При положителен RSC в експеримента се наблюдава. Реакция на фиксиране на комплемента

Реакцията на фиксиране на комплемента (RCC) се основава на факта, че специфичен комплекс антиген-антитяло винаги адсорбира (свързва) комплемента върху себе си.

Тази реакция се използва широко при идентифицирането на антигени и при серодиагностиката на инфекции, особено заболявания *, причинени от спирохети (реакция на Васерман), рикетсии и вируси.

RSK е сложна серологична реакция. Включва комплемент и две системи антиген-антитяло. По същество това са две серологични реакции.

Първата система, основната, се състои от антиген и антитяло (едното е известно, другото не). Към него се добавя известно количество комплемент. Когато антигенът и антитялото на тази система съвпаднат, те ще свържат и свържат комплемента. Полученият комплекс е фино диспергиран и не се вижда.

Образуването на този комплекс е известно с помощта на втора хемолитична или индикаторна система. Той включва овчи еритроцити (антиген) и съответния хемолитичен серум (антитела), т.е. готов имунен комплекс. В тази система лизисът на еритроцитите може да настъпи само в присъствието на комплемент. Ако комплементът е свързан с първата система (ако антигенът и антитялото съответстват в него), тогава няма да има хемолиза във втората система - тъй като няма свободен комплемент. Липсата на хемолиза (съдържанието на епруветката е мътна или има еритроцитна утайка на дъното на епруветката) се записва като положителен резултат от RSK.

Ако в първата система антигенът не съвпада с антитялото, тогава имунният комплекс не се образува и комплементът ще остане свободен! Оставайки свободен, комплементът участва във втората система, причинявайки хемолиза - резултатът от RSK е отрицателен (съдържанието на тръбите е прозрачно - "лакова кръв").

Компоненти на реакцията на фиксиране на комплемента:

Антиген – обикновено лизат, екстракт, хаптен; затваряйте по-рядко.

1. Антитяло-серум на системата на пациента
2. Комплемент - серум от морско свинче

3. Антиген - овчи еритроцити

4.Антитела - хемолизин към овешки еритроцити

5. Изотоничен разтвор

Поради факта, че голям брой сложни компоненти участват в RSC, те трябва да бъдат предварително титрувани и взети в реакцията в точни количества и в равни обеми: 0,5 или 0,25, по-рядко 0,2 ml. Съответно, целият експеримент се провежда в обеми от 2,5, 1,25 или 1,0 ml (по-големите обеми дават по-точен резултат). Титруването на реакционните компоненти се извършва в същия обем като експеримента, като липсващите съставки се заместват с изотоничен разтвор.

Подготовка на съставките

Хемолитичен серум (хемолизин). Серумът се разрежда 3 пъти по-малко от неговия титър (виж стр. 211). Пригответе общо разреждане на серума за целия експеримент, чийто обем се определя чрез умножаване на обема на серума в една епруветка (например 0,5 ml) по броя на епруветките, малко по-голям от броя им в експеримента.

2. Овчи еритроцити. Пригответе 3% суспензия от промити овчи еритроцити (виж стр. 211) за целия брой епруветки в опита. За да се подготви хемолитичната система, 30 минути преди добавянето й към експеримента, равни обеми от разреден хемолизин и еритроцитни суспензии се смесват, като се добавя серум към еритроцитите, разбърква се старателно и се инкубира в продължение на 30 минути при 37°C.

3. Добавката обикновено се разрежда 1:10. трябва да се титрира преди всеки опит. Титърът на комплемента е най-малкото му количество, когато се добави към хемолитичната система, пълната хемолиза настъпва в рамките на 1 час при 37°C. Схемата за титруване на комплемента е представена в таблица 21.

внимание! Комплиментът се титрува в същия обем като основния експеримент, като липсващите съставки се заместват с изотоничен разтвор.

Отчитане на резултатите. В контролите не трябва дори да има следи от хемолиза, тъй като в едната от тях липсва комплемент, а в другата липсва хемолизин. Контролите показват липсата на реакции на хемотоксичност (способност за спонтанно лизиране на еритроцитите) в компонентите.

На масата. 21 пример, титърът на комплемента в разреждане 1:10 е 0,15 ml. В експеримента активността на комплемента може да намалее поради неспецифичната му адсорбция от други компоненти на реакцията, следователно за експеримента количеството на комплемента се увеличава: взема се дозата, следваща титъра. Това е работната доза. В дадения пример той е равен на 0,2 комплемента в разреждане 1:10. Тъй като всички компоненти, участващи в CSC, трябва да се приемат в равни обеми (в нашия пример това е 0:5 ml), е необходимо да се добавят 0,3 ml изотоничен разтвор към работната доза комплемент (0,2 ml 1:10). За цялото преживяване обемът на всеки от тях (комплемент и изотоничен разтвор.

За целия експеримент обемът на всеки от тях (комплемент и изотоничен физиологичен разтвор) се умножава по броя на епруветките, включени в CSC. Например, за да проведете експеримент в 50 епруветки, трябва да вземете 10 ml комплемент 1:10 (0,2 mlx50) и 15 ml изотоничен разтвор (0,3 mlx50).

4. Антигенът обикновено се получава готов с указание за титъра му, т.е. количеството, което след разреждане на антигена трябва да се съдържа в 1 ml. например при титър 0,4 се разрежда в 0,96 ml изотоничен физиологичен разтвор. В експеримента вземам количеството антиген, равно на половината от титъра (0,5 ml). Това е работната му доза. Кажете общото разреждане на антигена за целия опит, като умножите 0,5 ml по броя на епруветките в опита.

5. Антитяло - серум на пациента. Пресният серум се инактивира преди експеримента, за да се унищожи присъстващият в него комплемент. За целта се загрява 30 минути при 56°C на водна баня или в инактиватор с термостат. Последният метод е за предпочитане: той елиминира възможността от прегряване на серума, т.е. неговата денатурация. Денатурираните серуми не са подходящи за тестване. Серумът на пациента обикновено се използва в разреждане от 1:10 до 1:160.

Таблица № 14

Състав, мл	епруветки
опит	контрол
										Хемолитична система	еритроцити
Изотоничен разтвор	1,45	1,4	1,35	1,3	1,25	1,2	1,15	1,1	1,05	1,0	1,5	1,5
Допълнение 1:10	0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3	0,35	0,4	0,45	0,5	―	0,5
Хемолитична система	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	―
3% суспензия от овчи еритроцити	―	―	―	―	―	―	―	―	―	―	―	0,5
Епруветките се разклащат старателно и се инкубират при 37°C за 1 час.
резултат	Няма хемолиза	Хемолиза	Няма хемолиза

Имунните серуми най-често се приготвят в индустриални условия и се освобождават инактивирани. Развъждат се 1:50 и нагоре.

Всички компоненти се приготвят с лек излишък.

Състав, мл	епруветки

Контрол на опита
	серум	антиген	Хемолитична система	Добавка в работна доза
½
Фаза 1 Изотоничен физиологичен разтвор	―	0,5	0,5	1,5	1,25	1,0	0,5
Тестван серум, разреден 1:10	0,5	0,5	―	―	―	―	―
Антиген в работна доза	0,5		0,5	―	―	―	―
Добавка 1:10 в работна доза	0,5	0,5	0,5	―	0,25	0,5	1,0
Епруветките се разклащат старателно и се инкубират при 37°C за 45 min 1 h или 4°C за 18 h
Фаза 2 хемолитична система	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Епруветките се разклащат старателно и се инкубират при 37°C до пълна хемолиза в 2, 3, 6 и 7 епруветки
Резултат	Положителен или отрицателен	―	―	++++	(+)	―	―

Таблица № 15

Провеждане на основния опит

При поставянето на експеримент е изключително; важен е редът, в който се добавят компонентите. Експериментът се провежда в две фази.

Фаза I. В епруветките се налива необходимото количество изотоничен разтвор на натриев хлорид, след това необходимото количество разреден серум и работните дози антиген и комплемент в същия обем. Опитът е задължително придружен от контрол на всички участващи в него съставки: серум, антиген, хемолитична система и комплемент.

Епруветките се разклащат старателно и се инкубират при 37°C за 45 min-1 h или при 4°C („CSC на студено“) за 18 ч. През това време, в присъствието на специфичен комплекс, настъпва фиксиране на комплемента. Провеждането на реакцията "на студено" значително повишава нейната чувствителност и специфичност.

Фаза II В края на инкубацията във всички епруветки се добавя по 1 ml от хемолитичната система, която предварително се държи в термостат за 30 минути (сенсибилизирана). Епруветките се разклащат и се връщат обратно в термостата.

Счетоводен резултат около при. Епруветките се оставят в термостат до пълна хемолиза във 2-ра, 3-та, 6-та и 7-ма епруветки (контрол на серум, антиген и комплемент за една и две дози). Първо ще настъпи хемолиза в 7-ма епруветка, която съдържа двойно количество комплемент. След като настъпи хемолиза в тази тръба и съдържанието й стане напълно прозрачно, трябва внимателно да наблюдавате останалите контроли. Веднага щом течността във 2-ра, 3-та и 6-та епруветки стане прозрачна, трябва незабавно да извадите стойката с епруветки от термостата. Фактът, че експериментът не е бил държан в термостата по-дълго от необходимото, се показва от наличието на леко помътняване (непълна хемолиза) в 5-та епруветка - тя съдържа само половината от работната доза комплемент и пълна хемолиза при правилна настройка на експериментът не може да бъде.

Хемолизата в серумните и антигенните контроли (епруветки 2 и 3) показва, че техните дози са избрани правилно и че нито серумът, нито антигенът на комплемента се свързват сами.

При контрола на хемолитичната система (епруветка 4), ако работи правилно, не трябва да има дори следи от хемолиза - липсва й комплемент.

След като се уверите, че контролите са преминали правилно, опитът може да бъде взет под внимание. Липсата на хемолиза в опитните епруветки се счита за положителен резултат от реакцията. Това показва, че в серума има антитела, които са специфични за взетия антиген. Образуваният от тях комплекс свързва комплемента и предотвратява участието му в реакцията на хемолиза. Ако се появи хемолиза в епруветките, резултатът от реакцията се оценява като отрицателен. В този случай няма съответствие между антигена и антитялото, комплементът не е свързан и участва в реакцията на хемолиза.

Успоредно със серума на пациента, същият експеримент се провежда с известен положителен серум (т.е. със серум, в който има антитела към даден антиген) и известен отрицателен, в който няма специфични антитела. При правилната настройка на експеримента в първия случай трябва да има забавяне на хемолизата, а във втория случай ще има хемолиза.

Интензивността на реакцията се изразява, както следва:

Пълно забавяне на хемолизата. Еритроцитите образуват равномерна мътност или се утаяват на дъното. В този случай течността в епруветката става безцветна;

Лизира приблизително 25% от еритроцитите. Утайката е по-малка, течността над нея е леко розова. Резултатът от RSC също се оценява като рязко положителен;

Лизира приблизително 50% от еритроцитите. Утайката е малка, течността е розова. Положителен RSK резултат;

Лизира приблизително 75% от еритроцитите. Незначителна утайка, интензивно оцветена течност над нея. Съмнителен резултат от RSK;

Всички еритроцити бяха лизирани. Течността е наситено оцветена и напълно прозрачна. Отрицателен RSK резултат.

Лабораторната диагностика на почти всички инфекциозни заболявания се основава на откриването на антитела в кръвта на пациента, които се произвеждат срещу антигените на патогена, чрез методите на серологичните реакции. Навлизат в медицинската практика от края на деветнадесети до началото на двадесети век.

Развитието на науката помогна да се определи антигенната структура на микробите и химичните формули на техните токсини. Това направи възможно създаването не само на терапевтични, но и на диагностични серуми. Те се получават чрез прилагане на атенюирани патогени на лабораторни животни. След няколко дни експозиция се приготвят препарати от кръвта на зайци или мишки, които се използват за идентифициране на микроби или техните токсини чрез серологични тестове.

Външната проява на такава реакция зависи от условията на нейната настройка и от състоянието на антигените в кръвта на пациента. Ако микробните частици са неразтворими, те се утаяват, лизират, свързват или имобилизират в серума. Ако антигените са разтворими, тогава се появява феноменът на неутрализация или утаяване.

Реакция на аглутинация (RA)

Реакцията на серологична аглутинация е много специфична. Той е лесен за изпълнение и достатъчно визуален за бързо определяне на наличието на антигени в кръвния серум на пациента. Използва се за стадиране на реакцията на Vidal (диагностика на коремен тиф и паратиф) и Weigl (коремен тиф).

Основава се на специфично взаимодействие между човешки антитела (или аглутинини) и микробни клетки (аглутеногени). След тяхното взаимодействие се образуват частици, които се утаяват. Това е положителен знак. Живи или убити микробни агенти, гъбички, протозои и соматични клетки могат да се използват за установяване на реакцията.

Химически реакцията се разделя на два етапа:

Специфична връзка на антитела (AT) с антигени (AG).
Неспецифично - утаяване на AG-AT конгломерати, т.е. образуване на аглутинат.

Реакция на индиректна аглутинация (IPHA)

За производството му се използват пречистени овчи еритроцити и човешки червени кръвни клетки, предварително обработени с антитела или антигени (зависи какво точно иска да открие лаборантът). В някои случаи човешките червени кръвни клетки се третират с имуноглобулини. Серологичните реакции на еритроцитите се считат за настъпили, ако те са се утаили на дъното на епруветката. За положителна реакция можем да говорим, когато клетките са подредени под формата на обърнат чадър, заемащ цялото дъно. Отрицателна реакция се отчита, ако еритроцитите се утаяват в колона или под формата на бутон в центъра на дъното.

Реакция на утаяване (RP)

Серологичните тестове от този тип се използват за откриване на изключително малки частици от антигени. Това могат да бъдат например протеини (или части от тях), съединения на протеини с липиди или въглехидрати, части от бактерии, техните токсини.

Серумите за реакцията се получават чрез изкуствено заразяване на животни, обикновено зайци. По този метод можете да получите абсолютно всеки утаяващ серум. Механизмът на действие на серологичните реакции на утаяване е подобен на реакциите на аглутинация. Антителата, съдържащи се в серума, се комбинират с антигени, за да образуват големи протеинови молекули, които се отлагат на дъното на епруветката или върху субстрата (гел). Този метод се счита за много специфичен и може да открие дори незначителни количества от дадено вещество.

Използва се за диагностициране на чума, туларемия, антракс, менингит и други заболявания. Освен това той участва в съдебномедицинска експертиза.

в гел

Серологичните реакции могат да се извършват не само в течна среда, но и в агар гел. Това се нарича метод на дифузно утаяване. С негова помощ се изучава съставът на сложни антигенни смеси. Този метод се основава на хемотаксиса на антигени към антитела и обратно. В гела те се движат един към друг с различна скорост и, срещайки се, образуват линии на утаяване. Всяка линия е един набор от AG-AT.

Реакция на неутрализация на екзотоксин с антитоксин (RN)

Антитоксичните серуми са в състояние да неутрализират действието на екзотоксина, който се произвежда от микроорганизми. Тези серологични реакции се основават на това. Микробиологията използва този метод за титриране на серуми, токсини и токсоиди и определяне на тяхната терапевтична активност. Силата на неутрализиране на токсина се определя от условни единици - AE.

В допълнение, благодарение на тази реакция е възможно да се определи вида или вида на екзотоксина. Това се използва за дифтерия, ботулизъм. Изследването може да се проведе както "на стъкло", така и в гел.

Реакция на лизис (RL)

Имунният серум, който влиза в тялото на пациента, освен основната си функция на пасивен имунитет, има и лизиращи свойства. Той е в състояние да разтваря микробни агенти, клетъчни чужди елементи и вируси, които влизат в тялото на пациента. В зависимост от специфичността на антителата, включени в серума, се изолират бактериолизини, цитолизини, спирохетолизини, хемолизини и др.

Тези специфични антитела се наричат "комплемент". Съдържа се в почти всички човешки телесни течности, има сложна протеинова структура и е изключително чувствителен към повишаване на температурата, разклащане, действието на киселини и пряка слънчева светлина. Но в изсушено състояние той е в състояние да запази лизиращите си свойства до шест месеца.

Има такива видове серологични реакции от този тип:

бактериолиза;

Хемолиза.

Бактериолизата се извършва с помощта на кръвен серум на пациента и специфичен имунен серум с живи микроби. Ако в кръвта присъства достатъчно комплемент, тогава изследователят ще види лизиране на бактериите и реакцията ще се счита за положителна.

Втората серологична реакция на кръвта е, че суспензия от еритроцити на пациента се третира със серум, съдържащ хемолизини, които се активират само при наличие на определен комплимент. Ако има такъв, тогава лаборантът наблюдава разтварянето на червените кръвни клетки. Тази реакция се използва широко в съвременната медицина за определяне на титъра на комплемента (т.е. най-малкото му количество, което провокира лизис на еритроцитите) в кръвния серум и за тестване за фиксиране на комплемента. По този начин се провежда серологична реакция за сифилис -

Реакция на свързване на комплемента (CFR)

Тази реакция се използва за откриване на антитела срещу инфекциозен агент в кръвния серум на пациента, както и за идентифициране на патогена чрез неговата антигенна структура.

До този момент описахме прости серологични реакции. RSK се счита за сложна реакция, тъй като в нея взаимодействат не два, а три елемента: антитяло, антиген и комплемент. Неговата същност се състои в това, че взаимодействието между антитялото и антигена се осъществява само в присъствието на комплементни протеини, които се адсорбират върху повърхността на образувания AG-AT комплекс.

Самите антигени след добавяне на комплемент претърпяват значителни промени, които показват качеството на реакцията. Това може да бъде лизис, хемолиза, имобилизация, бактерицидно или бактериостатично действие.

Самата реакция протича в две фази:

Образуване на комплекс антиген-антитяло, който не се вижда визуално от изследващия.
Промяна на антигена под действието на комплемента. Тази фаза най-често може да се проследи с просто око. Ако реакцията не се вижда визуално, тогава се използва допълнителна индикаторна система за идентифициране на промените.

индикаторна система

Тази реакция се основава на фиксиране на комплемента. Пречистени еритроцити от овен и хемолитичен серум без комплемент се добавят към епруветката един час след поставянето на RSC. Ако в епруветката остане несвързан комплемент, той ще се присъедини към AG-AT комплекса, образуван между овчи кръвни клетки и хемолизин, и ще ги накара да се разтворят. Това ще означава, че RSK е отрицателен. Ако еритроцитите останат непокътнати, тогава, съответно, реакцията е положителна.

Реакция на хемаглутинация (RHA)

Има две фундаментално различни реакции на хемаглутинация. Един от тях е серологичен, използва се за определяне на кръвни групи. В този случай еритроцитите взаимодействат с антитела.

И втората реакция не се отнася за серологичните, тъй като червените кръвни клетки реагират с хемаглутинини, произведени от вируси. Тъй като всеки патоген действа само върху специфични еритроцити (кокоши, овчи, маймунски), тази реакция може да се счита за много специфична.

Можете да разберете дали реакцията е положителна или отрицателна по местоположението на кръвните клетки на дъното на епруветката. Ако моделът им прилича на обърнат чадър, тогава желаният вирус присъства в кръвта на пациента. И ако всички еритроцити са се образували като колона от монети, значи няма желани патогени.

Реакция на инхибиране на хемаглутинацията (HITA)

Това е високоспецифична реакция, която ви позволява да установите вида, вида на вирусите или наличието на специфични антитела в кръвния серум на пациента.

Същността му се състои в това, че антителата, добавени в епруветка с тестовия материал, предотвратяват отлагането на антигени върху еритроцитите, като по този начин спират хемаглутинацията. Това е качествен признак за наличието в кръвта на специфични антигени към специфичния вирус, който представлява интерес.

Имунофлуоресцентна реакция (RIF)

Реакцията се основава на способността за откриване на AG-AT комплекси след третирането им с флуорохромни багрила. Този метод е лесен за работа, не изисква изолиране на чиста култура и отнема малко време. Той е незаменим за бърза диагностика на инфекциозни заболявания.

На практика тези серологични реакции се разделят на два вида: директни и индиректни.

Директният RIF се прави с антиген, който е бил предварително обработен с флуоресцентен серум. И индиректно, лекарството първо се третира с конвенционален диагностикум, съдържащ антигени за антителата, които представляват интерес, и след това се прилага отново луминесцентен серум, който е специфичен за протеините на комплекса AG-AT, и микробните клетки стават видими под микроскоп.

Реакция на фиксиране на комплемента(RSK) е сложна двустепенна серологична реакция. Той използва пет съставки, които образуват две системи: антиген, антитяло, комплемент (първата система); овчи еритроцити, сенсибилизирани (третирани) с хемолитичен серум, съдържащ антитела, специфични за тях (втора или индикаторна хем система). В този случай взаимодействието на антитялото с антигена на първия етап от реакцията води до образуването на имунен комплекс, който адсорбира комплемента, но това не може да се открие визуално. На втория етап хемовата система се използва като индикатор за свързване на комплемента към комплекса антиген-антитяло, който, като имунен комплекс, също е способен да го адсорбира. В крайна сметка има два възможни изхода от реакцията. Ако антитялото и антигенът съответстват един на друг и комплементът се адсорбира от образувания комплекс, няма да настъпи лизис на еритроцитите на хемовата система. Ако антитялото не съвпада с антигена и обратно, комплементът, оставайки свободен, ще се присъедини към хемовата система и ще причини хемолиза.

Подобно на други серологични тестове, RSK може да се използва за откриване на специфични антитела срещу известен антиген или за откриване на антиген срещу известни антитела.

Обща характеристика на съставките на RSC.

1. ИЗСЛЕДВАНИЯТ СЕРУМ преди започване на реакцията се нагрява във водна баня в продължение на 30 минути, за да се инактивира собствения му комплемент и се разрежда, като се започне от 1:5.

2. АНТИГЕН могат да бъдат култури от бактерии, техни лизати, вируси и вируссъдържащи материали, екстракти от патологично променени органи и тъканни липиди.

3. ДОПЪЛНЕНИЕ - серум от морско свинче, получен в деня на опита. Понастоящем се използва промишлен сух комплемент.

4. ХЕМОЛИТИЧНА СИСТЕМА се състои от хемолитичен серум, смесен в равни обеми и 3% суспензия от овчи еритроцити чрез утайка. За сенсибилизиране на еритроцитите с хемолизини сместа се държи в термостат при температура 37 ° С в продължение на 30 минути.

Изявление на основния експеримент на RSC.СЕРУМ, АНТИГЕН И КОМПЛЕМЕНТ се добавят към 1 епруветка, серум, комплемент и изотоничен разтвор на натриев хлорид вместо антиген (SERUM CONTROL), антиген, комплемент и същия разтвор на натриев хлорид (ANTIGEN CONTROL) се добавят към третата епруветка. Епруветките се поставят в термостат при температура 37°С за 1 час. В същото време се приготвя хемолитична система, която след това се добавя към трите епруветки след отстраняване на стойката от термостата. След смесване на хемовата система със съставките на три епруветки, последните отново се поставят в термостат за 1 час и след това време се вземат предвид резултатите от RSC.

Когато се вземе предвид RSC, интензивността на реакцията се обозначава с плюсове: "++++" - рязко положителна реакция с пълно забавяне на хемолизата, течността в епруветката е безцветна, всички еритроцити се утаяват на дъното; "+++", "++" - положителна реакция, характеризираща се с увеличаване на цвета на течността поради хемолиза и намаляване на броя на еритроцитите в утайката; "+" - слабо положителна реакция, течността е интензивно оцветена, на дъното на епруветката има малко количество червени кръвни клетки. Отрицателната реакция се обозначава със знака "-", докато се наблюдава пълна хемолиза, течността в епруветката има интензивен розов цвят ("лакова кръв").

RSK е много сложна, но много чувствителна специфична реакция. Намира широко приложение в диагностиката на сифилис, хронична гонорея, магарешка кашлица, актиномикоза, всички рикетсиози и вирусни инфекции.

Свързан имуносорбентен анализ.

Методът е разработен в началото на 70-те години независимо от три групи учени. Методът наподобява RIA, но се основава на маркирането на Ag или Ab, които влизат в реакцията с ензим. Vzd белези със субстрата обикновено се придружава от промяна в цвета на средата. Понастоящем са създадени множество модификации на този метод, но най-широко използваният е хетерогенният ELISA върху твърдата фаза (твърда фаза). Разграничаване:

1) ДИРЕКТЕН ТЪРДОФАЗЕН ELISA. В такъв случай:

1. Серумът с Ab се инкубира с Ag, фиксиран върху твърда подложка (най-често това е пластмасова микроплака).

2. Ab, който не е свързан с Ag, се отстранява чрез многократно измиване.

3. Ензимно-белязан серум се добавя към Ab свързан Ag.

4. Определете броя на маркерния ензим, свързан с At.

2) КОНКУРЕНТЕН ТВЪРДОФАЗЕН ELISA.

1. Добавя се серум. Ако съдържа специфични Abs, тогава те се свързват с Ag, фиксиран върху твърд субстрат. Ако няма специфични Abs, тогава Ag не е свързан.

2. При добавяне на антитела, специфични за фиксиран Ag, в първия случай те няма да имат с какво да взаимодействат (повечето Ag вече е свързано) Þ съдържанието на маркера е ниско. Във втория случай, специфични Abs ще се свържат с Ag и те няма да бъдат отмити по време на измиване Þ високо съдържание на маркера.

По същия начин, може би. АНТИТЕЛАТА са фиксирани, а различни фирми произвеждат именно таблетки с вече фиксирани At.

В сравнение с класическите методи за откриване на антигени, този метод ви позволява директно да регистрирате тяхното взаимодействие с антитела, а не вторични прояви (аглутинация, утаяване или хемолиза). Методът е много ЧУВСТВИТЕЛЕН (достатъчна е концентрация от 1ng/ml).

Определяне: Хламидия, клостридия, ХИВ и др.

8. Реакция на фагоцитоза.

Фагоцитозата се осъществява от микрофаги и макрофаги. Етапи на фагоцитоза: подход, залепване, потапяне, смилане.

Оценка на функционалната активност на фагоцитните клетки.

Количество фагоцитната активност на гранулоцитите и моноцитите се оценява в цяла кръв, в левкоцитна суспензия или в обогатени фракции на фагоцитни клетки. Като стандартни обекти на фагоцитоза се използват монодисперсни латексни частици с диаметър 1,0-2,0 μm, суспензия от топлинно убити бактерии или дрождеподобни гъбички.

Фагоцитите се смесват с фагоцитиран материал в съотношение 1:10 или 1:100 и се инкубират при 37°С в продължение на 30 минути при постоянно разбъркване. След това епруветките се центрофугират и утайката се ресуспендира в капка кръвен серум, за да се подготви цитонамазка. В петна, фиксирани с оцветяване на May-Chryunwald и оцветени по Romanovsky-Giemsa, се изчисляват процентът на фагоцитните клетки (FP - фагоцитен индекс) и броят на абсорбираните частици на 1 клетка (PF - фагоцитен брой).

При здрав човек FP=40-80%, FC=1-5.

9. Диагностикуми.

Диагностикумите са суспензия от определени микробни клетки, убити чрез нагряване или формалин с известно съдържание на клетки на единица обем. Като антиген могат да се използват и суспензии от живи бактерии. Феноменът на реакцията се появява предварително след два часа (при 37 0 С), крайният резултат се взема предвид при стайна температура след 18-20 часа. За диагностика положителната реакция представлява интерес само при определен серумен титър, който служи като диагностика. Така че, с бруцелоза, диагностичният титър е 1: 200, а с tula-remia -1: 100. За откриване на антитела могат да се извършат експресни реакции на аглутинация (времето за отчитане е няколко минути). Например: 1. Кръвно-капкова реакция при туларемия. Капка дестилирана вода (за хемолиза) и капка tularemia diagnosticum се нанасят върху капка от цяла кръв на пациента върху специално стъкло. Реакцията настъпва в рамките на 1-2 минути, аглутинатите са ясно видими под формата на белезникави бучки. 2. Провежда се експресна реакция на аглутинация по Хеделсон върху стъклото за бруцелоза.

Тези реакции не позволяват да се определи количеството на антителата в серума б) да се идентифицира чиста култура на патогени на инфекциозни заболявания. За тази цел имунодиагностич

аглутиниращи серуми, произведени от институти за ваксини и серуми чрез имунизиране на животни с цели микробни клетки. За надеждност е по-добре да се използват адсорбирани серуми, така че да съдържат само антитела, които съответстват на определен тип или тип микроорганизъм.

Принципи за получаване на имунни серуми.

Имунният серум (антисерум) е кръвен серум, съдържащ антитела към даден антиген. В повечето случаи имунни (диагностични) серуми срещу микробни, тъканни и други антигени се получават експериментално чрез имунизиране на животни с подходящи антигени.

Сред основните изисквания към антисерумите са тяхната висока специфичност и достатъчно съдържание на антитела. По специфичност се разграничават поливалентни (полиспецифични) и моновалентни (моноспецифични) антисеруми. Поливалентните серуми съдържат антитела към много антигени, моноспецифични - към един определен антиген. Можете да получите моноспецифични серуми:

1) използване на високо пречистени антигени за имунизация на животни,

2) изчистване на естествени серуми от антитела с нежелана специфичност.

За тази употреба:

1) имуноафинитетен метод, който се основава на свързването на антитела с определена специфичност към съответните антигени, имобилизирани върху твърдофазен носител, последвано от разделяне на получените AG-AT комплекси и изолиране на антитела;

2) методът на адсорбция по Кастелани. За тази цел микроорганизми, съдържащи всички групови антигени, се добавят последователно към нативния имунен серум, съдържащ групово-специфични кръстосано реагиращи антитела, като по този начин се адсорбират хомоложни анти-

тяло. Такива адсорбирани моноспецифични антисеруми съдържат антитела срещу различни детерминанти на антигенната молекула, които са хетерогенни в клас (подклас)

Тест за свързване на комплемента (CFR) и дългосрочна реакция на свързване на комплемента (RDSC)

РЕАКЦИЯ НА СВЪРЗВАНЕ НА КОМПЛЕМЕНТ (RSK) И ДЪЛГОСРОЧНА РЕАКЦИЯ НА СВЪРЗВАНЕ НА КОМПЛЕМЕНТ (RDSK)

РЕАКЦИЯ НА СВЪРЗВАНЕ НА ДОПЪЛНИТЕЛ, RSK, реакция на Bordet-Jangu [наречена на бактериолозите J. Bordet и O. Gengou, 1901], силно специфична и много чувствителна серологична. реакция, основана на свойството на комплекса антиген-антитяло да фиксира свободния комплемент.

Комплемент (комплементна система) (от лат. complementum - добавяне), група глобуларни протеини в кръвния серум на животни и хора, които са част от имунната система на организма. Когато в тялото навлязат бактерии или вируси, които го заразяват, определени токсини или когато се появят собствени трансформирани клетки, комплементът се активира, в резултат на което целевите клетки се лизират (унищожават) и токсините и вирусите се неутрализират. Следователно системата на комплемента се счита, заедно с макрофагите, за границата на имунната защита на организма.

Тази реакция се използва широко при идентифицирането на антигени и при серодиагностиката на инфекции, особено заболявания, причинени от спирохети (реакция на Васерман), рикетсии и вируси.

Първата система - основната - се състои от антиген и антитяло (едното е известно, другото не). Към него се добавя известно количество комплемент. Когато антигенът и антитялото на тази система съвпаднат, те ще свържат и свържат комплемента. Полученият комплекс е фино диспергиран и не се вижда.

реакция на свързване на комплемента серодиагностика

Образуването на този комплекс е известно с помощта на втора хемолитична или индикаторна система. Той включва овчи еритроцити (антиген) и съответния им хемолитичен серум (антитела), т.е. готов имунен комплекс. В тази система лизисът на еритроцитите може да настъпи само в присъствието на комплемент. Ако комплементът е свързан с първата система (ако антигенът и антитялото съответстват в него), тогава няма да има хемолиза във втората система - тъй като няма свободен комплемент. Липсата на хемолиза (съдържанието на епруветката е мътна или има еритроцитна утайка на дъното) се записва като положителен резултат от RSK.

Ако в първата система антигенът не съвпада с антитялото, тогава имунният комплекс не се образува и комплементът остава свободен. Оставайки свободен, комплементът се включва във втората система, причинявайки хемолиза - резултатът от RSC е отрицателен (съдържанието на тръбите е прозрачно - "лакова кръв").

Компоненти на реакцията на фиксиране на комплемента:

1. Антиген - обикновено лизат, екстракт, хаптен; по-рядко суспензия от микроорганизми

2. Антитяло - серум на пациента

3. Комплемент - серум от морско свинче

4. Антиген - овчи еритроцити Хемолитична система

5. Антитяло - хемолизин към овчи еритроцити

6. Изотоничен разтвор

Подготовка на съставките

1. Серумът се разрежда 3 пъти по-малко от неговия титър. Пригответе общо разреждане на серума за целия експеримент, чийто обем се определя чрез умножаване на обема на серума в една епруветка (например 0,5 ml) по броя на епруветките, малко по-голям от броя им в експеримента. При приготвянето на всички компоненти на реакцията е необходим излишък от течност: част от нея остава по стените на епруветки, колби, пипети. Обеми от разреден хемолизин и суспензия от еритроцити, добавяйки серум към еритроцитите, разбъркват се старателно и се инкубират за 30 минути при 37°C (сенсибилизиране).

2. Овчи еритроцити. Приготвя се 3% суспензия от промити овчи еритроцити за целия брой епруветки в опита. За да се приготви хемолитична система, 30 минути преди въвеждането й в експеримента се смесват равни обеми еритроцити на овен с антитяло към тях.

3. Комплементът обикновено се разрежда 1: 10. Трябва да се титрира преди всеки експеримент. Титърът на комплемента е най-малкото му количество, когато се добави към хемолитичната система, пълната хемолиза настъпва в рамките на 1 час при 37°C.

4. Антигенът обикновено се получава готов с указание за титъра му, т.е. количеството, което след разреждане на антигена трябва да се съдържа в 1 ml. Например, при титър 0,4, той се разрежда в 0,96 ml изотоничен разтвор. В опита вземете количеството антиген, равно на половината от титъра (0,5 ml). Това е работната му доза. Пригответе общо разреждане на антиген за целия експеримент, като умножите 0,5 ml по броя на епруветките в експеримента.

Изявление на реакцията на свързване на комплемента (RSC).

Реакцията се поставя в обем от 1 куб. cm (0,2 куб. cm от всеки компонент).

Тестовите серуми се изследват в разреждане 1: 5 и 1: 10 (дозата на серума е 0,04 cc и 0,02 cc със специфичен антиген, в разреждане 1: 5 с контролен антиген (за специфичност) и без антиген (за антикомплементарност).

Тестът и контролните серуми се инактивират в деня на реакцията в разредена форма при 56-65°C (в зависимост от вида на животното) за 30 минути. (също в RDSC).

И двата етапа на реакцията се провеждат на водна баня при 37-38 ° С, бактериолитичната система се държи 60 минути, вторият етап на реакцията (с хемолитичната система) е 20 минути.

Контроли на основния RSK опит:

положителен серум, разреден 1:5 без антиген и с контролен антиген; в разреждания от 1: 5 до неговия титър със специфичен антиген;

отрицателен серум в разреждания 1:5 и 1:10 със специфичен антиген, в разреждане 1:5 с контролен антиген и без антиген - специфични и контролни антигени в двойна доза - за антикомплементарност (комплемент +) и за хемотоксичност (комплемент );

хемолитична система за хемотоксичност (комплемент).

Отчитане на резултатите. В контролите дори не трябва да има следи от хемолиза, тъй като едната от тях няма комплемент, а другата не съдържа хемолизин. Контролите показват липсата на реакции на хемотоксичност (способност за спонтанно лизиране на еритроцитите) в компонентите.

В експеримента активността на комплемента може да намалее поради неговата неспецифична адсорбция от други компоненти на реакцията, следователно за експеримента количеството на комплемента се увеличава: взема се дозата, следваща титъра. Това е работната доза.

Има различни опции за поставяне на RSC: класически. методът на настройка под формата на макро- и микроварианти, реакцията на дългосрочно фиксиране на комплемента (RDSC) в студа, методът на количествата. RSC чрез 50% хемолиза на сенсибилизирани еритроцити и др. За диагностика на редица заболявания се използва по-чувствителен метод - RDSC.

Изявление на реакцията на дългосрочно фиксиране на комплемента (RDSC).

Първата фаза на реакцията се провежда в хладилник при 2-6°С за 16-18 часа, втората фаза на водна баня за 20 минути при 37-38°С.

Комплементът се използва в работно разреждане 1:25 или 1:30 (при определяне на работното му разреждане).

През първия ден серумите и антигенът се бутилират за основния експеримент. Реакцията се поставя в обем от 1 куб. cm (0,2 куб. cm от всеки компонент). Контролите на RDSC са същите като при настройката на RSC.

След това, допълнение от 0,2 куб. см, в зависимост от работното му разреждане, епруветките се разклащат и се поставят в хладилник за 16-18 часа. при 2-6°C.

На следващия ден решетките с първата фаза се изваждат от хладилника и след като престоят 20-30 мин. при стайна температура хемолитичната система се излива във всички епруветки в доза (в дадения пример 0,6 куб. см). Решетките се разклащат и се поставят на водна баня за 20 минути. при 37-38°С.

Схемата на основния експеримент RDSC е представена в таблица 3.

Отчитането на резултатите от RSC, RDSC се извършва два пъти: първият път - веднага след водната баня, вторият - след като еритроцитите се утаят на дъното на епруветката (3-4 часа след водната баня) или следващият ден при съхранение в хладилник от 2° до 6°C.

За обективно определяне на резултатите от реакцията се препоръчва да се оцени процентът на хемолизата. За целта от реакцията се избират 5 епруветки с пълна (100%) хемолиза и течността от тях се излива в една епруветка. От него се приготвят разреждания с по-нисък процент на хемолиза, така наречената скала „Стандарт“.

Степента на хемолиза в епруветките с тестовите серуми се определя чрез сравнение със степента на хемолиза в "стандартни" епруветки и процентът на хемолизата се изразява в кръстове.

Степента на забавяне е обратно пропорционална на процента на хемолиза на еритроцитите:

++++ (4 кръста) - няма хемолиза, супернатантната течност е прозрачна, безцветна;

+++ (3 кръста) - хемолиза на 25% от еритроцитите;

++ (2 кръста) - хемолиза на 50% от еритроцитите;

+ (1 кръст) - хемолиза на 75% от еритроцитите;

(минус) - пълна хемолиза на еритроцитите, без утайка, течността е интензивно оцветена с хемоглобин.

Оценка на резултатите от RSK, RDSK.

Тестовите серуми се оценяват в разреждания 1: 5 и 1: 10 (0,04 cc, 0,02 cc) с пълна хемолиза на еритроцитите в контролен серум без антиген и с контролен антиген.

Положителната реакция се оценява, когато хемолизата на еритроцитите се забави с 3-4 кръста в разреждане 1: 10.

Съмнително - със забавяне на хемолизата на еритроцитите с 1 кръст в разреждане на серума 1: 10 и от 2 до 4 кръста в разреждане 1: 5.

Отрицателен - с пълна хемолиза на еритроцитите в серумни разреждания 1: 5 и 1: 10.

Особено предимство на CSC е, че естеството на антигена, включен в него (корпускуларен или разтворим), няма значение, тъй като комплементът се свързва с Fc фрагмента на всяко антитяло, свързано с IgG и IgM, независимо от неговата специфичност на антитялото. В допълнение, CSC е много чувствителен: позволява откриване на количеството антитела 10 пъти по-малко, отколкото, например, в реакцията на утаяване. RSC е предложен през 1901 г. от J. Bordet и O. Zhang. Основава се на две свойства на комплемента:

1) способността да се свързва с комплекса "антиген + антитяло";

2) лизис на еритроцити, използвани за получаване на хемолитичен серум.

RSK се поставя на два етапа и в него участват съответно две системи - експериментална, или диагностична, и индикаторна. Диагностичната система се състои от тестов (или диагностичен) серум, който се нагрява при 56 ° C в продължение на 30 минути, преди да се настрои реакцията за инактивиране на наличния в него комплемент и антигена.

Към тази система се добавя стандартно допълнение. Неговият източник е прясна или изсушена суроватка от морско свинче. Сместа се инкубира при 37°С за един час. Ако има антитела в тестовия серум, те ще взаимодействат с добавения антиген и получените комплекси антиген + антитяло ще свържат добавения комплемент. Ако в серума няма антитела, няма да настъпи образуването на комплекса антиген + антитяло и комплементът ще остане свободен.

На този етап от реакцията обикновено няма видими прояви на фиксация на комплемента. Следователно, за да се изясни въпросът дали е настъпила фиксация на комплемента или не, се добавя втора индикаторна система (инактивиран хемолитичен серум + еритроцити на овен) и сместа от всички компоненти на CSC отново се инкубира при 37 °C за 30-60 минути, след което се оценяват резултатите от реакцията. С помощта на смартфон (например такъв) можете да изчислите точното време за реакция. Ако комплементът е свързан на първия етап, в диагностичната система, т.е. има антитела в серума на пациента и комплементът е бил свързан от комплекса "антитяло + антиген", няма да има лизис на еритроцитите - RSC е положителен : течността е безцветна, утайка има на дъното на епруветката еритроцити.

Ако в серума няма специфични антитела и в диагностичната система не настъпи свързване на комплемента, т.е. RSK е отрицателен, тогава комплементът, който не се консумира в диагностичната система, се свързва с комплекса "еритроцити + антитела" на индикаторната система и настъпва хемолиза. : в епруветката „лакова кръв” няма еритроцитна утайка. Интензитетът на CSC се оценява чрез четири кръстосана система, в зависимост от степента на забавяне на хемолизата и наличието на еритроцитна утайка. Реакцията е придружена от подходящи контроли: серумен контрол (без антиген) и антигенен контрол (без серум), тъй като някои серуми и някои антигени имат антикомплементарни ефекти. Преди да зададете RSK, всички компоненти, участващи в него, с изключение на изследвания серум или антиген, се титруват внимателно.

Особено важно е да се въведе точната доза комплемент в реакцията, тъй като неговият дефицит или излишък може да доведе до фалшиви резултати. Титърът на комплемента е минималното количество, което при наличие на работна доза хемолитичен серум осигурява пълно разтваряне на еритроцитите. За поставяне на основния опит се взема доза комплемент, увеличена с 20-25% спрямо установения титър. Титърът на хемолитичния серум е неговото максимално разреждане, което, когато се смеси с равен обем от 10% разтвор на комплемента, напълно хемолизира съответната доза еритроцити в рамките на 1 час при температура 37 ° C.

Реакцията на индиректна хемолиза се използва като ускорен метод за откриване на специфични антитела. Еритроцитите се използват като носители на антигени. При наличие на специфични антитела в серума на пациента, сенсибилизираните еритроцити се лизират в присъствието на комплемент.

Не намерихте точната информация? Няма проблем! Използвайте търсенето в сайта в горния десен ъгъл.