RNR grandinių (zondų) hibridizacija ir dvigrandžių struktūrų susidarymu. Pigiausias zondas yra klonuota rekombinantinė DNR. Zondas paženklintas radioaktyviais pirmtakais (dažniausiai radioaktyviuoju fosforu). Kolorimetrinių reakcijų naudojimas yra perspektyvus. Yra keli molekulinės hibridizacijos variantai: taškinė hibridizacija, blotinė hibridizacija, sumuštinių hibridizacija, hibridizacija in situ ir kt.

IgM klasės antikūnai atsiranda anksčiau nei G klasės antikūnai (3-5 ligos dieną) ir išnyksta po kelių savaičių, todėl jų aptikimas rodo neseną infekciją. IgM klasės antikūnai aptinkami imunofluorescenciniu arba fermentiniu imuniniu tyrimu, naudojant anti-m antiserumus (anti-IgM sunkiosios grandinės serumus).

Serologiniai virusologijos metodai yra pagrįsti klasikinėmis imunologinėmis reakcijomis (žr. Imunologinių tyrimų metodai ): komplemento fiksavimo reakcijos, hemagliutinacijos slopinimas, biologinė neutralizacija, imunodifuzija, netiesioginė hemagliutinacija, radialinė hemolizė, imunofluorescencija, fermentinis imunologinis tyrimas, radioimuninis tyrimas. Daugelio reakcijų mikrometodai buvo sukurti, o jų metodai nuolat tobulinami. Šie metodai naudojami virusams identifikuoti naudojant žinomų serumų rinkinį ir serodiagnostikai, siekiant nustatyti antikūnų padidėjimą antrajame serume, palyginti su pirmuoju (pirmasis serumas imamas pirmomis dienomis po ligos, antrasis – po ligos). 2-3 savaites). Diagnostinė vertė yra ne mažiau kaip keturis kartus padidėjęs antikūnų kiekis antrajame serume. Jei lgM klasės antikūnų aptikimas rodo, kad neseniai užsikrėtėte, tai lgC klasės antikūnai išlieka keletą metų, o kartais ir visą gyvenimą.

Norint nustatyti atskirus virusų antigenus ir antikūnus prieš juos sudėtinguose mišiniuose be išankstinio baltymų gryninimo, naudojamas imunoblotas. Šis metodas apjungia baltymų frakcionavimą, naudojant poliakrilamido gelio elektroforezę, su vėlesniu baltymų imunologiniu tyrimu, naudojant fermentinį imuninį tyrimą. Baltymų atskyrimas sumažina antigeno cheminio grynumo reikalavimus ir leidžia identifikuoti atskiras antigeno-antikūno poras. Ši užduotis aktuali, pavyzdžiui, ŽIV infekcijos serodiagnostikai, kai klaidingai teigiamos fermentų imunologinės analizės reakcijos atsiranda dėl to, kad yra antikūnų prieš ląstelių antigenus, kurie atsiranda dėl nepakankamo virusinių baltymų gryninimo. Antikūnų nustatymas pacientų serume prieš vidinius ir išorinius viruso antigenus leidžia nustatyti ligos stadiją, o analizuojant populiacijas – viruso baltymų kintamumą. Imunoblotavimas ŽIV infekcijos atveju naudojamas kaip patvirtinantis testas, siekiant nustatyti atskirus viruso antigenus ir antikūnus prieš juos. Analizuojant populiacijas, metodas naudojamas viruso baltymų kintamumui nustatyti. Didelė metodo vertė yra galimybė išanalizuoti antigenus, susintetintus naudojant rekombinantinės DNR technologiją, nustatyti jų dydį ir antigeninių determinantų buvimą.

Pagrindiniai virusinių ligų diagnostikos metodai yra virusų auginimas ir identifikavimas.

Norint įrodyti ligos virusinę etiologiją, būtina išskirti virusą iš sergančios žuvies organizmo, perduoti jį ląstelių kultūrai ar jautriai žuviai, dauginti ligą sveikoms tos pačios ar giminingos rūšies žuvims ir pakartotinai. Išskirti tą patį virusą iš eksperimentinių gyvūnų.

Virusams identifikuoti naudojami keli vienas kitą papildantys metodai: viruso elektroninė mikroskopija, jo fizikinių ir cheminių savybių tyrimas, būdingų morfologinių pokyčių infekuotose ląstelėse ir simptomų nustatymas užsikrėtusiems gyvūnams, įvairūs imunologiniai metodai.

Virusai išskiriami daugiausia iš vieno sluoksnio pirminių arba persodintų ląstelių kultūrų, kiekvienu atveju atrenkant tam tikram virusui jautrias kultūras. Pirminėms žuvų ląstelių kultūroms gauti dažniausiai naudojamos karpių ar karosų patelių lytinės liaukos. Lytinės liaukos pagal Kiselevičiaus skalę turėtų būti II arba II-III brandos stadijos. Tokiose lytinėse liaukose nėra plika akimi matomų kiaušinėlių. Priešingu atveju kiaušinių turinys neigiamai paveiks ląstelių augimą. Ląstelių kultūros iš karpių ir karosų lytinių liaukų ruošiamos patvirtintu būdu.

Kaip ištisinės kultūros plačiausiai naudojamos šios ląstelių linijos: FHM – iš uodeginio snukio audinių; RTG – iš vaivorykštinio upėtakio lytinių liaukų; EPC – nuo ​​raupų ataugų karpių odoje. Šios linijos prižiūrimos specializuotose veterinarijos ir žuvininkystės tyrimų institutų žuvų ligų tyrimo laboratorijose, kur jas galima užsisakyti ir gauti.

Diagnozuojant gerai ištirtas virusines ligas, tiriami organai ir audiniai, kuriuose susitelkęs sukėlėjas.

Sergant žuvų ligomis, apie kurias informacijos nepakanka, virusologiškai tiriami labiausiai pažeisti organai. Odos ir žiaunų atraižos, šių organų gabalėliai kartu su gleivėmis dedami į sterilius buteliukus su 2-3 ml sterilaus fiziologinio ar buferinio tirpalo. Mėginiai iš vidaus organų imami griežtai aseptinėmis sąlygomis.

Tais atvejais, kai neįmanoma greitai ištirti medžiagos, ji laikoma ne ilgiau kaip dieną šaldytuve ne aukštesnėje kaip 5 ° C temperatūroje. Užšaldytą medžiagą galima laikyti ilgesnį laiką.

Tyrimams skirta patologinė medžiaga susmulkinama homogenizatoriuje arba sumalama porcelianiniame skiedinyje su kvarciniu smėliu. Iš susmulkintų audinių Hank's, Earl's tirpaluose, buferyje arba fiziologiniame fiziologiniame tirpale paruošiama 10 % suspensija ir centrifuguojama 10-15 minučių 2000-3000 aps./min., supernatantas išsiurbiamas pipete ir dedamas į sterilius buteliukus. Jei suspensija nesterili, paruoštos medžiagos filtruojamos per 0,2-0,45 µm porų skersmens membraninius filtrus arba apdorojamos antibiotikais (penicilinu 1000 TV/ml ir streptomicinu 1000 µg/ml).

Iš žarnyno turinio steriliame distiliuotame vandenyje paruošiama 20 % suspensija ir centrifuguojama 10-15 minučių 2000 aps./min. Supernatantas vėl centrifuguojamas 4000–5000 aps./min. greičiu 30 minučių. Tada supernatantas įsiurbiamas į sterilų buteliuką ir apdorojamas antibiotikais. Į 1 ml įpilkite 1000 µg/ml streptomicino ir 1000 TV/ml penicilino. Mišinys 2-3 valandas palaikomas: kambario temperatūroje. Visos medžiagos yra išbandytos dėl bakterijų sterilumo sėjant BCH ir MPA. Paruoštos medžiagos nedelsiant naudojamos darbui arba, kraštutiniais atvejais, laikomos užšaldytos (minus 20 ° C temperatūroje).

Ląstelių kultūros infekcija. Infekcijai naudojami vamzdeliai su geru ląstelių monosluoksniu arba augimo zona aplink eksplantą. Maistinė terpė išsiurbiama ir į kiekvieną mėgintuvėlį įpilama 0,2-0,3 ml tiriamosios suspensijos. Tuo pačiu metu į mėgintuvėlius įpilama 0,8-0,9 ml maistinės terpės su 2-3% serumo.

Iš kiekvieno mėginio paruošta medžiaga užkrėsta audinių kultūra 4-6 mėgintuvėliuose. Iš kiekvienos tyrimų serijos paliekamas tiek pat mėgintuvėlių kaip kontrolinių mėginių, į juos įpilant 1 ml maistinės terpės. Mėgintuvėliai paliekami kambario temperatūroje 1-2 valandoms viruso adsorbcijai ant ląstelių, tada pipete išsiurbiamas supernatantas ir į pradinį tūrį įpilama palaikomoji maistinė terpė.

Užkrėstos ir kontrolinės ląstelių kultūros inkubuojamos 22-26°C temperatūroje ir kasdien tiriamos mažo padidinimo mikroskopu, siekiant nustatyti atsirandančius morfologinius pokyčius ląstelėse. Esant stipriai ląstelių degeneracijai, kultūros skystis išsiurbiamas ir daromi pasažai, o nesant citopatogeninio poveikio (CPE), atliekami du pasažai iš eilės. Norėdami tai padaryti, naudokite kultūros skystį kartu su ląstelių frakcija, sunaikinta pakartotinai šaldant ir atšildant. Centrifuguotos ląstelių masės supernatantas naudojamas šviežioms kultūroms užkrėsti. Į CPP po trečio pasėjimo atsižvelgiama kaip į specifinį viruso sukėlėjo veiksmą.

Ląstelės vienasluoksnio pažeidimo laipsnis vertinamas pagal 4 kryžminę sistemą; "+" - žala iki 25%, "+ +" - iki 50%, "+ + +" - iki 75% ir "+ + + +" - iki 100% monosluoksnio.

Sergant kai kuriomis virusinėmis žuvų ligomis, inkliuziniai kūnai atsiranda įvairių organų ir audinių ląstelėse (branduolių citoplazmoje). Virusinių inkliuzų tyrimo medžiaga yra užkrėstų audinių kultūros, organų ir audinių įbrėžimai ir tepinėliai-atspaudai, nurodytos medžiagos fiksuojamos prieš dažymą pagal visuotinai priimtus metodus, naudojant Dubosque-Brazil-Bouena, Bouena, Carnoy skysčius arba 10 proc. neutralaus formalino tirpalas.

Virusiniai inkliuzai dažomi įvairiais būdais: pagal Muromtsevą, rubiną, Manną, Sellexą, Klisenko, Romanovsky-Giemsa, May-Grunald-Giemsa ir kt.

Viruso titravimas- kiekybinis viruso aktyvumo nustatymas. Viruso titras išreiškiamas infekcinių vienetų, esančių viruso suspensijos tūrio vienete, skaičiumi. Infekciniu viruso vienetu laikoma tokia dozė, kuri sukelia infekciją 50% juo užkrėstų jautrių objektų. Ši viruso dozė vadinama infekcine ir žymima ID 50.

Ląstelių kultūros daugiausia naudojamos kaip jautrūs objektai titruojant žuvų virusus. Titravimas ląstelių kultūroje atliekamas pagal citopatogeninį virusų poveikį. Šiuo atveju ID 50 vadinamas audinių citopatogenine doze (TCD 50), o viruso titras išreiškiamas kaip TCD 50 kiekis 1 ml viruso suspensijos. Viruso titras nustatomas galutinio praskiedimo metodu. Pagal šį metodą jautrios ląstelių kultūros įšvirkščiamas tam tikras viruso suspensijos tūris nuosekliai didėjančiais praskiedimais ir, atsižvelgiant į kiekvienos injekcijos rezultatą kaip teigiamą (jei yra CPE) arba neigiamą, jei CPE nėra, galutinis taškas. apskaičiuojamas titravimas - 1 TCD 50 .

Virusams, kurie suteikia ryškų CPP, titruoti taip pat naudojamas apnašų metodas. Tokiu atveju vienas virusu užkrėstų ląstelių sluoksnis užpilamas maistinės terpės mišiniu su agaru, kad virusas nepatektų į kitas ląsteles, kurios yra gerokai nutolusios nuo iš pradžių užsikrėtusių, ir kad būtų galima užkrėsti pradinius židinius. apnašų infekcija).

Kiekviena plokštelė atsiranda iš vieno infekcinio vieneto, kuris yra žymimas PFU (plokštes formuojantis vienetas), o viruso titras išreiškiamas PFU skaičiumi suspensijos tūrio vienete.

Neutralizacijos reakcija(RN) ląstelių kultūroje.

Reakcija pagrįsta antigeno surišimu su homologinio antiserumo antikūnais. Reakcija naudojama patogenams nustatyti diagnozuojant virusinės etiologijos ligas. Jis leidžia pagal žinomus antikūnus nustatyti nežinomą viruso antigeną arba pagal žinomą (standartinį) antigeną – nežinomus antikūnus sergančių ar pasveikusių žuvų serume.

Išskirto viruso nustatymas neutralizacijos reakcijoje atliekamas naudojant jiems homologinių antigenų (virusų) diagnostinių hiperimuninių antiserumų (antikūnų) rinkinį.

Hiperimuniniai antiserumai gaunami užkrečiant laboratorinius gyvūnus (pavyzdžiui, triušius) žinomomis virusų padermėmis, sukeliančiomis žuvų ligas. Gauti antiserumai nustato specifinių antikūnų titrus. Darbui imami antiserumai, kuriuose yra aukštų titrų antikūnų.

Reakcijos tvarka.

1. Normalaus ir hiperimuninio serumo inaktyvavimas kaitinant 56°C temperatūroje 30 minučių.

2. Reakcijos ingredientų skiedimų paruošimas. Antigenas ir serumas skiedžiami maistine terpe be serumo ir antibiotikų, pradedant santykiu 1:5, 1:50, 1:500 ir tol, kol gaunamas praskiedimas, kurio kiekis yra mažesnis nei 1 TCD 50 / 0,2 ml. Hiperimuninis serumas skiedžiamas santykiu 1: 2 arba 1: 5. Esant žemam titrui, serumas naudojamas neskiestas. Normalus serumas skiedžiamas taip pat, kaip ir hiperimuninis serumas.

3. Reakcijos teiginys. Trys sterilių mėgintuvėlių eilės dedamos į stovą. Į pirmąją eilę pilamas praskiestas hiperimuninis serumas, į antrą – praskiestas normalus serumas, į trečią – maistinė terpė. Kiekvienas ingredientas pridedamas 0,5 ml tūrio.

Paruošti viruso skiedimai po 0,5 ml perkeliami į atitinkamus kiekvienos iš trijų eilių mėgintuvėlius, o kiekvieno I skiedimo virusas perpilamas atskira pipete, pradedant nuo didžiausio skiedimo. Taigi kiekvienoje mėgintuvėlių eilėje gaunami serijiniai 10 kartų viruso skiedimai: 10-1, 10-2 ir kt.

Serumo toksiškumui kontroliuoti į atskirą mėgintuvėlį įpilama 0,5 ml paruošto hiperimuninio serumo skiedimo, o po to įpilama tiek pat maistinės terpės. Tas pats daroma su įprastu serumu.

Mėgintuvėlius su mišiniais gerai suplakite ir 1 valandą inkubuokite kambario temperatūroje. Tada užkrėskite ląstelių kultūrą kiekvienu viruso skiedimu (0,2 ml kiekviename mėgintuvėlyje) su hiperimuniniu normaliu serumu ir maistine terpe, 4 mėgintuvėliais ląstelių kultūros. Lygiagrečiai kontroliuokite naudojamų ląstelių toksiškumą ir kontrolinius ląstelių kultūros mėginius.

Mėgintuvėliai su ląstelių kultūra inkubuojami termostate optimalioje šio viruso dauginimuisi temperatūroje ir kasdien tiriami mažo padidinimo mikroskopu, siekiant nustatyti viruso CPE. Rezultatai įrašomi į lentelę (11 lentelė).

Viruso titras išreiškiamas infekcinių vienetų, esančių viruso suspensijos tūrio vienete, skaičiumi. Raskite neutralizacijos indeksą (IN). Jis atitinka didžiausią ID 50 kiekį, kurį gali neutralizuoti hiperimuninis serumas. IN apskaičiavimas atliekamas pagal formulę: lgIN = lgT 1 -lgT 2 čia T 1 - viruso titras esant normaliam serumui; T 2 – viruso titras esant hiperimuniniam serumui. IN reikšmė randama iš antilogaritmų lentelės. Įprasta IN reikšmę iki 10 laikyti neigiama, nuo 10 iki 49 – abejotina, 50 ar daugiau – teigiamu rezultatu.

Reakcijos rezultatai gali būti laikomi patikimais tik tuo atveju, jei ištirtas hiperimuninis serumas dėl specifinio neutralizuojančio aktyvumo. Norėdami tai padaryti, iš anksto nustatykite neutralizuojančių antikūnų titrą šiame serume arba jo neutralizacijos indeksą reaguojant su homologiniu virusu.

Rabdovirusų apnašų išskyrimas. Šis metodas yra specifinis, jis naudojamas karpių ir upėtakių rabdovirusų išskyrimui, preliminariai tipizavimui ir atrankai, esant specifiniams imuniniams serumams viruso identifikavimui.

Ląstelių kultūrose, padengtose agaru, kai tiriamojoje medžiagoje yra viruso, susidaro apvalios kolonijos (plokštelės).

Aseptinėmis sąlygomis inkstų, kepenų, blužnies ir skysčiai iš pilvo ertmės surenkami Pasteur pipete, perkeliami į buteliuką su terpe, kurioje yra 500 TV (mcg) / ml antibiotikų santykiu 1:10. inkubuojama 60-90 minučių 18-22 °C temperatūroje, po to 10 minučių centrifuguojama 2-3 tūkst. aps./min. Supernatantas skiedžiamas maistine terpe santykiu 1:10 (skiedimas 1:100). Abu supernatantų skiedimai naudojami ląstelių kultūroms užkrėsti.

Tyrimui parenkama 3 dienų nepertraukiama ląstelių kultūra, auginama čiužiniuose su aiškiai apibrėžtu vienasluoksniu sluoksniu, taikant 2 čiužinius kiekvienam patologinės medžiagos praskiedimui ir 2 čiužinius kontrolei. Maistinė terpė išimama iš buteliukų ir įpilama 2 ml terpės be vaisiaus serumo. Tada įpilama 0,2 ml tiriamos patologinės medžiagos ir paliekama virusui adsorbuotis 60 minučių optimalioje žuvis užkrečiantiems virusams temperatūroje (karpių virusams - 24-26 °C, o upėtakių virusams - 16-18 °C). ).

Kontrolė įdėta į 2 čiužinius su 0,2 ml ląstelių kultūromis, kuriose yra 100 TCD 50 /ml žinomo viruso, ir 2 - 0,2 ml maistinės terpės be viruso.

Po 60 minučių skystis iš buteliukų pašalinamas. Ant sienelės, esančios priešingoje vienasluoksniam sluoksniui, į 50 ml buteliuką įpilama 5 ml agaro dangos, pašildytos iki 40-42°C (išskiriant HCV virusą – ne daugiau kaip 38°C). Čiužiniai apversti monosluoksniais žemyn, padengti juodu popieriumi. Po 15-20 minučių čiužiniai perkeliami inkubacijai optimalioje tirtų virusų temperatūroje. Čiužiniai klojami agaru dengta puse į viršų. Esant nežinomam virusui, kultūros laikomos dviem temperatūros sąlygomis – 14-18 ir 22-24°C.

Užkrėstos ląstelių kultūros žiūrimos baltame fone. Jei ląstelių kultūroje tiriamoje medžiagoje yra virusas, rausvai matiniame kultūros fone pirmiausia atsiranda skaidrūs taškai. Ateityje jie didėja, sudarydami apvalias skaidrias kolonijas - plokšteles, kurių buvimas rodo rabdovirusų buvimą patologinėje medžiagoje.

Su Pasteur pipete ant pažeistų ir nepažeistų dalių ribos surenkamas apnašų gabalėlis taip, kad į jį patektų ne tik agaras, bet ir ląstelės sluoksnis. Pasirinktas gabalas dedamas į mėgintuvėlį su 1 ml auginimo terpės, užšaldomas minus 20°C temperatūroje ir inkubuojamas 60 min. Esant dideliam apnašų skaičiui (visas ląstelės sluoksnis skaidrus), tyrimai kartojami praskiedus 10 -3 ir 10 -4.

3-8 mm skersmens karpinio rabdoviruso apnašos ant nepertraukiamos EPC ir FHM kultūros, inkubuojamos 24-26°C temperatūroje, atsiranda 4-7 dieną.

Nesant apnašų ir CPD ląstelių kultūrose, atliekami papildomi viruso turinčio kultūros skysčio tyrimai, praskiedus 10-2-10-3 (2-3 pasėjimai). Kaip papildomi virusų identifikavimo metodai naudojami: fluorescencinių antikūnų metodas; viruso jautrumo chloroformui, eteriui, pH reikšmės, kaitinimui nustatymas; elektroninis mikroskopinis viruso morfologijos tyrimas.