Полимеразна верижна реакция в козметологията. Полимеразна верижна реакция (PCR)

В края на статията вж
Полимеразна верижна реакция (PCR, PCR)изобретен през 1983 г. от Кери Мълис (американски учен). Впоследствие той получава Нобелова награда за това изобретение. В момента PCR диагностиката е един от най-точните и чувствителни методи за диагностициране на инфекциозни заболявания.
Полимеразна верижна реакция (PCR)- експериментален метод на молекулярната биология, метод за значително увеличаване на малки концентрации на определени фрагменти от нуклеинова киселина (ДНК) в биологичен материал (проба).
Методът PCR се основава на многократно удвояване на определен участък от ДНК с помощта на ензими при изкуствени условия (ин витро). В резултат на това се произвеждат достатъчни количества ДНК за визуално откриване. В този случай се копира само зоната, която отговаря на зададените условия, и то само ако присъства в изследваната проба.
В допълнение към простото увеличаване на броя на ДНК копията (този процес се нарича амплификация), PCR позволява много други манипулации с генетичен материал (въвеждане на мутации, снаждане на ДНК фрагменти) и се използва широко в биологичната и медицинската практика, напр. за диагностициране на заболявания (наследствени, инфекциозни), за установяване на бащинство, за клониране на гени, въвеждане на мутации, изолиране на нови гени.

Специфика и приложение

Провеждане на PCR

За PCR в най-простия случай са необходими следните компоненти:

  • ДНК матрица, съдържаща секцията от ДНК за амплифициране;
  • два праймера, комплементарни на краищата на желания фрагмент;
  • термостабилна ДНК полимераза;
  • дезоксинуклеотидни трифосфати (A, G, C, T);
  • Mg2+ йони, необходими за работата на полимераза;
  • буферен разтвор.

PCR се извършва в усилвател - устройство, което осигурява периодично охлаждане и нагряване на епруветки, обикновено с точност най-малко 0,1 ° C. За да се избегне изпаряването на реакционната смес, в епруветката се добавя масло с висока температура на кипене, като вазелин. Добавянето на специфични ензими може да увеличи добива на PCR реакцията.
Прогрес на реакцията

Обикновено при провеждане на PCR се извършват 20 - 35 цикъла, всеки от които се състои от три етапа. Двойноверижната ДНК матрица се нагрява до 94 - 96°C (или 98°C, ако се използва особено термостабилна полимераза) за 0,5 - 2 минути, за да се позволи на ДНК веригите да се разделят. Този етап се нарича денатурация – разрушават се водородните връзки между двете вериги. Понякога, преди първия цикъл, реакционната смес се загрява предварително за 2-5 минути, за да денатурира напълно шаблона и праймерите.
Когато нишките се разделят, температурата се понижава, за да се позволи на праймерите да се свържат с едноверижния шаблон. Този етап се нарича отгряване. Температурата на отгряване зависи от праймерите и обикновено се избира 4 - 5°C под тяхната точка на топене. Времетраене на сцената - 0,5 - 2 минути.

ДНК полимеразата репликира шаблонната верига, използвайки праймера като праймер. Това е етапът на удължаване. Температурата на удължаване зависи от полимеразата. Често използваните полимерази са най-активни при 72°C. Времето на удължаване зависи както от вида на ДНК полимеразата, така и от дължината на фрагмента, който се амплифицира. Обикновено времето за удължаване се приема като една минута за всеки хиляда базови двойки. След края на всички цикли често се извършва допълнителен етап на окончателно удължаване, за да се завършат всички едноверижни фрагменти. Този етап продължава 10-15 минути.
Подготовка на материала за изследване и транспортирането му до лабораторията

За успешен анализ е важно правилно да вземете материала от пациента и да го подготвите правилно. Известно е, че в лабораторната диагностика по-голямата част от грешките (до 70%) се допускат на етапа на подготовка на пробата. За вземане на кръв в лаборатория INVITRO в момента се използват вакуумни системи, които от една страна минимално нараняват пациента, а от друга позволяват материалът да бъде взет така, че да не влиза в контакт или с персонала, или с околната среда. По този начин се избягва контаминация (замърсяване) на материала и се гарантира обективността на PCR анализа.

ДНК - дезоксирибонуклеинова киселина - биологичен полимер, един от двата вида нуклеинови киселини, които осигуряват съхранение, предаване от поколение на поколение и изпълнение на генетичната програма за развитието и функционирането на живите организми. Основната роля на ДНК в клетките е дълготрайното съхранение на информация за структурата на РНК и протеините.


РНК - рибонуклеиновата киселина е биологичен полимер, подобен по своята химична структура на ДНК. Молекулата на РНК е изградена от същите мономерни единици – нуклеотиди като ДНК. В природата РНК обикновено съществува като единична верига. При някои вируси РНК е носител на генетична информация. В клетката той играе важна роля в преноса на информация от ДНК към протеина. РНК се синтезира върху ДНК шаблон. Този процес се нарича транскрипция. В ДНК има участъци, които съдържат информация, отговорна за синтеза на три вида РНК, които се различават по своите функции: информационна или информационна РНК (иРНК), рибозомна (рРНК) и транспортна (тРНК). И трите вида РНК по един или друг начин участват в протеиновия синтез. Информацията за протеиновия синтез обаче се съдържа само в иРНК.


Нуклеотидите са основната повтаряща се единица в молекулите на нуклеинова киселина, продукт на химично съединение от азотна основа, петвъглеродна захар (пентоза) и една или повече фосфатни групи. Нуклеотидите, присъстващи в нуклеиновите киселини, съдържат една фосфатна група. Наименуват се според съдържащата се в тях азотна основа - аденин (А) съдържащ аденин, гуанин (G) - гуанин, цитозин (С) - цитозин, тимин (Т) - тимин, урацил (U) - урацил. ДНК се състои от 4 вида нуклеотиди - A, T, G, C, РНК също има 4 вида - A, U, G, C. Захарта в състава на всички нуклеотиди на ДНК е дезоксирибоза, РНК е рибоза. По време на образуването на нуклеиновите киселини нуклеотидите чрез свързване образуват захарно-фосфатен скелет на молекулата, от едната страна на който има бази.


Праймерът е къса ДНК, използвана за репликиране на шаблонната верига. Всеки от праймерите е комплементарен към една от веригите на двойноверижния шаблон, рамкирайки началото и края на амплифицираната област.


Литература

  1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярна биотехнология. Принципи и приложение. пер. от английски. - М .: Мир, 2002. - 589 с., илюстрация. ISBN 5-03-003328-9
  2. Щелкунов С.Н. Генно инженерство - Новосибирск: Сиб. унив. издателство, 2004. - 496 с.; аз ще. ISBN 5-94087-098-8
  3. Патрушев Л.И. Изкуствени генетични системи - М .: Наука, 2005 - В 2 тома - ISBN 5-02-033278-X

ВАЖНО!

Информацията в този раздел не трябва да се използва за самодиагностика или самолечение. В случай на болка или друго обостряне на заболяването само лекуващият лекар трябва да предпише диагностични изследвания. За диагностика и правилно лечение трябва да се свържете с Вашия лекар.

Принципи на PCR диагностика

РЕЗЮМЕ

раздели, 34 стр., 5 фигури, 5 препратки

Целта на тази работа е кратко обобщение на основните принципи и технологични характеристики на метода PCR, неговото научно и практическо приложение в диагностиката на инфекциозни заболявания.

СПИСЪК НА КОНВЕНЦИОНАЛНИТЕ СЪКРАЩЕНИЯ

HCV - вирус на хепатит С

dATP - дезоксиаденозин трифосфат

dGTP - деоксигуанозин трифосфат

dNTP - дезоксинуклеотид трифосфат

dTTP - дезокситимидин трифосфат

dCTP - дезоксицитозин трифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеинова киселина

PCR - полимеразна верижна реакция

РНК - рибонуклеинова киселина - имуноглобулин клас GTime PCR - PCR метод в реално време

ВЪВЕДЕНИЕ

ПРИНЦИП НА МЕТОДА PCR

ЕТАПИ НА PCR АНАЛИЗ

PCR МЕТОД В РЕАЛНО ВРЕМЕ

ПРЕДИМСТВА НА МЕТОДА PCR

ОГРАНИЧЕНИЯ НА МЕТОДА PCR

ПРИЛОЖЕНИЕ НА МЕТОДА PCR

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСЪК НА ИЗПОЛЗВАНАТА ЛИТЕРАТУРА

ВЪВЕДЕНИЕ

Откриването на метода на полимеразна верижна реакция (PCR) се превърна в едно от най-забележителните събития в областта на молекулярната биология през последните десетилетия. Това направи възможно издигането на медицинската диагностика на качествено ново ниво. Принципът на метода на полимеразна верижна реакция е разработен от Carrie Mullis през 1983 г. За разработването на PCR анализ, К. Мълис е удостоен с Нобелова награда за химия през 1993 г.

След откриването на PCR, той много бързо беше въведен в практиката. Методът стана толкова популярен, че днес е трудно да си представим работа в областта на молекулярната биология без използването му. PCR методът получи особено бързо развитие благодарение на международната програма "Човешки геном". Създадени са съвременни лазерни технологии за секвениране (дешифриране на нуклеотидни последователности на ДНК). Ако в близкото минало декодирането на ДНК последователност от 250 базови двойки (bp) отнемаше една седмица, съвременните лазерни секвенатори могат да определят до 5000 bp. в един ден. Това от своя страна допринася за значително нарастване на информационните бази данни, съдържащи ДНК последователности. В момента са предложени различни модификации на PCR, показана е възможността за създаване на тестови системи за откриване на микроорганизми, откриване на точкови мутации и са описани десетки възможни приложения на метода.

Появата на PCR метода се дължи на някои постижения в областта на молекулярната генетика, главно на декодирането на нуклеотидната последователност на геномите на редица микроорганизми. Трябва да се отбележи, че това откритие беше придружено от развитието на някои технологии. По-специално, появата на устройства, които позволяват автоматичен синтез на едноверижни ДНК фрагменти (олигонуклеотиди). През същия период са открити уникални микроорганизми, живеещи в гейзери. Тяхната ензимна система, по-специално ДНК полимераза, издържа на високи температури на горещи извори и запазва биологичната си активност до 95°C, което е необходимо условие за полимеразната верижна реакция.

Полимеразната верижна реакция в момента е най-модерният диагностичен метод в молекулярната биология, молекулярната генетика и клиничната лабораторна диагностика, който позволява откриването на отделни клетки от патогени на много инфекциозни заболявания в тъканите и биологичните течности на тялото.

PCR методът се основава на комплементарното завършване на участък от геномна ДНК или РНК на патогена, проведено in vitro с помощта на ензима термостабилна ДНК полимераза. Спецификата на метода се определя от уникалността на генетичния материал на откритите инфекциозни агенти, към който се подбират олигонуклеотидните праймери, участващи в процеса на амплификация.

Диагностика на инфекциозни заболявания, включително причинени от трудни за култивиране агенти, генотипиране на микроорганизми, оценка на тяхната вирулентност, определяне на устойчивостта на микрофлората към антибиотици, пренатална диагностика, биологичен контрол на кръвни продукти - това е непълен списък от области на медицината използвайки PCR. Към днешна дата PCR анализът остава най-често срещаната и динамично развиваща се технология. Всяка година на пазара се появяват десетки нови тестови системи за PCR анализ, предназначени както за идентифициране на нуклеотидните последователности на различни микроорганизми, причиняващи заболявания, така и за изследване на човешки гени. Цената на PCR анализа непрекъснато намалява, което допринася за все по-широкото използване на метода в лечебните и диагностичните институции. Броят на PCR лабораториите в страните от ОНД нараства експоненциално и очевидно в близко бъдеще PCR анализът ще се превърне в един от най-разпространените методи за лабораторна диагностика.

1. ПРИНЦИП НА МЕТОДА PCR

Полимеразната верижна реакция е метод, който имитира естествената репликация на ДНК и позволява откриването на една специфична ДНК молекула в присъствието на милиони други молекули.

Същността на метода се състои в многократно копиране (амплифициране) на определени ДНК сегменти в епруветка в процеса на многократни температурни цикли. При всеки цикъл на амплификация предварително синтезираните фрагменти се копират отново от ДНК полимераза. Поради това има многократно увеличение на броя на специфичните ДНК фрагменти, което значително опростява по-нататъшния анализ.

PCR методът се основава на естествен процес - комплементарно попълване на ДНК матрицата, осъществявано с помощта на ензима ДНК полимераза. Тази реакция се нарича репликация на ДНК.

Естествената репликация на ДНК включва няколко стъпки:

) Денатурация на ДНК (развиване на двойната спирала, разминаване на ДНК вериги);

) Образуване на къси двойноверижни ДНК участъци (семена, необходими за започване на ДНК синтеза);

) Синтез на нова ДНК верига (комплементарно завършване на двете вериги).

Този процес може да се използва за създаване на копия на къси ДНК фрагменти, специфични за конкретни микроорганизми, т.е. да извършва целенасочено търсене на такива специфични области, което е целта на генната диагностика за идентифициране на патогени на инфекциозни заболявания.

Откриване на термостабилна ДНК полимераза (Taq полимераза) от термофилни бактерии Thermisaquaticus, чийто оптимум е от порядъка на 70-72°C, направи възможно да се направи процесът на репликация на ДНК цикличен и да се използва за работа in vitro. Създаването на програмируеми термостати (усилватели), които по зададена програма извършват циклични температурни промени, създаде предпоставки за широкото въвеждане на PCR метода в практиката на лабораторната клинична диагностика. При многократно повторение на циклите на синтез се получава експоненциално увеличаване на броя на копията на специфичен ДНК фрагмент, което позволява да се получи достатъчен брой ДНК копия за тяхната идентификация от малко количество анализиран материал, който може да съдържа единичен клетки от микроорганизми.

Комплементарното завършване на веригата не започва в която и да е точка на ДНК последователността, а само в определени начални блокове - къси двойноверижни участъци. Чрез прикрепването на такива блокове към специфични области на ДНК е възможно да се насочи процесът на синтез на нова верига само в тази област, а не по цялата дължина на ДНК веригата. Два олигонуклеотидни праймера (20 нуклеотидни двойки), наречени праймери, се използват за създаване на начални блокове в дадени ДНК региони. Праймерите са комплементарни на ДНК последователностите на лявата и дясната граница на специфичен фрагмент и са ориентирани по такъв начин, че завършването на нова ДНК верига става само между тях.

По този начин PCR е многократно увеличаване на броя на копията (амплификация) на специфична ДНК област, катализирана от ензима ДНК полимераза.

. ЕТАПИ НА PCR АНАЛИЗ

Техниката за анализ с помощта на метода PCR включва три етапа:

1. Изолиране на ДНК (РНК) от клинична проба;

2. Амплификация на специфични ДНК фрагменти;

. Откриване на продукти на амплификация.

. Изолиране на ДНК (РНК)

На този етап от анализа клиничната проба се подлага на специална обработка, която води до лизиране на клетъчния материал, отстраняване на протеинови и полизахаридни фракции и приготвяне на ДНК или РНК разтвор, свободен от инхибитори и готов за по-нататъшна амплификация . Изборът на техника за екстракция на ДНК (РНК) се определя главно от естеството на обработения клиничен материал.

2. Амплификация на специфични ДНК фрагменти

На този етап се натрупват къси специфични ДНК фрагменти в количеството, необходимо за тяхното по-нататъшно откриване.

За провеждане на полимеразна верижна реакция в реакционната смес трябва да присъстват редица компоненти:

· Грундове- изкуствено синтезирани олигонуклеотиди, имащи, като правило, размер от 15 до 30 bp, идентични на съответните участъци от целевата ДНК. Те играят ключова роля в образуването на продукти от реакцията на амплификация. Правилно подбраните праймери гарантират специфичността и чувствителността на тест системата.

· Taq полимераза- термостабилен ензим, осигуряващ завършване на 3 - краят на втората ДНК верига според принципа на комплементарността.

· Смес от дезоксинуклеотидни трифосфати (dNTPs)- дезоксиаденозин трифосфат (dATP), дезоксигуанозин трифосфат (dGTP), дезоксицитозин трифосфат (dCTP) и дезокситимидин трифосфат (dTTP) - "строителният материал", използван от Taq полимеразата за синтезиране на втората ДНК верига.

· буфер -смес от катиони и аниони в определена концентрация, осигуряваща оптимални условия за реакцията, както и стабилна стойност на pH.

· Проба се анализира- препарат, приготвен за въвеждане в реакционната смес, който може да съдържа желаната ДНК, например ДНК на микроорганизми, която служи като мишена за последващо многократно копиране.

Фиг.1 Компоненти на реакционната смес

Всеки цикъл на усилване включва 3 етапа, протичащи при различни температурни условия:

Етап 1:денатурация на ДНК (развиване на двойна спирала). Тече при 93-95°C за 30-40 секунди.

Една от веригите (+) се използва като основна матрица. Неговите пет лентови края са фиксирани от ензима ДНК полимераза, който осигурява изграждането на втора ДНК верига от отделни нуклеотиди, комплементарни на първата. Същото нещо, само в обратна посока, се случва на втората верига на ДНК, но тъй като размотаването на ДНК молекулата протича в обратен ред, нова верига се изгражда в малки фрагменти, които след това се зашиват заедно. За да може ензимът ДНК полимераза да започне своята работа, е необходим праймер или праймер - малък едноверижен ДНК фрагмент, който, свързвайки се с комплементарния участък на една от родителските ДНК вериги, образува начален блок за отглеждане на дъщерята нишка.

Етап 2:Прикрепване на праймери (отгряване). Прикрепването на праймера се извършва комплементарно на съответните последователности на противоположни ДНК вериги в границите на специфичен регион. Всяка двойка праймери има собствена температура на отгряване, чиито стойности са в диапазона 50-65°C. Точно изчислената и експериментално потвърдена температура на отгряване на праймера е една от характеристиките, определящи специфичността на реакцията, която изключва прикрепването на праймера към непълно комплементарни последователности.

Тъй като удължаването на дъщерни ДНК вериги може да се случи едновременно и на двете вериги на родителската ДНК, праймерът също е необходим, за да може ДНК полимеразата да работи върху втората верига. Така към реакционната смес се добавят два праймера. Всъщност праймерите, след като са се присъединили към противоположните вериги на ДНК молекулата, се ограничават до тази част от нея, която впоследствие ще бъде многократно удвоена или амплифицирана. Такива ДНК фрагменти се наричат ​​ампликони. Дължината на ампликона може да бъде няколко стотин нуклеотида. Чрез промяна на двойка праймери можем да преминем от анализа на един патоген към анализа на друг.

Време за отгряване -20-60 сек.

Етап 3:Изграждане на ДНК вериги (удължаване).

Механизмът на копиране е такъв, че удължаването на допълнителната верига може да не започне в която и да е точка на ДНК последователността, а само в определени начални блокове (къси двойноверижни участъци). За създаване на начални блокове в дадени ДНК области се използват праймери, които са олигонуклеотиди с дължина около 20 bp, наричани още праймери. Те са комплементарни на ДНК последователностите на лявата и дясната граница на специфичен фрагмент и са ориентирани по такъв начин, че ДНК синтезата, извършвана от ДНК полимераза, протича само между тях.

Комплементарното завършване на ДНК веригите протича в посока от 5'-края към 3'-края на веригата в противоположни посоки, започвайки от местата на прикрепване на праймера. Въведеният дезоксирибонуклеотид фосфат служи като материал за синтеза на нови ДНК вериги. Този процес се катализира от ензима Tag полимераза. Новата ДНК, образувана в първия цикъл на синтеза, служи като изходен материал за втория цикъл, в който се образува желаният специфичен ДНК фрагмент (ампликон) и т.н.

Фиг.2 Принцип на амплификация на ДНК

В момента се използват няколко метода за приготвяне на проба за PCR. Процедурата за подготовка на пробата включва микробен лизис и екстракция на нуклеинова киселина. За да се унищожат микробните клетки, се използва обикновено кипене, замразяване-размразяване в присъствието на лизозим, както и специални лизиращи буфери, съдържащи детергенти и протеиназа. Изборът на метод обикновено се диктува от естеството на микроба, по-точно от естеството на неговата клетъчна стена. Методът за получаване на чист ДНК препарат, описан от B.R. Marmionetal, се счита за стандартен и вече е станал класически. (1993). Включва ензимна протеолиза, последвана от депротеинизация и утаяване на ДНК с алкохол. Този метод позволява да се получи чист ДНК препарат, но е доста трудоемък и включва работа с такива агресивни и остри вещества като фенол и хлороформ.

Един от най-популярните е методът за екстракция на ДНК, предложен от R.Boometal. (1990), базиран на използването на силен лизиращ агент - гуанидин тиоцианат (GuSCN) за клетъчен лизис и последваща сорбция на ДНК върху носител (стъклени перли, диатомит, стъклено "мляко" и др.). След промиване ДНК остава в пробата, адсорбирана върху носителя, от който може лесно да бъде отстранена с помощта на елуиращ буфер. Методът е удобен, технологичен и подходящ за подготовка на проби за амплификация. Възможни са обаче загуби на ДНК поради необратима сорбция върху носителя, както и по време на многобройни измивания. Това е особено важно при работа с малки количества ДНК в пробата. В допълнение, дори следи от GuSCN могат да инхибират PCR, следователно, когато се използва този метод, правилният избор на сорбент и внимателното спазване на технологичните нюанси са много важни. Трябва да се отбележи, че поради големия брой етапи на добавяне и отстраняване на разтвори, е необходимо внимание при работа с проба, тъй като е възможно кръстосано замърсяване между пробите и получения ДНК аерозол.

Класическата процедура за екстракция на ДНК с фенол-хлороформ постига добро пречистване на ДНК, предимно от инхибитори на Tag-полимераза, но големи загуби на нуклеинова киселина са неизбежни, особено забележими при работа с малки обемни проби с ниска концентрация на инфекциозен агент.

Друга група методи за подготовка на проби се основава на използването на йонообменници от типа Chilex (САЩ), които, за разлика от стъклото, сорбират не ДНК, а примеси, които пречат на реакцията. По правило тази технология включва два етапа: кипене на пробата и адсорбция на примеси върху йонообменник. Методът е изключително атрактивен поради своята простота на изпълнение. В повечето случаи е подходящ за работа с клиничен материал. За съжаление, понякога има проби с примеси, които не могат да бъдат отстранени с помощта на йонообменници. Освен това някои микроорганизми не могат да бъдат унищожени чрез обикновено кипене. В тези случаи е необходимо въвеждането на допълнителни етапи на обработка на пробите.

При масов скрининг, когато е важно да се получат статистически данни, е възможно да се използват прости методи с използване на детергенти или обработка на биологичен материал с основи, последвана от тяхната неутрализация. В същото време използването на такива методи за клинична диагностика може да доведе до фалшиво отрицателни резултати поради използването на нискокачествен ДНК препарат в реакционната смес. Следователно изборът на метод за подготовка на пробата трябва да се третира с разбиране на целите на предвидените анализи.

По време на следващата процедура - амплификация - проба, съдържаща ДНК на патогена, се въвежда в малка епруветка с компоненти, които осигуряват полимеразната реакция, два вида праймери, два ензима (Tag полимераза и N-урацил гликолаза) и четири вида нуклеотид А, D, C, U. За провеждане на полимеразната реакция се използва специално устройство (термоциклер или ДНК усилвател), което позволява автоматично, според определена програма, да промени температурния режим на реакционната смес. В първия цикъл на PCR, пробата се нагрява до температура от 94°C, за да се разделят двете комплементарни вериги на ДНК. След това температурата се понижава до 40-60°C, при което праймерите се прикрепват към единична верига на ДНК, след което температурата отново се повишава до 72°C, когато активността на полимеразата е най-силно изразена. Целият цикъл с температурни промени продължава по-малко от 3 минути.

За да се оценят правилно резултатите от PCR, е важно да се разбере, че този метод не е количествен. Теоретично продуктите на амплификация на единични целеви ДНК молекули могат да бъдат открити чрез електрофореза след 30-35 цикъла. На практика обаче това се прави само в случаите, когато реакцията протича при условия, близки до идеалните, което е рядкост. Степента на чистота на ДНК препарата има особено голямо влияние върху ефективността на амплификацията; наличието на определени инхибитори в реакционната смес, от които в някои случаи може да бъде изключително трудно да се отървете. Понякога, поради тяхното присъствие, не е възможно да се амплифицират дори десетки хиляди целеви ДНК молекули. По този начин често няма пряка връзка между първоначалното количество целева ДНК и крайното количество продукти на амплификация.

Използват се различни методи за визуализиране на резултатите от амплификацията. Най-често срещаната днес е електрофорезата, базирана на разделянето на ДНК молекулите по размер. За да направите това, се приготвя плоча от агарозен гел, който се замразява с агароза след разтопяване в буфер за електрофореза при концентрация 1,5-2,5% с добавяне на специално ДНК багрило, например етидиев бромид. Замразената агароза образува пространствена решетка. При изливане с помощта на гребени в гела се образуват специални ямки, в които впоследствие се добавят продукти за усилване. Гелната плоча се поставя в хоризонтален апарат за гел електрофореза и се свързва източник на постоянно напрежение. Отрицателно заредената ДНК започва да се движи в гела от минус към плюс. В същото време по-късите ДНК молекули се движат по-бързо от дългите. Скоростта на движение на ДНК в гела се влияе от концентрацията на агароза, силата на електрическото поле, температурата, състава на буфера за електрофореза и, в по-малка степен, състава на ДНК. Всички молекули с еднакъв размер се движат с еднаква скорост. Багрилото се вгражда (интеркалира) в равнинни групи в ДНК молекули. След края на електрофорезата, която продължава от 10 минути до 1 час, гелът се поставя върху филтъра на трансилюминатор, излъчващ светлина в ултравиолетовия диапазон (254 - 310 nm). UV енергията, погълната от ДНК при 260 nm, се прехвърля към багрилото, което го кара да флуоресцира в оранжево-червената област на видимия спектър (590 nm).

Като "положителна контрола" използвайте стандартната ДНК на желания микроорганизъм. Размерът на неспецифичните ампликони може да бъде по-голям или по-малък в сравнение с "положителната контрола". В най-лошия случай тези размери могат да съвпаднат и се отчитат при електрофореза като положителни.

"Положителен контрол" ви позволява да се уверите, че всички компоненти, които съставляват реакционната смес, осигуряват нормалното протичане на реакцията. В същото време, ДНК препарат, приготвен за PCR от биологичен материал, може да съдържа примеси от инхибитори, които значително намаляват ефективността на реакцията и в някои случаи водят до липса на специфични ампликони дори в присъствието на желания патоген. Необходимо е да се контролира хода на амплификацията във всяка епруветка с реакционната смес, за което се използва допълнителен, така наречен "вътрешен контрол", който е всеки ДНК стандарт, който не е подобен на ДНК на желания микроорганизъм.

За инфекциозни тестови системи понякога се използва например p-глобинов ген, към чиито краища, с помощта на манипулации на генното инженерство, се пришиват ДНК участъци, които са хомоложни на праймерите, съставляващи тестовата система. Ако „вътрешният контрол“ се въведе в реакционната смес, тогава тя ще стане същата цел за отгряване на праймера като хромозомната ДНК на желания инфекциозен агент. Размерът на вътрешния контролен продукт на амплификация е избран така, че да е 2 или повече пъти по-голям от ампликоните, генерирани от амплификацията на целевата ДНК на микроорганизма. В резултат на това, ако в реакционната смес заедно с тестовата проба се въведе ДНК „вътрешен контрол“, тогава, независимо от наличието на микроорганизъм в биологичната проба, „вътрешният контрол“ ще предизвика образуването на специфични ампликони, но много по-дълъг (по-тежък) от ампликона на микроорганизма. Наличието на тежки ампликони в реакционната смес показва нормалния ход на реакцията на амплификация и отсъствието на инхибитори. Ако не са образувани ампликони с необходимия размер и "вътрешен контрол", може да се заключи, че анализираната проба съдържа нежелани примеси, които трябва да бъдат елиминирани, но не и липсата на желаната ДНК.

Въпреки цялата привлекателност на този подход, той има значителен недостатък. Така че, ако необходимата ДНК е в реакционната смес, тогава ефективността на нейното усилване рязко намалява поради конкуренцията с „вътрешния контрол“ за праймери. Това е фундаментално важно при ниски концентрации на ДНК в тестовата проба и може да доведе до фалшиво отрицателни резултати. Независимо от това, при условие че проблемът с конкуренцията за праймери е решен, този метод за контролиране на ефективността на амплификацията със сигурност ще бъде много полезен.

Фиг.3 Втори цикъл на амплификация на ДНК

. Откриване на продукти на амплификация

). Метод на хоризонтална електрофореза

Един от методите за визуализиране на резултатите от амплификацията е методът на електрофорезата, базиран на разделянето на ДНК молекулите по размер. В повечето техники на този етап сместа от продукти на амплификация, получена на 2-ри етап, се разделя чрез хоризонтална електрофореза в агарозен гел. Преди електрофоретичното разделяне към сместа за амплификация се добавя разтвор на етидиев бромид, който образува силни интерстициални връзки с двойноверижни ДНК фрагменти. Тези съединения под действието на UV облъчване могат да флуоресцират, което се записва като светещи ленти след електрофоретично разделяне на амплификационната смес в агарозен гел. Яркостта на лентите на усилващите продукти може да бъде различна. Поради това често е обичайно в лабораториите за PCR резултатът да се оценява според три-, четири- или петточкова система. Въпреки това, той не може да бъде свързан с първоначалното количество на целевата ДНК в пробата. Често намаляването на яркостта на лентите е свързано с намаляване на ефективността на усилване под въздействието на инхибитори или други фактори.

Фиг.4 Откриване на продукти на амплификация чрез хоризонтална електрофореза

). Метод на вертикална електрофореза

Методът на вертикалната електрофореза е фундаментално подобен на хоризонталната електрофореза. Тяхната разлика се състои в това, че в този случай вместо агароза се използва полиакриламид. Извършва се в специална камера за вертикална електрофореза. Електрофорезата с полиакриламиден гел има по-висока разделителна способност от агарозната електрофореза и дава възможност да се разграничат ДНК молекули с различни размери с точност до един нуклеотид. Приготвянето на полиакриламиден гел е малко по-сложно от агарозата. Освен това акриламидът е токсично вещество. Тъй като рядко възниква необходимостта от определяне на размера на продукта на амплификация с точност до 1 нуклеотид, този метод не се използва в рутинна работа.

3). Метод на хибридизационна сонда

Като алтернатива на метода за електрофоретично откриване, който има някои недостатъци: субективност при разчитане на резултатите, ограничения за определяне на ДНК на различни микроорганизми в една реакция, могат да бъдат предложени схеми за откриване на хибридизация. В тези схеми полученият от амплификацията ДНК фрагмент се хибридизира (образува 2-верижни комплекси - "хибриди") със специфична олигонуклеотидна проба. Регистрирането на такива комплекси може да се извърши колориметрично или флуориметрично.

3. PCR МЕТОД В РЕАЛНО ВРЕМЕ

Методът PCR в реално време дава възможност да се открият продуктите на амплификация по време на реакцията и да се наблюдава кинетиката на натрупване на ампликони. За откриване на PCR продукта се използват флуоресцентни багрила, които осигуряват флуоресценция, която е правопропорционална на количеството на PCR продукта - репортерна флуоресценция. Неговите механизми за генериране се различават в зависимост от конкретния тип PCR в реално време.

Кинетичната крива в координатите "Репортерно ниво на флуоресценция - цикъл на усилване" има S-образна форма.

Може да се раздели на три етапа:

1.Началния етап (когато PCR продуктите все още не са открити от флуоресцентния етикет).

2.Експоненциален етап (при който има експоненциална зависимост на количеството флуоресценция от PCR цикъла).

.Плато (етап на насищане).

Фиг.5 Графика на кинетичната крива на флуоресценцията чрез PCR в реално време

Регистрацията на флуоресцентен сигнал се извършва в процеса на амплификация на специално устройство - усилвател за Real-Time PCR. Чрез увеличаване на интензитета на флуоресцентния сигнал, концентрацията на първоначалната ДНК матрица се изчислява с помощта на софтуера, доставен с усилвателя.

Предимства на PCR в реално време

н възможността за откриване на натрупването на продукти на амплификация директно по време на амплификацията;

н основното предимство е възможността за откриване на натрупване на ампликони без отваряне на епруветката, което минимизира риска от получаване на фалшиви положителни резултати поради замърсяване на проби и реагенти с продукти на амплификация;

н значително намаляване на броя на манипулациите с тестовата проба намалява времето, опростява анализа и намалява вероятността от грешки;

н този подход позволява да се изостави етапът на електрофореза, което води до рязко намаляване на вероятността от замърсяване на изследваните проби с продукти на амплификация;

н намаляване на изискванията за PCR лаборатории;

н повишаване на обективността на интерпретацията на резултатите от PCR изследването, тъй като обработката се извършва с помощта на софтуера на устройството;

н значително, почти два пъти, общото време на изследването се намалява, което ви позволява да получите резултата в рамките на 1,5 - 2 часа след получаване на клиничния материал в лабораторията;

н този метод позволява за първи път да се определи количествено съдържанието на ДНК на микроорганизъм в клинична проба;

н използването на хибридизационни проби заедно с праймери осигурява повишаване на специфичността на анализа;

н възможността за независима едновременна регистрация на флуоресцентен сигнал от няколко хибридизационни ДНК сонди позволява откриването на няколко различни региона на една или различни ДНК цели в едно изследване.

. ПРЕДИМСТВА НА МЕТОДА PCR

н Директно откриване на патогени на инфекциозни заболявания

PCR методът дава директна индикация за наличието на специфичен ДНК фрагмент на патогена в материала, взет от пациента.

н Висока специфичност на PCR

С помощта на PCR метода в тествания материал се изолира ДНК фрагмент, присъщ само на специфичен патоген - бактерия или вирус. Този участък от ДНК е уникален и не е характерен за нито една инфекция на земята. Специфичността се определя от нуклеотидната последователност на праймерите, което елиминира възможността за получаване на грешни резултати, за разлика от метода на ензимен имуноанализ, където грешките не са необичайни поради кръстосано реагиращи антигени.

н PCR с висока чувствителност

PCR методът ви позволява да откриете дори единични клетки от бактерии или вируси. PCR диагностиката открива наличието на патогени на инфекциозни заболявания в случаите, когато е невъзможно да се направи това с други методи (имунологични, бактериологични, микроскопични). Чувствителността на PCR анализа е 10-1000 клетки на проба (чувствителността на имунологичните и микроскопските тестове е 103-105 клетки).

н Универсалност на PCR

Тъй като патогенът може да се съдържа във всякакви биологични секрети и тъкани, практически всякакви материали могат да се използват за PCR изследване, включително слуз, урина, кръв, серум, храчки, еякулат, изстъргвания от епителни клетки, които не са достъпни за изследване с други методи.

н Висока скорост на получаване на резултат от PCR анализ

PCR анализът не изисква изолиране и култивиране на културата на патогена, което отнема много време. Унифициран метод за обработка на биоматериали и откриване на реакционни продукти и автоматизация на процеса на амплификация позволява извършването на пълен анализ за 4-4,5 часа.

н Възможност за диагностициране на всякакъв вид инфекция

Високата чувствителност на PCR метода позволява да се диагностицира инфекция не само в острия стадий на заболяването, но и хронични инфекции и дори наличието на отделни бактерии или вируси.

Понастоящем предимството на PCR анализа пред метода на културата за откриване на микроорганизми е следното:

По-висока честота на откриване на микроба, надвишаваща същия показател при използване на метода на културата, с 6-7%. Тези разлики се обясняват с възможната смърт на микроба по време на съхранение и транспортиране, докато PCR може да открие и нежизнеспособни форми на микроорганизма.

Времето, необходимо за откриване на патогена чрез метода на културата, е около 4 дни, докато използването на PCR позволява откриването на микроба за 4-5 часа.

Използването на PCR технология позволява откриването на патогени, като хламидия, в неинвазивни проби, като проби от урина.

PCR методът е особено ефективен за диагностициране на трудни за култивиране, некултивирани и персистиращи форми на микроорганизми, които често се срещат при латентни и хронични инфекции, тъй като този метод избягва трудностите, свързани с отглеждането на такива микроорганизми в лабораторията.

н Възможност за задържане наблюдение и оценка на ефективността на терапията, особено при вирусни заболявания.

н Възможност за откриване отделни подвидове и щамове на вируси и бактерии.

н Способност за дефиниране няколко вида патогени (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonasvaginalis, Ureaplasmaurealyticum) от една епруветка с биологичен материал.

Този метод е сравним по трудоемкост с класическите методи (ензимен имуноанализ, имунофлуоресценция и др.), Но предоставя по-надеждна диагностична информация, позволявайки директно откриване на ДНК или РНК на инфекциозен агент в клиничен материал. Следователно PCR методът, заедно с културелния метод, е признат за "златен стандарт" за диагностика на инфекциозни заболявания.

5. ОГРАНИЧЕНИЯ НА МЕТОДА PCR

· По време на реакцията се усилва ДНК както на жив, така и на мъртъв микроорганизъм.

· Възможност за кръстосана реакция

Изборът на праймери се основава на съществуващите познания за генома на даден и подобни микроорганизми. Теоретично съществува възможност за наличие на същия фрагмент в други микроорганизми, чийто геном в момента не е декодиран и които не са тествани за възможност за кръстосана реактивност. Наличието на такива микроорганизми в пробата може да доведе до фалшиво положителен резултат от теста.

· Изменчивост на микроорганизмите

Въпреки че при проектирането на тестова система, фрагментът на генома, използван за амплификация, е избран от високо консервативна област, променливостта на микроорганизмите може да доведе до факта, че някои генотипове или щамове на изследвания патоген могат да придобият мутации в областта на генома, която се амплифицира, и по този начин стават неуловими за този тест.

Последните две точки са важни за разработчиците на PCR диагностикуми. Понастоящем са разработени стандарти, които управляват обхвата на тестването (включително тестване за кръстосана реактивност, както и тестване на известни щамове на откриваем патоген), които една тестова система трябва да премине, преди да влезе на пазара.

6. ПРИЛОЖЕНИЕ НА МЕТОДА PCR

полимеразна диагноза инфекциозно заболяване

PCR се използва в много области за анализ и в научни експерименти:

1. криминалистика

PCR се използва за сравняване на така наречените "генетични пръстови отпечатъци". Необходима е проба от генетичен материал от местопрестъплението - кръв, слюнка, сперма, коса и др. Тя се сравнява с генетичния материал на заподозрения. Достатъчно е много малко количество ДНК, теоретично - едно копие. ДНК се нарязва на фрагменти, след което се амплифицира чрез PCR. Фрагментите се разделят чрез ДНК електрофореза. Получената картина на местоположението на ДНК лентите се нарича генетичен пръстов отпечатък.

2. установяване на бащинство

При анализ на резултатите от електрофореза на ДНК фрагменти, амплифицирани чрез PCR баща-дете-майка, се установява, че детето ще наследи някои характеристики на генетичния отпечатък на двамата родители, което дава уникален отпечатък. Въпреки че "генетичните пръстови отпечатъци" са уникални (освен в случай на еднояйчни близнаци), семейните връзки все още могат да бъдат установени чрез създаване на няколко такива пръстови отпечатъка. Същият метод може да се приложи, с леки модификации, за установяване на еволюционни връзки между организмите.

3. медицинска диагностика

PCR позволява значително да се ускори и улесни диагностицирането на наследствени и вирусни заболявания. Генът, който представлява интерес, се амплифицира чрез PCR, като се използват подходящи праймери и след това се секвенира, за да се определят мутациите. Вирусните инфекции могат да бъдат открити веднага след заразяването, седмици или месеци преди появата на симптомите на заболяването.

4. генно клониране

Генното клониране е процес на изолиране на гени и в резултат на генно инженерни манипулации получаване на голямо количество от продукта на даден ген. PCR се използва за амплифициране на ген, който след това се вмъква във вектор, част от ДНК, която пренася чуждия ген в същия организъм или друг организъм, който е лесен за отглеждане. Като вектори се използват например плазмиди или вирусна ДНК. Вмъкването на гени в чужд организъм обикновено се използва за получаване на продукт от този ген – РНК или най-често протеин. По този начин се получават много протеини в индустриални количества за използване в селското стопанство, медицината и т.н.

5. ДНК секвениране

В метода за секвениране, използващ флуоресцентно или радиоактивно белязани дидезоксинуклеотиди, PCR е неразделна част, тъй като по време на полимеризацията нуклеотидните производни, белязани с флуоресцентен или радиоактивен етикет, се вмъкват в ДНК веригата. Това спира реакцията, позволявайки да се определят позициите на специфични нуклеотиди след разделяне на синтезираните нишки в гела.

6. мутагенеза

В момента PCR се превърна в основен метод за провеждане на мутагенеза (въвеждане на промени в нуклеотидната последователност на ДНК). Използването на PCR позволи да се опрости и ускори процедурата на мутагенеза, както и да я направи по-надеждна и възпроизводима.

7. диагностика на инфекциозни заболявания

Използването на PCR метода за диагностициране на инфекциозни заболявания от бактериална и вирусна природа е от голямо значение за решаването на много проблеми на микробиологията и епидемиологията. Използването на този метод допринася и за развитието на фундаменталните изследвания в областта на хроничните и малко проучени инфекциозни заболявания.

8. диагностика на вирусни заболявания

Най-изчерпателните ползи от PCR при диагностицирането на вирусни заболявания могат да бъдат демонстрирани чрез разглеждане на инфекциозния процес, причинен от вируса на хепатит С (HCV). PCR е от особена диагностична стойност за откриването на този вирус поради следните причини:

) липса на метод за култивиране на HCV; 2) не съществуват комплекти за антигенна диагностика; 3) реакцията на образуване на антитела срещу HCV е толкова бавна, че диагнозата по време на острата фаза на инфекцията по правило не може да бъде поставена.

Следователно използването на PCR технология за диагностика, контрол на качеството на лечението и епидемиологичен анализ на заболеваемостта, свързана с HCV, сега става общоприето.

В същото време само PCR технологията позволява решаването на следните задачи: 1) диагностициране на остра инфекция с късно откриване на антитела срещу HCV; 2) извършва етиологична диагностика на хроничен хепатит С при имуносупресирани пациенти; 3) оценка на ефективността на антивирусната терапия; 4) откриване на виремия при кръводарители с нормални нива на аминотрансферази; 5) определяне на възможно замърсяване на кръвни продукти; 6) оценка на широчината на разпространение на HCV.

9. Приложение на PCR в пулмологията и фтизиатрията

Честа причина за атипична пневмония, рецидивиращ хроничен бронхит са микоплазмите и хламидиите. Диагностиката на тези патогени чрез традиционните методи на микроскопия и култура е неефективна. PCR позволява не само да се диагностицира хламидия и микоплазмоза, но и да се извърши видова идентификация на патогена (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). Използването на PCR метода може значително да подобри ранната диагностика на туберкулозата. В момента са разработени и пуснати на пазара PCR комплекти за определяне на устойчивостта на микобактерии към антибиотици.

10. Приложение на PCR в кръвната служба

Изследването на донорска кръв за хепатит, сифилис, HIV чрез серологични методи не изключва опасността от използване на заразена кръв поради наличието на определен серонегативен период при тези заболявания, който може да бъде до няколко седмици от момента на появата на патогена в кръв. Най-ефективният метод за изследване на кръвта за наличието на тези патогени е PCR методът.

11. Приложение на PCR в неонатологията

Редица микроорганизми могат да заразят плода по време на бременност. Това са цитомегаловирус, токсоплазма, херпес вирус, вирус на рубеола, микоплазма, хламидия и др. Използването на серологични тестове за определяне на тези инфекции при новородени е неефективно, тъй като формирането на имунната система при дете се случва в рамките на няколко месеца и наличието на на инфекциозен агент може да не е придружено от производството на специфични антитела. От друга страна, майчините IgG антитела, които могат да преминат плацентарната бариера, могат да присъстват в кръвта на новородено за дълго време. По този начин наличието на специфичен IgG при дете през първите месеци от живота не показва наличието на патоген. Използването на PCR анализ значително увеличава възможностите за диагностициране на неонатални инфекции, включително тези на пренаталния етап.

12. Приложение на PCR в урогинекологичната практика

Сред инфекциозните агенти, засягащи урогениталния тракт, напоследък много внимание се обръща на патогените на латентни и хронични инфекции - хламидия, микоплазми. Болестите, причинени от тези патогени, се характеризират със замъгляване на клиничните симптоми, хронично протичане, което често води до увреждане на репродуктивните функции - спонтанен аборт, безплодие. Многобройни проучвания за използването на PCR метода за откриване на Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum, проведени в големи клиники в различни страни, показват високата ефективност на този метод. Признато е, че по чувствителност и ефективност PCR превъзхожда културелния метод, приет за „златен стандарт“.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По този начин PCR технологията е мощен инструмент, който дава възможност за изучаване и диагностика на хронични инфекциозни процеси, екологията на патогените на инфекциозни заболявания. PCR диагностичният метод допълва вече съществуващите методи за микробиологична диагностика, качествено променя методологията за решаване на приложни проблеми на медицинската микробиология и епидемиология.

Като вземем предвид гореизложеното, ще формулираме областите на изследване на инфекциозната патология, в решаването на които PCR започва да играе водеща роля.

Диагностика на хронични инфекциозни състояния, причинени от персистирането на бактерии или вируси. Това е най-очевидното приложение на PCR за диагностични цели.

PCR е най-ефективният метод за идентифициране и изследване на патогени, които, намирайки се в "некултивирано" състояние, могат да се задържат там, оцелявайки при неблагоприятни външни условия.

PCR позволява определяне на антибиотична резистентност при бавнорастящи и трудни за култивиране бактерии.

Обещаващи области на практическо използване на PCR диагностиката са:

диагностика на онкологични заболявания;

Диагностика на левкемия и лимфоми;

Диагностика на рак на гърдата

Диагностика на други злокачествени заболявания;

ДНК диагностиката на доброкачествени и злокачествени неоплазми е ограничена от малко, но нарастващо количество информация за гените, свързани с тези заболявания;

Диагностика на генетични заболявания.

Диагнозата на генетичните заболявания може да се развие само след задълбочени научни изследвания на човешкия геном. Въпреки това, медицинската общност вече е осъзнала важността на изучаването на генетичната основа на заболяванията, както и възможността за диагностициране и започване на лечение на заболяването, преди да се появят симптомите му;

Персонална идентификация: съдебна медицина, криминалистика; трансплантация на органи и тъкани; определение за бащинство. Експертите оценяват тази тенденция на пазара на ДНК диагностика като една от най-големите и най-бързо развиващите се;

Полимеразна верижна реакция (PCR)

Същността на метода PCR. ДНК полимераза

Полимеразната верижна реакция е експериментален метод на молекулярната биология, който позволява да се постигне значително увеличение на малки концентрации на определени фрагменти от нуклеинова киселина в биологичен материал. Този процес на увеличаване на броя на копията на ДНК се нарича усилване. Копирането на ДНК по време на PCR се извършва от специален ензим - полимераза.ДНК полимеразата (фиг. 3) е ензим, участващ в репликацията (усилване на ДНК в живите организми) на ДНК. Ензимите от този клас катализират полимеризацията на дезоксирибонуклеотиди по нуклеотидната верига на ДНК, която ензимът "чете" и използва като матрица. Типът на нов нуклеотид се определя от принципа на комплементарност с шаблона, от който се извършва четенето.

ДНК полимеразата добавя свободни нуклеотиди към 3" края на сглобената верига. Това води до удължаване на веригата в посока 5"-3. Нито една от известните ДНК полимерази не е в състояние да създаде верига "от нулата": те са способни само да добавят нуклеотиди към вече съществуваща 3"-хидроксилна група. Поради тази причина ДНК полимеразата се нуждае буквар- кратка последователност от нуклеотиди (обикновено 20-25), комплементарни на крайните участъци на изследвания ген - към които тя може да добави първия нуклеотид. Праймерите винаги са съставени от ДНК и РНК бази, като първите две бази винаги са РНК бази. Праймерите се синтезират от друг ензим - примаза. Друг ензим е хеликаза- необходими за размотаването на двойната спирала на ДНК с образуването на едноверижна структура, която осигурява репликацията на двете вериги в съответствие с полуконсервативния модел на репликация на ДНК.

Някои ДНК полимерази също имат способността да коригират грешки в новосглобената ДНК верига. Ако бъде открита неправилна двойка нуклеотиди, ДНК полимеразата се връща една стъпка назад, премахва грешния нуклеотид от веригата, след което вмъква правилния на негово място, след което репликацията продължава както обикновено.

Провеждане на PCR

Полимеразна верижна реакция (PCR) е метод за усилване на ДНК, който може да изолира и умножи определена ДНК последователност милиарди пъти в рамките на няколко часа. Възможността за получаване на огромен брой копия на една строго определена област на генома значително опростява изследването на съществуваща ДНК проба.

За да се осъществи полимеразната верижна реакция, трябва да са изпълнени редица условия. За PCR в най-простия случай са необходими следните компоненти:

ДНК матрица, съдържаща секцията от ДНК за амплифициране.

Два праймера, допълващи краищата на желания фрагмент. (Двойка изкуствено синтезирани олигонуклеотиди, обикновено с размер от 15 до 30 bp, идентични на съответните региони на таргетната ДНК. Те играят ключова роля в образуването на продукти от реакцията на амплификация. Правилно подбраните праймери гарантират специфичността и чувствителността на теста система.)

Термостабилна ДНК полимераза. Полимеразата, използвана в PCR, трябва да остане активна при висока температура за дълго време, поради което се използват ензими, изолирани от термофили - Thermus aquaticus (Taq полимераза) и други.

Дезоксинуклеотидни трифосфати (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Mg 2+ йони, необходими за работата на полимеразата.

Буферен разтвор, който осигурява необходимите условия за реакция - pH, йонна сила на разтвора. Съдържа соли, серумен албумин.

За да се избегне изпаряването на реакционната смес, в епруветката се добавя масло с висока температура на кипене, като вазелин. Ако се използва устройство с отопляем капак, това не е задължително.

Добавянето на пирофосфатаза може да увеличи добива на PCR реакцията. Този ензим катализира хидролизата на пирофосфат, страничен продукт от добавянето на нуклеотидни трифосфати към нарастващата ДНК верига, към ортофосфат. Пирофосфатът може да инхибира PCR реакцията.

За да се умножи броят на копията на оригиналната ДНК, е необходима циклична реакция. По правило всеки от последователно повтарящите се PCR цикли се състои от три етапа:

1. Денатурация или "стопяване" на ДНК.Двойноверижната ДНК матрица се нагрява до 94 - 96°C (или 98°C, ако се използва особено термостабилна полимераза) за 0,5 - 2 минути, за да се позволи на ДНК веригите да се разделят. Тази стъпка се нарича денатурация, защото водородните връзки между двете вериги на ДНК се разкъсват. Понякога, преди първия цикъл (преди добавяне на полимеразата), реакционната смес се загрява предварително за 2-5 минути, за да денатурира напълно шаблона и праймерите. Този подход се нарича горещ старт, позволява да се намали количеството на неспецифичните реакционни продукти.

2. Отгряване - свързване на праймери с матрична ДНК. След като нишките са се разделили, температурата бавно се понижава, за да се позволи на праймерите да се свържат с едноверижния шаблон. Температурата на отгряване зависи от състава на грунда и обикновено се избира при 50–65°C. Сценово време - 20 - 60 секунди. Неправилният избор на температура на отгряване води или до лошо свързване на праймерите към шаблона (при повишена температура), или до свързване на неправилно място и поява на неспецифични продукти (при ниска температура).

3. Синтез (удължение на веригата).ДНК полимеразата репликира шаблонната верига, използвайки праймера като "семе". Полимеразата започва синтеза на втората верига от 3" края на праймера, който се е свързал с шаблона и се движи по шаблона. Температурата на удължаване зависи от полимеразата. Често използваните Taq и Pfu полимерази са най-активни при 72 °C дължината на фрагмента, който трябва да бъде амплифициран. Обикновено времето за удължаване се приема като една минута за всеки хиляда базови двойки. След като всички цикли са завършени, често се извършва допълнителна стъпка крайно удължениеза завършване на всички едноверижни фрагменти. Този етап продължава 7-10 минути.

Впоследствие етапите на денатурация, отгряване и удължаване се повтарят многократно (30 или повече пъти). При всеки цикъл броят на синтезираните копия на ДНК фрагмент се удвоява.

Всички реакции се провеждат в епруветки, потопени в термостат. Промяната на температурния режим и поддържането му се извършва автоматично.

За да се разбере как точно се извършва амплификацията на определен ДНК сегмент по време на PCR, е необходимо ясно да се разбере позицията на всички праймери и техните комплементарни последователности в амплифицируемите вериги във всеки кръг. В първия кръг всяка от новосинтезираните вериги е много по-дълга от разстоянието от 3"-хидроксилната група на нейния праймер до крайния нуклеотид на последователността, комплементарна на втория праймер. Такива вериги се наричат ​​"дълги шаблони", това върху тях ще се осъществи по-нататъшен синтез.

Във втория кръг двойноверижната ДНК, състояща се от подобни и новосинтезирани (дълги шаблонни) вериги, отново се денатурира и след това се отгрява с праймери. По време на синтеза в този кръг отново се синтезират "дълги шаблони", както и редица вериги с праймер в единия край и с последователност, комплементарна на втория праймер в другия ("къси шаблони"). По време на третия кръг, всички хетеродуплекси, образувани по-рано, се денатурират едновременно и се отгряват с праймери и след това се репликират. В следващите кръгове има все повече и повече "къси матрици", а към 30-ия кръг броят им вече е 10 6 пъти по-голям от броя на началните вериги или "дългите матрици".

Количеството специфичен реакционен продукт (ограничен от праймери) теоретично нараства пропорционално на 2 n, където n е броят на реакционните цикли. Всъщност ефективността на всеки цикъл може да бъде по-малка от 100%, така че в действителност:

където P е количеството продукт, E е средната ефективност на цикъла.

Броят на "дългите" ДНК копия също расте, но линейно, така че специфичен фрагмент доминира в продуктите на реакцията. Растежът на необходимия продукт е експоненциално ограничен от количеството реагенти, наличието на инхибитори и образуването на странични продукти.

PCR е високочувствителен метод, следователно, ако има дори незначително количество ДНК в тестовата проба, която случайно е попаднала от една реакционна смес в друга, могат да се получат фалшиво положителни резултати. Това налага внимателно да се контролират всички разтвори и прибори, използвани за PCR.

Основни принципи на избор на грунд.

При създаването на PCR тестова система една от основните задачи е правилният избор на праймери, които трябва да отговарят на редица критерии:

1. Грундовете трябва да са специфични. Особено внимание се обръща на 3 "края на праймерите, тъй като именно от тях Taq полимеразата започва да завършва комплементарната ДНК верига. Ако тяхната специфичност е недостатъчна, тогава най-вероятно ще се появят нежелани процеси в епруветката с реакционната смес , а именно синтеза на неспецифична ДНК (къси или дълги фрагменти). Вижда се при електрофореза под формата на тежки или леки допълнителни ленти. Това затруднява оценката на резултатите от реакцията, тъй като е лесно да се обърка специфичен амплификационен продукт със синтезирана чужда ДНК. Някои праймери и dNTPs се изразходват за синтеза на неспецифична ДНК, което води до значителна загуба на усещане.

2. Грундовете не трябва да образуват димери и бримки, т.е. не трябва да се образуват стабилни двойни нишки чрез отгряване на праймерите към самите тях или един към друг.

Наскоро беше разработен надежден, високочувствителен и бърз метод за диагностициране на различни човешки инфекциозни заболявания. Този метод се нарича "PCR анализ". Какво е това, каква е неговата същност, какви микроорганизми може да разкрие и как да го приемаме правилно, ще кажем в нашата статия.

История на откритията


Също така PCR методите се използват при диагностицирането на рак.

Предимства на метода

PCR диагностиката има няколко предимства:

  1. Висока чувствителност. Дори при наличието само на няколко молекули ДНК на микроорганизма, PCR анализът определя наличието на инфекция. Методът ще помогне при хронични и латентно протичащи заболявания. Често в такива случаи микроорганизмът е иначе некултивиран.
  2. Всеки материал е подходящ за изследване, например слюнка, кръв, генитални секрети, коса, епителни клетки. Най-често се извършва кръвен тест и урогенитална намазка за PCR.

  3. Не се изисква дългосрочно отглеждане на култури. Автоматизираният диагностичен процес ви позволява да получите резултатите от изследването след 4-5 часа.
  4. Методът е почти 100% надежден. Регистрирани са само отделни случаи на фалшиво-отрицателни резултати.
  5. Възможност за идентифициране на няколко вида патогени от една материална проба. Това не само ускорява процеса на диагностициране на заболяването, но и значително намалява материалните разходи. Често лекарят предписва цялостен PCR анализ. Цената на изследването, състояща се от определянето на шест патогена, е около 1500 рубли.

    6. За да бъдат резултатите надеждни по време на PCR изследването, е необходимо да се премине анализът, следвайки препоръките за предварителна подготовка за диагностика:

    1. Преди да дарите слюнка, трябва да се въздържате от ядене и приемане на лекарства 4 часа преди да вземете материала. Непосредствено преди процедурата изплакнете устата си с преварена вода.
    2. Горните правила трябва да се спазват и при вземане на проба от вътрешната повърхност на бузата. След изплакване се препоръчва да се извърши лек масаж на кожата, за да се подчертае тайната на жлезата.
    3. Урината обикновено се събира у дома. За да направите това, трябва да извършите щателна тоалетна на гениталиите. Съберете 50-60 ml урина в стерилен пластмасов съд. За да се гарантира чистотата на материала, се препоръчва жените да поставят тампон във влагалището, а мъжете да изтеглят кожната гънка доколкото е възможно. Не можете да вземете материала по време на менструалния цикъл.
    4. За да дарите сперма, трябва да се въздържате от полов акт 3 дни преди събирането на материала. Лекарите съветват също така да не се посещава сауна и да се взема гореща вана, да се пие алкохол и пикантна храна. 3 часа преди анализа трябва да се въздържате от уриниране.
    5. При раждане, например, ако се прави PCR тест за хламидия, се препоръчва и на жените, и на мъжете да имат полов покой в ​​продължение на 3 дни. 2 седмици преди анализа не трябва да се приемат антибактериални лекарства. За една седмица трябва да спрете да използвате интимни гелове, мехлеми, вагинални супозитории, душове. 3 часа преди изследването трябва да се въздържате от уриниране. По време на менструация вземането на материал не се извършва, само 3 дни след спиране на изтичането на кръв можете да вземете урогенитална намазка.

    PCR по време на бременност

    Докато чакате бебе, много полово предавани инфекции са изключително опасни за нормалното развитие на плода. Полово предаваните болести могат да провокират вътрематочно забавяне на растежа, спонтанен аборт или преждевременно раждане, вродени малформации на детето. Ето защо е изключително важно да се подложите на PCR изследване в ранна бременност. Необходимо е да се премине анализът при регистрация - до 12 седмици.

    Материалът се взема от цервикалния канал с помощта на специална четка. Процедурата е безболезнена и не представлява опасност за бебето. Обикновено по време на бременност се извършва анализ за хламидия чрез PCR метод, както и за уреаплазмоза, микоплазмоза, цитомегаловирус, херпес, папиломен вирус. Такъв комплекс от изследвания се нарича PCR-6.

    PCR за диагностика на ХИВ

    Поради факта, че методът е много чувствителен към промените в тялото и условията на диагнозата, много фактори могат да повлияят на резултата. Следователно PCR анализът за HIV инфекция не е надежден метод, неговата ефективност е 96-98%. В останалите 2-4% от случаите тестът дава фалшиво положителни резултати.

    Но в някои ситуации не може да се направи без PCR диагностика на ХИВ. Обикновено се дава на хора с фалшиво-отрицателен резултат от ELISA. Такива показатели показват, че човек все още не е развил антитела срещу вируса и те не могат да бъдат открити без многократно увеличаване на броя. Точно това може да се постигне чрез провеждане на кръвен тест по метода PCR.

    Такава диагностика е необходима и за деца от първата година от живота, родени от ХИВ-позитивна майка. Методът е единственият начин за надеждно определяне на състоянието на детето.

    PCR за диагностика на хепатит

    Методът на полимеразна верижна реакция позволява да се открие ДНК на вируса на хепатит А, В, С много преди образуването на антитела срещу инфекцията или появата на симптомите на заболяването. Анализът на PCR за хепатит С е особено ефективен, тъй като в 85% от случаите това заболяване е асимптоматично и без навременно лечение преминава в хроничен стадий.

    Навременното откриване на патогена ще помогне да се избегнат усложнения и дългосрочно лечение.

    Цялостно PCR изследване

    Цялостен PCR анализ: изследване чрез метода на полимерна верижна реакция, което включва едновременно определяне на няколко вида инфекции: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, цитомегаловирус, херпес тип 1 и 2, гонорея, папиломавирус. Цената на такава диагностика варира от 2000 до 3500 рубли. в зависимост от клиниката, използваните материали и оборудване, както и от вида на анализа: качествен или количествен. Какво е необходимо във вашия случай - лекарят ще реши. В някои случаи е достатъчно само да се определи наличието на патогена, в други, например при HIV инфекция, количественият титър играе важна роля. При диагностициране на всички горепосочени патогени, изследването се нарича "PCR-12 анализ".

    Дешифриране на резултатите от анализа

    Дешифрирането на PCR анализа не е трудно. Има само 2 скали на показателя - "положителен резултат" и "отрицателен резултат". Когато се открие патоген, лекарите могат да потвърдят наличието на болестта с 99% сигурност и да започнат лечението на пациента. При количествен метод за определяне на инфекцията в съответната колона ще бъде посочен цифровият показател за откритите бактерии. Само лекар може да определи степента на заболяването и да предпише необходимото лечение.

    В някои случаи, например при определяне на HIV инфекция чрез PCR, с отрицателен резултат, става необходимо да се проведат допълнителни изследвания за потвърждаване на получените показатели.

    Къде да вземем анализа?

    Къде да направите PCR анализ: в държавна клиника или в частна лаборатория? За съжаление в общинските лечебни заведения често оборудването и методиката са остарели. Ето защо е по-добре да се даде предпочитание на частни лаборатории с модерно оборудване и висококвалифициран персонал. Освен това в частна клиника ще получите резултат много по-бързо.

    В Москва много частни лаборатории предлагат PCR анализ за различни инфекции. Например в такива клиники като Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro се извършва PCR анализ. Цената на прегледа е от 200 рубли. за идентифициране на отделен патоген.

    Може да се заключи, че диагностицирането на инфекциозни заболявания чрез PCR в повечето случаи е бърз и надежден начин за откриване на патогена в тялото в ранните стадии на инфекцията. Но все пак в някои случаи си струва да изберете други диагностични методи. Само специалист може да определи необходимостта от такова изследване. Дешифрирането на PCR анализа също изисква професионален подход. Следвайте инструкциите на Вашия лекар и не правете тестове, които не са Ви необходими.