Namen PCR in princip metode. Verižna reakcija s polimerazo (PCR) in njena uporaba

SEI HPE "Krasnoyarsk State Medical Academy

po imenu Yasenetsky Zvezna agencija za zdravje in socialni razvoj »

Oddelek za medicinsko genetiko in klinično nevrofiziologijo IPO

GLAVNA NAČELA METODE

VERIŽNA REAKCIJA POLIMERAZE

Metodični priročnik za študente 3-4 tečajev

specialnosti splošna medicina (060101) in

Krasnojarsk - 2007

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Osnovna načela metode verižne reakcije s polimerazo. Metodološki priročnik za obštudijsko delo študentov 3-4 tečajev specialnosti splošne medicine (060101) in pediatrije (060103). - Krasnojarsk: Založba GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42 str.

Metodološki priročnik je v celoti v skladu z zahtevami državnega standarda (2000) in odraža glavne vidike sodobne metode za diagnosticiranje dednih bolezni ljudi - metoda verižne reakcije s polimerazo, izobraževalno gradivo je prilagojeno izobraževalnim tehnologijam ob upoštevanju posebnosti usposabljanja v 3-4 tečajih medicinskih in pediatričnih fakultet.

Recenzenti: Vodja oddelka za medicinsko genetiko Državnega izobraževalnega zavoda za visoko strokovno izobraževanje

"Novosibirska državna medicinska univerza Zvezne agencije za zdravje in socialni razvoj", doktor medicinskih znanosti, profesor;

replikacija DNK

Predmet študije te metode je deoksiribonukleinska kislina (DNK). DNK je univerzalni nosilec genetske informacije v vseh organizmih, ki obstajajo na Zemlji (z izjemo mikroorganizmov, ki vsebujejo RNA). DNK je dvojna veriga, zvita v vijačnico. Vsaka veriga je sestavljena iz zaporedno povezanih nukleotidov. DNA verige imajo nasprotno smer: 5'-konec ene verige ustreza 3'-koncu druge verige. Edinstvena lastnost DNK je njena sposobnost podvajanja. Ta proces se imenuje podvajanje. Replikacija molekule DNA se pojavi v sintetičnem obdobju interfaze. Vsaka od obeh verig "starševske" molekule služi kot predloga za "hčerinsko". Po replikaciji na novo sintetizirana molekula DNA vsebuje eno "materinsko" verigo in drugo - "hčerinsko", na novo sintetizirano (polkonzervativna metoda). Za šablonsko sintezo nove molekule DNK je potrebno, da se stara molekula despiralizira in raztegne. Replikacija se začne na več mestih v molekuli DNA. Imenuje se odsek molekule DNA od začetka ene replikacije do začetka druge replikon.

Aktiviran je začetek replikacije primerji(semena), sestavljena iz 100-200 baznih parov. Encim DNK helikaza odvije in loči matično vijačnico DNK na dve verigi, na kateri se po principu komplementarnosti s sodelovanjem encima DNK polimeraza sestavijo "hčerinske" verige DNK. Da bi encim začel delovati, je potrebna prisotnost začetnega bloka - majhnega začetnega dvoverižnega fragmenta. Začetni blok nastane, ko oligonukleroza interagira s komplementarno regijo ustrezne verige starševske DNA. V vsakem replikonu se lahko DNA polimeraza premika vzdolž "materne" verige samo v eno smer (5`=>3`).

Na vodilni verigi, ko se replikon odvija, postopoma neprekinjeno raste "hčerinska" veriga. Na zaostali verigi se sintetizira tudi hčerinska veriga v smeri (5`=>3`), vendar v ločenih fragmentih, ko se replikon odvija.

Tako gre pritrditev komplementarnih nukleotidov "hčerinskih" verig v nasprotnih smereh (antiparalelno). Replikacija v vseh replikonih poteka istočasno. Fragmenti in deli "hčerinskih" verig, sintetiziranih v različnih replikonih, so vezani v eno samo verigo z encimsko ligazo. Za replikacijo so značilni polkonzervacija, antiparalelizem in diskontinuiteta. Celoten genom celice se podvoji enkrat na časovno obdobje, ki ustreza enemu mitotičnemu ciklu. Kot rezultat procesa replikacije nastaneta dve molekuli DNK iz ene molekule DNK, pri čemer je ena veriga iz matične molekule DNK, druga, hčerinska, pa je na novo sintetizirana (slika 1).

riž. eno. Diagram replikacije molekule DNA.

Tako cikel replikacije DNK vključuje tri glavne stopnje:

1. odvijanje vijačnice DNA in razhajanje verig (denaturacija);

2. pritrditev temeljnih premazov;

3. zaključek verige podrejene niti.

Princip metode PCR

Osnova PCR je bila replikacija DNK. Pri PCR se zgoraj našteti procesi izvajajo v epruveti v cikličnem načinu. Prehod iz ene stopnje reakcije v drugo se doseže s spreminjanjem temperature inkubacijske mešanice. Ko se raztopina segreje na 93-95°C, pride do denaturacije DNK. Za nadaljevanje naslednjega koraka - dodajanje ali "žarjenje" primerjev - inkubacijsko mešanico ohladimo na 50-65 °C. Nato se mešanica segreje na 70-72°C - optimalno delovanje taq-DNA polimeraze - na tej stopnji je nova veriga DNA dokončana. Nato se cikel znova ponovi. Z drugimi besedami Metoda PCR je večkratno povečanje števila kopij (ojačanje) specifičen del DNA, ki ga katalizira encim DNA polimeraza.

Podaljšanje hčerinskih verig DNK mora potekati istočasno na obeh verigah materine DNK, zato replikacija druge verige prav tako zahteva svoj začetni primer. Tako v reakcijsko zmes vnesemo dva primerja: enega za "+"-verigo, drugega za "-"-verigo. Po združitvi nasprotnih verig molekule DNA se primerji omejijo na njen del, ki se bo nato večkrat podvojil ali pomnožil. Dolžina takega fragmenta, ki ga imenujemo amplikon, je običajno nekaj sto nukleotidov.

koraki PCR

Vsak cikel ojačanja vključuje 3 stopnje, ki se pojavljajo pri različnih temperaturnih pogojih (slika 2).

· 1. stopnja: denaturacija DNK . Teče pri 93-95° 30-40 sekund.

· 2. stopnja: temeljno žarjenje . Pritrditev primerja se pojavi komplementarno z ustreznimi zaporedji na nasprotnih verigah DNK na mejah določene regije. Vsak par primerjev ima svojo temperaturo žarjenja, katere vrednosti so v območju 50-65°C. Čas žarjenja 20-60 sek.

· 3. stopnja: podaljševanje verig DNA. Komplementarno podaljševanje verig DNA se pojavi od 5" konca do 3" konca verige v nasprotnih smereh, začenši od pritrdilnih mest primerja. Material za sintezo novih verig DNK so deoksiribonukleozid trifosfati, dodani raztopini. Proces sinteze katalizira encim taq-polimeraza in poteka pri temperaturi 70-72°C. Čas sinteze - 20-40 sek.

Nove verige DNA, ki nastanejo v prvem ciklu pomnoževanja, služijo kot predloge za drugi cikel pomnoževanja, v katerem nastane specifičen fragment pomnoževanja DNA (slika 3). V naslednjih ciklih pomnoževanja služijo amplikoni kot predloga za sintezo novih verig.

Tako pride do kopičenja amplikonov v raztopini v skladu s formulo 2", kjer je n število ciklov pomnoževanja. Torej, tudi če je bila na začetku v začetni raztopini samo ena dvoverižna molekula DNA, potem približno 108 molekul pomnožev v raztopini se kopiči v 30-40 ciklih.Ta količina zadošča za zanesljivo vizualno detekcijo tega fragmenta z elektroforezo v agaroznem gelu.

Postopek ojačanja se izvaja v posebnem programabilnem termostatu ( kolesar), ki glede na dani program samodejno spreminja temperature glede na število ciklov ojačanja.

Za ojačanje so potrebne naslednje komponente:

· DNK šablona(DNK ali njen del, ki vsebuje želeni specifični fragment);

· Primerji(sintetični oligonukleotidi (20-30 nukleotidnih parov) komplementarni zaporedjem DNA na mejah določenega fragmenta, ki ga določamo). Izbira specifičnega fragmenta in izbor primerjev igrata pomembno vlogo pri specifičnosti pomnoževanja, kar vpliva na kakovost analize.

· Mešanica deoksinukleotid trifosfatov (dNTP)(mešanica štirih dNTP, ki so material za sintezo novih komplementarnih verig DNK v ekvivalentnih koncentracijah 200-500 mikronov)

· EncimTaq- polimeraza(termostabilna DNA polimeraza, katalizira podaljševanje začetnih verig z zaporednim dodajanjem nukleotidnih baz v rastočo verigo sintetizirane DNA, 2-3 mm).

· puferska raztopina(reakcijski medij, ki vsebuje Mg2+ ione, potrebne za vzdrževanje encimske aktivnosti, PH 6,8-7,8).

Za določitev specifičnih regij genoma virusov RNA se najprej pridobi kopija DNA iz predloge RNA z reakcijo reverzne transkripcije (RT), ki jo katalizira encim reverzna transkriptaza (reverzna transkriptaza).

riž. 2. Ojačitev (1. cikel).

riž. 3. Ojačitev (2. cikel).

Glavne uporabe PCR

klinična medicina:

o diagnoza okužb,

o odkrivanje mutacij, vključno z diagnozo dednih bolezni,

o genotipizacija, vključno z genotipizacijo HLA,

o celične tehnologije

ekologija (kot način spremljanja stanja in kakovosti okoljskih predmetov in hrane)

definicija transgenih organizmov (GSO)

Osebna identifikacija, očetovstvo, forenzika

splošna in posebna biologija,

Osnovna načela

organizacija diagnostičnih laboratorijev

Delo v laboratoriju PCR poteka v skladu s "Pravili za načrtovanje, varnost, industrijsko sanitarijo, protiepidemični režim in osebno higieno pri delu v laboratorijih (oddelkih, oddelkih) sanitarnih in epidemioloških ustanov zdravstvenega sistema.

Kontaminacija vzorcev DNK

Izvajanje PCR diagnostike je povezano s težavo, ki jo povzroča visoka občutljivost metode – možnost kontaminacija. Če v reakcijsko epruveto pridejo sledi pozitivne DNA (specifični produkti pomnoževanja DNA – amplikoni; standard DNA, ki se uporablja kot pozitivna kontrola; pozitivna DNA kliničnega vzorca), pride do pomnoževanja specifičnega fragmenta DNA med PCR in posledično do pojav lažno pozitivnih rezultatov.

Med delom se lahko srečate dve vrsti kontaminacije:

1. navzkrižna okuženost od vzorca do vzorca (med obdelavo kliničnih vzorcev ali pri izkopavanju reakcijske zmesi), kar vodi do pojava občasnih lažno pozitivnih rezultatov;

2. kontaminacija produkta ojačanja(amplikoni), kar je še posebej pomembno, saj se med postopkom PCR amplikoni kopičijo v ogromnih količinah in so idealni produkti za reamplifikacijo.

Kontaminacija posod, avtomatskih pipet in laboratorijske opreme, površine laboratorijskih miz ali celo površine kože laboratorijskih delavcev s sledovi pomnožev povzroči pojav sistematičnih lažno pozitivnih rezultatov. Določitev vira kontaminacije je lahko zelo težavna in zahteva veliko časa in denarja. Dosedanje izkušnje z delom laboratorijev, ki uporabljajo diagnostično metodo PCR, nam omogočajo oblikovanje osnovnih zahtev za organizacijo takih laboratorijev in izvajanje samih analiz. Skladnost s temi zahtevami odpravlja možnost kontaminacije in pridobitev lažno pozitivnih rezultatov.

Faze analize PCR

Geografsko ločeni in postavljeni v ločene prostore (slika 4.5):

· Pre-PCR soba, kjer se izvaja obdelava kliničnih vzorcev, ekstrakcija DNA, priprava reakcijske zmesi za PCR in PCR (če so na voljo pogoji, je tudi zadnja dva koraka priporočljivo izvesti v dodatnem ločenem prostoru). V teh prostorih je prepovedano izvajati vse druge vrste dela s proučevanimi povzročitelji, katerih PCR diagnostika se izvaja v tem laboratoriju.

· Post-PCR soba, kjer se izvaja detekcija produktov pomnoževanja. V tej sobi se lahko uporabljajo druge metode odkrivanja. Zaželeno je, da se prostor za detekcijo produktov pomnoževanja nahaja čim dlje od prostorov pred PCR.

Delovne sobe so opremljene z ultravijoličnimi žarnicami z maksimalnim sevanjem v območju 260 nm (tip DB-60) s hitrostjo 2,5 W na 1 m3. Svetilke so nameščene tako, da so površine delovnih miz, opreme in materialov, s katerimi pride operater v stik med analizo PCR, izpostavljene neposrednemu sevanju. Obsevanje se izvaja 1 uro pred začetkom dela in 1 uro po koncu dela.

Laboratorijski zdravniki delajo v posebnih laboratorijskih oblačilih, ki se menjajo ob prehodu iz enega prostora v drugega, in v rokavicah za enkratno uporabo. Obdelava oblačil iz različnih prostorov poteka ločeno. Na različnih stopnjah analize PCR delajo različni zaposleni.

Za delo se uporabljajo ločeni kompleti dozatorjev, plastična in steklena posoda, laboratorijska oprema, halje in rokavice, ki so namenjeni za različne faze analize in niso prenosljivi iz enega prostora v drugega. Oprema, materiali in inventar v vsaki sobi so ustrezno označeni.

Vse faze dela se izvajajo samo z uporabo potrošnega materiala za enkratno uporabo: konice za avtomatske pipete, epruvete, rokavice itd. Pri prehodu od vzorca do vzorca obvezno zamenjajte konice. Da bi preprečili vstop mikrokapljic raztopine v pipeto, je treba uporabiti konice z aerosolnim pregradnim filtrom. Uporabljene epruvete in konice odvržemo v posebne zabojnike ali zabojnike z razkužilno raztopino. Klinični vzorci so shranjeni ločeno od reagentov.

Za obdelavo in čiščenje delovnega mesta ima vsaka soba bombažne gaze (serviete), pincete, razkužila in inaktivacijske raztopine.

V PCR diagnostičnem laboratoriju je izključeno delo v zvezi s proizvodnjo (kloniranjem) in izolacijo rekombinantnih plazmidov, ki vsebujejo zaporedja DNA ali genske fragmente patogenov, ki se diagnosticirajo v tem laboratoriju.

Zbiranje kliničnega materiala

Študirani material za PCR so lahko ostanki epitelijskih celic, kri, plazma, serum, plevralna in cerebrospinalna tekočina, urin, sputum, sluz in drugi biološki izločki, vzorci biopsije.

Vzorčenje materiala se izvaja v pogojih sobe za zdravljenje ustreznega profila. Po vzorčenju je treba vzorce čim prej odnesti v PCR diagnostični laboratorij.

Vzorčenje je treba opraviti s sterilnimi, po možnosti za enkratno uporabo, instrumenti samo v sterilnih plastičnih ali steklenih epruvetah za enkratno uporabo, predhodno eno uro obdelanih z mešanico kroma, temeljito opranih z destilirano vodo in kalciniranih v pečici pri temperaturi 150 ° C za 1 uro.

Območje zaznavanja (drugo nadstropje ali druga zgradba).

riž. štiri. Laboratorijska naprava PCR z detekcijo z elektroforezo.

Območje zaznavanja (različno nadstropje ali stavba)

riž. 5. PCR laboratorijska naprava s fluorescentno detekcijo (kvantitativna analiza).

riž. 6. Soba za ekstrakcijo DNK. Prikazana je namizna škatla z baktericidno svetilko.

riž. 7. ojačitvena soba.

riž. osem. Soba za odkrivanje.

riž. 9. Vzorci krvi za DNK diagnostiko dednih bolezni.

Shranjevanje in transport vzorcev

Za diagnostiko dednih bolezni se vzorci krvi dlje časa hranijo na posebnih papirnatih obrazcih ali v epindorfih (plastičnih epruvetah) v zamrznjenem stanju (slika 9).

Za diagnozo nalezljivih bolezni se vzorci hranijo pri sobni temperaturi največ 2 uri. Če je potrebno daljše shranjevanje, lahko vzorce postavite v hladilnik pri temperaturi 2-8 °C za največ 24 ur. Daljše skladiščenje (do 2 tedna) je sprejemljivo pri zamrzovanju v zamrzovalniku pri temperaturi minus 20°C. Ponavljajoče zamrzovanje-odmrzovanje vzorcev ni dovoljeno.

Če sta diagnostični laboratorij PCR in prostor za vzorčenje teritorialno ločena, je treba vzorce prevažati v termosih ali termičnih posodah v skladu s pravili za shranjevanje vzorcev in pravili za prevoz kužnega materiala.

Ekstrakcija DNK iz vzorcev

Metoda trdne faze sorpcije, ki je sestavljena iz dodajanja lizirnega sredstva, ki vsebuje raztopino gvanidina, sorpcije DNA na sorbentu, ponavljajočega izpiranja in resorpcije DNA s pufrsko raztopino, je postala razširjena. V primeru obdelave seruma, plazme ali polne krvi se običajno uporablja metoda fenolne ekstrakcije. Metoda vključuje deproteinizacijo s fenolom/kloroformom, ki ji sledi obarjanje DNA (ali RNA) z etanolom ali izopropanolom. Obdelava poteka v mikrocentrifugiranih epruvetah tipa Eppendor P s prostornino 1,5 ml. Čas obdelave je 1,5-2 uri (slika 10).

riž. deset. Izolacija DNK.

Izvajanje PCR

Določeno količino vzorca iz obdelanega kliničnega vzorca prenesemo v posebno mikrocentrifugirno epruveto tipa Eppendorf s prostornino 0,2 ali 0,5 ml, dodamo mešanico za pomnoževanje, ki jo sestavljajo voda, PCR pufer, raztopina dNTP, raztopina primerja in raztopina. ista epruveta Taq-polimeraza (mešanici dodana zadnja) Običajno je volumen reakcijske zmesi 25 µl Nato se v vsako epruveto doda ena kapljica mineralnega olja, da se prepreči izhlapevanje reakcijske zmesi med pomnoževanjem Epruvete se prenesejo v programabilni termostat (ojačevalnik), kjer se ojačanje izvaja v avtomatskem načinu po danem programu (slika 11).

riž. enajst. ojačevalnik" Termociklist ».

Reakcijski čas, odvisno od danega programa, je 2-3 ure. Vzporedno z eksperimentalnimi vzorci so postavljeni kontrolni vzorci: pozitivna kontrola vključuje vse sestavine reakcije, vendar namesto materiala kliničnega vzorca uvedemo kontrolni pripravek DNK proučevanega gena. Negativna kontrola vključuje vse sestavine reakcije, le da se namesto kliničnega materiala ali preparata DNK doda ustrezna količina deionizirane vode ali ekstrakta, ki ne vsebuje preučevane DNK. Negativna kontrola je potrebna za preverjanje komponent reakcije glede odsotnosti DNK zaradi kontaminacije in za izključitev lažno pozitivnih rezultatov.

Registracija rezultatov

Pomnoženi specifični fragment DNA zaznamo z elektroforezo v agaroznem gelu v prisotnosti etidijevega bromida. Etidijev bromid tvori stabilno intersticijsko spojino s fragmenti DNA, ki se pokažejo kot svetleči trakovi, ko gel obsevamo z UV sevanjem z valovno dolžino 290-330 nm. Odvisno od velikosti nastalih amplikonov PCR se uporabi gel, ki vsebuje 1,5 % do 2,5 % agaroze. Za pripravo agaroznega gela v mikrovalovni pečici ali vodni kopeli stopimo mešanico agaroze, pufra in vode ter dodamo raztopino etidijevega bromida. Ohlajeno na 50-60°C zmes vlijemo v kalup s plastjo 4-6 mm debelo in s posebnimi glavniki naredimo v gelu žepke za nanos vzorca. Glavniki so nastavljeni tako, da med dnom vdolbinic in osnovo gela ostane plast agaroze 0,5-1 mm. Ko se gel strdi, se na žepke nanese amplifikat v količini 5-15 µl. Priporočljivo je izvajati elektroforezo mešanice označevalcev dolžin fragmentov DNA vzporedno s kontrolnimi in poskusnimi vzorci. Običajno taka mešanica vsebuje deset fragmentov DNK s 100, 200, 300 itd. dolgimi baznimi pari.

Nastavitev takega vzorca vam omogoča preverjanje dolžine amplikonov v kontrolnih in poskusnih vzorcih. Gel z nanešenim vzorcem prenesemo v komoro za elektroforezo, napolnjeno s pufrom, komoro priključimo na vir napajanja in izvajamo elektroforetsko ločevanje produktov pomnoževanja 30-45 minut pri električni poljski jakosti 10-15 V/cm. V tem primeru mora sprednji del barvila, ki je del reakcijske mešanice, preiti vsaj 3 cm.

Po končani elektroforezi gel prenesemo v steklo transiluminatorja in ga opazujemo v ultravijolični svetlobi. Za dokumentacijo gel fotografiramo na film Mikrat 300 ali posnamemo z video sistemom, povezanim z računalnikom.

Najprej se ocenijo kontrolni vzorci. V elektroforetskem pasu, ki ustreza pozitivni kontroli, mora biti prisoten oranžen svetleč pas. Njegova elektroforetska mobilnost mora ustrezati dolžini amplikona, ki je navedena v navodilih.

V elektroforetski sledi, ki ustreza negativni kontroli, tak pas ne sme biti. Prisotnost takega pasu v negativni kontroli kaže na kontaminacijo – kontaminacijo uporabljenih reagentov s proučevano DNK ali pomnožekom. Preskusni vzorci se ocenjujejo glede na prisotnost traku na ustreznem pasu, ki se nahaja na isti ravni kot trak v vzorcu pozitivne kontrole. Intenzivnost sijaja pasu ustreza količini proučevane DNK v vzorcu, kar omogoča polkvantitativno oceno PCR. Običajno se pozitivni rezultati ocenjujejo na štiristopenjski lestvici. Če je sij traku v poskusnem vzorcu zelo šibek, je treba tak vzorec preurediti (slika 12).

riž. 12. Elektroforeza v agaroznem gelu.

Vloge PCR zadiagnostika točkastih mutacij in genskih polimorfizmov

Eno vodilnih področij uporabe PCR v praktičnem zdravstvu je diagnostika točkovnih mutacij in genskih polimorfizmov. . Obstajajo neposredne in posredne metode diagnostike DNK. V primerih, ko je znan gen, katerega poškodba vodi v nastanek dedne bolezni, je to poškodbo mogoče odkriti z molekularno genetskimi metodami. Takšne metode se imenujejo neposredne. Z neposrednimi metodami ugotavljamo motnje v primarnem nukleotidnem zaporedju DNK (mutacije in njihove vrste). Za neposredne metode je značilna natančnost, ki doseže skoraj 100%.

Vendar pa je v praksi te metode mogoče uporabiti pod določenimi pogoji.:

z znano citogenetsko lokalizacijo gena, odgovornega za nastanek dedne bolezni;

Gen bolezni je treba klonirati in poznati njegovo nukleotidno zaporedje.

Cilj neposredne diagnostike DNK je identificirati mutirane alele.

Tako se v tistih situacijah, ko je znano, kakšna poškodba DNK vodi v dedno bolezen, neposredno pregleda fragment DNK, ki vsebuje poškodbo, torej se uporabi neposredna metoda DNK diagnostike.

Vendar pa do danes geni številnih bolezni niso bili preslikani, njihova ekson-intronska organizacija ni znana, za številne dedne bolezni pa je značilna izrazita genetska heterogenost, ki ne omogoča popolne uporabe neposrednih diagnostičnih metod DNK. Zato se v primerih, ko lokalizacija poškodbe ni znana, uporablja drugačen pristop, povezan s preučevanjem bližine gena, odgovornega za gensko bolezen, v kombinaciji z družinsko analizo, to je posrednimi metodami molekularno genetske diagnoze. dednih bolezni uporabljajo.

Za odkrivanje točkovnih mutacij in majhnih delecij je mogoče uporabiti različne metode, vse pa temeljijo na uporabi metode PCR. Ta reakcija vam omogoča, da večkrat pomnožite nukleotidno zaporedje DNA in nato poiščete mutacije. Metode iskanja fragmentov DNA, ki nosijo mutacije, temeljijo na primerjalni analizi mutantnih in normalnih nukleotidnih zaporedij DNA.

Analiza produktov PCR

v procesu neposredne DNK diagnostike

Vključuje preučevanje posebnih značilnosti pomnožene regije gena. Tako se pri boleznih, ki jih povzroča ekspanzija trinukleotidnih ponovitev, produkti pomnoževanja razlikujejo po dolžini (kar odraža različno število trojčkov v proučevanem genskem območju) in posledično po hitrosti gibanja v gelu. Zaradi tega je dosežena jasna elektroforetska ločitev normalnih in mutantnih alelov ter natančna določitev patološko podaljšanega fragmenta, tj. DNK diagnoza bolezni (slika 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

riž. štirinajst. Diagnoza izbrisa GAG v genu DYT 1 pri bolnikih z od dope neodvisno distonijo (elektroforeza v poliakrilamidnem gelu). Skladbe 2,3,6 - bolan; pasovi 1,4,5 - nadzor. Tanka puščica označuje normalni alel, krepka puščica označuje mutantni krajši alel (delecija treh nukleotidov).

Če je proučevana regija DNA v celoti vključena v razširjeno delecijo, potem PCR pomnoževanje DNA iz tega izbrisanega alela ne bo izvedeno zaradi pomanjkanja mest za hibridizacijo primerjev. V tem primeru bo homozigotna delecija diagnosticirana na podlagi popolne odsotnosti PCR produkta reakcije (sinteza DNK je nemogoča iz obeh kopij gena). S heterozigotno delecijo je mogoče zaznati produkt PCR, sintetiziran iz normalnega (varnega) alela, vendar je za zanesljivo diagnozo takšne mutacije potrebna uporaba bolj sofisticiranih metod vizualizacije DNA, ki omogočajo oceno odmerka končnega alela. PCR produkt.

Za odkrivanje točkovnih mutacij (najpogosteje nukleotidnih substitucij) na določenih mestih se metoda PCR uporablja v kombinaciji z drugimi metodami molekularno genetske analize. Če sta lokacija in narava predlagane točkovne mutacije natančno znani, potem za namensko odkrivanje takšne mutacije, restrikcijske endonukleaze (restriktaze) so posebni celični encimi, izolirani iz različnih sevov bakterij.

Ti encimi prepoznajo specifična nukleotidna zaporedja, dolga od štiri do deset nukleotidov. Nato izvedejo restrikcijo (lat. (rezanje) teh zaporedij kot del dvoverižne molekule DNK. Vsak restrikcijski encim prepozna in na določenem mestu prereže strogo določeno, specifično nukleotidno zaporedje – restrikcijsko mesto (prepoznavno mesto).

V primerih, ko točkovna mutacija spremeni naravno mesto prepoznave za določen restrikcijski encim, ta encim ne bo mogel odcepiti mutantnega fragmenta, pomnoženega s PCR. V nekaterih primerih mutacija vodi do pojava novega prepoznavnega mesta za določen restrikcijski encim, ki ga v normi ni.

V obeh primerih bodo mutirani in normalni produkti PCR, obdelani z izbranim restrikcijskim encimom, dali restrikcijske fragmente različnih dolžin, ki jih je mogoče zlahka zaznati z elektroforezo (slika 15).

Če je torej treba hitro zaznati katero koli točkovno mutacijo, se naloga zmanjša na iskanje ustreznega restrikcijskega encima, katerega prepoznavno mesto je lokalizirano na mestu motenega nukleotidnega zaporedja. Obdelava produktov PCR s tem restrikcijskim encimom bo omogočila enostavno diferenciacijo normalnih in mutantnih alelov. Restrikcijska analiza močno poenostavi odkrivanje znanih točkovnih mutacij in se trenutno pogosto uporablja za neposredno diagnozo DNK dednih bolezni.

končna faza molekularno genetska analiza mutacij je določitev nukleotidnega zaporedja proučevanega fragmenta DNA (sekvenciranje), ki se primerja z normo in se oblikuje končna genetska diagnoza. Zahvaljujoč napredku v molekularni genetiki so bile razvite DNK diagnostične metode za več kot 400 dednih bolezni.

riž. petnajst. Odkrivanje točkovne mutacije z uporabo restrikcijske analize: A - območje gena, ki ga je mogoče pomnožiti in vsebuje restrikcijsko mestoAGCTza restrikcijsko endonukleazoAlu jaz. MutacijaG→ Aspremeni to nukleotidno zaporedje, kar povzroči restrikcijski encimAluiblokiran; B - elektroferogram restrikcijskih produktov: steza 1 - homozigotnost za normalni alel; pas 2, homozigotnost za mutacijo; pas 3 - heterozigotno stanje (normalen alel + mutacija).

Diagnostika dednih bolezni, ki temelji na neposrednem pregledu mutantnih alelov pri bolnikih, njihovih družinskih članih ali domnevnih heterozigotnih nosilcih patoloških mutacij, je primerna za predsimptomatsko in prenatalno diagnostiko, ki jo lahko uporabimo že v najzgodnejših fazah razvoja ploda, pred pojavom kakršne koli klinične ali biokemične simptome.

Ne glede na metodo odkrivanja mutacij je natančno molekularno karakterizacijo vsake mutacije mogoče dobiti le z neposrednim sekvenciranjem. Za avtomatizacijo tega procesa se v zadnjih letih pogosto uporabljajo posebne naprave - sekvencerji, ki omogočajo znatno pospešitev procesa branja informacij o DNK.

Pot za širšo uporabo molekularno bioloških raziskav v kliničnih diagnostičnih laboratorijih odpira pospešitev analiznega procesa z izvajanjem vseh postopkov v enem kontinuumu, brez prenosa vzorca, ustvarjanjem pogojev za preprečevanje kontaminacije pri vzporednem testiranju več analitov in z objektivno registracijo. rezultatov v vsakem ciklu.

Glavne modifikacije metode PCR

Uporablja se za hitro skeniranje in iskanje znanih genskih mutacij.

Multipleks (multiprimer) PCR

Ta metoda temelji na hkratnem pomnoževanju več eksonov proučevanega gena v eni reakciji. To omogoča ekonomično hitro presejanje najpogostejših mutacij. Na primer, za hitro diagnosticiranje prenašanja delecij v genu za distrofin pri bolnikih s progresivno Duchenne/Beckerjevo mišično distrofijo se izvede sočasno pomnoževanje niza najpogosteje mutirajočih eksonov tega gena. Ker so te bolezni podedovane recesivno vezano na X in so povezane s poškodbo edinega kromosoma X pri dečkih, bo v primeru podaljšane delecije elektroforeza produktov reakcije pokazala odsotnost enega ali več fragmentov DNA (eksonov). ), kar lahko služi kot molekularna potrditev diagnoze. Poleg tega je z izbiro specifičnih genskih regij za pomnoževanje PCR možna dokaj natančna ocena celotne dolžine delecije in prelomnih točk gena (do eksona).

Kombinirana uporaba več multipleksnih reakcij omogoča diagnosticiranje do 98 % vseh izbrisov, ki se pojavijo pri bolnikih s progresivno Duchenne/Beckerjevo mišično distrofijo. To je približno 60 % celotnega števila znanih mutacij v genu za distrofin in kaže na zelo visoko učinkovitost te presejalne metode za DNK diagnozo distrofinopatije (slika 16).

riž. 16. Direktna DNK diagnostika Duchennove mišične distrofije z uporabo multipleks PCR (elektroforeza v agaroznem gelu). Pri vsakem od pregledanih posameznikov so bili hkrati pomnoženi štirje eksoni gena za distrofin (eksoni 17, 19, 44 in 45; puščice označujejo ustrezne produkte pomnoževanja). Proga 1 - kontrola, steza 2-5 - bolniki z Duchennovo mišično distrofijo z različnimi delecijami gena za distrofin (proga 2 in 5 - delecija eksona 45, steza 3 - delecija eksona 44, steza 4 - delecija eksona 17 in 19 ).

Alel specifično pomnoževanje

Metoda temelji na uporabi dveh neodvisnih parov primerjev za določeno regijo gena: en primer v obeh parih je skupen, drugi primer v vsakem paru pa ima drugačno strukturo in je komplementaren normalni ali mutirani DNA. zaporedje. Kot rezultat takšne reakcije v raztopini se lahko hkrati sintetizirata dve vrsti produktov PCR - normalni in mutirani. Poleg tega zasnova uporabljenih primerjev omogoča jasno razlikovanje normalnih in mutantnih produktov pomnoževanja glede na njihovo molekularno velikost. Ta metoda je zelo jasna in vam omogoča preverjanje homo- in heterozigotnega nosilca mutantnega alela.

Metoda za na mesto usmerjeno modifikacijo pomnožene DNA

Metoda temelji na uporabi v PCR tako imenovanega mismatch primerja (ki ni popolnoma komplementaren matrici), ki se od matričnega zaporedja DNA razlikuje za en nukleotid. Zaradi vključitve navedenega primerja v sestavo mutantnega produkta PCR se v njem oblikuje umetno ustvarjeno restrikcijsko mesto za eno od restrikcijskih endonukleaz, kar omogoča neposredno diagnozo DNK določene znane mutacije z uporabo restrikcijske analize. Ustvarjanje takšnega umetnega restrikcijskega mesta je lahko potrebno, če iskanje ni razkrilo obstoja znanega in dostopnega encima, katerega "naravno" restrikcijsko mesto je prizadeto zaradi pojava proučevane mutacije v molekuli DNA. .

Metoda PCR z reverzno transkriptazo (RT- PCR)

Ta metoda se uporablja v primerih, ko je bolj priročno uporabiti ne genomsko DNA kot predmet študije, temveč bolj kompaktno in informacijsko bogato cDNA, pridobljeno po ustrezni obdelavi vzorcev tkiv, kot je biopsijski material ali celične linije limfocitov, fibroblastov. , itd. Pri tem je pomemben pogoj izražanje (vsaj minimalno) želenega gena v tkivu, ki ga proučujemo.

Na prvi stopnji se izvede reverzna transkripcija mRNA, nastale molekule cDNA pa služijo kot matrica za PCR. Nato se kritična regija cDNA, pomnožena v zadostni količini, podvrže sekvenciranju in drugim metodam presejanja mutacij, neposredni elektroforetski študiji (odkrivanje izbrisov, vstavkov itd.) ali integraciji v ekspresijski sistem, da se pridobi proteinski produkt in njegova neposredna analiza .

Ta metoda je še posebej učinkovita za detekcijo mutacij, ki vodijo v sintezo "okrnjenega" proteina (nonsense mutacije, splicing mutacije, velike delecije) - tako imenovana PTT analiza (Protein Truncation Test). Analiza PTT se običajno uporablja pri preučevanju razširjenih genov z več eksoni, kot je gen za Duchenne/Beckerjevo mišično distrofijo, ataksijo-telangiektazijo ali nevrofibromatozo tipa 1.

PCR v realnem času(PCR v realnem času)

V praktičnem zdravstvu PCR v realnem času postaja vsako leto vse bolj priljubljena diagnostična metoda. Njegova temeljna značilnost je spremljanje in kvantitativna analiza kopičenja produktov verižne reakcije polimeraze ter avtomatska registracija in interpretacija rezultatov. Ta metoda ne zahteva koraka elektroforeze, kar zmanjšuje zahteve za laboratorij PCR. Zaradi prihrankov v proizvodnem prostoru, zmanjšanja števila osebja in povpraševanja po kvantifikaciji DNA/RNA se ta metoda v zadnjih letih uspešno uporablja v največjih sanitarno-epidemičnih, diagnostičnih in raziskovalnih centrih v razvitih državah sveta, zamenjava PCR v sedanji (»klasični«) obliki.

PCR v realnem času uporablja fluorescentno označene oligonukleotidne sonde za odkrivanje DNK med pomnoževanjem. PCR v realnem času omogoča popolno analizo vzorca v 20-60 minutah in je teoretično sposoben zaznati celo eno samo molekulo DNA ali RNA v vzorcu.

riž. 17. PCR v realnem času.

PCR v realnem času uporablja sistem TaqMan za nadzor kinetike PCR neposredno med pomnoževanjem z resonančnim dušenjem fluorescence. Za detekcijo se uporablja sonda, ki nosi fluorofor in dušilec, ki je komplementaren srednjemu delu pomnoženega fragmenta. Ko sta fluorofor in dušilec vezana na oligonukleotidno sondo, opazimo le majhno količino fluorescentne emisije. Med postopkom pomnoževanja zaradi 5'-eksonukleazne aktivnosti polimeraze Taq fluorescentna oznaka preide v raztopino, se sprosti iz bližine dušilnika in ustvari fluorescenčni signal, ki se povečuje v realnem času sorazmerno s kopičenjem ojačati (slika 17).

Glavne prednosti PCR-Real-Time pred PCR z gelsko elektroforezo:

Celotna metoda poteka v eni epruveti;

· Metoda traja 1 uro;

Dovolj 1-2 delovnih sob;

Skupaj s kvalitativno oceno rezultata ga je mogoče kvantificirati (na primer pri predpisovanju protivirusne terapije za aids ali virusni hepatitis je treba poznati virusno obremenitev, tj. količino virusa na 1 enoto, ki zagotavlja resnično -čas PCR);

· Dramatično zmanjša tveganje kontaminacije.

Zaključek

Metoda PCR je ena najpogostejših metod molekularno bioloških raziskav. To metodo bi morali klinični zdravniki smiselno uporabljati, zdravnik, ki se odloči za uporabo PCR pri svojem delu, pa mora imeti določeno znanje o lastnostih in zmožnostih te metode. Drugič, med klinikom in laboratorijem za PCR mora obstajati tesna povratna informacija, ki je potrebna za analizo kompleksnih primerov in razvoj pravilne diagnostične strategije. Tretjič, analiza PCR ni zdravilo za diagnozo (predvsem nalezljivih bolezni) in ne nadomešča obstoječih raziskovalnih metod, ampak jih le dopolnjuje. In kar je najpomembneje, PCR ne more nadomestiti intuicije in analitičnega razmišljanja, ki ju mora imeti zdravnik, ki pričakuje uspeh.

p . S . Molekularno-biološke raziskave - sprememba referenčnih točk diagnostike in zdravljenja. Uporaba molekularno bioloških metod je povezana z možnostjo korenite spremembe poudarkov v laboratorijski diagnostiki. Ne moremo govoriti le o pravočasni informaciji, ampak o njenem vnaprejšnjem prejemu. Če se zdaj laboratorijske študije v večini primerov izvajajo že z napredovalo boleznijo in začetim zdravljenjem, se pričakuje, da bodo podatki molekularno-biološkega laboratorija omogočili prepoznavanje nagnjenosti osebe k določenim vrstam patologije in stopnje občutljivosti na določena zdravila, kar bo omogočila utemeljitev napovednega, preventivnega in personaliziranega značaja medicine prihodnosti.

SPREMEMBA DIAGNOZE IN ŽARIŠČA ZDRAVLJENJA

DEDNE BOLEZNI

Danes V prihodnosti

Diagnoza Genetski potni list

8. Koliko delovnih prostorov je potrebnih za PCR laboratorij s fluorescenčno detekcijo (kvantitativna analiza, Real-Time PCR)?

9. Kaj je odkrivanje?

10. Katere metode DNK diagnostike ločimo?

11. Kateri encim deluje na osnovi PCR?

12. Zakaj mora biti območje zaznavanja ločeno od drugih delovnih območij?

13. Kaj je mesto omejitev?

14. Kakšna je razlika med neposredno metodo DNK diagnostike in posredno?

15. Kaj je sekvenciranje?

16. Kaj je multipleks PCR?

17. Katere vrste mutacij določa PCR?

18. Kaj je kontaminacija?

19. Kaj je bistvo alelno specifične metode pomnoževanja?

20. Pogoji shranjevanja PCR materiala?

21. Katera naprava se uporablja za ojačanje?

22. Kakšna je metoda PCR z reverzno transkriptazo (RT-PCR)?

23. Kaj je material za PCR diagnostiko?

24. Naštejte vrste kontaminacije?

Testi za samostojno učenje

1. Restrikcijske endonukleaze:

a) encimi, ki "razbijejo" DNK na točno določenih mestih;

b) encimi, ki šivajo prelome v molekuli DNA;

c) encimi, ki zagotavljajo spojine, ki izvajajo popravilo DNK.

2. Gensko pomnoževanje:

3. Katera od metod molekularne genetike se uporablja za diagnosticiranje bolezni, ki jih povzroča mutirani gen znanega zaporedja?

a) uporaba specifične restriktaze;

b) neposredno detekcijo z uporabo specifičnih molekularnih sond;

c) družinska analiza porazdelitve normalnega polimorfizma dolžine restrikcijskih fragmentov.

4. Sekvenciranje DNK:

a) identifikacijo baznega zaporedja DNA;

b) ponavljajoče se ponavljanje katerega koli segmenta DNK;

c) izolacija fragmenta DNA, ki vsebuje proučevani gen.

5. Vzorce DNK je mogoče pridobiti z uporabo :

b) horionske resice;

c) amnijska tekočina;

d) celice amnijske tekočine;

e) biopsije kože, mišic, jeter,

e) vse je pravilno, razen točke "c",

g) vse je pravilno, razen točke "d",

h) Vse zgoraj navedeno drži.

6. Katere mutacije se diagnosticirajo s PCR?

a) genomski;

b) kromosomski;

c) gen (točka).

7. Primer je:

a) komplementarni del DNK;

b) s sintetičnim oligonukleotidom označeno (radioaktivno ali fluorescentno) zaporedje, ki je komplementarno mutantnemu ali normalnemu genu;

c) oligonukleotid, ki deluje kot "seme" in sproži sintezo polinukleotidne verige na predlogi DNA ali RNA.

8. Kdo je razvil princip metode PCR?

b) K. Mullis

9. Ali se za diagnosticiranje ekspanzije trinukleotidnih ponovitev (dinamični tip mutacij) uporablja metoda PCR?

10. Na katerih področjih se uporablja PCR?

a) klinična medicina;

b) definicija transgenih organizmov (GSO)

c) identifikacija osebe, ugotavljanje očetovstva, kriminalistika

d) vse našteto

d) nič od naštetega.

Primeri odgovorov: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - v; 7 - v; 8 - b; 9 – a, 10 – d.

Glavni

1. Bočkova genetika. Moskva. GEOTAR, 2002.

Dodatno

1., Bakharev in zdravljenje prirojenih in dednih bolezni pri otrocih. - Moskva, 2004.

2. DNK diagnostika in medicinsko genetsko svetovanje. - Moskva, 2004.

3. Ginterjeva genetika. - Moskva, 2003.

4. Gorbunov osnove medicinske genetike. - Sankt Peterburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekularna klinična diagnostika. – Svet, 1999.

6. Menshikov - biološke raziskave v klinični laboratorijski diagnostiki: možnosti problema (predavanja). Klinična laboratorijska diagnostika, št. 3, 2006.

7. Kornienko o delu laboratorija PCR med in-line analizo biološkega materiala. Klinična laboratorijska diagnostika, št. 10, 2006.

8. Organizacija dela PCR laboratorija. Metodična navodila. MU 1.3.1794-03. Glavni sanitarni zdravnik Ruske federacije, 2003.

9. Erlich H. A. PCR tehnologija. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Kvantitativna PCR v realnem času. Genome Res. - št. 6, 1996.

GLAVNA NAČELA METODE

VERIŽNA REAKCIJA POLIMERAZE

Metodološki priročnik za obštudijsko delo študentov 3-4 tečajev specialnosti splošne medicine (060101) in pediatrije (060103).

SEI HPE "Krasnojarska državna medicinska akademija Zvezne agencije za zdravje in socialni razvoj"

Rusija, Krasnojarsk,

Zvezna agencija za izobraževanje

Državna izobraževalna ustanova

Višja strokovna izobrazba

"Karelijska državna pedagoška akademija"

Tečajna naloga na temo:

Verižna reakcija s polimerazo (PCR) in njena uporaba

Izpolnila: študentka Koryagina Valeria Aleksandrovna

Preverila: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

Uvod

1. poglavje Pregled literature

1.5.4 Učinek platoja

1.5.6 Ojačitev

Zaključek

Uvod

Zadnjih dvajset let je zaznamovalo široko uvajanje molekularno genetskih metod v biološke, medicinske in kmetijske vede.

Do začetka sedemdesetih let se je zdelo, da je molekularna biologija dosegla določeno stopnjo popolnosti. V tem obdobju so bili mikroorganizmi glavni predmet molekularno genetskih raziskav. Prehod na evkarionte je raziskovalcem postavil povsem nove probleme, ki jih ni bilo mogoče rešiti z metodami genetske analize, ki so obstajale v tistem času. Preboj v razvoju molekularne genetike je postal mogoč zaradi pojava novega eksperimentalnega orodja - restrikcijskih endonukleaz. V naslednjih letih se je število metod neposredne analize DNK, ki temeljijo na kvalitativno drugačnih pristopih, začelo hitro povečevati.

Sodobne tehnologije so v mnogih primerih omogočile globlje preučevanje fine strukturne in funkcionalne organizacije jedrskih in ekstranuklearnih genomov različnih organizmov. To je bilo še posebej pomembno za razvoj novih metod diagnostike in zdravljenja različnih bolezni. Nič manj pomembna ni bila možnost uporabe dosežkov molekularne genetike v populacijski biologiji in žlahtnjenju za identifikacijo in analizo genetske variabilnosti populacij, sort in sevov, identifikacijo in certificiranje gospodarsko vrednih osebkov, ustvarjanje gensko spremenjenih organizmov in reševanje drugih vprašanj.

Vsaka metoda ima svoje prednosti in slabosti. Univerzalne metode, ki bi rešila vse težave, ki se pojavljajo, ni. Zato je izbira posebne metode za tekoče raziskave ena najpomembnejših faz vsakega znanstvenega dela.

1. poglavje Pregled literature

1.1 Zgodovina odkritja verižne reakcije s polimerazo (PCR)

Leta 1983 je K.B. Mullis in drugi so objavili in patentirali metodo verižne reakcije s polimerazo (PCR), ki naj bi močno vplivala na vsa področja raziskovanja in uporabe nukleinskih kislin. Pomen te metode za molekularno biologijo in genetiko se je izkazal za tako velikega in očitnega, da je avtor sedem let pozneje prejel Nobelovo nagrado za kemijo.

Na začetku uporabe metode, po vsakem ciklu segrevanja-hlajenja, je bilo treba reakcijski mešanici dodati DNA polimerazo, saj je bila inaktivirana pri visoki temperaturi, ki je potrebna za ločevanje verig DNA vijačnice. Reakcijski postopek je bil relativno neučinkovit, zahteval je veliko časa in encimov. Leta 1986 je bila metoda verižne reakcije s polimerazo bistveno izboljšana. Predlagana je bila uporaba DNA polimeraz iz termofilnih bakterij. Ti encimi so se izkazali za termostabilne in so lahko vzdržali številne reakcijske cikle. Njihova uporaba je omogočila poenostavitev in avtomatizacijo PCR. Ena prvih termostabilnih DNA polimeraz je bila izolirana iz bakterij Thermus aquaticusin imenovan Taq- polimeraza.

Možnost pomnoževanja katerega koli segmenta DNA, katerega nukleotidno zaporedje je znano, in pridobivanje le-tega po PCR v homogeni obliki in preparativni količini, naredi PCR alternativno metodo za molekularno kloniranje kratkih fragmentov DNA. V tem primeru pri konvencionalnem kloniranju ni treba uporabljati zapletenih metodoloških tehnik, ki se uporabljajo v genskem inženiringu. Razvoj metode PCR je tako močno razširil metodološke možnosti molekularne genetike, še posebej genskega inženiringa, da je korenito spremenil in okrepil znanstveni potencial mnogih njenih področij.

1.2 Različice verižne reakcije s polimerazo (PCR)

· Ugnezdeni PCR- uporablja se za zmanjšanje števila stranskih produktov reakcije. Uporabite dva para primerjev in izvedite dve zaporedni reakciji. Drugi par primerjev pomnoži regijo DNK znotraj produkta prve reakcije.

· Invertirana PCR- se uporablja, ko je znano le majhno območje znotraj želenega zaporedja. Ta metoda je še posebej uporabna, ko je treba po vstavitvi DNK v genom določiti sosednje sekvence. Za izvedbo invertne PCR se izvede serija rezov DNK z restrikcijskimi encimi<#"justify">primer za verižno reakcijo s polimerazo

· Skupinsko specifična PCR- PCR za svojce<#"center">1.3 Verižna reakcija s polimerazo

Verižna reakcija s polimerazo (PCR), ki so jo odkrili sredi osemdesetih let prejšnjega stoletja, lahko v nekaj urah večmilijonsko poveča število kopij izvirnega vzorca. Med vsakim ciklom reakcije se iz originalne molekule tvorita dve kopiji. Vsaka od sintetiziranih kopij DNK lahko služi kot predloga za sintezo novih kopij DNK v naslednjem ciklu. Tako ponavljajoče se ponavljanje ciklov vodi do eksponentnega povečanja števila kopij. Iz izračunov izhaja, da bo število kopij originalne molekule, tudi če je 30 ciklov, več kot 1 milijarda. Tudi če upoštevamo, da se v vsakem ciklu ne podvojijo vsi amplikoni, je skupno število kopij kljub temu precej veliko.

Vsak cikel verižne reakcije s polimerazo (PCR) je sestavljen iz naslednjih korakov:

· Denaturacija – povišanje temperature povzroči, da se dvoverižna molekula DNA odvije in razcepi na dve enoverižni;

· Žarjenje – znižanje temperature omogoča, da se primerji pritrdijo na komplementarne regije molekule DNA;

· Raztezek – encim DNA polimeraza dopolni komplementarno verigo.

Za pomnoževanje izbranega fragmenta uporabimo dva oligonukleotidna primerja (semena), ki obkrožata določeno regijo DNA. Primerno usmerjeno 3 - konča drug proti drugemu in v smeri zaporedja, ki ga je treba ojačati. DNA polimeraza izvaja sintezo (dokončanje) medsebojno komplementarnih verig DNA, začenši s primerji. Med sintezo DNK se primerji fizično vstavijo v verigo na novo sintetiziranih molekul DNK. Vsaka veriga molekule DNA, oblikovana z enim od primerjev, lahko služi kot predloga za sintezo komplementarne verige DNA z uporabo drugega primerja.

1.4 Izvajanje verižne reakcije s polimerazo (PCR)

Verižna reakcija s polimerazo se izvaja v posebnih tankostenskih polipropilenskih epruvetah, ki so po velikosti združljive z uporabljenim termičnim ciklerjem (ojačevalcem) ​​- napravo, ki nadzoruje temperaturne in časovne značilnosti stopenj verižne reakcije s polimerazo (PCR). .

1.5 Princip metode verižne reakcije s polimerazo

Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je in vitro metoda pomnoževanja DNK, ki lahko v nekaj urah izolira in pomnoži specifično zaporedje DNK več milijard krat. Možnost pridobitve ogromnega števila kopij ene strogo določene regije genoma močno poenostavi študij obstoječega vzorca DNK.

Za izvedbo verižne reakcije s polimerazo morajo biti izpolnjeni številni pogoji:

1.5.1 Prisotnost številnih komponent v reakcijski mešanici

Glavne sestavine reakcijske (PCR) mešanice so: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, mešanica nukleotidnih trifosfatov (ATP, GTP, CTP, TTP), primerji (oligonukleotidi), analizirani DNA pripravek, termostabilna DNA polimeraza. Vsaka od komponent reakcijske mešanice je neposredno vključena v verižno reakcijo s polimerazo (PCR), koncentracija reagentov pa neposredno vpliva na potek pomnoževanja.

· Tris-HCl - določa pH reakcijske mešanice, ustvarja pufrsko kapaciteto. Aktivnost DNA polimeraze je odvisna od pH medija, zato vrednost pH neposredno vpliva na potek polimerazne verižne reakcije. Običajno je pH vrednost v območju 8 - 9,5. Visok pH je posledica dejstva, da z naraščanjem temperature pH pufra Tril-HCl pada.

· KCl - koncentracija kalijevega klorida do 50 mm vpliva na potek procesov denaturacije in žarjenja, koncentracija nad 50 mm zavira DNA polimerazo.

· MgCl 2- ker je DNA polimeraza Mg 2+- odvisen encim, potem koncentracija magnezijevih ionov vpliva na aktivnost encima (Mg 2+tvori komplekse z NTP - ti kompleksi so substrat za polimerazo). Visoka koncentracija vodi do povečanja nespecifičnega pomnoževanja, nizka pa do inhibicije reakcije, optimalna (za različne polimeraze) je v območju 0,5 - 5 mM. Poleg tega koncentracija magnezijevih soli vpliva na potek procesov denaturacije in žarjenja - povečanje koncentracije Mg 2+povzroči zvišanje temperature taljenja DNK (tj. temperature, pri kateri se 50 % dvoverižnih verig DNK zlomi v enoverižne verige).

· NTP - nukleotidni trifosfati so neposredni monomeri nukleinskih kislin. Za preprečitev prekinitve verige je priporočljivo enako razmerje vseh štirih nukleotidnih trifosfatov. Nizka koncentracija teh komponent v reakcijski mešanici poveča verjetnost napak pri konstrukciji komplementarne verige DNA.

· Primeri - Najbolj optimalna je uporaba temeljnih premazov z razliko v tališčih največ 2 - 4 o C. Včasih med dolgotrajnim skladiščenjem pri temperaturi 4 o Z ali po velikem številu zamrzovanja - odmrzovanja, primerji tvorijo sekundarne strukture - dimerje, kar zmanjšuje učinkovitost PCR. Odprava tega problema se zmanjša na inkubacijo v vodni kopeli (T=95 o C) 3 minute in nato hitro ohlajanje na 0o OD.

· DNK preparati - količina in kvaliteta DNK preparata (matrice) neposredno vplivata na potek in parametre polimerazne verižne reakcije. Presežek vzorca DNK zavira verižno reakcijo s polimerazo (PCR). Učinkovitost verižne reakcije s polimerazo (PCR) lahko zmanjšajo tudi nečistoče različnih snovi v pripravku DNK: natrijev acetat, natrijev klorid, izopropanol, etanol, heparin, fenol, sečnina, hemoglobin itd.

· DNA polimeraza - pri uporabi majhne količine DNA polimeraze opazimo zmanjšanje sinteze končnega produkta neposredno sorazmerno z velikostjo fragmentov. Presežek polimeraze za 2-4 krat vodi do pojava difuznih spektrov in za 4-16-krat nespecifičnih spektrov z nizko molekulsko maso. Razpon uporabljenih koncentracij je 0,5 - 1,5 enote aktivnosti glede na 25 µl mešanice PCR.

Poleg glavnih sestavin mešanice PCR se uporabljajo številne dodatne snovi, ki izboljšujejo kvalitativne in kvantitativne kazalnike PCR: acetamid (5%) - povečanje topnosti glavnih sestavin; betain (natrijeva sol) - stabilizacija DNK polimeraze, znižanje tališča DNK, izenačenje tališča; goveji albumin (10-100 μg / ml) - stabilizacija DNA polimeraze; dimetil sulfoksid (1-10%) - povečanje topnosti glavnih sestavin; formamid (2-10%) - povečanje specifičnosti žarjenja; glicerol (15-20%) - povečanje toplotne stabilnosti encima, znižanje temperature denaturacije vzorca DNK; amonijev sulfat - znižanje temperature denaturacije in žarjenja.

1.5.2 Cikel in temperatura

Splošni pogled na program verižne reakcije s polimerazo (PCR) je naslednji:

stopnja. Podaljšana primarna denaturacija preparata DNA.1 cikel

stopnja. Hitra denaturacija pripravka DNK. Primerno žarjenje. Raztezek.30 - 45 ciklov.

stopnja. Dolgotrajno raztezanje. Hlajenje reakcijske mešanice 1 cikel.

Vsak element stopnje - denaturacija, žarjenje, raztezek - ima individualne temperaturne in časovne značilnosti. Parametri temperature in časa pretoka vsakega elementa so izbrani empirično, v skladu s kvalitativnimi in kvantitativnimi kazalniki produktov ojačanja.

Denaturacija. Med tem elementom verižne reakcije s polimerazo se dvoverižna molekula DNK razdeli na dve enoverižni. Temperaturni parametri denaturacije so v območju 90 - 95 o C, v primeru vzorca DNK z visoko vsebnostjo gvanina in citozina pa je treba temperaturo povišati na 98 o C. Temperatura denaturacije naj bo zadostna za popolno denaturacijo – cepitev verig DNK in izogibanje "nenadnemu ohlajanju" ali hitremu žarjenju, vendar pa je termostabilna DNK polimeraza pri visokih temperaturah manj stabilna. Tako je izbira optimalnih temperaturnih parametrov denaturacije za razmerje primer/vzorec (priprava DNA) pomemben pogoj za pomnoževanje. Če je temperatura denaturacije v prvem koraku nad 95 o C, je priporočljivo dodati DNA polimerazo v reakcijsko mešanico po primarni denaturaciji. Trajanje tega elementa faze med verižno reakcijo s polimerazo (PCR) bi moralo zadostovati za popolno denaturacijo DNA, vendar hkrati ne bi bistveno vplivalo na aktivnost DNA polimeraze pri dani temperaturi.

Žarjenje. Temperatura žarjenja (T a ) je eden najpomembnejših parametrov verižne reakcije s polimerazo. Temperatura žarjenja za vsak temeljni premaz je izbrana posebej. Odvisno je od dolžine in nukleotidne sestave primerja. Ponavadi je nižja za 2-4 o Iz vrednosti tališča (T m ) temeljni premaz. Če je temperatura žarjenja sistema pod optimalno, se poveča število nespecifičnih pomnoženih fragmentov in, nasprotno, višja temperatura zmanjša število pomnoženih produktov. V tem primeru se lahko koncentracija specifičnih amplikonov močno zmanjša, vse do inhibicije verižne reakcije polimeraze (PCR). Povečanje časa žarjenja vodi tudi do povečanja števila nespecifičnih amplikonov.

Raztezek. Običajno ima vsaka vrsta termostabilne DNA polimeraze svoj temperaturni optimum aktivnosti. Hitrost sinteze komplementarne verige DNK z encimom je tudi vrednost, specifična za vsako polimerazo (v povprečju je 30–60 nukleotidov na sekundo oz. 1–2 tisoč baz na minuto), zato je čas raztezanja izbran glede na na vrsto DNA polimeraze in dolžino pomnožene regije.

1.5.3 Osnovna načela izbire temeljnih premazov

Pri izdelavi testnega sistema PCR je ena glavnih nalog pravilna izbira primerjev, ki morajo izpolnjevati številne kriterije:

Primerji morajo biti specifični. Posebna pozornost je namenjena 3 - konci primerjev, saj od njih polimeraza Taq začne dokončati komplementarno verigo DNA. Če je njihova specifičnost nezadostna, je verjetno, da se bodo v epruveti z reakcijsko mešanico pojavili nezaželeni procesi, in sicer sinteza nespecifične DNA (kratki ali dolgi fragmenti). Na elektroforezi je viden v obliki težkih ali svetlih dodatnih trakov. Zaradi tega je težko oceniti rezultate reakcije, saj je specifičen produkt pomnoževanja enostavno zamenjati s sintetizirano tujo DNK. Del primerjev in dNTP se porabi za sintezo nespecifične DNA, kar povzroči znatno izgubo občutljivosti.

Primerji ne smejo tvoriti dimerov in zank, tj. nobena stabilna dvojna pramena ne sme nastati z žarjenjem temeljnih pramenov na samem sebi ali drug na drugem.

1.5.4 Učinek platoja

Treba je opozoriti, da proces kopičenja specifičnih produktov ojačanja eksponentno traja le omejen čas, nato pa njegova učinkovitost kritično pade. To je posledica tako imenovanega "plato" učinka.

izrazni učinek planota uporablja se za opis procesa kopičenja produktov PCR v zadnjih ciklih pomnoževanja.

Odvisno od pogojev in števila ciklov reakcije ojačanja, v času, ko je učinek dosežen planota uporaba substratov (dNTP in primerji), stabilnost reaktantov (dNTP in encim), količina inhibitorjev, vključno s pirofosfati in dupleksi DNA, tekmovanje za reaktante z nespecifičnimi produkti ali primerji-dimeri, koncentracija specifičnega produkta. in nepopolna denaturacija pri visokih koncentracijah produktov pomnoževanja.

Nižja kot je začetna koncentracija tarčne DNK, večje je tveganje za reakcijo plato". Ta točka se lahko pojavi, preden je število specifičnih produktov pomnoževanja zadostno za analizo. Le dobro optimizirani testni sistemi se lahko temu izognejo.

1.5.5 Priprava vzorcev biološkega materiala

Za ekstrakcijo DNK se uporabljajo različne tehnike, odvisno od nalog. Njihovo bistvo je v ekstrakciji (ekstrakciji) DNA iz biološkega proizvoda in odstranitvi ali nevtralizaciji tujih nečistoč, da dobimo pripravek DNA s čistostjo, primerno za PCR.

Metoda pridobivanja pripravka čiste DNK, ki jo je opisal Marmur, velja za standardno in je že postala klasična. Vključuje encimsko proteolizo, ki ji sledi deproteinizacija in ponovno obarjanje DNA z alkoholom. Ta metoda omogoča pridobivanje čistega preparata DNK. Vendar pa je precej naporno in vključuje delo s tako agresivnimi in ostrimi snovmi, kot sta fenol in kloroform.

Ena od trenutno priljubljenih metod je metoda ekstrakcije DNK, ki so jo predlagali Boom et al. Ta metoda temelji na uporabi močnega kaotropnega sredstva, gvanidin tiocianata (GuSCN), za celično lizo in kasnejšo sorpcijo DNA na nosilcu (steklene kroglice, diatomejska zemlja, stekleno mleko itd.). Po izpiranju DNK ostane v vzorcu, adsorbirana na nosilcu, iz katerega jo je mogoče enostavno odstraniti z uporabo elucijskega pufra. Metoda je priročna, tehnološko napredna in primerna za pripravo vzorcev za pomnoževanje. Možne pa so izgube DNK zaradi ireverzibilne sorpcije na nosilcu, pa tudi med številnimi izpiranji. To je še posebej pomembno pri delu z majhnimi količinami DNK v vzorcu. Poleg tega lahko celo količine GuSCN v sledovih zavirajo PCR. Zato je pri uporabi te metode zelo pomembna pravilna izbira sorbenta in natančno upoštevanje tehnoloških odtenkov.

Druga skupina metod priprave vzorcev temelji na uporabi ionskih izmenjevalcev tipa Chilex, ki za razliko od stekla ne adsorbirajo DNK, temveč nasprotno nečistoče, ki motijo ​​reakcijo. Ta tehnologija praviloma vključuje dve stopnji: vretje vzorca in adsorpcijo nečistoč na ionskem izmenjevalniku. Metoda je izjemno privlačna zaradi svoje preprostosti izvedbe. V večini primerov je primeren za delo s kliničnim materialom. Na žalost včasih obstajajo vzorci z nečistočami, ki jih ni mogoče odstraniti z ionskimi izmenjevalci. Poleg tega nekaterih mikroorganizmov ni mogoče uničiti s preprostim prekuhavanjem. V teh primerih je potrebno uvesti dodatne stopnje obdelave vzorcev.

Zato je treba izbiro metode priprave vzorca obravnavati z razumevanjem namenov predvidenih analiz.

1.5.6 Ojačitev

Za izvedbo reakcije pomnoževanja je potrebno pripraviti reakcijsko zmes in ji dodati analizirani vzorec DNK. V tem primeru je pomembno upoštevati nekatere značilnosti žarjenja temeljnega premaza. Dejstvo je, da so v analiziranem biološkem vzorcu praviloma različne molekule DNA, s katerimi imajo primerji, uporabljeni v reakciji, delno in v nekaterih primerih pomembno homologijo. Poleg tega se lahko primerji med seboj žarijo in tvorijo primerje-dimerje. Oboje vodi do znatne porabe primerjev za sintezo stranskih (nespecifičnih) produktov reakcije in posledično bistveno zmanjša občutljivost sistema. To otežuje ali onemogoča branje rezultatov reakcije med elektroforezo.

1.6 Sestava standardne reakcijske mešanice PCR

x PCR pufer (100 mM raztopina Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM raztopina KCl, 25 mM raztopina MgCl2 ) …….2,5 µl

Voda (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Mešanica nukleotidnih trifosfatov (dNTP)

mM raztopina vsakega………………………………………….……….0,5 µl

Primer 1 (10 mM raztopina) ……………………………………….….1 µl

Primer 2 (10 mM raztopina) ……………………………………….….1 µl

DNA polimeraza (5 enot / µl) ……………………………………………0,2 µl

Vzorec DNK (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Vrednotenje reakcijskih rezultatov

Da bi pravilno ocenili rezultate PCR, je pomembno razumeti, da ta metoda ni kvantitativna. Teoretično lahko produkte pomnoževanja posameznih tarčnih molekul DNK z elektroforezo zaznamo že po 30-35 ciklih. Vendar se v praksi to izvaja le v primerih, ko reakcija poteka v pogojih, ki so blizu idealnim, kar se v življenju ne srečuje pogosto. Posebno velik vpliv na učinkovitost pomnoževanja ima stopnja čistosti pripravka DNA; prisotnost določenih inhibitorjev v reakcijski mešanici, ki se jih je v nekaterih primerih lahko zelo težko znebiti. Včasih zaradi njihove prisotnosti ni mogoče pomnožiti niti več deset tisoč ciljnih molekul DNK. Tako pogosto ni neposredne povezave med začetno količino ciljne DNA in končno količino produktov pomnoževanja.

2. poglavje: Uporaba verižne reakcije s polimerazo

PCR se uporablja na številnih področjih za analizo in v znanstvenih poskusih.

Kriminalistika

PCR se uporablja za primerjavo tako imenovanih "genetskih prstnih odtisov". Potrebujemo vzorec genetskega materiala s kraja zločina - kri, slina, seme, lasje itd. Primerjajo ga z genetskim materialom osumljenca. Dovolj je zelo majhna količina DNK, teoretično - ena kopija. DNK se razreže na fragmente, nato pa se pomnoži s PCR. Fragmente ločimo z elektroforezo DNA. Nastala slika lokacije trakov DNK se imenuje genetski prstni odtis.

Ugotavljanje očetovstva

Rezultati elektroforeze fragmentov DNA, pomnoženih s PCR. Oče. Otrok. mati. Otrok je podedoval nekatere značilnosti genetskega odtisa obeh staršev, kar je dalo nov, edinstven odtis.

Čeprav so "genetski prstni odtisi" edinstveni, je družinske vezi vseeno mogoče vzpostaviti z izdelavo več takih prstnih odtisov. Enako metodo lahko z majhnimi spremembami uporabimo za ugotavljanje evolucijskih odnosov med organizmi.

Medicinska diagnostika

PCR omogoča bistveno pospešitev in olajšanje diagnosticiranja dednih in virusnih bolezni. Gen, ki nas zanima, se pomnoži s PCR z uporabo ustreznih primerjev in nato sekvencira za določitev mutacij. Virusne okužbe lahko odkrijemo takoj po okužbi, tedne ali mesece preden se pojavijo simptomi bolezni.

Personalizirana medicina

Včasih so zdravila za nekatere bolnike strupena ali alergena. Vzroki za to so deloma v individualnih razlikah v občutljivosti in presnovi zdravil in njihovih derivatov. Te razlike so določene na genetski ravni. Na primer, pri enem bolniku je lahko določen citokrom bolj aktiven, pri drugem pa manj. Da bi ugotovili, kakšen citokrom ima določen bolnik, se pred uporabo zdravila predlaga analiza PCR. Ta analiza se imenuje predhodna genotipizacija.

Kloniranje genov

Kloniranje genov je postopek izolacije genov in kot rezultat manipulacije genskega inženiringa pridobivanje velike količine produkta določenega gena. PCR se uporablja za pomnoževanje gena, ki se nato vstavi v vektor, kos DNK, ki prenaša tuji gen v isti organizem ali drug organizem, ki ga je enostavno gojiti. Kot vektorji se uporabljajo na primer plazmidi ali virusna DNA. Z vstavitvijo genov v tuj organizem se običajno pridobi produkt tega gena – RNK ali najpogosteje protein. Na ta način se pridobi veliko beljakovin v industrijskih količinah za uporabo v kmetijstvu, medicini itd.

Sekvenciranje DNK

Pri metodi sekvenciranja s fluorescentno ali radioaktivno označenimi dideoksinukleotidi je sestavni del PCR, saj se med polimerizacijo v verigo DNA vstavijo fluorescentno ali radioaktivno označeni nukleotidni derivati. To ustavi reakcijo in omogoča določitev položajev specifičnih nukleotidov po ločitvi sintetiziranih verig v gelu.

Mutageneza

Trenutno je PCR postala glavna metoda mutageneze. Uporaba PCR je omogočila poenostavitev in pospešitev postopka mutageneze ter njeno zanesljivost in ponovljivost.

Metoda PCR je omogočila analizo prisotnosti sekvenc humanega papiloma virusa v odsekih biopsij človeških neoplazem materničnega vratu, vdelanih v parafin 40 let pred to študijo. Še več, s pomočjo PCR je bilo mogoče pomnožiti in klonirati fragmente mitohondrijske DNK iz fosilnih ostankov človeških možganov, starih 7 tisoč let!

Na lizatih posameznih človeških semenčic je bila dokazana možnost hkratne analize dveh lokusov, ki se nahajata na različnih nehomolognih kromosomih. Ta pristop ponuja edinstveno priložnost za natančno genetsko analizo in preučevanje kromosomske rekombinacije, polimorfizma DNA itd. Metoda analize posameznih semenčic je takoj našla praktično uporabo v sodni medicini, saj HLA tipizacija haploidnih celic omogoča ugotavljanje očetovstva ali identifikacijo kriminalec (kompleks HLA je niz genov človeškega glavnega histokompatibilnega kompleksa; lokusi kompleksa HLA so najbolj polimorfni od vseh znanih pri višjih vretenčarjih: znotraj vrste je na vsakem lokusu nenavadno veliko število različni aleli – alternativne oblike istega gena).

S pomočjo PCR je mogoče ugotoviti pravilnost integracije tujih genetskih struktur v vnaprej določeno regijo genoma proučevanih celic. Celotna celična DNA je žarjena z dvema oligonukleotidnima začetnima primerjema, od katerih je eden komplementaren mestu gostiteljske DNA blizu insercijske točke, drugi pa zaporedju integriranega fragmenta v antiparalelni verigi DNA. Verižna reakcija s polimerazo pri nespremenjeni strukturi kromosomske DNA na predlaganem mestu vstavitve povzroči nastanek enoverižnih fragmentov DNA nedoločene velikosti, v primeru načrtovane vstavitve pa dvoverižnih fragmentov DNA znanega velikost, določena z razdaljo med mesti žarjenja obeh primerjev. Poleg tega bo stopnja ojačanja analizirane regije genoma v prvem primeru linearno odvisna od števila ciklov, v drugem pa eksponentno. Eksponentno kopičenje pomnoženega fragmenta vnaprej določene velikosti med PCR omogoča vizualno opazovanje po elektroforetski frakcioniranju pripravka DNA in nedvoumen sklep o vstavitvi tujega zaporedja v določeno regijo kromosomske DNA.

Zaključek

Metoda PCR je trenutno najbolj razširjena metoda za diagnosticiranje različnih nalezljivih bolezni. PCR vam omogoča, da ugotovite etiologijo okužbe, tudi če vzorec, odvzet za analizo, vsebuje le nekaj molekul DNA patogena. PCR se pogosto uporablja pri zgodnji diagnostiki okužb s HIV, virusnega hepatitisa itd. Do danes skoraj ni povzročitelja okužbe, ki ga ne bi bilo mogoče odkriti s PCR.

Seznam uporabljene literature

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Metode molekularno-genetske analize. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 str.

2.PCR "v realnem času" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. in itd.; izd. b. n. D.V. Rebrikov; predgovor L.A. Osterman in akad. RAS in RAAS E.D. Sverdlov; 2. izd., rev. in dodatno - M.: BINOM. Laboratorij znanja, 2009. - 223 str.

.Patrushev L.I. Umetni genetski sistemi. - M.: Nauka, 2005. - V 2 tonah

.B. Glick, J. Pasternak Molekularna biotehnologija. Načela in uporaba 589 strani, 2002

5.Ščelkunov S.N. genski inženiring. - Novosibirsk: Sib. univ. založba, 2004. - 496 str.

Uredil A.A. Vorbjeva "Verižna reakcija s polimerazo in njena uporaba v diagnostiki v dermatovenerologiji"; Medicinska tiskovna agencija - 72 strani

http://ru. wikipedia.org

http://učenjak. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - zdravniški dnevnik

mentorstvo

Potrebujete pomoč pri učenju teme?

Naši strokovnjaki vam bodo svetovali ali nudili storitve mentorstva o temah, ki vas zanimajo.
Oddajte prijavo navedite temo prav zdaj, da izveste o možnosti pridobitve posvetovanja.

Vendar je takrat ta ideja ostala nezahtevana. Polimerazno verižno reakcijo je leta 1983 ponovno odkril Kary Mullis. Njegov cilj je bil ustvariti metodo, ki bi omogočila pomnoževanje DNK med večkratnim zaporednim podvajanjem originalne molekule DNK z uporabo encima DNK polimeraze. 7 let po objavi te zamisli, leta 1993, je Mullis zanjo prejel Nobelovo nagrado.

Na začetku uporabe metode je bilo treba po vsakem ciklu segrevanja-hlajenja v reakcijsko mešanico dodati DNA polimerazo, saj se je hitro inaktivirala pri visoki temperaturi, ki je potrebna za ločevanje verig vijačnic DNA. Postopek je bil zelo neučinkovit, zahteval je veliko časa in encimov. Leta 1986 so ga bistveno izboljšali. Predlagana je bila uporaba DNA polimeraz iz termofilnih bakterij. Ti encimi so se izkazali za termostabilne in so lahko vzdržali številne reakcijske cikle. Njihova uporaba je omogočila poenostavitev in avtomatizacijo PCR. Ena prvih termostabilnih DNA polimeraz je bila izolirana iz bakterij Thermus aquaticus in imenovan Taq- polimeraza. Pomanjkljivost te polimeraze je, da je verjetnost vnosa napačnega nukleotida precej velika, saj ta encim nima mehanizmov za popravljanje napak (3" → 5" eksonukleazna aktivnost). Polimeraze pfu in Pwo, izolirani iz arhej, imajo takšen mehanizem, njihova uporaba bistveno zmanjša število mutacij v DNK, vendar je hitrost njihovega delovanja (procesivnost) nižja kot pri Taq. Trenutno uporabljam mešanice Taq in pfu za doseganje visoke hitrosti polimerizacije in visoke natančnosti kopiranja.

V času izuma metode je Mullis delal za podjetje Cetus (en: Cetus Corporation), ki je patentiralo metodo PCR. Leta 1992 je Cetus prodal pravice do metode in patent za uporabo Taq-podjetje za polimerazo Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) za 300 milijonov dolarjev. Vendar se je izkazalo, da Taq-polimerazo je leta 1980 označil ruski biokemik Aleksej Kaledin, v zvezi s katerim je podjetje Promega (Promega) poskušalo prisiliti Roche, da se na sodišču odreče izključnim pravicam za ta encim. Ameriški patent za metodo PCR je potekel marca 2005.

Izvajanje PCR

Metoda temelji na večkratnem selektivnem kopiranju določene regije DNA s pomočjo encimov v umetnih pogojih ( in vitro). V tem primeru se kopira samo območje, ki izpolnjuje določene pogoje, in le, če je prisotno v proučevanem vzorcu. V nasprotju s pomnoževanjem DNK v živih organizmih (replikacija) se s PCR pomnoži relativno kratke odseke DNK. Pri običajnem postopku PCR dolžina repliciranih regij DNK ne presega 3000 baznih parov (3 kbp). S pomočjo mešanice različnih polimeraz, z uporabo dodatkov in pod določenimi pogoji lahko dolžina PCR fragmenta doseže 20-40 tisoč baznih parov. To je še vedno precej manj od dolžine kromosomske DNK evkariontske celice. Na primer, človeški genom je dolg približno 3 milijarde baznih parov.

Reakcijske komponente

Za PCR so v najpreprostejšem primeru potrebne naslednje komponente:

• DNK šablona, ki vsebuje del DNK, ki ga je treba pomnožiti.
• Dva primerja, komplementarno nasprotnim koncem različnih verig želenega fragmenta DNA.
• termostabilen DNA polimeraza je encim, ki katalizira polimerizacijo DNK. Polimeraza za uporabo v PCR mora ostati aktivna pri visoki temperaturi dolgo časa, zato se uporabljajo encimi, izolirani iz termofilov - Thermus aquaticus(Taq polimeraza), Pyrococcus furiosus(Pfu polimeraza), Pyrococcus woesei(Pwo-polimeraza) in drugi.
• Deoksinukleozidni trifosfati(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Ioni Mg 2+, potrebni za delovanje polimeraze.
• puferska raztopina, ki zagotavlja potrebne reakcijske pogoje - pH, ionsko moč raztopine. Vsebuje soli, goveji serumski albumin.

Da preprečimo izhlapevanje reakcijske zmesi, dodamo v epruveto olje z visokim vreliščem, kot je vazelin. Če se uporablja ogrevan cikličen pokrov, to ni potrebno.

Dodatek pirofosfataze lahko poveča izkoristek reakcije PCR. Ta encim katalizira hidrolizo pirofosfata, stranskega produkta dodajanja nukleotidnih trifosfatov na rastočo verigo DNA, v ortofosfat. Pirofosfat lahko zavre reakcijo PCR.

Primerji

Specifičnost PCR temelji na tvorbi komplementarnih kompleksov med šablono in primerji, kratkimi sintetičnimi oligonukleotidi, dolgimi 18-30 baz. Vsak od primerjev je komplementaren eni od verig dvoverižne predloge in omejuje začetek in konec pomnožene regije.

Po hibridizaciji matrice s primerjem (žarjenjem) slednji služi kot primer za DNA polimerazo pri sintezi komplementarne verige matrice (glej).

Najpomembnejša značilnost primerjev je tališče (Tm) kompleksa primer-matriks. T m je temperatura, pri kateri polovica vzorčne DNK tvori kompleks z oligonukleotidnim začetnim oligonukleotidom. Tališče lahko približno določimo s formulo , kjer je n X število X nukleotidov v oligonukleotidi. Če sta dolžina in nukleotidna sestava primerja ali temperatura žarjenja izbrana nepravilno, je možna tvorba delno komplementarnih kompleksov z drugimi regijami matrične DNK, kar lahko privede do pojava nespecifičnih produktov. Zgornja meja tališča je omejena z optimalno temperaturo delovanja polimeraze, katere aktivnost pade pri temperaturah nad 80 °C.

Pri izbiri temeljnih premazov je zaželeno upoštevati naslednja merila:

ojačevalnik

riž. eno: PCR cikler

PCR se izvaja v ojačevalniku - napravi, ki zagotavlja periodično hlajenje in segrevanje epruvet, običajno z natančnostjo najmanj 0,1 ° C. Sodobni ciklerji vam omogočajo nastavitev zapletenih programov, vključno z možnostjo "vročega zagona", Touchdown PCR (glejte spodaj) in poznejšega shranjevanja pomnoženih molekul pri 4 °C. Za PCR v realnem času se proizvajajo naprave, opremljene s fluorescenčnim detektorjem. Instrumenti so na voljo tudi s samodejnim pokrovom in prostorom za mikroplošče, kar omogoča njihovo integracijo v avtomatizirane sisteme.

Napredek reakcije

Fotografija gela, ki vsebuje DNK markerja (1) in produkte reakcije PCR (2,3). Številke prikazujejo dolžino fragmentov DNA v nukleotidnih parih.

Običajno se pri izvajanju PCR izvede 20-35 ciklov, od katerih je vsak sestavljen iz treh stopenj (slika 2).

Denaturacija

Predloga dvoverižne DNK se segreva na 94–96 °C (ali 98 °C, če se uporablja posebej termostabilna polimeraza) 0,5–2 minuti, da se verigi DNK ločita. Ta stopnja se imenuje denaturacija ker so vodikove vezi med obema verigama DNK pretrgane. Včasih se pred prvim ciklom (pred dodajanjem polimeraze) reakcijska zmes predhodno segreje 2–5 minut. za popolno denaturacijo šablone in primerjev. Takšen pristop se imenuje vroč zagon, omogoča zmanjšanje količine nespecifičnih reakcijskih produktov.

Žarjenje

Ko so prameni ločeni, se temperatura zniža, da se primerji lahko vežejo na enovijačno predlogo. Ta stopnja se imenuje žarjenje. Temperatura žarjenja je odvisna od sestave temeljnih premazov in je običajno izbrana 4-5 °C pod njihovim tališčem. Čas faze - 0,5-2 min. Nepravilna izbira temperature žarjenja vodi bodisi do slabše vezave primerjev na šablono (pri povišani temperaturi) bodisi do vezave na napačnem mestu in pojava nespecifičnih produktov (pri nizki temperaturi).

Raztezek

Sorte PCR

• "Ugnezdeni" PCR (Nested PCR (eng.)) - uporablja se za zmanjšanje števila stranskih produktov reakcije. Uporabite dva para primerjev in izvedite dve zaporedni reakciji. Drugi par primerjev pomnoži regijo DNK znotraj produkta prve reakcije.
• »Obrnjeni« PCR (Inverse PCR (eng.)) – se uporablja, če je znotraj želenega zaporedja poznano le majhno območje. Ta metoda je še posebej uporabna, ko je treba po vstavitvi DNK v genom določiti sosednje sekvence. Za izvedbo invertne PCR se izvede serija rezov DNA z restrikcijskimi encimi, ki jim sledi povezovanje fragmentov (ligacija). Posledično so znani fragmenti na obeh koncih neznane regije, po kateri se PCR lahko izvede kot običajno.
• PCR z reverzno transkripcijo (RT-PCR) se uporablja za pomnoževanje, izolacijo ali identifikacijo znanega zaporedja iz knjižnice RNA. Pred konvencionalno PCR se na šabloni mRNA s pomočjo reverzetaze sintetizira enoverižna DNA molekula in dobi enoverižna cDNA, ki se uporablja kot matrica za PCR. Ta metoda pogosto določa, kje in kdaj so ti geni izraženi.
• asimetrični PCR. Asimetrični PCR) - se izvaja, ko je treba pomnožiti predvsem eno od verig izvorne DNK. Uporablja se v nekaterih tehnikah analize zaporedja in hibridizacije. PCR izvedemo kot običajno, le da enega od primerjev vzamemo v velikem presežku.
• Kvantitativni PCR (Q-PCR) se uporablja za hitro merjenje količine specifične DNA, cDNA ali RNA v vzorcu.
• Kvantitativna PCR v realnem času – ta metoda uporablja fluorescentno označene reagente za natančno merjenje količine reakcijskega produkta, ko se kopiči.
• Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR(English) ) - z uporabo te metode se zmanjša vpliv nespecifične vezave primerjev na tvorbo produkta. Prve cikle izvajamo pri temperaturi nad temperaturo žarjenja, nato pa temperaturo vsakih nekaj ciklov znižamo. Pri določeni temperaturi bo sistem prešel skozi pas optimalne specifičnosti primerja za DNA.
• Metoda molekularnih kolonij (PCR v gelu) Kolonija Polony-PCR) - akrilamidni gel polimeriziramo z vsemi komponentami PCR na površini in izvedemo PCR. Na točkah, ki vsebujejo analizirano DNK, pride do pomnoževanja s tvorbo molekularnih kolonij.
• PCR s hitrim pomnoževanjem koncev cDNA Hitro pomnoževanje koncev cDNA, RACE-PCR )
• PCR dolgih fragmentov PCR dolgega dosega) - modifikacija PCR za pomnoževanje razširjenih segmentov DNA (10 tisoč baz ali več). Uporabljata se dve polimerazi, od katerih je ena polimeraza Taq z visoko procesnostjo (to je sposobna sintetizirati dolgo verigo DNA v enem prehodu), druga pa je polimeraza DNA s 3'-5' endonukleazno aktivnostjo. Druga polimeraza je potrebna za popravljanje napak, ki jih je povzročila prva.
• RAPD-PCR Naključno pomnoževanje polimorfne DNA PCR , PCR z naključnim pomnoževanjem polimorfne DNA - se uporablja, kadar je treba razlikovati med organizmi, ki so blizu v genetskem zaporedju, na primer različne sorte gojenih rastlin, pasme psov ali tesno sorodni mikroorganizmi. Ta metoda običajno uporablja en sam majhen primer (20-25 bp). Ta primer bo delno komplementaren naključnim regijam DNK preučevanih organizmov. Z izbiro pogojev (dolžina primerja, sestava primerja, temperatura itd.) je možno doseči zadovoljivo razliko v vzorcu PCR za dva organizma.

Če je nukleotidno zaporedje predloge delno znano ali sploh ni znano, lahko uporabite degenerirani primerji, katerega zaporedje vsebuje degenerirane položaje, ki lahko vsebujejo poljubne baze. Primerno zaporedje je lahko na primer: ...ATH... kjer je H A, T ali C.

Uporaba PCR

PCR se uporablja na številnih področjih za analizo in v znanstvenih poskusih.

Kriminalistika

PCR se uporablja za primerjavo tako imenovanih "genetskih prstnih odtisov". Potreben je vzorec genetskega materiala s kraja zločina - krvi, sline, semena, las itd. Primerja se z genetskim materialom osumljenca. Dovolj je zelo majhna količina DNK, teoretično - ena kopija. DNK se razreže na fragmente, nato pa se pomnoži s PCR. Fragmente ločimo z elektroforezo DNA. Nastala slika razporeditve trakov DNK se imenuje genetski prstni odtis(Angleščina) genetski prstni odtis).

Ugotavljanje očetovstva

riž. 3: Rezultati elektroforeze fragmentov DNA, pomnoženih s PCR. (1) Oče. (2) Otrok. (3) Mati. Otrok je podedoval nekatere značilnosti genetskega odtisa obeh staršev, kar je dalo nov, edinstven odtis.

Čeprav so »genetski prstni odtisi« unikatni (razen v primeru enojajčnih dvojčkov), je družinske vezi vseeno mogoče vzpostaviti z izdelavo več takih prstnih odtisov (slika 3). Enako metodo lahko z majhnimi spremembami uporabimo za ugotavljanje evolucijskih odnosov med organizmi.

Medicinska diagnostika

PCR omogoča bistveno pospešitev in olajšanje diagnosticiranja dednih in virusnih bolezni. Želeni gen se pomnoži s PCR z uporabo ustreznih primerjev in nato sekvencira za določitev mutacij. Virusne okužbe lahko odkrijemo takoj po okužbi, tedne ali mesece preden se pojavijo simptomi bolezni.

Personalizirana medicina

Znano je, da večina zdravil ne deluje pri vseh bolnikih, ki so jim namenjena, ampak le pri 30-70% njihovega števila. Poleg tega so številna zdravila za nekatere bolnike toksična ali alergena. Vzroki za to so deloma v individualnih razlikah v občutljivosti in presnovi zdravil in njihovih derivatov. Te razlike so določene na genetski ravni. Na primer, pri enem bolniku je lahko določen citokrom (jetrni protein, odgovoren za presnovo tujih snovi) bolj aktiven, pri drugem pa manj. Da bi ugotovili, kakšen citokrom ima določen bolnik, se pred uporabo zdravila predlaga analiza PCR. Ta analiza se imenuje predhodna genotipizacija. prospektivno genotipizacijo).

Kloniranje genov

Kloniranje genov (ne zamenjujte s kloniranjem organizmov) je postopek izolacije genov in kot rezultat manipulacije genskega inženiringa pridobivanje velike količine produkta določenega gena. PCR se uporablja za pomnoževanje gena, ki se nato vstavi v vektor- fragment DNA, ki prenaša tuj gen v isti ali drug organizem, primeren za gojenje. Kot vektorji se uporabljajo na primer plazmidi ali virusna DNA. Z vstavitvijo genov v tuj organizem se običajno pridobi produkt tega gena – RNK ali najpogosteje protein. Na ta način se pridobi veliko beljakovin v industrijskih količinah za uporabo v kmetijstvu, medicini itd.

riž. štiri: Kloniranje gena s plazmidom. .
(1) Kromosomska DNA organizma A. (2) PCR. (3) Več kopij gena organizma A. (4) Vstavitev gena v plazmid. (5) Plazmid z genom organizma A. (6) Vnos plazmida v organizem B. (7) Pomnožitev števila kopij gena organizma A v organizmu B.

Sekvenciranje DNK

Pri metodi sekvenciranja s fluorescentno ali radioaktivno označenimi dideoksinukleotidi je sestavni del PCR, saj se med polimerizacijo v verigo DNA vstavijo fluorescentno ali radioaktivno označeni nukleotidni derivati. To ustavi reakcijo in omogoča določitev položajev specifičnih nukleotidov po ločitvi sintetiziranih verig v gelu.

Mutageneza

Trenutno je PCR postala glavna metoda mutageneze. Uporaba PCR je omogočila poenostavitev in pospešitev postopka mutageneze ter njeno zanesljivost in ponovljivost.

Bakterijska genetika. Informacije za drugo lekcijo.

verižna reakcija polimeraze

Verižna reakcija s polimerazo je metoda, ki omogoča večkratno povečanje (pomnoževanje) števila določenih molekul DNK v analiziranem vzorcu (vključno z biološkim materialom ali čisto kulturo).

Glavne prednosti PCR kot diagnostične metode v mikrobiologiji so zelo visoka občutljivost, ki omogoča detekcijo izjemno nizkih koncentracij patogenov v vzorcih, ter nastavljiva specifičnost, ki omogoča odkrivanje oziroma identifikacijo patogenov na generičnih, vrstnih , ali raven podvrste. Glavna pomanjkljivost PCR izhaja iz njegove izjemno visoke občutljivosti - slike zelo enostavno kontaminirajo DNK iz pozitivne kontrole, drugega vzorca ali produkta PCR, kar povzroči lažno pozitivno reakcijo. To nalaga stroge omejitve glede pogojev, pod katerimi se PCR meša in obdeluje s končnimi izdelki PCR.

Izvajanje PCR. Pripravimo reakcijsko zmes, ki vsebuje naslednje sestavine:

izoliran DNK iz testnega vzorca,

puferska raztopina,

ioni Mg2+ (potrebni za delovanje encima),

Dva primerja sta enoverižni kratki molekuli DNA (najpogosteje dolgi od 18 do 24 nukleotidov), ki sta komplementarni koncem različnih verig zaporedja DNA, ki ga je treba zaznati.

Mešanica deoksinukleotid trifosfatov.

Toplotno odporna DNA polimeraza (najpogosteje uporabljena je Taq polimeraza, polimeraza, izolirana iz Termus aquaticus).

Nato se ta reakcijska zmes postavi v ciklometer, ki je pravzaprav programabilni termostat. V ciklerju se izvede 30-40 ciklov temperaturnih sprememb. Vsak od teh ciklov je sestavljen iz treh stopenj (glej sliko 1):

Denaturacija (temperatura 94 ° C) - vodikove verige se zlomijo in verige DNK se razhajajo.

Žarjenje primerjev (temperatura je običajno v območju 50-60 ° C) - primerji so pritrjeni na konce verig DNK. V splošnem velja, da je pri znižani temperaturi energijsko ugodneje ponovno združiti originalne verige DNA iz proučevanega vzorca (renaturacija), vendar je koncentracija primerjev v reakcijski mešanici za veliko velikostnih redov višja od koncentracije DNA. iz vzorca (vsaj v začetnih ciklih PCR), zato reakcija žarjenja primerja poteka hitreje kot renaturacija. Temperatura žarjenja je izbrana glede na temperaturo taljenja (denaturacije) primerjev.

Raztezek (temperatura je običajno 72 ° C) - DNA polimeraza dokonča primerje vzdolž predloge dolgih verig DNA. Temperatura ustreza optimalni delovni temperaturi za uporabljeno DNA polimerazo.

Zaznavanje rezultatov se razlikuje glede na različne formulacije PCR in je opisano v razdelku »Različice PCR«.

Dinamika PCR

V zgodnjih ciklih PCR se število dvoverižnih molekul DNK, katerih velikost je določena z razdaljo med začetnimi mesti, z vsakim ciklom podvoji. Nastane tudi manjše število daljših molekul DNK, ki pa jih lahko zanemarimo (glej sliko 2).

Tako je v zgodnjih ciklih količina produkta PCR opisana s formulo m*2 n , kjer je m začetna količina želene DNA v vzorcu, n pa število ciklov. Nato reakcija doseže plato. To je posledica kopičenja reakcijskega produkta, zmanjšanja koncentracije primerjev in deoksinukleotid trifosfatov ter tudi zaradi povečanja koncentracije pirofosfata (glej sliko 3).

Sorte PCR

Konvencionalni PCR

Pri tej različici nastavitve PCR reakcija poteka vnaprej izbrano število ciklov (30-40), nato pa se analizira, ali je prišlo do kopičenja dvoverižnih molekul DNA v reakcijski mešanici.

Ta različica PCR, če se uporablja kot diagnostična metoda, je kvalitativna metoda. Pozitivna reakcija pomeni prisotnost vsaj sledov želenih molekul DNK v vzorcu. Negativna reakcija kaže na njihovo odsotnost. Kvantitativna ocena vsebnosti začetnih molekul DNA v vzorcu je nemogoča, ker reakcija doseže plato.

Glavna metoda za ugotavljanje prisotnosti produkta je elektroforeza v agaroznem ali poliakrilamidnem gelu. Produkte PCR ločimo v gelu pod delovanjem električnega polja glede na njihovo molekulsko maso. V gel je dodano interkalacijsko barvilo (fluorescentno v stanju, ki je povezano z dvoverižno DNA - najpogosteje etidijev bromid). Tako bo ob izpostavitvi ultravijolični svetlobi mogoče videti prisotnost ali odsotnost traku, ki ustreza DNK zahtevane molekulske mase. Pri izvajanju PCR za diagnostične namene se vedno postavijo kontrole pozitivne in negativne reakcije, s katerimi se primerjajo vzorci (glej sliko 4).

PCR v realnem času

V tej različici nastavitve PCR se količina produkta PCR v reakcijski mešanici med potekom reakcije nenehno beleži. To vam omogoča, da sestavite reakcijsko krivuljo (glej sliko 3) in na podlagi nje izračunate število želenih molekul DNK v vzorcih.

Ena vrsta PCR v realnem času uporablja interkalacijsko barvilo, ki se doda neposredno v reakcijsko mešanico (najpogosteje se uporablja SYBRGreen). Druga vrsta je uporaba ene od vrst fluorescentnih sond, ki se vežejo na mesto znotraj produkta PCR, kar omogoča povečanje specifičnosti detekcije (glej sliko 5).Fluorescenčna detekcija poteka neposredno v napravi med reakcijo.

Poleg možnosti kvantitativne detekcije obstajajo še druge prednosti PCR v realnem času v primerjavi s konvencionalno PCR. Ta PCR varianta je preprostejša, hitrejša in ne zahteva odpiranja epruvet s PCR produkti, kar zmanjša možnost kontaminacije drugih vzorcev. Glavna pomanjkljivost je višja cena ojačevalnika z vgrajeno zmožnostjo zaznavanja fluorescence v primerjavi z običajnim.

Digitalni kvantitativni PCR

Nova, draga in še premalo razširjena različica PCR, ki omogoča natančnejše določanje količine DNK v vzorcu, pri kateri se reakcijska zmes, ki vsebuje fluorescentno barvilo, razdeli na ogromno število mikroskopskih volumnov (npr. , kapljice v emulziji). Po PCR se analizira, v katerem deležu kapljic se je reakcija izkazala za pozitivno in v skladu s tem opazimo fluorescenco. Ta delež bo sorazmeren s številom zanimivih molekul DNK v vzorcu.

PCR z reverzno transkripcijo

V tem primeru se pred eno ali drugo različico PCR izvede reakcija reverzne transkripcije (RNA v DNA) z uporabo reverznega encima. Tako ta metoda omogoča kvalitativno ali kvantitativno detekcijo molekul RNA. To se lahko uporablja za odkrivanje virusov, ki vsebujejo RNA, ali določanje stopnje transkripcije (količine mRNA) določenega gena.

Slika 1. koraki PCR. Primeri so označeni z rdečo barvo.

Slika 2. Kopičenje s primerjem omejenih dvoverižnih molekul DNA med PCR.

Slika 3 Dinamika reakcije PCR pri različnih začetnih koncentracijah želenih molekul DNA v vzorcu. (a) - najvišja koncentracija (b) - vmesna koncentracija (c) - najnižja koncentracija

Slika 4 Agarozna elektroforeza produktov PCR. K+ - pozitivna kontrola (očitno je prisotna potrebna DNK). 1-7 - testni vzorci (od tega 1-2 pozitivni, 3-7 negativni). K- -negativna kontrola (definitivno manjka želena DNK). V mnogih primerih so poleg ciljnega produkta vidni svetlejši produkti nespecifične reakcije (primer-dimeri).

Slika 5 Metode odkrivanja s PCR v realnem času. (a) - interkalacijsko barvilo - fluorescira ob vezavi na dvoverižno DNA (b) - Taqmanova sonda - do fluorescence pride, ko sondo odcepi DNA polimeraza s 5'-3' endonukleazno aktivnostjo zaradi ločitve fluoroforja in dušilca. (c) Sonda MolecularBeacon - do fluorescence pride, ko se sonda hibridizira s ciljnim fragmentom zaradi prostorske ločitve fluoroforja in dušilca ​​(d) - Sonde LightCycler - do akceptorske fluorescence pride, ko sonde (ki vsebujejo akceptor in donor) hibridizirajo s tarčo fragment zaradi resonančnega fluorescenčnega prenosa energije (FRET).

1. Verižna reakcija s polimerazo (PCR)

2. Princip metode verižne reakcije s polimerazo

2.1 Prisotnost številnih komponent v reakcijski mešanici

2.2 Kroženje temperature

2.3 Osnovna načela izbire primerja

2.4 Učinek platoja

3. Faze nastavitve PCR

3.2 Ojačitev

3.4.1 Pozitivne kontrole

3.4.2 Notranji nadzor

4.1 Kvalitativna analiza

4.1.2 Detekcija molekul RNA

3.1 Priprava vzorcev biološkega materiala

Za ekstrakcijo DNK se uporabljajo različne tehnike, odvisno od nalog. Njihovo bistvo je v ekstrakciji (ekstrakciji) DNA iz biološkega proizvoda in odstranitvi ali nevtralizaciji tujih nečistoč, da dobimo pripravek DNA s čistostjo, primerno za PCR.

Metoda pridobivanja pripravka čiste DNK, ki jo je opisal Marmur, velja za standardno in je že postala klasična. Vključuje encimsko proteolizo, ki ji sledi deproteinizacija in ponovno obarjanje DNA z alkoholom. Ta metoda omogoča pridobivanje čistega preparata DNK. Vendar pa je precej naporno in vključuje delo s tako agresivnimi in ostrimi snovmi, kot sta fenol in kloroform.

Ena od trenutno priljubljenih metod je metoda ekstrakcije DNK, ki so jo predlagali Boom et al. Ta metoda temelji na uporabi močnega kaotropnega sredstva, gvanidin tiocianata (GuSCN), za celično lizo in kasnejšo sorpcijo DNA na nosilcu (steklene kroglice, diatomejska zemlja, stekleno mleko itd.). Po izpiranju DNK ostane v vzorcu, adsorbirana na nosilcu, iz katerega jo je mogoče enostavno odstraniti z uporabo elucijskega pufra. Metoda je priročna, tehnološko napredna in primerna za pripravo vzorcev za pomnoževanje. Možne pa so izgube DNK zaradi ireverzibilne sorpcije na nosilcu, pa tudi med številnimi izpiranji. To je še posebej pomembno pri delu z majhnimi količinami DNK v vzorcu. Poleg tega lahko celo količine GuSCN v sledovih zavirajo PCR. Zato je pri uporabi te metode zelo pomembna pravilna izbira sorbenta in natančno upoštevanje tehnoloških odtenkov.

Druga skupina metod priprave vzorcev temelji na uporabi ionskih izmenjevalcev tipa Chilex, ki za razliko od stekla ne adsorbirajo DNK, temveč nasprotno nečistoče, ki motijo ​​reakcijo. Ta tehnologija praviloma vključuje dve stopnji: vretje vzorca in adsorpcijo nečistoč na ionskem izmenjevalniku. Metoda je izjemno privlačna zaradi svoje preprostosti izvedbe. V večini primerov je primeren za delo s kliničnim materialom. Na žalost včasih obstajajo vzorci z nečistočami, ki jih ni mogoče odstraniti z ionskimi izmenjevalci. Poleg tega nekaterih mikroorganizmov ni mogoče uničiti s preprostim prekuhavanjem. V teh primerih je potrebno uvesti dodatne stopnje obdelave vzorcev.

Zato je treba izbiro metode priprave vzorca obravnavati z razumevanjem namenov predvidenih analiz.

3.2 Ojačitev

Za izvedbo reakcije pomnoževanja je potrebno pripraviti reakcijsko zmes in ji dodati analizirani vzorec DNK. V tem primeru je pomembno upoštevati nekatere značilnosti žarjenja temeljnega premaza. Dejstvo je, da so v analiziranem biološkem vzorcu praviloma različne molekule DNA, s katerimi imajo primerji, uporabljeni v reakciji, delno in v nekaterih primerih pomembno homologijo. Poleg tega se lahko primerji med seboj žarijo in tvorijo primerje-dimerje. Oboje vodi do znatne porabe primerjev za sintezo stranskih (nespecifičnih) produktov reakcije in posledično bistveno zmanjša občutljivost sistema. To otežuje ali onemogoča branje rezultatov reakcije med elektroforezo.

3.3 Vrednotenje reakcijskih rezultatov

Da bi pravilno ocenili rezultate PCR, je pomembno razumeti, da ta metoda ni kvantitativna. Teoretično lahko produkte pomnoževanja posameznih tarčnih molekul DNK z elektroforezo zaznamo že po 30-35 ciklih. Vendar se v praksi to izvaja le v primerih, ko reakcija poteka v pogojih, ki so blizu idealnim, kar se v življenju ne srečuje pogosto. Posebno velik vpliv na učinkovitost pomnoževanja ima stopnja čistosti pripravka DNA; prisotnost določenih inhibitorjev v reakcijski mešanici, ki se jih je v nekaterih primerih lahko zelo težko znebiti. Včasih zaradi njihove prisotnosti ni mogoče pomnožiti niti več deset tisoč ciljnih molekul DNK. Tako pogosto ni neposredne povezave med začetno količino ciljne DNA in končno količino produktov pomnoževanja.

3.3.1 Metoda vodoravne elektroforeze

Za vizualizacijo rezultatov ojačanja se uporabljajo različne metode. Danes je najbolj razširjena metoda elektroforeze, ki temelji na ločevanju molekul DNA po velikosti. Za to pripravimo ploščo agaroznega gela, ki jo po taljenju agarozo zamrznemo v elektroforetskem pufru v koncentraciji 1,5-2,5% z dodatkom posebnega barvila DNA, na primer etidijevega bromida. Zamrznjena agaroza tvori prostorsko mrežo. Pri vlivanju s pomočjo glavnikov se v gelu oblikujejo posebne jamice, v katere se naknadno dodajajo produkti za ojačanje. Plošča z gelom se postavi v vodoravni aparat za elektroforezo z gelom in priključi se vir konstantne napetosti. Negativno nabita DNK se začne v gelu premikati iz minusa v plus. Hkrati se krajše molekule DNK premikajo hitreje od dolgih. Na hitrost gibanja DNA v gelu vplivajo koncentracija agaroze, električna poljska jakost, temperatura, sestava pufra za elektroforezo in v manjši meri GC sestava DNA. Vse molekule enake velikosti se gibljejo z enako hitrostjo. Barvilo je vdelano (interkalirano) v ravninskih skupinah v molekule DNA. Po končani elektroforezi, ki traja od 10 minut do 1 ure, se gel namesti na filter transiluminatorja, ki oddaja svetlobo v ultravijoličnem območju (254 - 310 nm). UV-energija, ki jo absorbira DNK pri 260 nm, se prenese na barvilo, zaradi česar le-to fluorescira v oranžno-rdečem območju vidnega spektra (590 nm).

Svetlost pasov ojačitvenih izdelkov je lahko različna. Vendar tega ni mogoče povezati z začetno količino ciljne DNK v vzorcu.

3.3.2 Metoda vertikalne elektroforeze

Metoda vertikalne elektroforeze je v osnovi podobna horizontalni elektroforezi. Njihova razlika je v tem, da se v tem primeru namesto agaroze uporabljajo poliakrilamidni geli. Izvaja se v posebni komori za vertikalno elektroforezo. Elektroforeza s poliakrilamidnim gelom ima višjo ločljivost kot elektroforeza z agarozo in omogoča razlikovanje molekul DNK različnih velikosti z natančnostjo enega nukleotida. Priprava poliakrilamidnega gela je nekoliko bolj zapletena kot priprava agaroznega. Poleg tega je akrilamid strupena snov. Ker se redko pojavi potreba po določitvi velikosti produkta pomnoževanja z natančnostjo 1 nukleotida, se pri rutinskem delu uporablja metoda horizontalne elektroforeze.

3.4 Spremljanje poteka reakcije pomnoževanja

3.4.1 Pozitivne kontrole

Kot "pozitivno kontrolo" uporabite pripravek DNK želenega mikroorganizma. Nespecifični amplikoni se po velikosti razlikujejo od amplikonov, ki nastanejo s pomnoževanjem s kontrolnim pripravkom DNA. Velikost nespecifičnih izdelkov je lahko večja ali manjša od pozitivne kontrole. V najslabšem primeru lahko te dimenzije sovpadajo in se v elektroforezi odčitajo kot pozitivne.

Za nadzor specifičnosti nastalega pomnoževalnega produkta je mogoče uporabiti hibridizacijske sonde (regije DNA, ki se nahajajo znotraj zaporedja, ki ga je mogoče pomnožiti), označene z encimskimi oznakami ali radioaktivnimi izotopi in medsebojno delujejo z DNA v skladu z enakimi načeli kot primerji. To močno oteži in podaljša analizo, njena cena pa se znatno poveča.

3.4.2 Notranji nadzor

Potrebno je nadzorovati potek pomnoževanja v vsaki epruveti z reakcijsko mešanico. V ta namen se uporablja dodatna, tako imenovana »notranja kontrola«. Je vsak pripravek DNK, ki ni podoben DNK želenega mikroorganizma. Če reakcijski zmesi dodamo notranjo kontrolo, bo postala enaka tarča za žarjenje primerja kot kromosomska DNK želenega povzročitelja okužbe. Velikost produkta pomnoževanja notranje kontrole je izbrana tako, da je 2 ali večkrat večja od pomnožev, ki nastanejo pri pomnoževanju ciljne DNA mikroorganizma. Posledično, če v reakcijsko mešanico skupaj s testnim vzorcem vnesemo notranjo kontrolno DNK, bo notranja kontrola ne glede na prisotnost mikroorganizma v biološkem vzorcu povzročila nastanek specifičnih amplikonov, vendar veliko dlje (težjih) kot pomnožek mikroorganizma. Prisotnost težkih amplikonov v reakcijski zmesi bo kazala na normalen potek reakcije pomnoževanja in odsotnost inhibitorjev. Če niso nastali pomnožki zahtevane velikosti, niso pa nastali tudi pomnožki notranje kontrole, lahko sklepamo, da analizirani vzorec vsebuje nezaželene primesi, ki jih je treba odstraniti, ne pa tudi odsotnost želene DNA.

Na žalost ima kljub vsej privlačnosti tega pristopa pomembno pomanjkljivost. Če je zahtevana DNA prisotna v reakcijski mešanici, se učinkovitost njenega pomnoževanja močno zmanjša zaradi konkurence z notranjim nadzorom za primerje. To je še posebej pomembno pri nizkih koncentracijah DNK v testnem vzorcu, kar lahko povzroči lažno negativne rezultate.

Kljub temu pa bo ta način nadzora učinkovitosti pomnoževanja zagotovo zelo koristen, če bo problem konkurence za primerje rešen.

4. Metode, ki temeljijo na verižni reakciji s polimerazo

4.1 Kvalitativna analiza

Klasična metoda vzpostavitve PCR, katere načela so bila opisana zgoraj, je bila razvita v nekaterih modifikacijah, katerih cilj je preseči omejitve PCR in povečati učinkovitost reakcije.

4.1.1 Kako nastaviti PCR z uporabo "vročega zagona"

Za zmanjšanje tveganja nastanka nespecifičnih produktov reakcije pomnoževanja se uporablja pristop, imenovan “hot-start”, katerega bistvo je preprečiti možnost začetka reakcije, dokler v epruveti niso doseženi pogoji, ki zagotavljajo specifično žarjenje. primerji.

Dejstvo je, da imajo primerji glede na sestavo in velikost HC določeno temperaturo tališča (Tm). Če temperatura sistema preseže Tm, se primer ne more oprijeti verige DNK in denaturira. V optimalnih pogojih, tj. temperatura žarjenja blizu tališča, tvori primer dvoverižno molekulo le, če je popolnoma komplementarna in tako zagotavlja specifičnost reakcije.

Obstajajo različne možnosti za izvedbo "vročega zagona":

Vnos polimeraze Taq v reakcijsko mešanico med prvim ciklom po segrevanju epruvete na temperaturo denaturacije.

Ločevanje sestavin reakcijske mešanice s parafinsko plastjo v plasti (primerji v spodnjem delu, Taq polimeraza in tarčna DNA v zgornjem delu), ki se premešajo, ko se parafin stopi (~65-75 0 С).

Uporaba monoklonskih protiteles proti polimerazi Taq. Encim, ki ga vežejo monoklonska protitelesa, postane aktiven šele po prvi fazi denaturacije, ko monoklonska protitelesa nepovratno denaturirajo in sprostijo aktivna mesta Taq polimeraze.

V vseh teh primerih, tudi če je do nespecifičnega žarjenja prišlo pred začetkom toplotnega cikla, do raztezanja ne pride in kompleksi primer-DNA so denaturirani pri segrevanju, tako da ne nastanejo nespecifični produkti. Nato temperatura v cevi ne pade pod tališče, kar zagotavlja tvorbo specifičnega pomnoževalnega produkta.

4.1.2 Detekcija molekul RNA

Možnost uporabe RNA kot tarče za PCR bistveno razširi obseg uporabe te metode. Na primer, genomi številnih virusov (hepatitis C, virus gripe, pikornavirusi itd.) so predstavljeni z RNA. Hkrati pa v njihovih življenjskih ciklih ni vmesne faze transformacije v DNK. Za odkrivanje RNK jo je treba najprej pretvoriti v obliko DNK. Za to se uporablja reverzna transkriptaza, ki je izolirana iz dveh različnih virusov: virusa aviarne mieloblastoze in virusa mišje levkemije Moloney. Uporaba teh encimov je povezana z nekaterimi težavami. Prvič, so termolabilni in se zato lahko uporabljajo pri temperaturi, ki ne presega 42 ° C. Ker pri tej temperaturi molekule RNA zlahka tvorijo sekundarne strukture, se učinkovitost reakcije izrazito zmanjša in je po različnih ocenah približno 5%. Tej pomanjkljivosti se skušajo izogniti z uporabo termostabilne polimeraze, pridobljene iz termofilnega mikroorganizma Thermus Thermophilus, ki izkazuje transkriptazno aktivnost v prisotnosti Mn 2+ kot reverzno transkriptazo. Je edini znani encim, ki lahko kaže tako polimerazno kot transkriptazno aktivnost.

Za izvedbo reakcije reverzne transkripcije mora reakcijska mešanica, tako kot PCR, vsebovati primerje kot seme in mešanico 4 dNTP kot gradbeni material.

Po reakciji reverzne transkripcije lahko nastale molekule cDNA služijo kot tarča za PCR.

5. Organizacija tehnološkega procesa nastavitve PCR

Zaradi potencialno visoke občutljivosti verižne reakcije s polimerazo je nujno treba posebej skrbno načrtovati laboratorij za PCR. To je posledica najbolj perečega problema metode - kontaminacije.

Kontaminacija - vstop iz zunanjega okolja v reakcijsko mešanico specifičnih molekul DNA, ki lahko služijo kot tarče v reakciji pomnoževanja in dajejo lažno pozitivne rezultate.

S tem neprijetnim pojavom se lahko spopadete na več načinov. Eden od njih je uporaba encima N-uracil glikozilaze (UG). Ta metoda temelji na sposobnosti UG, da cepi molekule DNA z vgrajenim uracilom. Reakcija pomnoževanja se izvede z mešanico dNTP, v kateri je dTTP nadomeščen z uracilom, po termičnem ciklu pa bodo vsi pomnožki, ki nastanejo v epruveti, vsebovali uracil. Če reakcijski zmesi pred pomnoževanjem dodamo HC, se pomnoži, ki vstopijo v reakcijsko zmes, uničijo, medtem ko bo nativna DNA ostala nedotaknjena in bo kasneje služila kot tarča za pomnoževanje.

Tako ta metoda samo do neke mere odpravi vir kontaminacije in ne jamči pred lažno pozitivnimi rezultati.

Drugi način ravnanja s posledicami kontaminacije je znatno zmanjšanje števila reakcijskih ciklov (do 25-30 ciklov). Toda tudi pri tem pristopu je tveganje za pridobitev lažno pozitivnih rezultatov veliko, saj je v tem primeru v odsotnosti inhibitorjev zaradi kontaminacije enostavno dobiti produkt pomnoževanja.

Tako je kljub prednostim ukrepov pred pomnoževanjem, namenjenih inaktivaciji molekul DNK, ki povzročajo lažno pozitivne rezultate, najbolj radikalno zdravilo dobro premišljena organizacija laboratorija.

Zaključek

Metoda PCR je trenutno najbolj razširjena metoda za diagnosticiranje različnih nalezljivih bolezni. PCR vam omogoča, da ugotovite etiologijo okužbe, tudi če vzorec, odvzet za analizo, vsebuje le nekaj molekul DNA patogena. PCR se pogosto uporablja pri zgodnji diagnostiki okužb s HIV, virusnega hepatitisa itd. Do danes skoraj ni povzročitelja okužbe, ki ga ne bi bilo mogoče odkriti s PCR.