Вирусологични методи на изследване. Вирусологично изследване

Вирусологичните изследвания в клиниката на инфекциозните заболявания стават все по-важни, което се дължи главно на увеличаването на дела на инфекциите с вирусна природа, чиято клиника не винаги е типична. В същото време не са разработени бързи и надеждни методи за вирусологична диагностика за всички инфекциозни заболявания, много от тях са трудоемки, изискват специални условия, опитни животни, хранителни среди и обучен персонал. В момента се използват 3 основни вида изследвания за диагностициране на вирусни инфекции.
1. Микроскопско изследване на инфекциозен материал с цел откриване на вирусен антиген или патогномонични промени в тъканите. За диагностични цели се използва директно микроскопско изследване на инфекциозен материал от пациенти за ограничен брой вирусни инфекции (бяс, варицела, жълта треска, херпес и др.). Методът, основан на откриването на вирусен антиген с помощта на флуоресцентни антитела, получи по-широко приложение. Методът на имунофлуоресценцията може да бъде надежден само при стриктно спазване на всички технически изисквания.
2. Вирусологични методи.
3. Серологични изследвания за определяне на повишаването на титъра на антителата в хода на заболяването. Серологичните методи за изследване са по-достъпни в лабораторията.
За тези изследвания е необходимо да се вземе кръвен серум в острия период на заболяването и по време на периода на възстановяване (сдвоени серуми). Кръвните проби за серологични изследвания се вземат стерилни без антикоагуланти и консерванти.
Основните етапи на вирусологичното изследване са изолирането на вируси, тяхната идентификация и характеризиране на основните биологични свойства. В момента няма единен метод за изолиране на различни групи вируси. Това се дължи преди всичко на разнообразието от техните свойства и особеностите на култивиране извън организма гостоприемник. За изследването се използват биосубстрати (измивки от лигавиците, кръв и нейните компоненти, цереброспинална течност, урина и изпражнения, биопсични проби от органи и тъкани или техни парчета, взети по време на аутопсия), които се подлагат на специална обработка, последвана от преминаване на Материалът. Взетият за изследване материал трябва да се съхранява при температура от -20 °C до -70 °C. В зависимост от предварителната диагноза, обработката на материала има свои собствени характеристики, но във всички случаи се предполага, че се получава субстрат, който е максимално пречистен от примеси от слуз, клетки от органи и тъкани или техни фрагменти, бактерии. Това се постига чрез хомогенизиране на изследвания материал в специален апарат или смилане в порцеланов хаван на студено с кварцово стъкло (парчета от органи и тъкани) с добавяне на стерилно охладен (+4 С) 0,9 %

разтвор на натриев хлорид до получаване на 10-30% суспензия и последващо центрофугиране при 1500-3000 rpm за 10-15 минути. Така полученият супернатант се използва за по-нататъшни изследвания.
Преди интензивното развитие и въвеждане в широката практика на метода на тъканно и клетъчно култивиране се използва заразяване на опитни животни или пилешки ембриони. Тези методи се използват и днес. Откриването на вируси с помощта на животни е най-подходящо в случаите, когато е възможно да се възпроизведе в експеримента типична картина на инфекциозно заболяване или неговите отделни прояви. По този начин патогените на групите арбовируси и Coxsackie могат да бъдат открити чрез инфекция в мозъка на кърмачки, грип - чрез инфекция на пилешки ембриони или интраназално приложение на тестовия материал на мишки. През последните години вирусологичните лаборатории най-широко използват метода на клетъчно-тъканни култури, който позволява да се изолират аденовируси, херпесни вируси, респираторен синцитиален вирус, миксовируси и други и да се извърши етиологична диагностика на заболяването още при първите етапи на изследването. Основа за това са добре проучените цитологични особености на взаимодействието на повечето вируси и клетки. По този начин, инфекцията на HeLa, Hep-2 клетки с материал, съдържащ аденовирус тип 2, води още на 3-ия ден до промяна в модела на растеж на клетъчния монослой и до появата на типични клетки под формата на гроздови чепки и т.н. , които са добре дефинирани в обичайния светлинен микроскоп при ниско увеличение.
От изключително значение за етиологичната диагноза на инфекциозно заболяване е стандартизирането на изолирането на вируса от тестовия материал, което на този етап от работата включва използването на генетично чисти линейни животни, като се вземат предвид техните фенотипни (предимно възрастови) характеристики. Това се дължи преди всичко на факта, че експериментални животни от различни генетични линии и възрасти са податливи на вируси в различна степен. По този начин, по време на интрацеребрална инфекция на мишки с невротропния WSN щам на грипния вирус, BALB/c, A, CBA и безпородни животински линии показват най-висока чувствителност, същият модел е установен в случаите на интраназално приложение на тестовия материал. От съществено значение за окончателните резултати от изолирането на вируса е предварителното изследване на животни, пилешки ембриони, клетъчни и тъканни култури за латентни вирусоносители. Много широко използвани в лабораторната практика, пилешките ембриони могат да бъдат заразени с вируси на птичи левкемия, птичи енцефаломиелит, инфекциозен синузит, пситакоза, нюкасълска болест, патогени на някои бактериални инфекции (паратиф и др.), както и микоплазма. Още по-голям брой бактериални и особено вирусни агенти са способни спонтанно да инфектират клетъчни и тъканни култури и да оцелеят в тях. Тяхното присъствие значително влияе върху оценката на изследвания материал. Някои видове микоплазми в клетъчна култура
може да предизвика хемаглутинация и хемадсорбция и дори да образува плаки под агарното покритие, подобно на образуваните вируси. Не малко значение има и замърсяването на клетъчни култури от един вид от други, най-често това е свързано с HeLa клетки и се наблюдава при работа с различни видове култури в едно помещение, при недобра обработка на лабораторна стъклария и др. наличие на замърсяване на клетъчни култури или инфекция на животни с бактериални агенти, като по правило се проявява доста ясно (промени в модела на растеж на клетъчния монослой, свойствата на хранителната среда, смърт на пилешки ембриони или животни с определени симптоми и т.н.) и не представлява особени затруднения при оценката на резултатите. Ситуацията е по-сложна при латентни форми на инфекция, където е необходимо използването на серологични и други методи. Тези указания трябва да се вземат предвид в работата на вирусолог, особено при провеждане на етиологична диагностика на неясни случаи на заболяването.

Диагнозата на острите чревни инфекции се поставя въз основа на клинични и епидемиологични данни със задължително лабораторно потвърждение. Без лабораторно потвърждение диагнозата на остри чревни инфекции може да се постави само в случаите, когато има ясно установени епидемиологични данни (в огнищата на инфекцията и в лабораторни дешифрирани групови огнища на заболявания при повечето пациенти).

За окончателната диагноза се използват бактериологични, вирусологични и серологични методи на изследване.Копрологичният метод, както и резултатите от сигмоидоскопията (за шигелоза) са от второстепенно значение.

аз. Бактериологичен методе от най-голямо значение при AII, причинена от бактериална флора (инвазивна и секреторна диария). Най-добри резултати се получават чрез засяване на изпражненията директно до леглото на пациента, преди назначаването на антибиотична терапия и с доставянето му в бактериологичната лаборатория през първите два часа от момента на вземане на пробата. За изследването е необходимо да се изберат частици, съдържащи патологични примеси, но не и кръв. Биоматериалът се засява върху селективните среди на Ploskirev, Levin и др. Честотата на положителните резултати (инокулация на патогена и неговата идентификация), дори при наличие на типични клинични прояви на AII. Не надвишава 70-80%.

II. Серологични методидиагностиката, като правило, се използва в съмнителни случаи и с отрицателни резултати от бактериологичното изследване на изпражненията. При деца от първите месеци живот, това е неинформативно, но във всички случаи увеличението на титъра на антителата с 4 пъти или повече има значение. Те се провеждат в две посоки - определяне на титъра на специфични антитела в кръвния серум на пациента и антигена в изпражненията.

За определяне на титъра на специфични антитела обикновено се използва RNHA, по-рядко RPHA или RA. Като антигени се взема суспензия от дневна бактериална култура (RA) или еритроцитна диагностика. ( RPGA, RNGA). По-надеждно трябва да се счита за повишаване на титрите на антителата в динамиката на заболяването. Специфичните антитела в кръвта на пациент с AII се появяват на 3-5-ия ден от заболяването и нарастват до максимум в рамките на 2-3 седмици, след което постепенно намаляват. При малки деца, особено тези с променен преморбиден фон, специфичните антитела в кръвта не се откриват или имат ниски титри (1:50 - 1:100).

При наличие на типични клинични симптоми и откриване на диагностичен титър на специфични антитела (1: 200) и по-висок със съответния диагностикум) или повишаване на техния титър в динамиката на заболяването, клиничната диагноза на чревната инфекция трябва да бъде се считат за установени дори при липса на посяване на патогена от изпражненията на пациента.

III. Методи за експресна диагностикаЧревните инфекции се основават на откриването на антигена на патогена (бактерия или вирус) от изпражненията, за което се използва директният метод на луминесцентни антитела (PMLA) или методът на имуноадсорбция - реакция на агломерация на въглен (RCA). Предварителният резултат се получава след 2-3 часа, а окончателният след ден. Специфичността на метода е 82-94,6%.

През последните години ензимно-свързаният имуносорбентен анализ (ELISA) и латексната аглутинация (RLA) се използват за бърза диагностика на диария.

Етиологичното декодиране на вирусна диария се извършва с помощта на вирусологични и бактериологични методи.

Оптималният период за откриване на вируси в изпражненията се счита от 1 до 4 дни от заболяването, въпреки че патогенът често продължава по-дълго.

Основният използван метод е методът на електронната микроскопия, който позволява по морфологични признаци да идентифицира широк спектър от вирусни агенти, причиняващи гастроентерит.

Използва се и имуноелектронна микроскопия (въз основа на способността на вирусните частици в присъствието на хомоложни серуми или реконвалесцентни серуми да образуват агрегати от ротавирусни частици с имуноглобулини.

Сред методите за серодиагностика традиционните включват реакцията на неутрализация, инхибиране на хемаглутинацията, фиксиране на комплемента.Два до четирикратно увеличение на антителата в сдвоени серуми има ретроспективна стойност за диагностицирането на ротавирусна инфекция. За откриване на ротавируси или техните антигени се използват ELISA, дифузна преципитация, латексна аглутинация, реакция на коаглутинация.

В практическата работа IFA заема най-широко място – изолиране на ротавирусни антигени в копрофилтри. По-добре е тези методи да се използват в динамика (първия ден от хоспитализацията и след клинично възстановяване).

За да се изключи бактериалната етиология на AII, се извършва и бактериологично изследване на изпражненията чрез инокулация върху хранителни среди.

сигмоидоскопияметодът рядко се използва при деца, главно за определяне на причината за продължителна бактериална екскреция и диагностика на продължителни и хронични форми на заболяването. Този метод на изследване позволява да се оцени само естеството на морфологичните промени в лигавиците на дисталните черва, но не може да се използва за етиологична диагноза на чревна инфекция.

Показания за инструментално изследване (ултразвук, рентгеново изследване на коремните органи, FGS) при остри чревни инфекции е необходимостта от диференциална диагноза с хирургични заболявания на коремните органи (инвагинация, апендицит), соматични заболявания (гастрит, пептична язва, холецистопанкреатит и др.) и функционални нарушения на стомашно-чревния тракт.

Определяне на клиничната форма на токсикоза (невротоксикоза, токсикоза с ексикоза, TSS), нейната степен (етап), вид дехидратация при инфекциозна диария при деца и спешна помощ

15.1. Характеристики на микробиологични и имунологични лаборатории

Цялата работа с микроби се извършва в лаборатории, които в зависимост от основните задачи могат да бъдат изследователски, диагностични или производствени.

Здравната система разполага с:

Клинични диагностични лаборатории от общ или специален (биохимичен, бактериологичен, имунологичен, цитологичен и др.) тип, които са част от болници, поликлиники, диспансери и други лечебни заведения;

Бактериологични лаборатории на Държавния санитарен и епидемиологичен надзор (GSN);

Санитарни и бактериологични лаборатории на GOS;

Санитарно-химични лаборатории на GOS;

Централни (ЦНИЛ), проблемни, клонови, образователни лаборатории на университети;

Специализирани лаборатории (особено опасни инфекции и др.).

В момента лабораториите и по-големите лабораторни институции (катедри, институти, производствени предприятия) обикновено са специализирани и работят с една или друга група микроби.

С вирусите се занимават вирусологични лаборатории, които разполагат с подходящо оборудване и използват специални методи за изследване. Има микологични и протозоологични лаборатории. Специализиран характер

придобиват се и бактериологични лаборатории, в които работата е съсредоточена върху определени групи бактерии, например рикетсиални, туберкулозни, лептоспирални, анаеробни и др. Имунологичните изследвания се извършват в имунологични лаборатории, въпреки че някои видове изследвания могат да се извършват и в микробиологични лаборатории, например, серодиагностика на инфекциозни заболявания.

Лабораторната работа с патогенни микроби се извършва в специално оборудвани лаборатории, които осигуряват режим на работа и предпазни мерки, които изключват възможността за заразяване на персонала и изтичане на микроби извън лабораторията.

Необходимостта от ясно регулиране на условията на работа с микроби, които са опасни в различна степен за лабораторните работници и околното население, доведе до разработването на класификация на микробите, разделяйки ги на 4 групи според степента на биологична опасност (класификация на СЗО). ). В Русия, в съответствие с препоръките на СЗО, патогенните микроби също са разделени на 4 групи: Група 1 - патогени на особено опасни инфекции; група 2 - патогени на силно заразни човешки епидемични заболявания; 3-та група - причинители на инфекциозни заболявания, разпределени в независими нозологични групи; 4-та група - условно патогенни микроби - причинители на опортюнистични инфекции. Номерирането на групите микроби, прието в Русия, се различава в обратен ред от класификацията на СЗО, където микробите с най-ниска патогенност принадлежат към 1-ва група, а особено опасните - към 4-та група.

В съответствие с разделянето на микробите на групи според степента на биологична опасност, лабораториите също се разделят на категории. Според номенклатурата на СЗО има 3 категории микробиологични лаборатории:

Базови (базови или общи) лаборатории, които поради спецификата на работата могат да бъдат оборудвани с различни защитни средства;

Охранени (изолирани) лаборатории и лаборатории със специален режим (максимално изолирани).

Безопасността на работа в лаборатории от всички категории се осигурява от прилагането на режима и правилата за работа в лабораторията, спазването на изискванията за лабораторните помещения и тяхното оборудване, осигуряването на лабораториите с подходящо оборудване.

мониторинг, медицинско наблюдение на здравето на служителите, обучение и обучение на персонала по безопасност в лабораторията.

15.2. Оборудване за микробиологични и имунологични лаборатории

Помещенията на базовата лаборатория трябва да са просторни, за да се осигури безопасно провеждане на лабораторната работа. Стените, таваните и подовете трябва да имат гладка, лесна за почистване повърхност, непроницаема за течности и устойчива на дезинфектанти, които обикновено се използват в лабораторията. Повърхността на работните маси трябва да бъде водоустойчива, устойчива на дезинфектанти, киселини, основи, органични разтворители и умерена топлина. Лабораторните мебели трябва да са издръжливи. Пространството под масите и между мебелите трябва да е лесно достъпно за почистване. Лабораторията трябва да разполага с автоклав за дезинфекция на отпадъците.

Основното лабораторно оборудване трябва да ограничава или предотвратява контакта на микробиолога с инфекциозен материал, трябва да бъде изработено от устойчиви материали, непроницаеми за течности и устойчиви на корозия. Оборудването трябва да бъде проектирано и инсталирано така, че да може лесно да се почиства, обеззаразява и инспектира.

Лабораторията е оборудвана с микроскоп, автоклав, термостати, сушилни, стерилизационни шкафове, апарат за серумна коагулация, дестилатор, центрофуги, лабораторни везни, рН метър, FEC, магнитна бъркалка, миеща вана.

Работните помещения на лабораторията трябва да бъдат снабдени със студена и топла вода, електричество, вакуум, кислород, въздух под високо налягане и др. Някои шкафове са оборудвани с кутии и аспиратори.

Задължителните помещения включват лаборатории за чревни и капкови инфекции, санитарно-бактериологични, серологични, както и спомагателни помещения: средна готварска печка, перално помещение, стерилизационно помещение (чисто и мръсно), регистратура, складове, санитарен възел за служители, вивариум. В лаборатории с пунктове за изследване за носителство на микроорганизми те допълнително ще оборудват приемна, стая за лечение, тоалетни за вземане на проби

материал. Подредете помещенията по такъв начин, че мръсни и чисти потоци да не се пресичат и да не се докосват.

По отношение на помещенията на охраняваните лаборатории трябва да се спазват същите изисквания, както за базовата лаборатория. Освен това този тип лаборатория трябва да бъде отделена от тези части на сградата, където движението на служителите не е ограничено. Съоръженията за миене на ръце трябва да бъдат оборудвани със съоръжения за отваряне на водата с крачен педал или лакът. Прозорците трябва да бъдат затворени и запечатани. Входните врати на лабораторните помещения трябва да са самозатварящи се и заключващи се. Изпускателната вентилация е проектирана така, че най-ниското налягане се създава в помещения с най-висок риск от инфекция. В този случай движението на въздуха ще се извършва от спомагателните помещения в посока към основното работно помещение. Отработеният въздух се освобождава в околната среда само след филтриране през бактериални филтри. При оборудването на лаборатории с висока степен на сигурност с оборудване те се ръководят от препоръките, разработени за основните лаборатории, с допълнение, че цялата работа с инфекциозен материал в тях се извършва в защитни кутии. В режим на максимално изолирани лаборатории има редица функции за осигуряване на максимална биологична безопасност на персонала, населението и околната среда. Входът на лабораторията и изходът от нея се осъществяват през санитарен пункт. На входа е задължително пълното преобличане в специално облекло, при напускане, преди преобличане е задължителна целенасочена дезинфекция (душ, дезинфектанти) на персонала. Боксът се използва за намаляване на риска от навлизане на инфекциозен материал в околната среда. Като се използва кутии (настолен, ламинарен) създават физически бариери за предотвратяване на възможен контакт на работещия персонал с инфекциозен материал.

15.3. Правила за работа в микробиологична лаборатория

Основните правила за работа в базовата лаборатория включват:

Забрана за работа с пипета през устата;

Забрана за ядене, пиене, пушене, съхраняване на храна и използване на козметика в работните помещения;

Поддържане на чистота и ред;

Дезинфекция на работните повърхности поне веднъж на ден и след всеки контакт със заразен материал;

Измиване на ръцете от персонала след работа с заразен материал, животни, преди напускане на лабораторията;

Извършване на всички работи по такъв начин, че да се сведе до минимум възможността за образуване на аерозол;

Обеззаразяване на всички заразени материали преди изхвърляне или повторна употреба.

15.4. Принципи на микробиологична диагностика на инфекциозни заболявания

Най-важно място в лабораторната диагностика на инфекциозните заболявания заема специфичната микробиологична диагностика, която се провежда в бактериологични, вирусологични, имунологични и други лаборатории. Състои се от три етапа: преданалитичен, аналитичен и следаналитичен.

Първият етап от микробиологичната диагностика е преаналитичен, включително вземане на материал за изследване. Изборът на материала за изследване се определя от патогенезата и клиничната картина на инфекциозното заболяване. Материалът за изследване се взема, ако е възможно, при асептични условия, поставя се в стерилен контейнер и се доставя в лабораторията възможно най-скоро (за предпочитане в рамките на 1 час). В някои случаи сеитбата на материала се извършва до леглото на пациента. Понякога се допуска краткотрайно съхранение на материала при регламентирани условия. Изследваният материал се придружава от документ, в който трябва да се посочат времето на вземане, естеството на материала, неговият източник и точно да се определи целта на изследването.

Материалът за изследване в медицинската микробиология е различни биологични и патологични телесни течности (кръв, гной, урина, храчки, гръбначно-мозъчна течност, изпражнения, повръщане, измиване и др.) И тъкан - биопсичен материал от жив или аутопсия от труп. В санитарната микробиология за изследване се вземат обекти от околната среда (въздух, вода, храна и др.) или тампони от тях. При вземане на материал

за микробиологични изследвания трябва да се спазват следните правила:

Материалът се взема директно от огнището на инфекцията или се изследва съответният секрет (гной, урина, жлъчка и др.);

Количеството материал трябва да е достатъчно, за да се проведе изследването и да се повтори, ако е необходимо;

Материалът се взема, ако е възможно, в началния период на заболяването, тъй като през този период патогените се изолират по-често, има повече от тях, те имат по-типична локализация;

Материалът се взема преди началото на антимикробната химиотерапия или след определен период от време след приема на антибактериалното лекарство, необходимо за отстраняването му от тялото;

Необходимо е да се предотврати възможността за навлизане в материала на антимикробни препарати (дезинфектанти, антисептици, антибиотици);

Транспортирането на материала до лабораторията трябва да се извърши възможно най-скоро, при условия, които изключват смъртта на нестабилни микробни видове или поставени в специални транспортни среди;

По време на транспортирането трябва да се спазват всички правила за биологична безопасност;

Към материала е приложен придружаващ документ, съдържащ основната информация, необходима за провеждане на микробиологично изследване (фамилия, собствено име, бащино име на пациента, номер на историята на случая, клинична диагноза и др.).

15.5. Методи за микробиологична диагностика

Аналитичният етап включва микроскопски, културни, биологични, серологични и алергологични методи за микробиологична диагностика.

Микроскопски метод се състои в приготвянето на препарати (местни или оцветени по прости или сложни методи) от изследвания материал и тяхното микроскопиране с помощта на различни видове микроскопско оборудване (светло, тъмно поле, фазово-контрастно, луминесцентно, електронно и др.). В бактериологията микроскопският метод се нарича бактериоскопски, във вирусологията - вирусоскопия.

Културен метод се състои в инокулация на тестовия материал върху изкуствени хранителни среди, клетъчни култури или пилешки ембриони, за да се изолира и идентифицира чиста култура на патогена или патогените. В бактериологията методът на културата се нарича бактериологичен, в микологията - микологичен, в протозоологията - протозоологичен, по вирусология - вирусологичен.

биологичен метод (експериментален или биоанализ) се състои в заразяване на чувствителни лабораторни животни или други биологични обекти (пилешки ембриони, клетъчни култури) с тестовия материал. Използва се за изолиране на чиста култура на патогена, определяне на вида на токсина, активността на антимикробните химиотерапевтични лекарства и др.

Серологичен метод се състои в определяне на титъра на специфични антитела в кръвния серум на пациента, по-рядко в откриването на микробен антиген в тестовия материал. За тази цел се използват имунни реакции.

Алергологичен метод се състои в идентифициране на инфекциозна алергия (ХЗТ) към диагностичен микробен лекарствен алерген. За целта се правят кожно-алергични проби със съответните алергени.

Диагностичната стойност на тези методи е нееднаква. Водещ метод за микробиологична диагностика е бактериологичен метод, тъй като позволява да се изолира и идентифицира микробът-причинител, т.е. основната причина за заболяването. Останалите методи са по-малко информативни, тъй като ви позволяват да откриете промени в тялото поради наличието на микроб в него. На второ място по важност е серологичен метод, тъй като взаимодействието на антиген и антитяло се характеризира с висока степен на специфичност. Информативността на останалите три метода е ниска и те обикновено служат като допълнение към бактериологичните и серологичните методи. По този начин микроскопията на изследвания материал не винаги ни позволява да видим и идентифицираме микробите под микроскоп. Те могат да бъдат открити само когато материалът е силно замърсен с тях. Дори намирането на бактерии под микроскоп е невъзможно да се идентифицират морфологично към вида. Както е известно, цялото видово разнообразие на бактериите се свежда до 4 основни морфологични форми: коки, пръчици, извити и разклонени форми. Следователно, според микро

В скопичната картина наблюдаваните бактерии могат много условно да бъдат приписани на голям таксон, например грам-положителни коки. Само в отделни случаи, когато бактериите имат уникална морфология, микроскопски може да се определи родът им. Информативното съдържание на микроскопичния метод на гъби и протозои е по-високо, тъй като гъбите и протозоите, като еукариоти, имат по-големи размери и по-характерна морфология.

Диагностичните възможности на биологичния метод са ограничени от факта, че лабораторните животни са имунизирани срещу повечето патогени на човешки антропонозни инфекции, така че не е възможно да се причини експериментална инфекция при тях.

Възможностите на алергологичния метод са ограничени от факта, че повечето микроби в човешкото тяло не причиняват ХЗТ.

Тъй като микробиологичните изследвания са едни от най-скъпите видове лабораторни изследвания, микробиологът е изправен пред задачата да постави надеждна микробиологична диагноза с най-малко време, усилия и средства. Затова за поставяне на диагнозата се използват 1-5 диагностични метода, така че избраният набор от методи да гарантира верния отговор.

От особено значение са методите за експресна диагностика, които позволяват поставяне на микробиологична диагноза в кратък период от време (от няколко минути до няколко часа) от момента на доставяне на тестовия материал в лабораторията. Експресните методи включват RIF, ELISA, RIA, PCR, използването на биочипове, хроматография и др. Характеристиките на диагностиката на анаеробни инфекции са описани в материалите на диска.

Наред с традиционните класически методи за микробиологична диагностика, през последните години все по-голямо значение придобиват молекулярно-биологичните диагностични методи (ДНК сонди, PCR, лигазна верижна реакция - LCR, хроматография, електрофореза, имуноблот, биочипове и др.).

Молекулярно-биологичните диагностични методи се основават на идентифицирането на ДНК и РНК, специфични за даден микробен вид, и включват хибридизация на базата на ДНК сонди и диагностика на базата на PCR.

пост-аналитичен етапът на микробиологичната диагностика се състои в клинична интерпретация на резултатите от лабораторните изследвания. В същото време лекуващият лекар трябва да оцени етиологичното значение на микробите, изолирани от пациента, да коригира емпиричната антимикробна химиотерапия, приложена на пациента, въз основа на данните от микробиологичния мониторинг и др.

15.5.1. Методи за микробиологична диагностика на бактериални инфекции

В бактериологията се използват бактериоскопски, бактериологични и биологични методи за откриване на патоген в изследвания материал.

Предимствата на бактериоскопския метод са простота, бързина, икономичност. Въпреки това, той намира ограничено приложение, тъй като може да се използва само ако има някакви морфологични или тинкториални характеристики на патогена и неговото достатъчно съдържание в тестовия материал. Този метод е ориентировъчен.

Основният и най-точен метод за диагностициране на бактериални инфекции е бактериологичният, който се използва за почти всички заболявания, въпреки неговите недостатъци: продължителността на изследването (от 4-5 дни до 2 месеца), опасността (тъй като чистата култура на патогена натрупва), сравнително висока цена. В случай, че се очаква тестовият материал да съдържа патогена в достатъчни количества, материалът се засява върху плътна хранителна среда, за да се получат изолирани колонии. При ниско съдържание на микроби, материалът за изследване първо се засява върху течни хранителни среди - обогатителни среди. Изолираната чиста култура се идентифицира чрез морфологични, тинкториални, културни, биохимични, антигенни и токсигенни свойства (в зависимост от вида на патогена). Дефинирането на изброените свойства ви позволява да зададете вида на патогена. За целите на епидемиологичното маркиране се извършва вътрешноспецифична идентификация на изолираната култура: определя се нейният фаговар, биовар и др.. Освен това, за да се предпише рационално лечение, като правило се определя чувствителността на изолираната култура към антибиотици.

При микробиологичната диагностика на заболявания, причинени от опортюнистични микроби, представители на нормалната микрофлора, е задължително да се определи броят на патогените в изследвания материал.

Биологичният метод е неикономичен, нехуманен и затова намира ограничено приложение. Като опитни животни се използват бели мишки, морски свинчета, зайци, маймуни и други животни.

Диагнозата на инфекциозно заболяване може да се установи и чрез серологичен метод, който позволява да се открият или специфични антитела в серума на пациента, или специфични антигени директно в тестовия материал. Антителата към причинителя на заболяването се появяват, като правило, до края на първата седмица от заболяването. Невъзможността да се открият в първите дни на заболяването е сериозен недостатък на метода, особено в случаите, когато заболяването протича в остра форма. В допълнение, много заболявания изискват изследване на образуването на антитела в динамиката и откриване на увеличаване на броя на антителата, което също не позволява бърза диагноза. Недостатъкът на метода е, че не може точно да идентифицира патогена и да определи неговата антибиограма. Но в същото време това е напълно безопасен, сравнително евтин метод, който ви позволява да поставите диагноза за кратко време. В момента при редица заболявания се определя не само количеството, но и класовете имуноглобулини.

При някои заболявания се използва серологичен метод за откриване на специфични антигени в тестовия материал. Тъй като специфичните антигени, съставляващи патогена, са в патологичния материал от първите минути на заболяването, този вариант на серологичния метод се използва за ускорена (през първия ден на заболяването) или дори експресна диагностика (в рамките на няколко часа) на инфекциозни заболявания.

Като помощно средство в малка група инфекциозни заболявания се използва алергологичен метод, който позволява да се открие свръхчувствителност към специфичен антиген (алерген), който е причинителят на заболяването.

15.5.2. Методи за микробиологична диагностика на вирусни инфекции

Във вирусологията методите за лабораторна диагностика на вирусни инфекции имат своя специфика, отчитаща особеностите на биологията на вирусите. Използват се вирусоскопски, вирусологични и серологични методи за лабораторна диагностика.

Вироскопският метод се състои в откриване на вируса в изследвания материал под микроскоп. По-често се използва електронен микроскоп, по-рядко флуоресцентен микроскоп. Поради незначителния размер на вирусите, светлинната микроскопия практически не се използва. Само за откриване на големи вируси, като се използват методи на супероцветяване, може да се използва светлинен микроскоп. Освен това с помощта на светлинен микроскоп могат да се открият вътреклетъчни включвания, които се образуват в засегнатите клетки при определени инфекции.

Вирусологичният метод се състои в заразяване на чувствителен биологичен модел (лабораторни животни, пилешки ембриони или клетъчни култури) с тестовия материал, посочване на вируса и последващото му идентифициране. Когато лабораторните животни са заразени, вирусите се показват, като правило, според клиничната картина на заболяването, приблизително патологичните и анатомични промени и накрая, например, с помощта на реакция на хемаглутинация. Същата реакция дава възможност за откриване на вируси в пилешки ембрион, който по правило не показва видими промени по време на отварянето. В клетъчната култура присъствието на вируса се определя от цитопатичното действие (включително образуването на вътреклетъчни включвания), хемадсорбцията, феномена на образуване на плаки, реакцията на хемаглутинация и липсата на промяна в цвета на индикатора. Идентифицирането на вируса се извършва с помощта на серологични тестове (RPGA, RTGA, RN, RSK, ELISA и др.). Вирусологичният метод ви позволява точно да определите естеството на патогена, но изисква достатъчно време (5-7 дни или повече), значителни материални разходи и не е безопасен.

Характеристика на серологичния метод във вирусологията е изследването на сдвоени серуми. Първият серум се взема от пациента в острия период в началото на заболяването, съхранява се при температура 4-8 ° C, а вторият серум се взема след 10-14 дни. Серуми

изследвайте едновременно. Заболяването се доказва чрез сероконверсия, т.е. повишаване на титъра на антителата във втория серум спрямо първия. Сероконверсия 4 пъти или повече е диагностична. Тъй като много вирусни заболявания са остри, този вариант на серологичния метод обикновено се използва за ретроспективна диагностика.

Водещият метод за лабораторна диагностика на вирусни инфекции е вирусологичният.

Ускорената и експресна диагностика на вирусните заболявания се извършва по същия начин, както при бактериалните инфекции.

15.5.3. Характеристики на микробиологичната диагностика на микозите

Микроскопският метод обикновено се използва за диагностициране на гъбични инфекции. Микологичният метод се състои в засяване на патологичен материал върху специални хранителни среди, изолиране на чиста култура на патогена и идентифицирането му чрез морфологични, културни и биохимични свойства. Характеристика на този метод е неговата продължителност - няколко седмици поради бавния растеж на гъбичките. Откриването на антитела по време на серологично изследване е възможно от 2-4-та седмица на заболяването. При някои заболявания в изследвания материал се откриват специфични антигени. Алергологичният метод се използва рядко. Често при микози се използва хистологичен метод, който се състои в откриване на елементи на гъбичките (спори, конидиални глави и др.) В органи и тъкани, засегнати от гъбички. За целта се изготвят хистологични тънки или ултратънки тъканни срезове, които се оцветяват със специални хистологични и хистохимични методи и се изследват чрез светлинна и при необходимост електронна микроскопия.

15.5.4. Характеристики на микробиологичната диагностика на протозойни инфекции

Микроскопското изследване на патологичния материал се състои в приготвянето както на нативни препарати („дебела капка“), така и на петна, оцветени по метода на Романовски-Гимза, и е основният метод за диагностициране на заболявания, причинени от протозои. В някои случаи се използват серологични и алергологични диагностични методи.

15.6. Принципи на имунологичната диагностика на човешките заболявания

Имунодиагностиката е раздел от имунологията, който изучава и разработва методи за диагностика на инфекциозни и неинфекциозни заболявания, свързани с функцията на имунната система.

Много инфекциозни заболявания вече са претърпели значителни промени, което се изразява в увеличаване на дела на леки, изтрити и асимптоматични форми, увеличаване на алергичния компонент и висока честота на смесени инфекции. Това усложнява традиционната диагностика на заболяванията, така че значението на имунодиагностиката, насочена към търсене на антигени на патогени или специфични имунни промени в тялото на пациента, нараства.

Под имунореактивност (имунен статус, имунен профил) се разбира способността на имунната система за имунен отговор в даден момент. Характеризира се с концентрацията на имуноглобулини, броя на лимфоцитите и левкоцитите, съотношението на Т- и В-клетките и функционалните показатели, по-специално способността на имунокомпетентните клетки да реагират на стимулация.

15.7. Контрол на качеството на лабораторните изследвания

Важен елемент от работата на микробиологичната и имунологична лаборатория е получаването на точни и сравними резултати от изследванията, за което е необходимо да се контролира качеството на изследванията. Контролът на качеството може да бъде вътрешен или външен.

Вътрешнолабораторен контрол на качеството - система от мерки за контрол, които се извършват в отделна лаборатория от персонала на тази лаборатория и са насочени към осигуряване на подходящо ниво на качество на работата на лабораторията.

Външен контрол на качеството - система от мерки за контрол, които се извършват в рамките на Единната федерална система за външна оценка на качеството (FSVOK) на лабораторни изследвания от групи експерти и са насочени към осигуряване на правилната организация на технологичните процеси за производство на лабораторни изследвания.

Федералната система за външна оценка на качеството на лабораторните изследвания се състои от раздели, във всеки от които

извършва се оценка на качеството на даден вид лабораторно изследване. Структурата на FSVOK включва експертни групи за разработване и прилагане на външен контрол на качеството при различни видове лабораторни изследвания.

Задачи за самоподготовка (самоконтрол)

А.Назовете метода на микробиологичното изследване, което позволява да се установи вида на патогена:

1. Алергичен.

2. Микроскопични.

3. Културен.

4. Биологичен.

б.Посочете основната задача на бактериологичния метод на изследване.

b.Взет е серум от пациент със съмнение за вирусна инфекция на 7-ия ден от заболяването, в който са открити специфични антивирусни антитела. Оценете надеждността на резултата от изследването.

Ж.Посочете типа лаборатория, към която трябва да се изпрати материал от пациент, за който се подозира, че има особено опасна инфекция.

Вирусологични методи на изследване— методи за изследване на биологията на вирусите и тяхната идентификация. Във вирусологията се използват широко методи на молекулярна биология, с помощта на които е възможно да се установи молекулярната структура на вирусните частици, как те проникват в клетката и характеристиките на възпроизвеждането на вируси, първичната структура на вирусните нуклеинови киселини и протеини. Разработват се методи за определяне на последователността на съставните елементи на вирусните нуклеинови киселини и протеиновите аминокиселини. Става възможно да се свържат функциите на нуклеиновите киселини и кодираните от тях протеини с нуклеотидната последователност и да се установят причините за вътреклетъчните процеси, които играят важна роля в патогенезата на вирусна инфекция.

Методите за вирусологично изследване също се основават на имунологични процеси (взаимодействие на антиген с антитела), биологични свойства на вируса (способност за хемаглутинация, хемолиза, ензимна активност), характеристики на взаимодействието на вируса с клетката гостоприемник (естеството на цитопатичния ефект, образуване на вътреклетъчни включвания и др.) .

При диагностицирането на вирусни инфекции, при култивирането, изолирането и идентифицирането на вируси, както и при приготвянето на ваксинални препарати, широко се използва методът на тъканната и клетъчната култура. Използват се първични, вторични, стабилни непрекъснати и диплоидни клетъчни култури. Първичните култури се получават чрез диспергиране на тъкани с протеолитични ензими (трипсин, колагеназа). Източник на клетки могат да бъдат тъкани и органи (по-често бъбреци) на човешки и животински ембриони. Суспензия от клетки в хранителна среда се поставя в т. нар. матраци, бутилки или петриеви панички, където след закрепване към повърхността на съда клетките започват да се размножават. За вирусна инфекция обикновено се използва клетъчен монослой. Хранителната течност се отцежда, вирусната суспензия се въвежда в определени разреждания и след контакт с клетките се добавя свежа хранителна среда, обикновено без серум.

Клетките от повечето първични култури могат да бъдат субкултивирани и се наричат ​​вторични култури. При по-нататъшно преминаване на клетките се образува популация от фибробластоподобни клетки, способни на бързо възпроизвеждане, повечето от които запазват оригиналния набор от хромозоми. Това са така наречените диплоидни клетки. При серийно култивиране на клетки се получават стабилни непрекъснати клетъчни култури. По време на пасажи се появяват бързо делящи се хомогенни клетки с хетерплоиден набор от хромозоми. Стабилните клетъчни линии могат да бъдат монослойни и суспензионни. Еднослойните култури растат под формата на непрекъснат слой върху стъклената повърхност, суспензионните култури растат под формата на суспензии в различни съдове с помощта на бъркалки. Има над 400 клетъчни линии, получени от 40 различни животински вида (включително примати, птици, влечуги, земноводни, риби, насекоми) и хора.

Части от отделни органи и тъкани (органни култури) могат да се култивират в изкуствени хранителни среди. Тези видове култури запазват тъканната структура, което е особено важно за изолирането и преминаването на вируси, които не се възпроизвеждат в недиференцирани тъканни култури (например коронавируси).

В заразени клетъчни култури вирусите могат да бъдат открити чрез промяна в клетъчната морфология, цитопатично действие, което може да бъде специфично, поява на включвания, чрез определяне на вирусни антигени в клетката и в културалната течност; определяне на биологичните свойства на вирусно потомство в културална течност и титруване на вируси в тъканна култура, пилешки ембриони или чувствителни животни; чрез откриване на отделни вирусни нуклеинови киселини в клетки чрез молекулярна хибридизация или клъстери от нуклеинови киселини чрез цитохимичен метод с помощта на флуоресцентна микроскопия.

Изолирането на вируси е трудоемък и продължителен процес. Провежда се, за да се определи вида или варианта на вируса, циркулиращ сред населението (например за идентифициране на сероварианта на грипния вирус, дивия или ваксиналния щам на полиомиелитния вирус и др.); в случаите, когато е необходимо провеждането на спешни епидемиологични мерки; когато се появят нови видове или варианти на вируси; ако е необходимо, потвърдете предварителната диагноза; за индикация на вируси в обекти на околната среда. При изолиране на вируси се взема предвид възможността за тяхното персистиране в човешкия организъм, както и възникването на смесена инфекция, причинена от два или повече вируса. Генетично хомогенна популация на вирус, получена от един вирион, се нарича вирусен клонинг, а процесът на получаването му се нарича клониране.

За изолиране на вируси се използва инфекция на податливи лабораторни животни, пилешки ембриони, но най-често се използва тъканна култура. Наличието на вирус обикновено се определя от специфична клетъчна дегенерация (цитопатичен ефект), образуване на симпласти и синцитии, откриване на вътреклетъчни включвания, както и специфичен антиген, открит чрез имунофлуоресценция, хемадсорбция, хемаглутинация (при хемаглутиниращи вируси) и др. . Тези признаци могат да бъдат открити само след 2-3 пасажа на вируса.

За изолирането на редица вируси, като например грипните вируси, се използват пилешки ембриони, за изолирането на някои вируси Coxsackie и редица арбовируси се използват новородени мишки. Идентифицирането на изолирани вируси се извършва с помощта на серологични тестове и други методи.

При работа с вируси се определя техният титър. Титруването на вируси обикновено се извършва в тъканна култура, като се определя най-високото разреждане на течността, съдържаща вируса, при която настъпва тъканна дегенерация, образуват се включвания и вирус-специфични антигени. Методът на плаката може да се използва за титруване на редица вируси. Плаките или отрицателните колонии от вируси са огнища на унищожени от вируса клетки на еднослойна тъканна култура под агарово покритие. Преброяването на колониите позволява количествен анализ на инфекциозната активност на вирусите въз основа на това, че една инфекциозна вирусна частица образува една плака. Плаките се идентифицират чрез оцветяване на културата с витални багрила, обикновено неутрално червено; плаките не адсорбират боята и затова се виждат като светли петна на фона на оцветени живи клетки. Титърът на вируса се изразява като брой образуващи плака единици в 1 мл.

Пречистването и концентрирането на вирусите обикновено се извършва чрез диференциално ултрацентрофугиране, последвано от центрофугиране в градиенти на концентрация или плътност. За пречистване на вируси се използват имунологични методи, йонообменна хроматография, имуносорбенти и др.

Лабораторната диагностика на вирусни инфекции включва откриване на патогена или неговите компоненти в клиничен материал; изолиране на вируса от този материал; серодиагностика. Изборът на лабораторен диагностичен метод във всеки отделен случай зависи от естеството на заболяването, периода на заболяването и възможностите на лабораторията. Съвременната диагностика на вирусните инфекции се основава на експресни методи, които позволяват получаване на отговор няколко часа след вземане на клиничен материал в ранните стадии след заболяването.Те включват електронна и имунна електронна микроскопия, както и имунофлуоресценция, метод на молекулярна хибридизация, откриване на антитела от клас lgM и др.

Електронната микроскопия на отрицателно оцветени вируси позволява диференциране на вирусите и определяне на тяхната концентрация. Използването на електронна микроскопия при диагностицирането на вирусни инфекции е ограничено до случаите, когато концентрацията на вирусни частици в клиничния материал е достатъчно висока (10 5 в 1 мли по-високи). Недостатъкът на метода е невъзможността да се прави разлика между вируси, принадлежащи към една и съща таксономична група. Този недостатък се елиминира чрез използване на имунна електронна микроскопия. Методът се основава на образуването на имунни комплекси, когато специфичен серум се добавя към вирусни частици, докато се получава едновременна концентрация на вирусни частици, което прави възможно тяхното идентифициране. Методът се използва и за откриване на антитела. За целите на експресната диагностика се извършва електронно микроскопско изследване на тъканни екстракти, изпражнения, течност от везикули и секрети от назофаринкса. Електронната микроскопия се използва широко за изследване на морфогенезата на вируса, нейните възможности се разширяват с използването на белязани антитела.

Методът на молекулярната хибридизация, базиран на откриването на специфични за вируса нуклеинови киселини, дава възможност за откриване на единични копия на гени и няма равен по отношение на чувствителността. Реакцията се основава на хибридизацията на комплементарни вериги на ДНК или РНК (сонди) и образуването на двойноверижни структури. Най-евтината сонда е клонирана рекомбинантна ДНК. Сондата е белязана с радиоактивни прекурсори (обикновено радиоактивен фосфор). Използването на колориметрични реакции е обещаващо. Има няколко варианта на молекулярна хибридизация: точкова хибридизация, блот хибридизация, сандвич хибридизация, in situ хибридизация и др.

Антителата от клас lgM се появяват по-рано от антителата от клас G (на 3-5-ия ден от заболяването) и изчезват след няколко седмици, така че тяхното откриване показва скорошна инфекция. Антитела от клас IgM се откриват чрез имунофлуоресценция или ензимен имуноанализ, като се използват анти-m антисеруми (анти-IgM тежковерижни серуми).

Серологичните методи във вирусологията се основават на класически имунологични реакции (вж. Имунологични методи на изследване ): реакции на свързване на комплемента, инхибиране на хемаглутинацията, биологична неутрализация, имунодифузия, индиректна хемаглутинация, радиална хемолиза, имунофлуоресценция, ензимен имуноанализ, радиоимуноанализ. Разработени са микрометоди за много реакции и техните техники непрекъснато се подобряват. Тези методи се използват за идентифициране на вируси с помощта на набор от известни серуми и за серодиагностика, за да се определи увеличението на антителата във втория серум в сравнение с първия (първият серум се взема в първите дни след заболяването, вторият - след 2-3 седмици). Диагностичната стойност е не по-малко от четирикратно увеличение на антителата във втория серум. Ако откриването на антитела от клас lgM показва скорошна инфекция, тогава антителата от клас lgC персистират няколко години, а понякога и цял живот.

За идентифициране на отделни антигени на вируси и антитела към тях в сложни смеси без предварително пречистване на протеини се използва имуноблотинг. Методът съчетава протеиново фракциониране чрез електрофореза в полиакриламиден гел с последващ имуноанализ на протеини чрез ензимен имуноанализ. Разделянето на протеини намалява изискванията за химическа чистота на антигена и дава възможност за идентифициране на отделни двойки антиген-антитяло. Тази задача е от значение, например, при серодиагностиката на HIV инфекцията, където фалшиво положителни реакции на ензимен имуноанализ се дължат на наличието на антитела срещу клетъчни антигени, които присъстват в резултат на недостатъчно пречистване на вирусни протеини. Идентифицирането на антитела в серума на пациенти срещу вътрешни и външни вирусни антигени позволява да се определи стадият на заболяването, а при анализа на популациите - променливостта на вирусните протеини. Имуноблотингът при HIV инфекция се използва като потвърдителен тест за откриване на отделни вирусни антигени и антитела към тях. При анализиране на популациите методът се използва за определяне на вариабилността на вирусните протеини. Голямата стойност на метода е във възможността за анализиране на антигени, синтезирани чрез рекомбинантна ДНК технология, установяване на техния размер и наличие на антигенни детерминанти.

Основните методи, използвани в диагностиката на вирусните заболявания, са култивирането и идентифицирането на вируси.

За да се докаже вирусната етиология на заболяването, е необходимо вирусът да се изолира от тялото на болна риба, да се прехвърли върху клетъчна култура или чувствителна риба, да се възпроизведе болестта в здрави риби от същия или сродни видове и повторно изолирайте същия вирус от опитни животни.

Използват се няколко допълващи се метода за идентифициране на вируси: електронна микроскопия на вируса, изследване на неговите физикохимични свойства, откриване на характерни морфологични промени в заразените клетки и симптоми при заразени животни, различни имунологични методи.

Вирусите се изолират главно върху еднослойни първични или трансплантирани клетъчни култури, като във всеки случай се избират култури, които са чувствителни към даден вирус. За получаване на първични култури от рибни клетки най-често се използват половите жлези на женски шаран или каракуда. Гонадите трябва да бъдат II или II-III етап на зрялост според скалата на Киселевич. Такива полови жлези не съдържат видими с просто око яйца. В противен случай съдържанието на яйцата ще повлияе неблагоприятно на растежа на клетките. По утвърдения метод се приготвят клетъчни култури от гонади на шаран и каракуда.

Като непрекъснати култури най-широко приложение намират следните клетъчни линии: FHM - от тъканите на опашното стъбло на дебелоглавата мивка; RTG - от половите жлези на дъгова пъстърва; EPC - от израстъци от шарка по кожата на шарана. Тези линии се поддържат в специализирани лаборатории за изследване на болести по рибите на ветеринарни и рибарски научноизследователски институти, където могат да бъдат заявени и получени.

При диагностицирането на добре проучени вирусни заболявания се изследват органите и тъканите, където е концентриран патогенът.

При заболявания на рибите, информацията за които е недостатъчна, най-засегнатите органи се подлагат на вирусологично изследване. Остъргвания от кожата и хрилете, парчета от тези органи, заедно със слуз, се поставят в стерилни флакони с 2-3 ml стерилен физиологичен или буферен разтвор. Вземането на проби от вътрешните органи се извършва при строго асептични условия.

В случаите, когато е невъзможно бързо да се изследва материалът, той се съхранява за не повече от един ден в хладилник при температура не по-висока от 5 ° C. Замразеният материал може да се съхранява за по-дълго време.

Патологичният материал, предназначен за изследване, се раздробява в хомогенизатор или се смила в порцеланов хаван с кварцов пясък. От натрошените тъкани се приготвя 10% суспензия в разтвори на Hank's, Earl's, буфер или физиологичен разтвор и се центрофугира 10-15 минути при 2000-3000 rpm, супернатантата се изсмуква с пипета и се поставя в стерилни флакони. Ако суспензията не е стерилна, приготвените материали се филтрират през мембранни филтри с диаметър на порите 0,2-0,45 µm или се третират с антибиотици (пеницилин 1000 IU/ml и стрептомицин 1000 µg/ml).

Приготвя се 20% суспензия от чревното съдържимо в стерилна дестилирана вода и се центрофугира за 10-15 минути при 2000 rpm. Супернатантата се центрофугира отново при 4000-5000 rpm за 30 минути. След това супернатантата се аспирира в стерилен флакон и се третира с антибиотици. За 1 ml добавете 1000 µg/ml стрептомицин и 1000 IU/ml пеницилин. Сместа се държи 2-3 часа при: стайна температура. Всички материали са тествани за бактериална стерилност чрез инокулация върху BCH и MPA. Подготвените материали се използват незабавно за работа или в краен случай се съхраняват в замразено състояние (при температура минус 20 ° C).

Инфекция на клетъчна култура. За инфекция се използват тръби с добър клетъчен монослой или зона на растеж около експланта. Хранителната среда се изсмуква и във всяка епруветка се добавят 0,2-0,3 ml от тестовата суспензия. В същото време към епруветките се добавят 0,8-0,9 ml хранителна среда с 2-3% серум.

Материалът, приготвен от всяка проба, се заразява с тъканна култура в 4-6 епруветки. От всяка серия изследвания се оставят същия брой епруветки като контроли, като към тях се добавя 1 ml хранителна среда. Епруветките се оставят на стайна температура за 1-2 часа за адсорбция на вируса върху клетките, след което супернатантната течност се изсмуква с пипета и към първоначалния обем се добавя поддържаща хранителна среда.

Инфектираните и контролните клетъчни култури се инкубират при температура 22-26°C и се изследват ежедневно под микроскоп с ниско увеличение за откриване на възникващи морфологични промени в клетките. При тежка клетъчна дегенерация културалната течност се аспирира и се правят пасажи, а при липса на цитопатогенен ефект (CPE) се извършват два последователни пасажа. За да направите това, използвайте културалната течност заедно с клетъчната фракция, унищожена чрез многократно замразяване и размразяване. Супернатантът от центрофугираната клетъчна маса се използва за заразяване на свежи култури. CPP след третия пасаж се отчита като специфично действие на вирусния агент.

Степента на увреждане на клетъчния монослой се оценява по 4-кръстосаната система; "+" - щети до 25%, "+ +" - до 50%, "+ + +" - до 75% и "+ + + +" - до 100% от монослоя.

При някои вирусни заболявания на рибите в клетките (цитоплазмата на ядрото) на различни органи и тъкани се появяват телца за включване. Материалът за изследване на вирусни включвания са заразени тъканни култури, изстъргвания и петна-отпечатъци от органи и тъкани, посочените материали се фиксират преди оцветяване съгласно общоприетите методи, като се използват течности Dubosque-Brazil-Bouena, Bouena, Carnoy или 10% разтвор на неутрален формалин.

Вирусните включвания се оцветяват по различни методи: според Muromtsev, ruby, Mann, Sellex, Klisenko, Romanovsky-Giemsa, May-Grunald-Giemsa и др.

Титруване на вируса- количествено определяне на вирусната активност. Вирусният титър се изразява като брой инфекциозни единици, съдържащи се в единица обем вирусна суспензия. За инфекциозна единица на вируса се приема такава доза, която причинява инфекция на 50% от заразените с него възприемчиви обекти. Тази доза вирус се нарича инфекциозна и се обозначава с ID 50.

Клетъчните култури се използват главно като чувствителни обекти при титруване на рибни вируси. Титруването в клетъчната култура се извършва според цитопатогенния ефект на вирусите. В този случай ID 50 се нарича тъканна цитопатогенна доза (TCD 50), а вирусният титър се изразява като количество TCD 50 в 1 ml вирусна суспензия. Титърът на вируса се определя чрез метода на окончателното разреждане. Съгласно този метод чувствителните клетъчни култури инжектират определен обем вирусна суспензия в последователно нарастващи разреждания и, като се вземе предвид резултатът за всяка инжекция като положителен (ако CPE присъства) или отрицателен, ако CPE липсва), крайната точка на титруване се изчислява - 1 TCD 50 .

За титруване на вируси, които дават изразен CPP, се използва и плаковият метод. В този случай монослой от клетки, заразени с вируса, се излива със смес от хранителна среда с агар, за да се предотврати прехвърлянето на вируса към други клетки, които са значително отдалечени от първоначално заразените и да могат да заразят първоначалните огнища на инфекция на плаката).

Всяка плака възниква от една инфекциозна единица, която се обозначава като PFU (плакообразуваща единица), а титърът на вируса се изразява като брой PFU за единица обем от суспензията.

Реакция на неутрализация(RN) в клетъчна култура.

Реакцията се основава на свързването на антиген с антитела на хомоложен антисерум. Реакцията се използва за идентифициране на патогени при диагностицирането на заболявания с вирусна етиология. Позволява ви да определите чрез известни антитела неизвестен вирусен антиген или чрез известен (стандартен) антиген - неизвестни антитела в серума на болна или възстановена риба.

Определянето на изолирания вирус в реакцията на неутрализация се извършва с помощта на набор от диагностични хиперимунни антисеруми (антитела) на антигени (вируси), хомоложни на тях.

Хиперимунните антисеруми се получават чрез заразяване на лабораторни животни (например зайци) с известни щамове на вируси, които причиняват заболявания на рибите. Получените антисеруми определят титрите на специфични антитела. За работа се вземат антисеруми, съдържащи антитела във високи титри.

Редът на реакцията.

1. Инактивиране на нормален и хиперимунен серум чрез нагряване при 56°C за 30 минути.

2. Приготвяне на разреждания на реакционните съставки. Антигенът и серумът се разреждат с хранителна среда без серум и антибиотици, като се започне от 1: 5, 1: 50, 1: 500 и докато се получи разреждане със съдържание по-малко от 1 TCD 50 / 0,2 ml. Хиперимунният серум се разрежда 1: 2 или 1: 5. При нисък титър серумът се използва неразреден. Нормалният серум се разрежда по същия начин като хиперимунния серум.

3. Изложение на реакцията. Три реда стерилни епруветки се поставят в стелаж. В първия ред се излива разреден хиперимунен серум, във втория - разреден нормален серум, а в третия - хранителна среда. Всяка съставка се добавя в обем от 0,5 ml.

Готовите разреждания на вируса се прехвърлят по 0,5 ml в съответните епруветки от всеки от трите реда, като вирусът от всяко разреждане I се пренася с отделна пипета, като се започне от най-високото разреждане. Така във всеки ред епруветки се получават серийни 10-кратни разреждания на вируса: 10-1, 10-2 и т.н.

За да се контролира токсичността на серума, 0,5 ml от приготвения разтвор на хиперимунен серум се добавя в отделна епруветка и след това се добавя равно количество хранителна среда. Същото се прави и с нормален серум.

Разклатете добре епруветките със смесите и инкубирайте при стайна температура за 1 час. След това инфектирайте клетъчната култура с всяко разреждане на вируса (0,2 ml на епруветка) с хиперимунни нормални серуми и хранителна среда, 4 епруветки с клетъчна култура. Успоредно с това поставете контроли върху токсичността на използваните клетки и контролни проби от клетъчна култура.

Епруветките с клетъчна култура се инкубират в термостат при оптимална температура за възпроизвеждане на този вирус и се изследват ежедневно под микроскоп с ниско увеличение, за да се открие CPE на вируса. Резултатите се въвеждат в таблицата (Таблица 11).

Вирусният титър се изразява като брой инфекциозни единици, съдържащи се в обемна единица на вирусната суспензия. Намерете индекса на неутрализация (IN). Съответства на максималното количество ID 50, което може да бъде неутрализирано от хиперимунен серум. Изчисляването на IN се извършва по формулата: lgIN = lgT 1 -lgT 2, където T 1 - титър на вируса в присъствието на нормален серум; Т 2 - вирусен титър в присъствието на хиперимунен серум. Стойността на IN се намира от таблицата на антилогаритмите. Обичайно е стойността на IN до 10 да се счита за отрицателна, от 10 до 49 - съмнителна, 50 или повече - положителен резултат.

Резултатите от реакцията могат да се считат за надеждни само ако хиперимунният серум се тества за специфична неутрализираща активност. За да направите това, предварително определете титъра на неутрализиращи антитела в този серум или неговия неутрализационен индекс в реакция с хомоложен вирус.

Изолиране на плака на рабдовируси. Този метод е специфичен, използва се за изолиране, предварително типизиране и селекция на рабдовируси на шаран и пъстърва при наличие на специфични имунни серуми за идентифициране на вируса.

Заоблени колонии (плаки) се образуват в клетъчни култури под агарово покритие при наличие на вирус в тестовия материал.

При асептични условия тъканта на бъбреците, черния дроб, далака и течността от коремната кухина се събират с пипета на Пастьор, прехвърлят се във флакон със среда, съдържаща 500 IU (mcg) / ml антибиотици в съотношение 1: 10. инкубират се 60-90 минути при температура 18-22 °C, след което се центрофугират при 2-3 хиляди rpm за 10 минути. Супернатантата се разрежда с хранителна среда 1:10 (разреждане 1:100). И двете разреждания на супернатанти се използват за заразяване на клетъчни култури.

За изследването се избира 3-дневна непрекъсната клетъчна култура, отглеждана в дюшеци с добре дефиниран монослой в размер на 2 дюшека за всяко разреждане на патологичния материал и 2 дюшека за контрол. Хранителната среда се отстранява от флаконите и се добавят 2 ml от средата без фетален серум. След това се добавят 0,2 ml от изследвания патологичен материал и се оставят за адсорбция на вируса за 60 минути при оптимална температура за вируси, които заразяват рибите (за шаранови вируси - 24-26 ° C и за вируси на пъстърва - 16-18 ° C ).

Контролът се поставя в 2 дюшека с клетъчни култури от 0,2 ml, съдържащи 100 TCD 50 /ml известен вирус, и 2 - 0,2 ml хранителна среда без вирус.

След 60 минути течността от флаконите се отстранява. На стената, противоположна на монослоя, 5 ml агарово покритие, загрято до 40-42 ° C (при изолиране на HCV вируса - не повече от 38 ° C), се въвежда във флакон от 50 ml. Матраците са обърнати еднослойно надолу, покрити с черна хартия. След 15-20 минути дюшеците се прехвърлят за инкубация при оптимална температура за изследваните вируси. Матраците се поставят с агар нагоре. При неизвестен вирус културите се държат при две температурни условия - 14-18 и 22-24°C.

Заразените клетъчни култури се разглеждат на бял фон. Ако има вирус в изследвания материал в клетъчната култура, първо се появяват прозрачни точки върху розово-матовия фон на културата. В бъдеще те се увеличават по размер, образувайки кръгли прозрачни колонии - плаки, чието присъствие показва наличието на рабдовируси в патологичния материал.

С пипета на Пастьор се събира парче плака на границата на засегнатата и незасегнатата част, така че в нея да попадне не само агарът, но и клетъчният слой. Избраното парче се поставя в епруветка с 1 ml от хранителната среда, замразява се при минус 20°C и се инкубира за 60 min. В случай на голям брой плаки (целият клетъчен слой е прозрачен), изследванията се повтарят в разреждания 10 -3 и 10 -4.

Плаки с диаметър 3-8 mm от рабдовирус на шаран върху непрекъсната култура на EPC и FHM, инкубирани при температура 24-26°C, се появяват на 4-7-ия ден.

При липса на плаки и наличие на CPD в клетъчни култури се извършват допълнителни изследвания на съдържащата вирус културална течност в разреждания от 10 -2 -10 -3 (2-3 пасажа). Като допълнителни методи за идентифициране на вируси се използват: методът на флуоресцентните антитела; определяне на чувствителността на вируса към хлороформ, етер, рН стойност, нагряване; електронно микроскопско изследване на морфологията на вируса.