Обща схема на бактериологична диагностика. Етапи на бактериологичния метод на изследване
20. Характеристики на бактериологичния метод на изследване
Културен (бактериологичен) метод на изследване - набор от методи, насочени към изолиране и идентифициране на чисти култури от микроорганизми (бактерии) чрез култивиране върху хранителни среди.
Чистата култура е съвкупност от микроорганизми от един и същи вид. Най-често чиста култура се получава чрез селекция и култивиране на изолирана колония (потомството на единична микробна клетка).
Стъпки на метода:
1. Събиране на материал за изследване.
2. Изолиране на чиста култура и нейната идентификация.
3. Заключение.
Събиране на материал за изследване.Видът на изследвания материал зависи от целта на изследването (диагноза - от пациента; епидемиологичен анализ - от околната среда, храната, пациента и (или) бактериологичния носител).
Изолиране на чиста култура. Включва 3 или 4 етапа:
1. Засяване на материала (след предварителна микроскопия) върху чаша с плътна хранителна среда (за предпочитане диференциално диагностична или селективна), за да се получат изолирани колонии. Произвежда се най-често по метода на механичното разделяне. В някои случаи (например кръв), материалът се посява предварително в течна среда за обогатяване, последвано от субкултивиране върху плака с агарна среда. Понякога се извършва селективна обработка на материала преди инокулацията (като се вземат предвид свойствата на изолирания микроорганизъм; например обработка с киселина или основа за изолиране на резистентни бактерии). Култивира се при температура 37°C за 18-24 часа. Времето за култивиране на различните видове бактерии може да варира.
2(3): а) изследване на колонии върху агарово блюдо (културни признаци), селекция на най-типичните; б) изготвяне на намазки от тези колонии с оцветяване (по Грам или други методи); а) пресяване на останалата част от изследваната колония върху средата за натрупване и отглеждане в термостат при оптимална температура.
3(4). Изследване на чистотата на културата, получена върху средата за натрупване. С тази
целта е да се подготви цитонамазка, оцветяване (обикновено по Грам), микроскопско изследване
морфологична и тинкториална хомогенност (в различни зрителни полета).
4(5). Идентификация на чиста култура.
Заключение.Според съвкупността от характеристики в сравнение със свойствата на референтните (типични) щамове се посочва видът на микроорганизма, изолиран от материала.
Оценка на метода:
предимства:относително висока чувствителност и точност, възможност за определяне на броя на микробите в тестовия материал, както и чувствителност към антибиотици; ограничения:относителна продължителност, методът е скъп.
21. Хранителни среди за аероби и анаероби. Изисквания към хранителните среди, класификация.
Изисквания:
медиите трябва да са питателни
трябва да има определено ph
трябва да е изотоничен, т.е. осмотичното налягане в средата трябва да бъде същото като в клетката.
трябва да е влажна и не прекалено течна
трябва да има определен редокс потенциал
трябва да е стерилен
трябва да бъдат унифицирани, т.е. съдържат постоянни количества от отделни съставки.
Хранителните среди могат да бъдат разделени:
А) Произход
1) естествена - естествена храна (месо, мляко, картофи);
2) изкуствени - специално подготвени за отглеждане на микроби: - среди от естествени продукти (месна вода, месо-пептонен бульон (MBB), месо-пептонен агар (MPA), - без постоянен състав; - синтетични хранителни среди - разтвори на строго определени количества соли, аминокиселини, азотни основи, витамини в дестилирана вода - имат постоянен състав, използват се за отглеждане на микроорганизми и клетъчни култури при производството на ваксини, имунни серуми и антибиотици;
Б) С предварително записване:
1) общо предназначение (MPB, MPA) - върху тях растат повечето микроби;
2) избираеми - селективно насърчаване на растежа на един вид микроби от смес (например жълтъчно-солев агар за стафилококи);
3) диференциална диагностика - позволяват един вид микроби да бъдат диференцирани по външния вид на околната среда от други (например Endo, Levin media за чревната група микроби).
Освен това в зависимост от цели на използванеВ схемата за изолиране на чисти култури по предназначение могат да се разграничат следните среди:
1) обогатяване - инхибират растежа на микроби, свързани с патогена;
2) да се получат изолирани колонии;
3) натрупване на чиста култура;
B) Консистенция:
1) течност;
2) полутечен (с добавяне на агар-агар в концентрация 0,5-0,7%);
3) плътен - над 1%.
Същността на бактериоскопския метод: откриване на микроби в изследвания материал; изследване на техните морфологични и тинкториални свойства, естеството на местоположението в бактериологичната намазка в зрителното поле.
Техника на изпълнение. Материалът от пациента се изследва визуално, избира се част, в която с най-голяма степен на вероятност може да се открие причинителят на заболяването (бучки слуз, гнойни тапи). Прилага се върху предметно стъкло (понякога материалът се емулгира предварително във физиологичен разтвор, по-рядко се центрофугира). Капката се разстила върху стъклото, изсушава се и се фиксира. След това цитонамазката се оцветява и препаратът се разглежда под микроскоп. Намазката обикновено е оцветена по Грам. Понякога, като най-щадящ, се използва един от простите методи за оцветяване, след което препаратът се боядисва с едно багрило (например при диагностициране на менингококова инфекция, холера).
При необходимост се използват специални усъвършенствани методи за оцветяване, като метода на Burri-Gins за откриване на капсулни организми или метода на Ziehl-Neelsen за откриване на киселинноустойчиви бактерии. В някои случаи (по-специално при изследване на двигателната активност на микроорганизмите) се приготвят препарати „висящи капки“ и „натрошени капки“ и се микроскопират неоцветени бактерии.
Предимства на бактериоскопския метод:лекота на изпълнение, възможност за бързо получаване на резултати, техническа и икономическа достъпност.
Недостатъци на метода:за да се определи вида на микроорганизмите, често е недостатъчно да се определят неговите морфологични свойства, тъй като те са идентични при представители на сродни видове. В допълнение, бактериите с характерна морфология често претърпяват промени, особено под действието на антибиотици, и стават неразпознаваеми; накрая, концентрацията на патогени в тестовия материал може да бъде изключително ниска и тогава е трудно да се открият.
Предвид гореизложеното, бактериоскопският метод рядко се използва като единствен и краен начин за установяване на етиологията на заболяването. По-често се използва като показателен, предварителен, а при диагностицирането на някои инфекциозни заболявания изобщо не се предоставя.
Как да разберем ориентация и предварително? Това се отнася както за клинициста, така и за бактериолога. Клиницистът, който получава предварителен отговор (положителен или отрицателен), в по-голяма или по-малка степен използва получената информация в по-нататъшните си изследвания, докато се получи окончателният резултат от бактериологичния диагностичен метод. Бактериологът, след като получи индикативна информация за предполагаемия патоген, неговата концентрация в използвания материал, наличието на съпътстваща микрофлора, определя методите за обработка на материала и изолиране на чистата култура на патогена, избира хранителни среди за последващо култивиране.
Бактериологичен метод
Същността на метода е изолирането на чиста култура на микроба - патоген от патологичен материал, подробно изследване на неговите морфологични, тинкториални, културни, биохимични, серологични свойства с цел последваща идентификация на патогена. При прилагането на бактериологичния метод на изследване се разграничават 4 етапа.
А. Като се вземат предвид данните, получени по време на бактериоскопско изследване, се избират най-ефективните хранителни среди, върху които с най-голяма степен на вероятност ще бъде възможно да се получи растеж на култура от предполагаеми микроби - патогени.
Б. Материалът за изследване се засява върху редица хранителни среди: течни и твърди, универсални, елективно-селективни, диференциално диагностични. В същото време сеитбата върху петриеви панички с плътна хранителна среда се извършва с бактериологичен цикъл с удар, за да се осигури възможността за получаване на растеж на микробни колонии, изолирани една от друга (можете също да използвате метода на Дригалски или друг метод за разделяне на култури от микроорганизми).
А. Изследват се културните свойства на микроорганизми, отглеждани върху хранителни среди; подозрителни колонии се избират. Трябва да се подчертае, че подборът на подозрителни колонии е най-важният и труден етап от работата. Основава се предимно на определянето на характерните черти на микробните колонии, но често това не позволява да се диференцират микробните колонии на отделните видове и е необходимо допълнително да се изследва морфологията на микробите в намазки от съмнителни колонии, характеристиките на растежа на микроорганизмите върху диференциално диагностични среди и др. Изолирането на чисти култури от бактерии и тяхното изследване може да се извърши чрез извършване на предварителна инокулация върху течна среда за натрупване, но в този случай се отделя допълнително време за изследване.
Б. Приготвя се бактериологична намазка от подозрителни колонии, оцветени по Грам и микроскопски (установява се идентичността на микроорганизмите с тези, изследвани по време на микроскопско изследване на 1-ви етап). В. От останалата част от съмнителната колония посявката се пренася в скосен месопептонен агар (може да се използват и други хранителни среди, върху които се очаква добър растеж на изолираните микроорганизми). Целта е натрупване на чиста култура от микроба – предполагаемия причинител на болестта, т.к. на следващия етап от изследването ще е необходима много микробна маса.
Предложеният патоген се изследва за захаролитични свойства (инокулация се извършва върху пъстра среда, среда Olkenitsky, Ressel и др.), Протеолитична активност (инокулация върху желатин, мляко според Тукаев, определяне на образуването на индол и сероводород по време на растеж на месопептонен бульон). Изследва се чувствителността на изолирани култури към антибиотици (по-често по метода на стандартни хартиени дискове, по-рядко по метода на серийни разреждания). Серотипирането се извършва в реакцията на аглутинация върху стъкло с групови и типични диагностични серуми; фаготипизиране със стандартни диагностични бактериофаги. В някои случаи факторите на патогенност в бактериите се изследват за идентифициране.
Резултатите от проведените изследвания са взети предвид. Въз основа на сравнение на свойствата, идентифицирани в микроорганизмите (морфологични, тинкториални, културни, биохимични, серологични и др.), Микробите се идентифицират. Окончателният отговор се дава с резултатите от бактериологично изследване, което показва вида на патогена (понякога неговия серотип, биовар, фагов тип) и неговата чувствителност към антибиотици.
Доста често, за да се получат надеждни резултати, издаването на отговор се предхожда от биологични, алергологични или други методи на изследване.
Предимства на бактериологичния диагностичен метод:висока надеждност на резултатите от изследването; възможността за получаване на допълнителни данни за чувствителността на изолирани патогени към антибиотици; възможност за провеждане на епидемиологични изследвания.
Към недостатъците на методаможе да включва продължителността на изследването (поне 4-5 дни), както и невъзможността да се използва в случаите, когато патогени (например рикетсия, хламидия) инфекции не растат върху изкуствени хранителни среди.
биологичен метод
В някои случаи за оптимизиране на диагностиката на инфекциозни заболявания се използва биологичен метод (биологичен анализ), който включва заразяване на лабораторни животни. В този случай изследователят може да има различни цели:
Възпроизвеждане на клиничната и патологоанатомичната картина на заболяването (например при диагностициране на тетанус, лептоспироза);
Изолиране за кратко време на чиста култура на патогена (при диагностициране на пневмококова инфекция);
Определяне на вирулентността и патогенността на патогена (при диагностика на туберкулоза);
Определяне на вида и вида на токсините (при диагностика на ботулизъм)
За диагностика на инфекциозни заболявания се използват различни животни. Изборът им се определя от чувствителността на вида към различни етиологични агенти. Например, мишките са податливи на пневмококова инфекция, антракс, тетанус; морски свинчета - към патогени на туберкулоза, бруцелоза, туларемия; зайци - към стафилококи, стрептококи, ботулизъм. За изследването се избират само здрави животни на определена възраст и телесно тегло.
Преди въвеждането на материала животните се фиксират. Малките животни се държат от експериментатора, а за големи животни се използват специални устройства. Мястото на инжектиране на заразения материал се третира с алкохол или йод. Инфектираният материал се прилага подкожно, кожно, венозно, интраперитонеално, интрацеребрално и др., в зависимост от особеностите на патогенезата на изследваното заболяване.
При кожен методинфекции предварително изрежете вълната, скарифицирайте кожата и след това втрийте материала в нея.
Подкожен метод:кожата на животните се улавя в гънка, за предпочитане с пинсети, иглата се вкарва наполовина, след инжектирането се нанася памучен тампон със спирт и иглата се отстранява.
Интрамускулен метод:материалът се инжектира в мускулната тъкан на горната част на задния крайник.
Интраперитонеален метод:животното се държи с главата надолу, за да не се наранят червата. Инжекцията се прави в долната част на корема, от страната на средната линия. Коремната стена се пробива с рязко движение, спринцовката е под прав ъгъл.
Интравенозен метод:мишки, плъхове се инжектират с материал - в опашната вена или интракардиално. Заекът се инжектира - във вените на ухото, които са повърхностно разположени и ясно видими (по-добре е да се пробие външната вена). Мястото на инжектиране след инжектирането се затяга с памучна вата с алкохол, така че да няма кървене. Морските свинчета с интракардиална инфекция се инжектират с игла на височината на „удара“ на сърцето в междуребрието. Ако иглата е поставена правилно, в спринцовката ще се появи кръв.
Подготовка на инструменти и материали: спринцовки, скалпели, игли се стерилизират чрез кипене. Материалът се изтегля в спринцовката (малко повече от необходимото за влизане), обръща се вертикално нагоре, покрива се иглата със стерилен памук и се изтласкват въздушните мехурчета от спринцовката с бутало. Тази манипулация се извършва върху дезинфекционен разтвор.
При диагностициране на инфекции, причинени от действието на токсин (ботулинов, антракс), материалът, вероятно съдържащ патогена и токсините, се поставя във физиологичен разтвор, след което се филтрира през хартиен филтър, натрит с талк (добре адсорбира токсина). Чувствителните животни се заразяват с филтърни тампони. В някои случаи, когато патогенезата на заболяването се дължи на патогенните свойства на самия патоген, животните се заразяват с микробна суспензия.
Заразените бели мишки се етикетират и поставят в специални стъклени буркани; залепени са с етикет, указващ датата на заразяване и вида на микроорганизма, с който е извършена работата. По същия начин се подписват клетки със заразени зайци или морски свинчета. Животните се наблюдават. В случай на смърт те веднага се отварят.
Преди дисекция на бели мишки, животните се евтаназират предварително с етерни пари. Мишките се потапят за кратко в дезинфекционен разтвор и след това се фиксират в кювета с корема нагоре с лапите. Отбелязва се наличието или отсъствието на външни патологични промени. Кожният разрез се прави надлъжно от пубиса към долната челюст и напречно към крайниците. Отбелязват се промени в кожната тъкан и състоянието на лимфните възли. От последните направете петна-отпечатъци. За да се изследва гръдната кухина, гръдната кост се отстранява чрез разрязване на ребрата от двете страни с ножица. След външен преглед парчета от сърцето се отрязват и се поставят в BCH. Посяването се извършва директно върху МРА петна-отпечатъци от сърце, бял дроб.
Коремната кухина се отваря, по време на външен преглед се отбелязва състоянието на вътрешните органи (размер, цвят, консистенция, наличие на гнойни огнища). Направете посеви на черен дроб, далак и петна.
Работата се извършва със стерилни инструменти, след всяко вземане на органа, пинсети и ножици се спускат в чаша с алкохол и се изгарят.
След аутопсията трупът и кюветата, в която е извършена аутопсията, се заливат с дезинфектант за един ден.
Културите се инкубират за 24 часа (или повече, ако е необходимо) при
t 37 около С. След това се изследват, изолира се чиста култура на патогена и се извършва идентифицирането му с помощта на бактериологичен метод.
Предимства на метода: надеждност на получените резултати, липса на необходимост от сложно оборудване.
недостатъци: висока цена, ограничена употреба, риск от инфекция.
Подобна информация.
ЦЕЛ:
1. Изследване на методи за изолиране на чисти култури от бактерии
2. Овладейте бактериологичния метод за диагностика на инфекциозни заболявания.
ТЕОРЕТИЧНА СПРАВКА
Бактериологичен методе основният метод за диагностициране на инфекциозни заболявания. Неговата същност е определянето на вида на инфекциозния агент, следователно въз основа на резултатите от бактериологичния метод може да се направи етиологична (окончателна) диагноза. Основният недостатък на метода е продължителността на изследването - от 3 до 5 дни, а в някои случаи и повече.
Успехът на бактериологичния метод до голяма степен зависи от предварителния етап, включително вземането на проби от тестовия материал и транспортирането му, както и дизайна на насочване към бактериологична лаборатория. В този случай трябва да се спазват редица правила.
1. Оградана материала за изследване трябва да се извърши преди началото на антибиотичната терапия или 8-10 часа след последната доза от антибиотика. За да се избегне замърсяване на пробата с микрофлора на околната среда, е необходимо да се спазва най-строга асептика. За да направите това, използвайте стерилен материал: а) памучни тампони за вземане на материал от раната, от лигавиците (очи, фаринкс, нос); б) телена примка за вземане на материал от вагината, ануса; в) спринцовка за вземане на кръв, гной; г) стерилни съдове за директно събиране на урина, храчки, изпражнения в него.
2. ТранспортПолученият материал трябва да бъде произведен възможно най-скоро (2-3 часа) в специални бикове или моливи.
3. Посокаприлага се към клиничната проба като придружителен документ. Той съдържа основната информация, необходима за провеждане на микробиологично изследване:
Фамилия, име, бащино име, възраст на пациента;
Предложена диагноза на заболяването;
Предшестваща антимикробна терапия;
Естеството на материала;
Дата и час на вземане на материала;
Цел на изследването;
Името на лечебното заведение, номерът на отделението, отделението;
Подпис на лекаря.
Бактериологичният метод се извършва на два етапа (фиг. 2.1.):
1. Изолиране на чиста култура на патогена (1-2 дни);
2. Идентифициране на чиста култура (1-3 дни).
На първия етап тестовият материал се засява върху твърда или течна хранителна среда, оценяват се културните свойства, избират се подозрителни колонии и се изследват върху наклонен агар. Етапът на идентификация включва задължително изследване на морфологията, биохимичните свойства и антигенната структура на изолираната чиста култура, както и допълнителни изследвания за определяне на антибиотична чувствителност, фагочувствителност, фаготипизиране, патогенност и персистиращи свойства.
ВЪПРОСИ ЗА ПОДГОТОВКАТА:
1. Правила за събиране и транспортиране на тестовия материал за бактериологично изследване.
2. Правила за издаване на направление за бактериологично изследване.
3. Методи за изолиране на чисти култури от микроорганизми.
4. Бактериологичен диагностичен метод. Цел. Етапи. диагностична стойност.
ПЛАН ЗА САМОСТОЯТЕЛНА РАБОТА:
1. Разучете таблиците "Методи за изолиране на чисти култури от бактерии" и "Изолиране и идентификация на чисти култури".
2. Изолирайте чиста култура от смес от бактерии и извършете нейната идентификация - овладейте бактериологичния диагностичен метод (Работа 1)
4.2. БИОЛОГИЧНИ И МИКРОБИОЛОГИЧНИ ФАКТОРИ
Бактериологична диагностика на коремен тиф и паратиф А, В и С
Дата на въвеждане: от момента на одобрение
1. РАЗРАБОТЕН: FGUN Санкт Петербург NIIEM им. Пастьор от Роспотребнадзор (Л.А. Кафтырева, З.Н. Матвеева, Г.Ф. Трифонова); GOUVPO "Санкт Петербургска държавна медицинска академия на името на I.I. Мечников" на Федералната агенция за здравеопазване и социално развитие (A.G. Бойцов).
3. ОДОБРЕНО от ръководителя на Федералната служба за надзор на защитата на правата на потребителите и благосъстоянието на хората, Главен държавен санитарен лекар на Руската федерация Г. Г. Онищенко 29 декември 2007 г. 0100/13745-07-34
4. ВЪВЕЖДА СЕ от момента на утвърждаване.
5. ПРЕДСТАВЕН ЗА ПЪРВИ ПЪТ.
1 област на използване
1 област на използване
1.1. Насоките излагат основните принципи и характеристики на бактериологичната диагностика на коремен тиф и паратиф А, В и С; съдържа съвременна информация за биологичните свойства на патогените, резистентността към антибактериални лекарства, хранителните среди за тяхното изолиране и характеристиките на диференциацията на патогени на тиф и паратиф от други серологични варианти на Salmonella.
2. Списък на съкращенията
ABP - антибактериално лекарство
BCA - бисмутов сулфитен агар
MPU - лечебно-профилактична институция
MIC - минимална инхибираща концентрация
P - междинен
U - стабилен
H - чувствителен
RIF - реакция на имунофлуоресценция
ЦНС - централна нервна система
В таблици:
"+" - положителна реакция през първия ден;
"-" - отрицателна реакция за 4-20 дни;
"(+)" - забавена положителна реакция за 2-20 дни;
d - различни ензимни реакции.
Възможна е диференциация в ензимни варианти.
3. Общи положения
3.1. Коремният тиф и паратифите A, B и C са антропонозни чревни инфекции, причинени от Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi B и Salmonella Paratyphi C. рядко - паратиф C.
3.2. Заболяванията се характеризират с язвени лезии на лимфната система на тънките черва, бактериемия, треска, цикличен клиничен ход с тежка интоксикация, розелозен обрив по кожата на тялото, хепато- и спленомегалия. Запекът е по-често срещан от диарията. Улцерацията на пейеровите петна на илеума в около 1% от случаите води до чревно кървене и перфорация на червата с най-неблагоприятните последици за пациента.
3.3. Диагнозата на коремен тиф и паратиф А, В и С се поставя въз основа на клиничните признаци на заболяването, като се вземат предвид епидемиологичната анамнеза и данните от цялостно лабораторно изследване, което включва класически бактериологични и серологични методи. Бактериологичната диагностика е от приоритетно значение, т.к в този случай е възможно да се получи най-пълната информация за биологичните свойства на патогена, включително неговата чувствителност към антибактериални лекарства.
3.4. Използването на антимикробни лекарства за етиотропна терапия на коремен тиф и паратиф позволи, от една страна, да намали смъртността от 10-20% до по-малко от 1%, а от друга страна, усложни лабораторната диагностика, т.к. често вземането на проби от материал за лабораторни изследвания се извършва след началото на антибиотичната терапия. Този факт налага по-внимателно да се подходи към въпроса за избора на материал за изследване, вземането на изследвания материал и изследователските техники.
3.5. Съвременна характеристика на епидемиологията на коремния тиф е рязкото увеличаване на честотата на внос (пренасяне) на инфекция от територии, ендемични за това заболяване, страни от близката и далечната чужбина, както и инфекция на руски жители при заминаване за тези страни и в процеса на миграция в страната. Друга особеност е наличието на голям контингент с висок епидемиологичен риск под формата на лица без постоянно местожителство, сред които се регистрира висока заболеваемост от коремен тиф.
3.6. Тези насоки са изготвени с цел унифициране на методите за бактериологична диагностика на коремен тиф и паратиф А, В и С, както и правилното тълкуване на резултатите от лабораторно изследване, като се вземат предвид съвременните характеристики на клиниката, лечение и епидемиологичната ситуация в конкретни райони.
4. Показания за бактериологична диагностика
Индикация за бактериологично изследване на биологичен материал за наличие на патогени на коремен тиф и паратиф А, В и С е необходимостта от изследване:
4.1) пациенти със съмнение за коремен тиф, както и с треска с неизвестна етиология, продължаваща 5 или повече дни;
4.2) лица, имали контакт с болни от коремен тиф и паратиф А, В, С;
4.3) служители от определени професии, отрасли и организации при постъпване на работа и по епидемиологични показания;
4.4) лица преди постъпване в болници и специализирани санаториуми по клинични и епидемиологични показания;
4.5) лица, регистрирани за стационарно лечение в болници (отделения) с психо-неврологичен (психосоматичен) профил, домове за възрастни хора, интернати за хора с хронични психични заболявания и лезии на ЦНС и други видове затворени институции с денонощно денонощие. престой;
4.6) пациенти с коремен тиф и паратиф след изчезване на клиничните симптоми на заболяването преди изписване от болницата;
4.7) лица, които са били болни от коремен тиф и паратиф по време на диспансерно наблюдение;
4.8) хронични бактериални носители, идентифицирани сред служители на определени професии, отрасли и организации, при повторно наемане на работа в тези предприятия и съоръжения;
4.9) секционен материал при съмнение за коремен тиф и паратиф.
5. Логистика на метода
5.1. Стандартно изпитвателно и спомагателно оборудване, измервателни уреди за микробиологични лаборатории.
5.2. Хранителни среди, диагностични серуми и химични реактиви за култивиране, изолиране, идентифициране и определяне на чувствителността към антибактериални лекарства на причинители на коремен тиф и паратиф А, В и С.
5.3. За лабораторна диагностика на коремен тиф и паратиф и откриване на бактериални носители трябва да се използват хранителни среди и реактиви, разрешени за употреба на територията на Руската федерация по установения ред.
6. Лабораторна диагностика на коремен тиф и паратиф
6.1. Принципът на бактериологичния метод се основава на откриването на живи микроорганизми в различни биологични субстрати (кръв, урина, изпражнения, жлъчка, костен мозък, розеола) в зависимост от стадия на заболяването. За целта определено количество биологичен материал се засява върху специални хранителни среди, последвано от инкубиране в термостат и идентифициране на порасналите колонии от микроорганизми, характерни за S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B и S. Paratyphi C, според културни и ензимни свойства и антигенни характеристики.
6.2. Само бактериологично изследване може да осигури точна етиологична диагноза и контрол на освобождаването на тялото от патогена. По отношение на диференциалната диагноза на коремен тиф и паратиф, единственият метод е лабораторно изследване на биологичен материал с изолиране на патогена и идентифицирането му до ниво на серологичен вариант, т.к. клиничният ход на инфекциозния процес не винаги дава възможност да се разграничат тези нозологични форми.
7. Бактериологично изследване
7.1. Изолирането на причинители на коремен тиф и паратифи А, В и С се извършва по същата схема на бактериологично изследване на биоматериали.
7.2. Процедурата за събиране на материал за лабораторни изследвания за коремен тиф и паратиф се определя от SP 3.1.1.2137-06.
7.3. Техниката за събиране и транспортиране на биоматериали до микробиологични лаборатории е описана в MU 4.2.2039-05.
7.4. Материалът за бактериологично изследване за диагностициране на коремен тиф и паратиф е:
кръв;
екскрети;
урина;
Патогените също могат да бъдат изолирани от:
розеол;
костен мозък;
кърма.
Материалът за бактериологично изследване за идентифициране на носители на бактерии, съгласно SP 3.1.1.2137-06, са:
екскрети;
урина;
жлъчка (дуоденално съдържимо).
7.5. Проучването на секционен материал се извършва, за да се изясни диагнозата.
7.6. Събирането на биологичен материал за лабораторни изследвания се извършва преди началото на етиотропното лечение: от медицински работник, който подозира инфекция с тиф-паратиф; в случай на групова и епидемична заболеваемост - от специалисти на институциите на Роспотребнадзор и персонала на лечебните заведения. От хоспитализирани пациенти се взема материал за бактериологично изследване в спешното отделение на болницата.
7.7. От лица, които са общували с пациенти или носители (контакти), събирането на материал се извършва от медицински работници на здравни заведения и други организации и институции на мястото на откриване на пациенти.
7.8. Биоматериалът за лабораторни изследвания е придружен от специално направление. Не се допуска предаване на материала от самите субекти. При невъзможност за навременно доставяне на материала се използват консерванти и транспортни среди (Таблица 1).
8. Бактериологично изследване на кръвта
Индикация за кръвен тест е съмнение за коремен тиф-паратиф или фебрилно състояние с неизвестен произход (треска с неизвестен произход), наблюдавано в продължение на 5 или повече дни (SP 3.1.1.2137-06).
Съотношението кръв - хранителна среда трябва да бъде 1:10-1:60. Броят на независимо взетите кръвни проби и времето на тяхното вземане се определят от лекуващия лекар съгласно MU 4.2.2039-05 за треска с неизвестен произход или съгласно MU 04-723/3 на Министерството на здравеопазването на СССР ( 1984) при съмнение за коремен тиф-паратиф. При пациенти, приемащи антибактериални лекарства, пробите трябва да се вземат непосредствено преди въвеждането (приемането) на следващата доза от лекарството.
При наличие на треска е оптимално да се вземе кръв на фона на повишаване на телесната температура (но не на върха на температурата!). Засяването върху хранителни среди се извършва директно до леглото на пациента.
Ако се подозира тиф-паратиф, за кръвна култура може да се използва среда Rapoport, 20% жлъчен бульон, месно-пептонен бульон с добавяне на 1% глюкоза (в 100 ml флакони). Използвани преди това хемокултури в стерилна дестилирана (чешмяна) вода. Въпреки това е за предпочитане да се използват специални среди за хемокултура.
Количеството кръв, засято в разгара на треската, може да бъде 10 ml, на по-късна дата - до 20 ml (при деца - до 5 ml).
При температура с неизвестен произход, продължаваща повече от 5 дни, по правило трябва да се изследват няколко кръвни проби. Вземането на кръв от вена се извършва съгласно MU 4.2.2039-05. Това е необходимо, за да се разграничи истинската бактериемия от случайно замърсяване на кръвта по време на венепункция (вероятността за замърсяване на пробата поради случайно пробиване на мастните или потните жлези е 3%). В този случай се използват две среди за хемокултура: 1) среда за аероби и факултативни анаероби и 2) среда за облигатни анаероби (например "двойна" среда + тиогликолова среда съгласно заповедта на Министерството на здравеопазването на СССР от 12.04.85 N 535) или универсална среда за аероби и анаероби.
За предпочитане е да използвате промишлено произведени медии, одобрени за употреба в Русия.
Културите се инкубират при 37 °C в продължение на 10 дни с ежедневно наблюдение. В този случай флаконите с "двойната" среда се накланят, измивайки плътната част на средата.
При липса на признаци на растеж на 10-ия ден се издава отрицателен отговор.
Ако има признаци на растеж (мътност, зачервяване на средата на Rapoport, появата на видими колонии върху плътната част на "двойната" среда), засяването се извършва паралелно върху поливъглехидратна среда и плътна среда в петриеви панички ( кръвен агар в случай на треска с неизвестен произход и среда Endo в случай на съмнение за коремен тиф и паратиф).
Извършва се директна инокулация върху поливъглехидратна среда, за да се намали времето на изследването, въз основа на предположението, че когато кръвта се инокулира с голяма вероятност, ще се наблюдава растеж на монокултурата на патогена. Необходимо е паралелно посяване върху среда Endo или кръвен агар, за да се контролира това предположение и да се изолира чиста култура чрез разделяне на отделни колонии.
Ако се наблюдава монокултурен растеж върху тези среди, тогава могат да се вземат предвид биохимичните свойства на поливъглехидратната среда. За да се контролира чистотата на културата, е необходимо да се извърши микроскопия на намазка от поливъглехидратна среда, оцветена по Грам. На този етап също е възможно да се постави реакция на аглутинация върху стъкло със съответните аглутиниращи O- и H-салмонелни серуми и да се даде предварителен отговор.
Схемата за бактериологично изследване на кръвта на пациенти със съмнение за коремен тиф и паратиф е показана на фиг.1.
Фиг. 1. Схема на бактериологично изследване на кръвта на пациенти със съмнение за тиф и паратиф
Фиг. 1. Схема на бактериологично изследване на кръвта на пациенти със съмнение за тиф и паратиф
Схемата за бактериологично изследване на кръвта на пациенти с треска с неизвестен произход е показана на фиг. 2.
Фиг.2. Схема на бактериологично изследване на кръвта на пациенти с треска с неизвестен произход
Фиг.2. Схема на бактериологично изследване на кръвта на пациенти с треска с неизвестен произход
Ходът на по-нататъшното идентифициране на културата чрез културно-морфологични, ензимни свойства и серологични характеристики е описан допълнително в съответните раздели.
9. Бактериологично изследване на изпражненията
Пробите от изпражненията се вземат веднага след дефекацията от дезинфекциран и старателно измит съд, на дъното на който е поставен лист плътна чиста хартия. Материалът се събира с помощта на лъжица-шпатула, монтирана в капака на стерилен контейнер. При липса на контейнер със шпатула, за вземане на материала се използва всеки стерилен инструмент (стерилна дървена шпатула, телена примка, лъжица и др.). При наличие на патологични примеси е необходимо да се изберат области, съдържащи слуз, гной, люспи, но свободни от кръв. Проби от течни изпражнения се вземат с помощта на стерилна пластмасова пипета на Пастьор със затворен резервоар.
Обемът на взетия материал трябва да бъде най-малко 2 гр. Оптималният материал е да се вземе материалът при декориран стол - в размер на орех; в случай на разхлабени изпражнения, неговият слой в контейнера трябва да бъде най-малко 1,5-2,0 см. Материалът, поставен в стерилен контейнер, се доставя в лабораторията в рамките на 2 часа.
Ако материалът не може да бъде доставен в лабораторията до 2 часа, той се събира в консервант (транспортна система със среда). Обемът на материала не трябва да надвишава обема на средата.
Изпражненията трябва внимателно да се хомогенизират в средата. Пробите могат да се съхраняват преди началото на изследването през деня в хладилник (4-6 °C).
Транспортните среди и консервантите, използвани за изолиране на причинители на коремен тиф и паратиф А, В и С, както и други патогени на остри чревни инфекции, са представени в таблица 1.
маса 1
Транспортни среди и консерванти, използвани най-често за транспортиране на фекалии
|
Име на средата |
Осигурява запазване |
|
Сряда Кари Блеър |
всички чревни патогени, включително Campylobacter |
|
Уензди Еймс |
всички ентеробактерии |
|
Уензди Стюарт |
салмонела и шигела |
|
глицеринова смес |
всички ентеробактерии с изключение на йерсиния; предпочитан при шигела |
|
фосфатна буферна смес |
всички ентеробактерии |
|
боратен буферен разтвор |
всички ентеробактерии |
|
физиологичен разтвор |
всички ентеробактерии, включително кампилобактер |
Проби от изпражнения, взети директно от ректума с помощта на ректален тампон, се използват предимно за обективизиране на диагнозата (MU 4.2.2039-05). Материалът се взема от парамедицински персонал. По правило специална сонда за вземане на намазка е част от транспортната система. Важно е да се отбележи, че попадането на транспортни среди върху ректалната лигавица е недопустимо! Следователно ректалния тампон трябва да се потопи в транспортната среда само след вземане на материала. Пациентът е помолен да легне настрани с бедрата, изтеглени към стомаха и задните части раздалечени с дланите на ръцете. Сондата за тампон се вкарва в ануса на дълбочина 4-5 cm и с леко завъртане около оста се събира материал от криптите на ануса. Внимателно отстранете сондата за тампон и я потопете в транспортната среда. Не се допуска транспортиране на тампон без среда.
В лабораторията инокулацията на проби от изпражнения се извършва директно върху плътна диференциално диагностична хранителна среда и паралелно върху обогатяващата среда.
Схемата за бактериологично изследване на изпражненията е показана на фиг.3.
Фиг.3. Схема на бактериологично изследване на изпражненията
Фиг.3. Схема на бактериологично изследване на изпражненията
От нативните изпражнения се приготвя суспензия в 0,9% разтвор на натриев хлорид в съотношение 1:5-1:10, престоява 30 минути, за да се утаят едрите частици. След това една капка от супернатанта се инокулира в панички с плътна хранителна среда и 1 ml от суспензията се инокулира в обогатяващата среда (съотношението материал-среда трябва да бъде 1:5).
Изпражненията, доставени в лабораторията в консервант (транспортна среда), трябва да бъдат внимателно хомогенизирани в средата преди инокулация, след което материалът се инокулира директно върху твърда среда и обогатителна среда в същите пропорции като нативните изпражнения.
Проби от изпражнения, събрани с ректален тампон, се изследват по подобен начин на изпражненията, доставени в консервант. Трябва да се помни, че ректалния тампон съдържа по-малко микроорганизми в сравнение с естествените изпражнения, така че дозата на инокулума трябва да се увеличи.
Максималното откриване на S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B и S. Paratyphi C във фекалиите се постига с обогатителни среди, въпреки че при пациенти в острия период на заболяването патогенът често се изолира чрез директна инокулация. Инокулацията върху обогатителни среди успоредно с директната инокулация е задължителна!
Всички инокулации се инкубират при 37 °C върху среда за диференциална диагностика за 18-24 часа, върху бисмут-сулфитен агар за 24-48 часа. среден). Колониите, характерни за тези патогени, отглеждани върху плътна среда, се отсяват върху поливъглехидратна среда.
Трябва да се отбележи, че техниката на разпръскване на материала върху повърхността на плоча с плътна среда трябва да осигури растеж на изолирани колонии от типичен тип, които могат да се използват за визуална оценка на културните свойства на микроорганизма.
Бисмутов сулфитен агар (BCA) е предпочитаният метод за изолиране на S. Typhi. Типичните колонии на S. Typhi са черни и заобиколени от черен или кафяв ръб с метален блясък. Въпреки това, S. Typhi често не предизвиква характерното почерняване на ICA, когато се появи обилен растеж, така че чашите трябва да бъдат инокулирани, за да се позволи растеж на единична колония.
Фекалните проби могат да бъдат инокулирани върху стандартни селективни среди за ентеробактерии, одобрени за употреба в Руската федерация. Бисмутовият сулфитен агар обаче е предпочитаният метод за изолиране на S. tymhi. Ходът на по-нататъшното идентифициране на културите чрез ензимни свойства и серологични характеристики е описан допълнително в съответните раздели.
10. Бактериологично изследване на урина
Уринокултурата се извършва за диагностика от първите дни на заболяването и до изписването на пациента, както и за идентифициране на бактерионосителя. Тъй като при тиф и паратиф отделянето на патогена в урината се случва периодично и за кратко време, изследванията на урината трябва да се повтарят на интервали от 5-7 дни.
Трябва стриктно да се придържате към общите правила за събиране на урина, посочени в MU 4.2.2039-05. Независимо от метода на получаване на урина, тя трябва да бъде доставена в лабораторията в рамките на 2 часа.В краен случай урината може да се съхранява през нощта в хладилника.
Трябва да се помни, че в зависимост от химичния състав на урината, бактериите в нея могат както да умрат по време на съхранение, така и да се размножават.
Увеличаването на срока на годност на материала може да направи изключително трудно интерпретирането на резултата.
Директно посяване на урина (или утайка след центрофугиране) се извършва без предварително обогатяване съгласно заповедта на Министерството на здравеопазването на СССР N 535 върху плътна диференциална диагностична среда, препоръчана за салмонела, включително патогени на тиф и паратиф. В същото време нативната урина се инокулира в среда за обогатяване с двойна концентрация в съотношение 1:1 или седиментът от урина се инокулира в среда с нормална концентрация. Инокулациите се поставят в термостат при 37 °C за 18-24 часа и след това обогатяващата среда се инокулира върху плътна среда за диференциална диагностика. Колониите, отглеждани върху твърда среда, се идентифицират чрез културно-ензимни и серологични свойства.
11. Бактериологично изследване на жлъчка (дуоденално съдържимо)
Жлъчката се събира в три стерилни епруветки или стерилни контейнери за еднократна употреба отделно в порции A, B, C съгласно MU 4.2.2039-05 и се доставя в лабораторията.
Проведете изследване на всяка порция (A, B, C) поотделно или пригответе смес от три порции. Пробите се инокулират:
върху плътна диференциално диагностична среда (ICA, Endo, EMS и др.) в количество от 0,5 ml;
в епруветка (шише) с хранителен бульон в съотношение 1:10. Няма нужда да се инокулира жлъчка върху обогатителна среда, т.к самата жлъчка е добра среда за размножаване на патогени на тиф и паратиф.
Инокулираните среди се инкубират с жлъчни остатъци при 37°C.
След 18-24 часа инокулациите се изследват върху плътна хранителна среда (резултатите от растежа върху ICA се вземат предвид след 24 и 48 часа) и се извършва повторно засяване на съмнителни колонии върху поливъглехидратна среда.
От хранителния бульон се правят посеви върху плътни диференциално диагностични среди.
От останалата жлъчка в случай на отрицателен резултат от директното засяване се правят повторни посеви върху плътна диференциално диагностична среда след 18-24 часа и на 3, 5, 7 и 10 дни.
Отглежданите микроорганизми се идентифицират по културно-морфологични, ензимни и серологични свойства.
12. Бактериологично изследване на материал от розеола
Бактериологично изследване ("остъргване" с розеола) се извършва при наличие на добре дефинирана розеола. Материалът се събира асептично. За да направите това, областта на кожата над розеолата се третира със 70% етилов алкохол, след това се избърсва с памучен тампон, навлажнен със стерилен 0,9% разтвор на натриев хлорид и се изсушава със стерилен тампон.
Материал за изследване (тъканна течност) се получава чрез скарификация на кожата над розеолата със скалпел. 1-2 капки жлъчен бульон или изотоничен разтвор на натриев хлорид се нанасят върху увредената кожа, смесват се с изпъкналата тъканна течност и се събират с пипета на Пастьор или подобно стерилно устройство за еднократна употреба в епруветка с една от течните среди за обогатяване (жлъчка бульон, среда Rapoport и др.). В лабораторията инокулацията се поддържа при 37 °C за 18-24 часа, последвано от инокулация върху плътна диференциално диагностична среда (Endo, EMS, ICA).
13. Бактериологично изследване на костен мозък
Добре известно е, че в случай на лабораторно потвърждение на диагнозата коремен тиф, най-ефективно е бактериологичното изследване на костния мозък (инокулацията на патогена е 90-95%). Дори при пациенти с леки и изтрити форми на коремен тиф, трудни за клинично разпознаване, както и на фона на приема на антимикробни лекарства, инокулацията на миелокултурите е значително по-висока от кръвните култури.
На практика обаче бактериологичното изследване на костния мозък се извършва много рядко, само при специални клинични показания, при липса на други лабораторни данни, потвърждаващи диагнозата коремен тиф или паратиф, т.к. тази инвазивна процедура е доста травматична. Вземането на материал за изследване се извършва само в болница с присъствието на подходящ специалист.
Материал за бактериологично изследване (аспират) в количество от 0,50-0,75 ml се получава асептично чрез пробиване на гръдната кост (дръжка или тяло) и се инокулира в епруветка с една от обогатяващите среди (жлъчен бульон, среда Rapoport и др.).
Ако аспиратът не може да бъде инокулиран в обогатяващата среда веднага след пункцията, той се събира в стерилна епруветка и незабавно се изпраща в лабораторията, където се извършва инокулацията в обогатяващата среда. В лабораторията инокулациите се инкубират при 37 °C за 18-24 часа, последвано от инокулация върху плътна диференциално диагностична среда.
Провеждат се допълнителни изследвания, както при бактериологично изследване на друг биологичен материал.
14. Хранителни среди и реактиви
Списъкът с хранителни среди за изолиране и идентифициране на патогени на чревни инфекции, по-специално на ентеробактерии, е обширен и непрекъснато се разширява. Изборът на конкретни среди до голяма степен се определя от местните икономически условия и традиции. Въпреки това трябва да се ръководи от няколко основни принципа.
14.1. Описанието на културалната среда трябва да показва, че тя може да се използва не само за откриване на Salmonella, но и за Salmonella Typhi и S. Paratyphi A, B и C.
14.2. Трябва да се предпочитат дехидратирани култури от реномирани производители пред среди, приготвени директно в лабораторията.
14.3. Всяка партида културална среда в лабораторията трябва да се контролира чрез тестови щамове (вътрешен качествен контрол).
14.4. За лабораторна диагностика на коремен тиф и паратиф и откриване на бактериални носители трябва да се използват хранителни среди и реактиви, разрешени за употреба на територията на Руската федерация по установения ред.
15. Методи за изследване на ензимните свойства
Понастоящем за изследване на ензимната активност на микроорганизми от семейство Enterobacteriaceae, включително патогени на тиф и паратиф, са разработени, произведени и регистрирани различни диагностични тестови системи от местно и чуждестранно производство (от най-простата класическа среда на Hiss в епруветки и плочи до автоматични анализатори). Ако тестовите системи позволяват да се идентифицира микроорганизъм до нивото на род и да се идентифицират характеристиките на ензимната активност на щамовете, тогава те могат да се използват за идентифициране на патогени на коремен тиф и паратиф. Процедурата за работа с тест системи е описана подробно в инструкциите за употреба и трябва да се спазва стриктно.
16. Биологични свойства на патогените
Причинителите на коремен тиф и паратифи А, В и С принадлежат към семейство Enterobacteriaceae, род Salmonella, видове enterica, подвид I (enterica) и имат морфологични, културни и ензимни свойства, характерни за този подвид, вид, род и семейство.
Представители на рода Salmonella видове enterica исторически са развили ситуация, когато сероварите са обозначени не с антигенна формула, както при други бактерии, а с имената на болести (човешки или животински), страната, града или улицата, където са били изолирани, и т.н. Грешка е да се разглеждат тези видове имена, т.к нямат таксономичен статус. Имената на най-често срещаните серовари на Salmonella обаче са толкова познати, че е почти невъзможно да бъдат заменени с антигенни формули. Следователно в съвременната схема на Кауфман-Уайт, когато се обозначава Salmonella само enterica подвид I, вместо наименованието на вида се използва името на серовара, но се пише с главна буква.
По този начин пълните имена на причинителите на коремен тиф и паратиф са както следва:
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi;
Salmonella enterica subsp. enterica серовар Paratyphi A;
Salmonella enterica subsp. enterica серовар Paratyphi B;
Salmonella enterica subsp. enterica серовар Paratyphi C
В обичайната практика е възможно да се използват съкратени версии на имената:
Salmonella ser. Typhi или Salmonella Typhi или S. Typhi;
Salmonella ser. Paratyphi A или Salmonella Paratyphi A или S. Paratyphi A;
Salmonella ser. Paratyphi B или Salmonella Paratyphi B или S. Paratyphi B;
Salmonella ser. Paratyphi C или Salmonella Paratyphi C или S. Paratyphi C
16.1. Културни и морфологични свойства
Мобилните грам-отрицателни пръчки не образуват спори и капсули, факултативните анаероби растат добре на обикновени хранителни среди.
На обикновен хранителен агар - колонии леко изпъкнали с гладък ръб и гладка повърхност, влажни с блясък над 1 mm.
На диференциално-диагностична среда (съдържаща лактоза като диференциращо вещество) - прозрачна, безцветна или синкава, а понякога и розова или цвят на средата на колонията (Endo, Ploskirev, EMS и други подобни среди).
На SS-arape, средноцветни колонии с черен център.
Върху бисмут-сулфитна среда изолираните колонии от S. Typhi, S. Paratyphi B са черни с характерен метален блясък, средата под колонията е боядисана в черно. Колониите на S. Paratyphi A са зеленикави, светли на цвета на средата, нежни.
Щамове на S. Paratyphi B (причинителят на паратиф B) върху месо-пептонен агар могат да образуват повдигната мукоидна стена по периферията на колониите. Слизестият вал се развива за 2-5 дни, когато културите се съхраняват при стайна температура. Този симптом не е постоянен и диагностичен.
16.2. Ензимни свойства
Изследването на ензимните свойства се извършва във връзка с набор от въглехидрати, многовалентни алкохоли, аминокиселини и други органични съединения, използвани при идентифицирането и изследването на Salmonella и други ентеробактерии. По правило в практическите лаборатории се използват малък брой тестове за идентифициране на основните родове, които са част от семейството на чревните бактерии. Характеристики на ензимните свойства на Salmonella, включително причинители на коремен тиф и паратиф A, B и C, са представени в таблица 2.
таблица 2
Ензимни свойства на патогени на коремен тиф и паратифи A, B, C
|
субстрат |
С. Паратифи А |
||||
|
Глюкоза (газ) |
Бактериологичният метод за изследване на патологичния материал за изолиране и идентифициране на микобактерии включва 3 метода: бактериоскопски, културен и биологичен / R.V. Tkzova, 1983; И. И. Румачик, 1987, 1993; КАТО. Донченко, 1989; Ю.Я. Касич, 1990; А.Х.Найманов, 1993; Л. П. Ходун, 1997/. Периодът на бактериологично изследване не трябва да надвишава 3 месеца.
Като се има предвид, че макроскопските туберкулозни промени в органите и тъканите на говедата са причинени от причинителя на туберкулозата по говедата, няма смисъл да се изследва бактериологично такъв материал. Ако такъв материал бъде доставен в лабораторията за изследване, тогава се извършва комисионна проверка и се съставя акт. Материалът е безвреден.
Бактериоскопското (микроскопско) изследване на материала се състои в приготвяне от всеки орган (или части от орган със съмнителни промени в туберкулоза) и лимфен възел, доставени за изследване, на 2 отпечатъчни петна, изсушаването им на въздух, фиксирането им върху пламъка на алкохолна лампа, оцветяване по Cyl-Nielsen и разглеждане на оцветените натривки под микроскоп, с най-малко 50 зрителни полета във всяка натривка. Необходимо е да се подготвят най-малко 20 петна-отпечатъци от материала от един труп. В допълнение, петна за микроскопия също се приготвят от суспензия от материал, засят върху хранителни среди.
Оцветяването на петна по Ziehl-Neelsen е селективно за откриване на микобактерии: на син фон от оцветени тъкани или чужда микрофлора, микобактериите се виждат като червени, розови или рубиненочервени пръчици. Най-добре е петната да се разглеждат под бинокулярен микроскоп при увеличение 1,5 (дюза) x 7 (окуляр) x 90 или 100 (обектив).
Методът се използва като сигнал, тъй като наличието или отсъствието на микобактерии в намазките абсолютно не влияе върху хода на по-нататъшното изследване и дори положителното заключение от бактериоскопията няма правно значение (с изключение на птиците). Материалът трябва да бъде проучен допълнително.
Лабораторна диагноза туберкулоза при птици се счита за установена, ако от тестовия материал се изолира култура от птичи микобактерии (от папагали - човешки или птичи видове), се получи положителен резултат от биоанализа, както и ако се открият микобактерии в намазки от патологичен материал по време на микроскопско изследване (клауза 7.3 .2 инструкции).
Необходимо е също така да се обърне внимание на факта, че отнема много време за приготвяне на натривки за отпечатъци, тяхното фиксиране и преглед и е много рядко да се открият микобактерии в тях, дори в намазки от суспензия от посевен материал. Следователно, за да спестите работно време и пари при изследване на материал от животни, които не са имали промени по време на клането, препоръчително е да се ограничим до подготовката и разглеждането на намазки само от суспензия от материал, засят върху хранителни среди. Това няма да доведе до увреждане при диагностицирането на туберкулоза, тъй като изследването на материала продължава по-нататък.
В допълнение към конвенционалната светлинна микроскопия може да се използва флуоресцентна микроскопия. Намазките се приготвят по същия начин, фиксират се и се оцветяват със смес от флуорохроми. Оцветените петна се разглеждат под флуоресцентен микроскоп. Методът е по-чувствителен, но по-малко специфичен и следователно не е много приемлив, особено в практическите лаборатории.
Културното изолиране на микобактерии върху хранителни среди е една от важните връзки в лабораторната диагностика на туберкулозата на съвременния етап. Въпреки това, хранителните среди, върху които е засят материалът (за 5-10 епруветки в съответствие с инструкциите), през първите 2-3 седмици имат частично или пълно поникване, като правило, поради нарушаване на стерилността по време на инокулацията на материала. Културите се изхвърлят точно по времето, когато е най-вероятно появата на първоначалния растеж на атипични микобактерии (да не говорим за проявата на първоначалния растеж на причинителя на туберкулозата, който показва растеж дори по-късно). В такива случаи културният метод за изолиране на микобактерии върху хранителни среди механично отпада. Това е една от основните причини за получаване на отрицателни резултати при бактериологичното изследване на материала. В резултат на това, след като не се получи растеж на колонии от микобактерии върху хранителни среди след инокулация на материала и лабораторните животни останаха живи в продължение на 3 месеца, стандартният отговор на лабораториите е следният: „Причинителят на туберкулозата не е изолиран“ или „ Изследването на материала за туберкулоза е отрицателно”. Въз основа на резултатите от проучванията причината за реакцията на говедата към туберкулин не е установена и това води до по-нататъшно неоправдано клане на значителен брой животни, които са отговорили на туберкулин във ферми, които са свободни от туберкулоза по говедата, което причинява големи икономически щети, нарушава се обръщаемостта и възпроизводството на стадото.
Предвид гореизложеното е необходимо да се даде приоритет на културния метод за изолиране на микобактерии от материала върху хранителни среди, като най-слабото звено в бактериологичната диагностика на туберкулозата в районните ветеринарни лаборатории.
Положителните резултати от културния метод за изолиране на микобактерии зависят главно от две обстоятелства: повишаване на надеждността на засяване на микобактерии от материала и спазване на условията за стерилност при работа в кутия.
Увеличаването на надеждността на засяването на микобактерии от материала, взет за изследване, зависи преди всичко от неговия качествен подбор, предсеитбена обработка и увеличаване на броя на епруветките на средата, върху която се извършва засяването.
Основните условия, спазването на които при засяване на материала върху хранителни среди гарантира растежа на колонии от микобактерии:
а) вземете материал за бактериологично изследване от заклани животни, които не са имали промени по време на клането, отделно от всеки труп и инокулирайте всяка проба (материал от всяко животно) върху 10-20 епруветки от средата по следната схема:
Лимфни възли на главата (субмандибуларни, фарингеални);
Бронхиални и медиастинални лимфни възли;
Мезентериални (мезентериални) лимфни възли;
Други лимфни възли (ако има подозрителни зони);
Органи (също ако е необходимо).
Резултатът е инокулация на материал от едно животно за 30-50 епруветки от средата. Това постига повишаване на надеждността на засяване на микобактерии с 3-5 пъти, тъй като без разделяне на пробите (съгласно инструкциите) се препоръчва материалът да се засява само върху 5-10 епруветки със средата от две глави на една ферма.
б) Непосредствено при бактериологично засяване на материала се изрязват парчета с нарушена морфологична структура на лимфен възел или орган (хиперплазия, индурация, точковидни и набраздени кръвоизливи и др.). Освен това е необходимо да изрежете всички променени области. Ако има много материал по обем в един хоросан, тогава той може да бъде разделен на две.
в) Спазвайте стриктно възприетата методика на работа, без да нарушавате режима на обработка и засяване на материала.
г) При хомогенизиране на материала, особено на лимфните възли, е необходимо да се използва стерилен пясък или ситно натрошено стерилно стъкло. Смелете материала колкото е възможно повече (до кремообразна консистенция) за по-добра екстракция на микобактериите от тестовия материал
д) Добавете физиологичен разтвор към хомогенизирания материал в хаванче в количеството, необходимо за инокулация на суспензия от материал върху хранителни среди и за биоанализ (средно до 0,5 cm3 в една епруветка и 1-2 cm3 за подкожна инфекция на едно морско свинче). Това количество физиологичен разтвор може да се изчисли предварително.
f) Прегледът на културите от материала трябва да се извършва след 3, 5, 7, 10, 15 дни и след това веднъж седмично.
ж) Всяка колония от микроорганизми, отгледана върху средата (типична или нетипична, пигментирана или непигментирана, лигавична или суха и т.н.), трябва да бъде микроскопирана със селективно оцветяване по Ziehl-Neelsen.
Трябва да се обърне внимание на степента на измиване на материала от киселина (или основа), използвана за третиране на материала от замърсяване с чужда микрофлора. Остатъчната киселина винаги ще присъства в суспензията от посевния материал, но тя трябва да бъде сведена до минимум. Индикатор за това е възстановяването на първоначалния цвят на средата на 2-4-ия ден след засяване на материала. Ако цветът на средата не се възстанови, това показва повишено количество остатъчна киселина. Цветът на средата придобива синкав оттенък с различна интензивност. Растежът на (предполагаеми) микобактерии в този случай се забавя или изобщо няма да съществува, особено на причинителя на туберкулозата, тъй като е по-взискателен към режима на култивиране. Остатъчното количество киселина действа на микобактериите до известна степен бактериостатично.
За запечатване на епруветките след инокулация на материала могат да се използват памучни и памучно-марлени запушалки, последвани от запълване с парафинови, безгумени и гумени с изрязан наклонен жлеб, кортикални и метални запушалки (затвори).
При определяне на видовата принадлежност на изолирана култура от микобактерии са известни много (около 300) различни теста: културно-морфологични, биологични, биохимични, серологични, определяне на лекарствена резистентност и др. Във ветеринарната практика обаче се използва техният минимум (виж ръководството). За лабораториите е достатъчно да се определи изолирана култура от микобактерии от следните видове: говеда, хора и птици, която се определя чрез биотест, и атипични микобактерии - разделени на групи според Runyon (1959): I - фотохромогенни (образуващи пигмент под въздействието на светлина), II - скотохромогенни (образуват пигмент независимо от излагането на светлина - както на тъмно, така и на светло), III - нехромогенни (не образуват пигмент) или се наричат още непигментирани (т.е. причинител на птича туберкулоза също е включен тук), IV - бързорастящи микобактерии и устойчиви на киселина сапрофити.
За да направите това, е доста ефективно и икономически оправдано да се изследват свойствата на изолираната култура по съкратена схема, в която основното внимание се обръща на времето на появата на първичния растеж на колониите, образуването на пигменти, културата морфологични и тинкториални свойства при оцветяване по Ziehl-Neelsen. Особено важен е тестът за образуване на корда в първична или дори субкултура в комбинация с резултатите от биоанализ. За да се приготвят намазки от отглеждани колонии, препоръчително е да се правят едновременно както от колонии, така и от остатъци от суспендирано вещество и кондензат, т.е. от течната част на дъното на тубата.
В допълнение, лабораторният персонал има възможност не само да извършва контролно клане на животни, реагиращи на туберкулин, и да взема проби от материал за изследване, но и да взема проби за бактериологични изследвания по време на живота на животните (бронхиална или назална слуз, мляко, изпражнения, урина, ексудат, кръв и др.), както и проби от фураж, вода, обекти от околната среда за изолиране на микобактерии и по този начин косвено доказват причината за реакцията на говедата към туберкулин. При засяване на допълнителен материал и проби от обекти на околната среда се използват добре познати методи за концентриране на микобактерии: утаяване, флотация, флотация-утаяване и др.
Съкратена схема на диференциация на микобактерии с помощта на биоанализ
