Biotestiranje otpadnih voda metodom Daphnia. Počni u nauci

Biotestiranje (biološko ispitivanje) - procjena kvaliteta objekata životne sredine (vode i sl.) prema odgovorima živih organizama koji su objekti za ispitivanje.

Ovo je široko korištena eksperimentalna metoda, a to je toksikološki eksperiment. Suština eksperimenta je da se ispitni objekti postavljaju u okruženje koje se proučava i izdrži (izlaže) određeno vrijeme tokom kojeg se snimaju reakcije testnih objekata na uticaj ovog okruženja.

Tehnike biotestiranja se široko koriste u različitim oblastima zaštite životne sredine i koriste se u različite svrhe. Biotestiranje je glavna metoda u razvoju MPC standarda za hemikalije (biotestiranje toksičnosti pojedinih hemikalija), i, u krajnjoj liniji, u proceni opasnosti po životnu sredinu i javno zdravlje. Dakle, procjena stepena kontaminacije na osnovu rezultata hemijske analize, tj. tumačenje rezultata u smislu opasnosti po životnu sredinu takođe se u velikoj meri oslanja na podatke biotestiranja.

Metode biotestiranja, kao biološke u suštini, slične su po značenju dobijenih podataka metodama hemijske analize vode: kao i hemijske metode, odražavaju karakteristike uticaja na vodene biocenoze.

Zahtjevi koji se primjenjuju na metode biotestiranja:

- osjetljivost test organizama na dovoljno niske koncentracije zagađivača.
- odsustvo inverzije odgovora test organizama na različite vrijednosti koncentracije zagađivača u granicama onih vrijednosti zabilježenih u prirodnim vodama;
- sposobnost dobijanja pouzdanih rezultata, metrološka sigurnost metoda;
- dostupnost test organizama za sakupljanje, lakoća uzgoja i održavanja u laboratoriji;
- jednostavnost implementacije postupka i tehnika biotesta;
- niska cijena radova biotestiranja.

Razvijaju se dva glavna područja rada na biotestiranju:

- izbor metoda pomoću hidrobionta, koji pokrivaju glavne hijerarhijske strukture vodenog ekosistema i karike u trofičkom lancu;
- traženje najosetljivijih test organizama, koji bi omogućili hvatanje niskog nivoa toksičnosti uz obezbeđivanje pouzdanosti informacija.

Za toksikološku procjenu zagađenja slatkovodnih ekosistema na osnovu biotestiranja vodene sredine preporučuje se korištenje nekoliko vrsta test objekata: alge, dafnije, ceriodafnije, bakterije, protozoe, rotifere i ribe.

Alge su osnova lanaca ishrane u svim prirodnim ekosistemima. Najosjetljiviji organizmi na širok spektar hemikalija od deterdženata do NFPR-a. Smrt ćelije, poremećaj brzine rasta, promene u procesima fotosinteze itd. metabolički. procesi. Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda, Anabaena, Microcystis, Oscillatoria, Phormidium.

Bakterije - promjena u brzini razgradnje (biorazgradnje) organskih jedinjenja / Nitrosomonas, Nitrosobacter; promjene u metaboličkim procesima u organizmu - Escherichia coli (procjena učinka toksičnog sredstva na fermentaciju glukoze)

Protozoa. Dafnija. DDT, (HCCH) heksahlorcikloheksan, TEŠKI metali (bakar-cink-kadmijum-hrom), biogeni elementi. Daphnia magna.

Rotiferi

Riba. Gupi (Poecillia reticulata) - metali, pesticidi; zebra (Brachidanio rerio).

Ribe prirodnih voda. Visoko osjetljivi: - losos (pastrmka), šiljak, gudak, plotica, ćugar, smuđ, vrh; srednje osjetljivi: smuđ, crvendać, deverika, gavčica, šaran, ukljeva.

Toksičnost vode

O prisutnosti toksičnosti sudi se prema manifestacijama negativnih efekata u ispitivanim objektima, koji se smatraju pokazateljima toksičnosti.

Među indikatorima toksičnosti izdvajaju se: opšti biološki, fiziološki, biohemijski, hemijski, biofizički itd.

Indikator toksičnosti je testna reakcija, čije promjene se bilježe tokom toksikološkog eksperimenta.

Treba napomenuti da se toksikološki (biotest) indikatori u ekološkoj i vodenoj toksikologiji podrazumijevaju kao indikatori biotestiranja na različitim ispitivanim objektima. Istovremeno, u sanitarno-higijenskoj regulativi pod toksikološkim pokazateljima se podrazumijevaju koncentracije toksičnih hemikalija (npr. u regulaciji vode za piće karakterišu njenu neškodljivost).

Prilikom biotestiranja uzoraka prirodne vode obično se postavljaju dva pitanja: - da li je uzorak prirodne vode toksičan; - koji je stepen toksičnosti, ako postoji?

Kao rezultat biotestiranja uzoraka na osnovu registracije indikatora toksičnosti, toksičnost se procjenjuje prema kriterijima utvrđenim za svaki biološki objekat. Rezultati biotestiranja eksperimentalnog uzorka iz područja istraživanja upoređuju se sa kontrolnim, očigledno netoksičnim uzorkom, a prisutnost toksičnosti se procjenjuje po razlici u kontroli i iskustvu.

U ovom slučaju, učinci izloženosti se dijele na akutne i kronične. Nazivaju se akutnim i kroničnim toksičnim efektima ili akutnim i kroničnim toksičnim efektima (OTD i CTD). Ovi izrazi se koriste za izražavanje rezultata biotestiranja.

Akutni toksični učinak - učinak koji uzrokuje brzu reakciju ispitivanog objekta. Najčešće se mjeri testnom reakcijom "preživljavanje" u relativno kratkom vremenskom periodu.

Hronični toksični efekat - efekat koji izaziva reakciju ispitivanog objekta, koja se manifestuje tokom relativno dugog vremenskog perioda. Mjereno test reakcijama: preživljavanje, plodnost, promjena rasta, itd.

Reakcija test objekata na toksično izlaganje ovisi o intenzitetu ili trajanju izlaganja. Prema rezultatima biotestiranja, utvrđena je kvantitativna veza između veličine udara i reakcije test objekata.

Reakcija organizama na utjecaj toksičnih kemikalija je kompleks međusobno povezanih, evolucijski formiranih reakcija usmjerenih na održavanje postojanosti unutrašnjeg okruženja tijela i, u konačnici, opstanak.

Otkriveni su određeni obrasci reakcija organizama na toksične efekte. Općenito, učinak toksične tvari na tijelo opisuje se s dva glavna parametra: koncentracijom i vremenom izlaganja (izloženosti). Upravo ti parametri određuju stupanj utjecaja toksične tvari na tijelo.

Izloženost - period tokom kojeg je tijelo pod uticajem proučavanog faktora, posebno hemijske supstance. Ovisno o izloženosti, razlikuju se akutni ili kronični toksični efekti.

Rezultat toksičnog izlaganja se obično naziva efektom toksičnog izlaganja. Da bi se opisao odnos između djelovanja toksične tvari na tijelo i njene koncentracije, predložene su različite funkcije, na primjer, Haberova formula:

gdje je E efekat (rezultat) uticaja;

C je koncentracija aktivne tvari;

T - vrijeme ekspozicije (ekspozicija).

E - predstavlja bilo koji rezultat izlaganja (smrt test objekata), a vrijednosti C i T - mogu se izraziti u odgovarajućim mjernim jedinicama.

Kao što se može vidjeti iz Haberove formule, postoji direktna funkcionalna veza između efekta koncentracije vremena izlaganja: učinak će biti veći, što je veća veličina izlaganja (koncentracija supstance) i/ili njegovo trajanje.

Haberova formula omogućava upoređivanje bioloških efekata različitih hemikalija analizom njihove koncentracije ili izloženosti. Razlike u bilo kojoj od ovih vrijednosti odražavaju razlike u osjetljivosti organizama na toksične efekte.

Pri niskim koncentracijama ili ekspozicijama, efekat ekspozicije se manifestuje u populaciji malog broja test objekata, koji su najosjetljiviji, tj. najmanje otporan na udarce. Kako koncentracija ili izloženost raste, broj otpornih organizama se smanjuje i na kraju svi (ili gotovo svi) organizmi uspijevaju registrirati dobro definirane toksične efekte. U toku toksikološkog eksperimenta utvrđuje se zavisnost odgovora test objekata o veličini ili vremenu izlaganja.

Parametri hemijske toksičnosti:

- Smrtonosna koncentracija (LC50) - koncentracija otrovne tvari koja uzrokuje smrt 50% testiranih organizama u određenom vremenu (što je niži LC50, to je veća toksičnost kemikalije ili vode)
- Maksimalna neaktivna koncentracija - najveća izmjerena koncentracija hemikalije (testna voda) koja ne izaziva uočljiv hemijski efekat (što je niži MNC, to je veća toksičnost hemikalije ili otpadne vode).

Ne reaguju svi organizmi na isti način na istu izloženost. Reakcija zavisi od osetljivosti na vazduh.

Osetljivost organizma na toksičnu supstancu je skup reakcija na njene efekte, koji karakterišu stepen i brzinu reakcije organizma. Karakteriziraju ga takvi pokazatelji kao što su vrijeme početka manifestacije odgovora (reakcije) ili koncentracija toksične tvari u kojoj se reakcija manifestira; značajno se razlikuje ne samo kod različitih vrsta, već i kod različitih jedinki iste vrste.

Prema seriji osjetljivosti koju je razvio S.A. Patin (1988), ispitni objekti se mogu rasporediti na sljedeći način:

Riba-zooplankton-zoobentos-fitoplankton-bakterije-protozoe-makrofiti.

Postoje i druge serije osjetljivosti.

Na primjer, kod biotestiranja voda preduzeća za celulozu i papir: alge-bakterije-ribe (za smanjenje osjetljivosti).

Faktori koji utiču na biotestiranje:

- faktori koji utiču na ispitne organizme (izloženost; uslovi uzgoja; u prirodi - uslovi života biljaka i životinja; starosne karakteristike, godišnje doba, snabdijevanje testnih organizama hranom, temperatura (pesimum i optimalna), osvijetljenost);
- faktori koji određuju fizičko-hemijska svojstva ispitivane prirodne vode, od kojih zavisi njena toksičnost za ispitivane organizme (svježina uzorka, prisustvo suspendovanih čestica u njemu).

TsOS PV R 005-95

Dokument je izradio tim autora koji čine: Rakhmanin Yu.A., Cheskis A.B. (menadžeri razvoja), Eskov A.P., Kiryanova L.A., Mikhailova R.I., Plitman S.I., Rogovets A.I., Tulakina N.V., Rusanova N.A., Doneryan L.G., Pozharov A.V.

U prilozima su korišćeni materijali Uputstva za biotestiranje vode RD 118-02-90* i metodološka dokumenta o upotrebi uređaja „BIOTESTER“, kao i „Metode praćenja toksičnosti medicinskih proizvoda za jednokratnu upotrebu sterilisanih zračenjem ili gasnom metodom" (Ministarstvo zdravlja SSSR-a, 1991. ).

________________
* Dokument naveden u daljem tekstu se ne reprodukuje. Za više informacija slijedite link

Dostavio: Tehnički komitet za standardizaciju TK-343 "Kvalitet vode"

Predstavio: Odeljenje za standardizaciju i sertifikaciju prehrambene, lake industrije i poljoprivredne proizvodnje Državnog standarda Rusije

Odobrio: Zamjenik predsjednika Gosstandarta Rusije 10/12/95 za objavljivanje i distribuciju kao metodološki referentni priručnik.

Registrovao: Centralno telo za sertifikaciju vode za piće, materijala, tehnoloških procesa i opreme koja se koristi u vodosnabdevanju domaćinstava i pijaće vode N TsOS PV R 005-95

OPĆE ODREDBE

U kontekstu sve većeg antropogenog zagađenja izvorišta vodosnabdijevanja, osiguranje sigurnosti i neškodljivosti vode za piće koju stanovništvu snabdijevaju vodovodna preduzeća umnogome zavisi od potpunosti, pouzdanosti i efikasnosti kontrole kvaliteta vode u svim tehnološkim karikama sistema. : na kontrolnim tačkama vodnih tijela, na mjestima zahvatanja vode, na posudama čiste vode nakon njenog prečišćavanja i dezinfekcije, u distributivnoj vodovodnoj mreži kod potrošača. Istovremeno, broj standardiziranih i kontroliranih parametara kvalitete, koji zajedno određuju sigurnost i neškodljivost vode, više se nego udvostručio u protekloj deceniji i, u skladu s preporukama Svjetske zdravstvene organizacije (WHO), uključuje više preko 100 standarda. Visoka toksičnost i, shodno tome, niske maksimalno dozvoljene koncentracije (MAC) za niz teških metala i većine organskih toksikanata značajno otežavaju postupke analitičke hemijske kontrole, zahtevaju dugo vremena i veoma značajne materijalne troškove za integrisanu kontrolu kvaliteta vode. Osim toga, čak ni potpuna analiza kvaliteta vode za sve pojedinačne indikatore utvrđene regulatornim dokumentima ne omogućava utvrđivanje njihovog kompleksnog djelovanja na ljudski organizam, a usvajanje sistema za sumiranje relativnih koncentracija ne odražava u potpunosti mehanizam kumulativno dejstvo otrovnih materija na stepen opasnosti od vode koju ljudi konzumiraju.

S tim u vezi, uz tradicionalne metode praćenja kvaliteta vode u sistemima vodosnabdijevanja za piće, primjenjuju se i biološke metode ispitivanja zasnovane na procjeni stepena opasnosti vodoizvorišta vodosnabdijevanja i vode za piće prema reakciji posebno pripremljenih živih organizama - test objekti se mogu koristiti.

Značajka informacija dobivenih metodom biotestiranja je integralna priroda percepcije i refleksije svih toksičnih učinaka zbog kombinacije toksičnih tvari sadržanih u vodi i složenih faktora njihovog zajedničkog prisustva.

Istovremeno, korišćenje različitih metoda biološke analize treba da bude ograničeno određenim uslovima u odnosu na ciljeve kontrole, mesto uzorkovanja vode, stepen efikasnosti itd., u zavisnosti od specifičnosti svake pojedine metode. Moguće je koristiti složene biotestove koji se međusobno nadopunjuju u smislu osjetljivosti na različite grupe toksičnih tvari.

U svim slučajevima, upotreba metoda biotestiranja ne može zamijeniti analitičku fizičko-hemijsku kontrolu utvrđenu važećim regulatornim dokumentima, međutim, biotestovi mogu značajno dopuniti njegove rezultate procjenom kompleksnog uticaja toksičnih materija sadržanih u vodi, povećati efikasnost detekcije. opasnim nivoima kontaminacije izvora pitke vode za preduzimanje hitnih mjera za uvođenje rezervnih kapaciteta za čišćenje ili upozorenje potrošača, kao i u nekim slučajevima za povećanje učestalosti uzorkovanja za fizičku i hemijsku kontrolu i, shodno tome, smanjenje troškova kontrole uz održavanje stabilni pokazatelji nivoa sigurnosti izvorske vode u izvorištu, potvrđeni biotestovima.

Ovim dokumentom utvrđuju se opće smjernice za korištenje različitih metoda biotestiranja u centraliziranim sistemima za snabdijevanje pitkom vodom za rješavanje specifičnih problema kontrole kvaliteta vode u izvorima vodosnabdijevanja i prečišćene vode koja se isporučuje potrošačima u kombinaciji sa tradicionalnim metodama fizičko-hemijske kontrole.

Smjernice su namijenjene preduzećima za vodosnabdijevanje i kanalizaciju u cilju poboljšanja sistema kontrole kvaliteta vode, povećanja njene pouzdanosti i efikasnosti, a može ih koristiti i Ruski državni komitet za sanitarni i epidemiološki nadzor kada obavlja nadzorne funkcije nad kvalitetom vode. izvori vode za vodosnabdijevanje i kvalitet vode za piće kako bi se poboljšala pouzdanost procjene sigurnosti (neškodljivosti) kontrolirane vode u odnosu na kompleksno djelovanje toksičnih materija u njoj.

KARAKTERISTIKE METODA BIOTESTIRANJA KOJE SE KORISTE ZA KONTROLU KVALITETA VODE U JAVNIM SISTEMIMA I SISTEMIMA SNABDIJEVANJA VODOM ZA PIĆE

Glavne karakteristike metoda biotestiranja koje određuju ciljeve i uslove za njihovu moguću upotrebu u sistemima za vodosnabdevanje su:

- vrsta ispitnog objekta;

- kontrolirani parametar ispitnog objekta (testna reakcija);

- procedure za mjerenje odgovora na test;

- standardi evaluacije za određivanje stepena opasnosti od kontrolisanog okruženja (vode) za osobu prema izmerenim parametrima test reakcije.

Ribe, rakovi (dafnije, itd.), cilijati, embrionalni organizmi, alge, enzimi, bakterije itd. mogu se koristiti kao test objekti u savremenim metodama biotestiranja za kontrolu sigurnosti (bezopasnosti) vode.

Glavni zahtjevi za objekte za ispitivanje su njihova dostupnost, jednostavnost i lakoća uzgoja ili skladištenja za upotrebu, dovoljna osjetljivost na toksične tvari u vodi koje su opasne za ljude.

Reakcija testnog objekta kada je izložen otrovima ili drugim štetnim faktorima okoline može se izraziti smrću test objekata (preživljavanjem), smanjenjem intenziteta reprodukcije, smanjenjem pokretljivosti ili drugim karakteristikama ponašanja tipičnim za dati test. objekta, kao i u suzbijanju nekih biohemijskih procesa koji se odvijaju u ćelijama i enzimskim sistemima.

Glavni zahtjevi za testne reakcije pri odabiru metoda biotestiranja za praktičnu upotrebu su postojanje jasno definirane ovisnosti zabilježenih odstupanja od norme o koncentracijama toksičnih tvari u vodi, kao i mogućnost promatranja i bilježenja kvantitativnih vrijednosti testa. reakcije sa potrebnom tačnošću i pouzdanošću korišćenjem raspoloživih sredstava.kontrola.

Glavni zahtjevi za postupke mjerenja test reakcija pri korišćenju metoda biotestiranja za kontrolu kvaliteta vode u vodovodnim sistemima su mogućnost da se što prije dobije potreban „odgovor“ na pojavu opasnih toksikanata u vodi. To, u pravilu, zahtijeva korištenje posebnih upravljačkih uređaja s elementima automatizacije koji osiguravaju pretvaranje zabilježenih testnih reakcija u normalizirane vrijednosti karakteristika toksičnosti vode.

Metode biotestiranja, u kojima su postupci mjerenja test reakcije osmišljeni za dugotrajno posmatranje, mogu naći ograničenu primjenu u fazi ispitivanja i odabira izvora vode za potrebe domaćinstva i za piće ili prilikom praćenja izvora vode sa poznat stabilan kvalitet vode.

Standardi evaluacije pri korišćenju metoda biotestiranja treba da omoguće da se na osnovu dobijenih rezultata merenja donese zaključak o stepenu opasnosti vode i o preduzimanju potrebnih mera za sprečavanje moguće opasnosti po zdravlje stanovništva koje konzumira vodu za piće. ovog vodovoda kada su prekoračene dozvoljene granice opasnosti (toksičnosti) vode.

Trenutno ne postoje odobrene normalizirane vrijednosti maksimalno dozvoljenih kompleksnih toksičnih efekata mjerenih metodama biotestiranja u važećim regulatornim dokumentima.

S tim u vezi, za svaku konkretnu metodu biotestiranja, kao rezultat posebnih studija, uspostavljaju se korelacije između fiksnih vrijednosti testnih reakcija s mogućim toksičnim djelovanjem na toplokrvne životinje ili s koncentracijama specifičnih otrovnih tvari, a na tome na osnovu, uvode se određene procenjene vrednosti stepena toksičnosti (opasnosti) kontrolisane vode, u zavisnosti od zabeleženih rezultata merenja tokom biotestiranja.

Istovremeno, treba imati na umu da ove procijenjene vrijednosti nisu kriteriji za opasnost ili sigurnost vode kada se osoba koristi za piće duže vrijeme; mogu samo ukazivati na vjerovatnoću prisustva ili odsustva opasnih koncentracija toksičnih zagađivača u vodi, što se mora potvrditi rezultatima odgovarajuće kemijske kontrole, na osnovu čega se, uzimajući u obzir trenutne MPC, donosi zaključak o usklađenosti vode za piće sa utvrđenim zahtjevima i njenoj prikladnosti za ljudsku upotrebu.

Istovremeno, u usporedbi, kada se ocjenjuju, na primjer, različite tehnologije prečišćavanja vode koje osiguravaju njenu usklađenost s regulatornim zahtjevima za određene vrste otrovnih tvari, prednost treba dati onim metodama koje pružaju viši nivo sigurnosti utvrđen metodama biotestiranja. .

Tabela 1 navodi glavne karakteristike metoda biološke analize preporučene za upotrebu u kontroli kvaliteta vode u sistemima vodosnabdijevanja za domaćinstvo. Opis metoda je dat u referentnim prilozima, čija numeracija odgovara brojevima testnih objekata u tabeli 1.

Tabela 1


test objekt	Test reakcija	Testna metoda mjerenja reakcije	Standard (indeks toksičnosti)
1. Ćelijski test objekat (granularni kupka sa bikovom spermom)	Promjena indikatora mobilnosti testnog objekta	Proračun broja fluktuacija u intenzitetu raspršenog zračenja uzrokovanih prolaskom ispitnog objekta kroz optičku sondu pomoću automatskog upravljačkog sistema	Dozvoljene vrijednosti indeksa toksičnosti (omjer utvrđenih vrijednosti koje karakteriziraju pokretljivost ispitnog objekta u eksperimentalnoj i kontrolnoj otopini): %
2. Paramecium ciliates	Reakcija hemotakse - broj cilijata koje se kreću u smjeru u zoni analize	Mjerenje pomoću uređaja serije "Biotester" (na primjer, "Biotester-2"), koji omogućavaju registraciju test reakcija sa izlazom podataka u konvencionalnim jedinicama toksičnosti.	Dozvoljene vrijednosti indeksa toksičnosti (dozvoljeni stepen zagađenja): ; visok stepen zagađenja:
3. Tetrahymen ciliates- periformis	Promjene u preživljavanju i intenzitetu razmnožavanja	Vizuelna procjena (brojanje) pod mikroskopom broja test objekata u određenim vremenskim intervalima (15 minuta, 1 sat, 6 sati, 24 sata, 48 sati).	Akutni toksični učinak - smrt 100% cilijata u roku od 6 sati. Hronični toksični učinak pri omjeru toksičnosti (smanjenje broja test objekata u odnosu na kontrolu za 48 sati.) i
4. E Collie bakterija Soj	Promjena nivoa aktivnosti dehidrogenaze mikroorganizama (supresija aktivnog enzima)	Određivanje vremena promjene boje metilen plavog, kao indirektnog indikatora aktivnosti enzima dehidrogenaze.	Znak odsustva toksičnosti - odstupanje vremena promjene boje od kontrolnog uzorka je manje od 15%.
5. Školjke nye (dafnija, cejodafnija)	Promjene u stopi preživljavanja i fertiliteta	Vizuelna procjena (prebrojavanje) broja test objekata u određenim intervalima u poređenju sa kontrolnim uzorcima.	Akutni toksični efekat - smrt više od 50% rakova u 96 sati. Hronični toksični efekat - značajno smanjenje u poređenju sa kontrolnim objektima u roku od 20 dana.
6. Alge (scenedesmus, chlorella)	Smanjenje intenziteta reprodukcije (rast ćelija algi)	Vizuelna procjena (brojanje) povećanja broja ćelija u poređenju sa kontrolnim eksperimentom.	Pokazatelj toksičnog djelovanja - značajno smanjenje stope rasta broja ćelija u odnosu na kontrolu nakon 96 sati (akutni toksični učinak) i nakon 14 dana (kronični toksični učinak)
7. Ribe (gupi, zebra)	Smanjeno preživljavanje	Vizuelna procjena (prebrojavanje) prosječnog broja test objekata koji su preživjeli u ispitivanoj vodi u poređenju sa kontrolnim eksperimentom	Akutni toksični efekat - uginuće 50% ili više riba u 96 sati. Kronični toksični učinak - značajno smanjenje preživljavanja riba tijekom 30 dana u usporedbi s kontrolnim eksperimentom

Uz one navedene u tabeli 1, posebne metode nalaze praktičnu primjenu za ocjenjivanje kvaliteta vode u sustavima vodosnabdijevanja za domaćinstvo i vodu za piće, a posebno za određivanje ukupne mutagene aktivnosti pomoću bioloških test sistema nakon odgovarajuće pripreme. U analizi vode za piće ovaj preparat uključuje operacije ekstrakcije, koncentracije i sterilizacije. Za procjenu mutagenog potencijala dobijenih ekstrakata najčešće se koriste Amesov test (Salmonela/mikrozomi) i testovi za indukciju citogenetskih poremećaja (hromozomske aberacije, mikronukleusi, izmjena sestrinskih hromatida). Opis ovih postupaka sadržan je u "Smjernicama za eksperimentalnu procjenu ukupne mutagene aktivnosti zagađenja zraka i vode" (Ministarstvo zdravlja SSSR-a, M., 1990). Složenost implementacije ovih metoda omogućava njihovu upotrebu u posebnim laboratorijama istraživačkih instituta koji imaju potrebnu opremu i kvalifikovano osoblje.

Konkretno, ove studije se sistematski provode u Istraživačkom institutu za humanu ekologiju i higijenu životne sredine AN Sysin Ruske akademije medicinskih nauka.

OPĆA PRAVILA ZA PRIMJENU METODA BIOTESTIRANJA ZA KONTROLU KVALITETA VODE U CENTRALIZOVANIM SISTEMIMA KUĆANSTVA I SNABDIJEVANJA VODOM ZA PIĆE

Kontrola kvaliteta vode u centralizovanim sistemima za snabdevanje pitkom vodom obuhvata prikupljanje i analizu uzoraka vode u sledećim glavnim elementima tehnološke šeme:

- u izvorištu vodosnabdijevanja prije vodozahvata;

- u međufazama procesa prečišćavanja vode (tehnološka kontrola);

- u rezervoarima čiste vode i (ili) iz cjevovoda prije dovoda u vodovodnu mrežu;

- u vodovodnoj mreži iz razvodnih stubova ili slavina

Osim toga, u velikim vodovodnim sistemima, snage vodovodnog preduzeća kontrolišu površinske izvore vodosnabdijevanja uzorkovanjem na različitim lokacijama, po pravilu, unutar zone sanitarne zaštite.

Uzimajući u obzir specifičnosti metoda biotestiranja koje se odnose na osjetljivost većine test objekata na dezinficijense koji se koriste u procesu obrade vode, kao i karakteristike pojedinačnih metoda biotestiranja u pogledu vremena dobijanja rezultata (mogućnost implementacije ekspresne kontrole) i stepen univerzalnosti u identifikaciji različitih vrsta otrovnih materija u tabeli 2. Tabela 2 daje preporuke o preferiranoj upotrebi različitih vrsta bioloških testova za kontrolu kvaliteta vode u različitim objektima i različitim kontrolnim tačkama sistema vodosnabdijevanja.

tabela 2


Predmet kontrole	Kontrolne tačke
Voda u izvoru vode	Kontrolni punktovi unutar zona sanitarne zaštite
________________ * Dokument nije važeći na teritoriji Ruske Federacije. Na snazi je SanPiN 2.1.5.980-00, u daljem tekstu. - Napomena proizvođača baze podataka.
		2. Kontinuirana operativna „Kontrola alarma“ radi blagovremenog otkrivanja iznenadne pojave opasnih koncentracija otrovnih materija u izvorištu vodosnabdijevanja, čije prisustvo zahtijeva donošenje posebnih mjera za dodatnu hemijsku kontrolu, prečišćavanje vode i (ili) upozorenje na stanovništva.
		3. Periodična kontrola za određivanje stepena opasnosti vode po kumulativnom dejstvu toksičnih materija u njoj.
	zona zahvata vode	4. Kontinuirano operativno automatizirano "upravljanje alarmom"
		5. Periodična kontrola za potvrdu usklađenosti izvorske vode sa opštim sigurnosnim zahtjevima
Pije vodu	rezervoare čiste vode i kontrolne tačke pre ulaska u distributivni sistem	6. Periodično praćenje nakon dehlorisanja na opšte toksično dejstvo toksičnih materija koje mogu nastati u procesu prečišćavanja i dezinfekcije vode (proizvodi za dezinfekciju - organohalogena jedinjenja i dr.)
	uređaji za uzorkovanje vode u vodovodnoj mreži	7. Periodična kontrola uzoraka vode za potvrdu odsustva toksičnih efekata vode za piće nakon prolaska kroz cevovode vodovodnog sistema.
Materijali koji se koriste u opremi, proizvodima i procesima		8. Potvrda odsustva toksičnog efekta kao rezultat interakcije materijala sa vodom za izdavanje dozvola za upotrebu materijala (supstanci) u oblasti vodosnabdijevanja

Pored preporuka datih u tabeli 2, treba uzeti u obzir i neke od sledećih karakteristika metoda biotestiranja koje se odnose na njihovu osetljivost na određene grupe toksičnih supstanci i mogućnost poređenja zabeleženih rezultata test reakcija sa podacima standardizovanih metoda. hemijsko-analitičke kontrole.

Za ćelijski ispitni objekt (granulirana bikova sperma), korelacijske ovisnosti izmjerene test reakcije o nivou toksikometrijskih parametara (- pola smrtonosne doze za pacove) i koncentracijama širokog spektra organskih otrovnih tvari (hlorirani ugljovodonici, fenoli, akrilamid, formaldehid itd.) koji posebno mogu dospjeti u vodu pri kontaktu s polimernim materijalima i proizvodima. Utvrđene su granične vrijednosti indeksa toksičnosti pri kojima nema reakcije laboratorijskih životinja na kombinaciju različitih toksikanata prisutnih u vodi u određenim koncentracijama. Na osnovu toga, ovu metodu je odobrilo Ministarstvo zdravlja Rusije za procjenu polimernih materijala koji se koriste u medicinskoj opremi. Utvrđena je i osjetljivost ispitnog objekta na teške metale (živa, olovo, kadmijum).

Za metode biotestiranja pomoću cilijata utvrđeni su podaci koji karakterišu sadržaj u vodi i koncentraciju većeg broja organskih i neorganskih komponenti, pri čemu se bilježi test reakcija, koja odražava akutni toksični učinak ovih komponenti. Na osnovu toga, ova metoda se može preporučiti, posebno za praćenje kvaliteta vode u vodnim tijelima (izvori vodosnabdijevanja), koja mogu sadržavati toksična metalna jedinjenja (živa, hrom, kadmijum, nikl, bakar, cink) i organska jedinjenja. jedinjenja (hloroform, benzen, akrilamid, vinil acetat, metil metakrilat, itd.).

Prilikom upotrebe enzimskih sistema kao testnog objekta (procjena inhibicije dehidrogenaze), dovoljno je visoka osjetljivost test reakcija na prisustvo u vodi povišenih koncentracija jona teških metala (živa, olovo, bakar, kadmijum), kao i niz organska jedinjenja (fenoli, resorcinol, hidrokinon, itd.). Specifičnost pri korištenju enzimskih test sistema umjesto živih organizama je nedostatak dovoljne osjetljivosti na respiratorne otrove (cijanide), karcinogene poput benzapirena, kao i na neke anjone (nitrite, nitrate).

Upotreba rakova, algi i riba u sistemima za biotestiranje za određivanje akutnih i kroničnih toksičnih učinaka kontrolirane vode uz odgovarajuće trajanje eksperimenata karakterizira ukupan nivo zagađenosti vode toksičnim komponentama i prisutnost štetnih faktora koji utiču na vitalne funkcije organizama. . S obzirom na osjetljivost na pojedinačne toksične tvari, ove metode su relativno manje specifične u odnosu na korištenje, na primjer, cilijata, međutim, zabilježene test reakcije se mogu javiti pri opasnim koncentracijama u vodi teških metala (živa, krom, itd.), fenola i njihovi derivati, te pojedini visoko toksični pesticidi, itd.

Kada se uporedi osjetljivost metoda biotestiranja sa metodama analitičkog kemijskog određivanja pojedinih hemikalija u kontroliranim uzorcima vode, obično se uočava da je nemoguće fiksirati test reakcije pri niskim koncentracijama zagađenja vode na nivou MPC, koje se kvantitativno određuju hemijske metode.

Reakcije testa koje su stvarno zabilježene s potrebnom pouzdanošću u prisustvu pojedinačnih toksičnih supstanci u vodi za tipične metode biotestiranja u ekspresnim kontrolnim režimima, opažene su pri koncentracijama koje znatno premašuju MPC.

Dakle, kada se koristi biotest sa cilijatima, akutni toksični efekat se manifestuje u koncentracijama koje čine nikl - 5 MPC, hrom i kadmijum - 10-20 MPC, hloroform - 50 MPC, benzol - 100 MPC, fenol - 500 MPC. Izuzetak je živa, za koju je zabilježen akutni toksični efekat u sadržaju od 1-2 MPC.

Međutim, sve se to odnosi samo na slučajeve zagađenja vode pojedinačnim toksikantima, a glavna prednost metoda biotestiranja se očituje u fiksiranju kumulativnog učinka prisutnih toksikanata u vodi, kada može doći do zbrajanja utjecajnih faktora koji značajno smanjuju nivo otkrivanje pojedinačnih toksikanata. Istovremeno, mogućnost ekspresne kontrole pri primjeni metoda biotestiranja uz odgovarajuću instrumentaciju omogućava pravovremeno otkrivanje pojave vanrednih situacija kada iznenadno visoki nivoi zagađenja vode opasnim otrovima mogu u kratkom roku oštetiti javno zdravlje kada male količine vode se troše.

Zbirni podaci o organizacijama-proizvođačima metoda bioloških testova navedenih u tabelama 1 i 2, kao i glavne publikacije o ovim pitanjima, dati su u tabeli 3.

Tabela 3


NN metode prema tabeli 1 i objekti ispitivanja	Razvojne organizacije i konsultanti	Književni izvori
1 ćelijski test objekat (granulirano bikovo sperma)	Sveruski institut za naučna istraživanja i ispitivanja medicinske opreme (VNIIIIIMT), Moskva; AD "BMK-INVEST", Moskva	Kvantitativna ekspresna metoda za procjenu toksičnosti vode za piće, prirodnih voda i industrijskih efluenta korištenjem ćelijskog test objekta. A.P. Eskov, R.I. Kayumov, Yu.S. Rotenberg Biotestiranje sa suspenzijom spermatozoida "Zdravlje na radu i profesionalne bolesti" N 8, 1989.
2 Paramecium ciliates	JSC "Quantum", Sankt Peterburg	Metoda za određivanje toksičnosti uzoraka vode ekspresnom metodom na uređaju "Biotester" Istraživački institut za higijenu i patologiju rada Ministarstva zdravlja SSSR-a, Ld 1991. A.V.Pozharov, Yu.A.Rahmanin, S.A. Shelemotov. Primijenjeni aspekti instrumentalnog biotestiranja vode. "Higijena i sanitacija" 1994
3 Ciliates tetrachymene periformis	Istraživački institut za ljudsku ekologiju i higijenu životne sredine nazvan po A.N. Sysinu (NIIECHiGOS), Moskva	Metode biotestiranja vode, Chernogolovka, 1988
4 soj bakterije E-collie (enzim dehidrogenaza)	Moskovski istraživački institut za higijenu nazvan po F.F. Erismanu (MNIIG), Moskva	Maksimalno dozvoljene koncentracije štetnih materija u vazduhu i vodi. Referentni priručnik, GIPH, Ld, 1972
5 rakova (dafnije, ceriodafnije)	VNIIVODGEO, Moskva; Hidrohemijski institut, Rostov; Institut za biologiju unutrašnjih voda RAS (IBVV), Dubna; GUAK, Ministarstvo prirodnih resursa Rusije, Moskva	Smjernice za biotestiranje vode RD 118-02-09 * Goskompriroda SSSR-a, M., 1991. MS ISO 6341:1989 "Kvalitet vode - Određivanje inhibicije pokretljivosti dafnije"
6 alge (scenedesmus, chlorella)	Moskovski državni univerzitet, Moskva	Smjernice za biotestiranje vode RD 118-02-90 Goskompriroda SSSR-a, M., 1991. MS ISO 6341:1989 "Kvalitet vode - Test usporavanja rasta slatkovodnih algi"
7 Riba (gupi, zebra)	Istraživački institut za morsko ribarstvo (VNIRO), Rostov; Moskovski državni univerzitet, Moskva	Smjernice za biotestiranje vode RD 118-02-09 Goskompriroda SSSR-a, M., 1991. M.N. Ilyin. Uzgoj akvarijskih riba, M., ur. MGU, 1997
8 Salmonella (biološki test sistemi za određivanje mutagene aktivnosti)	NIIECHiGOS nazvan po A.N. Sysinu, Moskva	V.V.Sokolovsky, V.S.Zhukov, Yu.A.Rakhmanin, I.N.Ryzhova. Smjernice za eksperimentalnu procjenu ukupne mutagene aktivnosti zagađenja zraka i vode, Ministarstvo zdravlja SSSR, M., 1990; A.M.Fonshtein, S.K.Abilev i dr. Metode za primarnu detekciju genetske aktivnosti zagađivača životne sredine korišćenjem bakterijskih test sistema; Smjernice, M., 1985

DODATAK 1: BIOTESTIRANJE KORIŠĆENJEM STANIČNOG TEST OBJEKTA (granulirano sperma bikova)

1. Princip metode

Princip metode zasniva se na analizi zavisnosti indeksa pokretljivosti suspenzije spermatozoida od vremena i određivanju supresije njihove pokretljivosti (smanjenje prosečnog vremena pokretljivosti) pod uticajem toksičnih supstanci sadržanih u kontrolisanoj vodi. .

Spermatozoidi mogu postojati izvan tijela u medijima jednostavnog sastava i do nekoliko sati bez promjene svojih funkcionalnih svojstava.

Glavna svrha zametnih ćelija kao nosilaca nasljednih informacija je oplodnja jajne stanice. Učinak ove funkcije je određen njihovom sposobnošću kretanja do mjesta oplodnje, zbog čega je mobilnost glavni pokazatelj fiziološkog, biohemijskog i morfološkog statusa spermatozoida, koji su vrlo osjetljivi na djelovanje spermatozoida. širok spektar toksikanata.

Implementacija metode se provodi pomoću automatskog analitičkog sistema (skupa instrumenata) koji omogućava uporednu procjenu indeksa mobilnosti suspenzije spermatozoida u eksperimentalnim (ispitanim) uzorcima vode i u kontrolnim medijima, definisanje postupaka proračuna. i izdavanje rezultata u obliku odgovarajućih indeksa toksičnosti procijenjenih uzoraka vode.

Indeks pokretljivosti () koji procjenjuje sistem određuje se kao funkcija koncentracije pokretnih ćelija i prosječnog modula njihove brzine

Gdje je faktor koji se odnosi na dizajn mjernog sistema.

Procjena indeksa mobilnosti se vrši automatskim prebrojavanjem broja fluktuacija u intenzitetu raspršenog zračenja uzrokovanih prolaskom ćelija kroz optičku sondu.

2. Testni objekat

Spermatozoidi bikova se koriste kao test objekt. Sperma se dobija na stanicama za umjetnu oplodnju u obliku granula zamrznutih u tekućem dušiku. Zamrznuta sperma se može čuvati u Dewaru sa tečnim azotom neograničeno.

Dopunjavanje dušikom (4-5 litara) vrši se svakih 4-5 dana.

Koeficijent varijacije koncentracije spermatozoida u granulama sperme ne prelazi 10%, što osigurava dovoljnu stabilnost i reproduktivnost u eksperimentima za procjenu njihove mobilnosti u kontroliranim vodenim medijima.

3. Analitički sistem

Analitički sistem obuhvata set instrumenata, koji uključuje analizator toksičnosti, jedinicu za pripremu uzoraka i računar sa štampačem, koji omogućavaju automatsku evaluaciju kontrolisane reakcije ispitivanja, obradu rezultata uporedne procene pokretljivosti i izdavanje konačne podatke u obliku odgovarajućih ispisa.

Specifikacije sistema:

- talasna dužina laserskog zračenja - 0,63 mikrona;

- snagu laserskog zračenja - ne manje od 1 mW,

- vrijeme jedne analize - od 10 do 300 s sa korakom od 10 s;

- vrijeme kretanja kivete (kapilara) sa uzorkom - ne više od 2 s;

- vrijeme povratnog kretanja kolica - ne više od 15 s;

- temperatura uzoraka i radnih uzoraka - 35-45 °C;

- dozvoljene granice odstupanja od zadate temperature - ± 1,5 °C;

- zapremina kivete (kapilara) sa kontrolisanim uzorkom - 25 µl;

- tip računara IBM PC AT (i kasniji modeli).

Blok dijagram sistema je prikazan na slici 1

Blok dijagram kompleksa

Fig.1. Blok dijagram sistema

1 - kapilara, 2 - nosač, 3 - pogon, 4 - kapilarna jedinica za kontrolu temperature, 5 - laser, 6 - razdjelnik zraka, 7 - mikrosočiva, 8 - razdjelnik snopa, 9 - ekran, 10 - maska, 11 - fotodioda, 12 - pojačalo, 13 - kontroler, 14 - kompjuter, 15 - štampač, 16 - jedinica za pripremu uzoraka i radni uzorci

Dizajn sistema pruža mogućnost vizuelnog posmatranja ćelijskih test objekata u suspenziji.

4. Pomoćna oprema, materijali, reagensi

Pomoćna oprema, materijali i reagensi uključuju:

- set kiveta (kapilara) za stavljanje kontrolisanih uzoraka u analitički sistem;

- epruvete sa brušenim čepovima prema GOST 1770-74 zapremine 3-5 ml - 40 kom.;

- dozatori za pipete zapremine 0,2 ml i 0,5 ml;

- volumetrijske tikvice sa mljevenim čepovima od 1000 ml - 2 kom.;

- konusne tikvice sa brušenim čepovima od 50 ml i 100 ml - 10 kom., 500 ml i 1000 ml - 2 kom.;

- torzijske vage tipa VT-500;

- anatomske pincete;

- Dewar posuda kapaciteta 26,5 litara marke SDP-25 - 2 kom.;

- Dewar posuda zapremine 5 l marke SDS-5 - 1 kom.;

- orman za sušenje;

- kućni frižider;

- bikova sperma u granulama, smrznuta na temperaturi tečnog azota;

- tečni azot;

- kristalni natrijum citrat, hemijski čist;

- kristalna glukoza;

- etanol;

- destilovana voda;

- bidestilat.

5. Uslovi i postupak za biotestiranje

5.1. Temperaturu radnog medija tokom biotestiranja treba održavati unutar 40 ± 1,5 °C. To se postiže automatskim termostatskim uređajem.

5.2. Testiranje

5.2.1. Analitički sistem se uključuje pritiskom na prekidač "Mreža" 30 minuta prije početka ispitivanja. Kompjuterom se postavljaju uslovi ispitivanja: temperatura, vreme jedne analize, broj kiveta (kapilara) sa uzorcima. Na displeju se prikazuju informacije o dostizanju potrebne temperature i spremnosti sistema za rad.

5.2.2. Pripremite ispitne i kontrolne otopine. Kao kontrolna otopina koristi se glukozno-citratni medij sastava: glukoza - 4 g, natrijum citrat - 1 g, destilovana voda - 100 ml. Kontrolni medij je također razrjeđivač za odmrzavanje smrznute sperme. Izotoničnost eksperimentalnog (ispitanog) rastvora (uzorci vode) postiže se dodavanjem suhih reagensa: 4 g glukoze i 1 g natrijum citrata na 100 ml vode. Umjesto destilovane vode može se koristiti "pozadinski" uzorak vode iz izvora poznatog hemijskog sastava koji ispunjava sigurnosne zahtjeve.

5.2.3. Dozirati 1 ml kontrolne i ispitne otopine u epruvete i staviti u vodeni termostat za kontrolu temperature na temperaturi od 40 ± 1,5 °C.

5.2.4. Za odmrzavanje smrznute sperme, 0,5 ml razblaživača se odmeri u epruvete (prema tački 5.2.2) i termostatuje na temperaturi od 40 ± 1,5 °C. Ohlađenom anatomskom pincetom, granula sperme se uklanja iz Dewarove posude i brzo se spušta u zagrijani rastvor. Svaka granula se odmrzava u posebnoj epruveti. Odmah nakon odmrzavanja sperme, sadržaj epruveta se sipa u jednu epruvetu i dobro promeša. Smjesa je termostatirana na 40 ± 1,5 °C.

5.2.5. Radni uzorci za biotestiranje u analitičkom sistemu pripremaju se dodavanjem 0,2 ml suspenzije sperme u svaku epruvetu sa kontrolnim i ispitnim rastvorima (prema tački 5.2.4).

5.2.6. Za analizu, radni uzorci iz epruveta sa kontrolnim i ispitnim rastvorima (prema tački 5.2.5) se prenose u kapilare koje deluju kao kivete i zatvaraju se naizmeničnim uranjanjem krajeva kapilara u parafinsku kupku.

Kapilare sa radnim uzorcima postavljaju se na nosač i ugrađuju u pogon analitičkog sistema.

Uz pomoć kompjutera se identifikuju kapilari i pokreće proces akumulacije eksperimentalnih podataka. Proces se nastavlja sve dok se ne postignu nulte vrijednosti indeksa pokretljivosti u svim kapilarama, nakon čega se vrši matematička obrada rezultata prema algoritmima implementiranim kompjuterskim programom u skladu sa metodološkim odredbama navedenim u nastavku.

6. Obrada i evaluacija rezultata

6.1. Kao rezultat eksperimenta u sistemu, za svaki uzorak biotestiranih rastvora (probni i kontrolni uzorci vode) beleži se zavisnost:

gdje je indikator mobilnosti (prema zahtjevu 1),

- vrijeme

7.6.2. Za svaku od ovih zavisnosti izračunava se ponderisana prosečna vrednost vremena mobilnosti,

Gdje je vrijednost indeksa mobilnosti,

- trenutni broj procjene indeksa mobilnosti.

6.3. Za kontrolne i eksperimentalne uzorke uzoraka izračunavaju se aritmetička sredina i standardna devijacija, koji zauzvrat izračunavaju koeficijent varijacije za svaki uzorak, prema formuli:

Gdje je standardna devijacija,

- aritmetička sredina

Ako je koeficijent varijacije veći od 15% za barem jedan od uzoraka, eksperiment se ponavlja. Ako je vrijednost koeficijenta varijacije za svaki od uzoraka manja ili jednaka 15%, tada se rezultati kontrole smatraju pouzdanim.

6.4. Izračun indeksa toksičnosti vrši se prema formuli:

Gdje i su aritmetičke srednje vrijednosti ponderiranog prosječnog vremena mobilnosti za eksperimentalni i kontrolni uzorak.

6.5. Kriterijum za odsustvo toksičnih efekata je nalaz vrednosti u rasponu vrednosti od 70 do 130%.

DODATAK 2: BIOTESTIRANJE KORIŠĆENJEM PARAMECIUM INFUSORIANS

1. Princip metode

Metoda biološke analize uzoraka vode zasniva se na sposobnosti Paramecium caudatum - trepavica (u daljem tekstu: trepavice) da izbjegavaju nepovoljne i po život opasne zone i aktivno se kreću duž gradijenta kemijske koncentracije do povoljnih zona (reakcija hemotakse). Tehnika omogućava brzo određivanje akutne toksičnosti uzoraka vode.

2. Karakteristike ispitnog objekta, uzgoj i priprema kulture za analizu

2.1. Kao ispitni objekat korišćen je Paramecium caudatum - trepavica. Pripada podcarstvu protozoa (jednoćelijske životinje) - Protozoa, tip - Ciliophora. Cilijati su rasprostranjeni u slatkoj vodi. Oblik ćelije je elipsoidan, dimenzije su 200x40 mikrona. Glavna hrana cilijata su bakterije, kvasac itd. Reprodukcija cilijata se događa poprečnom diobom stanica. U zavisnosti od uslova uzgoja, vreme generisanja može biti od nekoliko sati do nekoliko dana.

U usporedbi s drugim grupama protozoa, cilijati imaju najsloženiju strukturu i razlikuju se po raznim funkcijama. Infuzorija je u stalnom pokretu. Njegova brzina na sobnoj temperaturi je 2,0-2,5 mm/s. Putanja kretanja je složena: kreće se naprijed, rotirajući duž uzdužne ose tijela, uz pomoć cilija, čiji broj doseže 10-15 tisuća. Promjene vanjskih uvjeta (temperatura, hemijski sastav okoline, elektromagnetne oscilacije i drugi faktori) percipira ćelija, a prvi odgovor je promjena u prirodi kretanja: smanjenje ili povećanje brzine, učestalost zaustavljanja i skretanja. , razni taksiji, na primjer, geo-, magneto-, aero - kemotaksija.

2.2. Izvorni materijal za uzgoj kulture trepavica prenosi se prilikom isporuke uređaja "BIOTESTER-2". Kultura se takođe može nabaviti iz zbirki kulture protozoa dostupnih u različitim naučnim organizacijama (na primer, na Državnom univerzitetu u Sankt Peterburgu BiNII: 198904; Stari Peterhof, autoput Oranienbaum, 2). Možete izolirati svoju kulturu iz lokalnih vodnih tijela ili je kupiti od akvarista, ali treba imati na umu da specijalist-protozoolog može odrediti vrstu, jer. postoje i drugi predstavnici roda Paramecium caudatum.

2.3. Uzgoj

2.3.1. U ovoj metodi može se koristiti kultura cilijata uzgojenih različitim metodama, koje daju ispitni objekt, prvo, u količini dovoljnoj za analizu, a drugo, osjetljivoj na model toksičnosti unutar koncentracija utvrđenih u tački 2.3.

Uzgoj kulture vrši se u bilo kojoj prikladnoj posudi, na primjer, u staklenim tikvicama, čašama, Petrijevim posudama i drugim. Kao hrana se koriste bakterije, kvasac i njihova mješavina sterilno uzgojena na čvrstim podlogama. U nedostatku uslova za uzgoj sterilne hrane, može se koristiti pekarski kvasac sušen na vazduhu.

Opće odredbe za uzgoj kulture uključuju obavezni zahtjev da je podloga za uzgoj i podloga koja će se koristiti za postupke ispiranja kulture od metaboličkih produkata, dobijanja radne suspenzije, razrjeđivanja uzoraka vode i drugih postupaka sa kulturom.

Metoda uzgoja cilijata je data u nastavku kao primjer.

2.3.2. Metoda uzgoja infuzorije

U konusnu tikvicu sa širokim grlom od 200 ml unosi se suspenzija cilijata u mediju Lozin-Lozinsky u količini od 100 ml gustoće od 1000 ± 200 ćelija / ml. Na zraku sušeni kvasac dodaje se kao hrana u količini od 1 mg na 1 ml podloge. Uzgoj se vrši na temperaturi od 18-26°C.

Za analizu biološke analize koristi se kultura na početku stacionarne faze rasta. Za kontrolu razvoja populacije svakodnevno se uzima uzorak u kojem se određuje broj ćelija prema tački 2.3.4.1. Odsustvo rasta ćelija u populaciji ukazuje na početak stacionarne faze rasta, a svakodnevno praćenje omogućava utvrđivanje njenog početka. Obično, pod uslovima navedenim na početku ovog odeljka, stacionarna faza rasta nastupa 2-3 dana, dok će gustina kulture biti 4000±1000 ćelija/ml.

2.3.3. Održavanje i čuvanje kulture

U slučaju prekida u analizi biološke analize, dovoljno je održavati kulturu samo kao inokulum. Jedan od načina održavanja je na zrnima pirinča. 2-3 sirova zrna pirinča se stave u Petrijevu posudu, doda se medijum od oko 30-40 ml, a ćelije cilijata cipela se stave u količini od 50-100 ćelija/ml. Jednom svake 2 sedmice mijenjajte medijum i zrna pirinča.

Pogodno je čuvati rezervnu kulturu u epruvetama. Jednom u 7-10 dana koncentrat ćelija iz gornjeg dela epruvete (bez mešanja) se sipa u drugu epruvetu, dodaje se L-L medijum u prethodni volumen i 0,5 mg kvasca na 1 ml tečnosti.

Drugi način očuvanja kulture je da se čuva u frižideru na niskim pozitivnim temperaturama. Stopa podjele u ovom slučaju može biti jedna podjela u 10-20 dana. Kultura se ispere od metaboličkih produkata i stare hrane, koncentracija suspenzije se podesi na 200±100 ćelija/ml, doda se suvi kvasac 0,2 mg/ml i stavi u frižider. Tako se kultura čuva do mjesec dana. Kod upotrebe kulture koja se čuva u frižideru, potrebno je sačekati da se njena temperatura izjednači sa temperaturom ostalih rastvora i tek onda izvršiti potrebne postupke.

Posebnu pažnju treba obratiti na činjenicu da cilijati ne podnose nagle promjene temperature (!).

2.3.4. Određivanje koncentracije suspendiranih cilijata

Koncentracija ćelija se mora odrediti u procesu uzgoja kulture, kada se priprema radna suspenzija ćelija, kao i da se odredi veličina test reakcije. Određivanje koncentracije ćelija cilijata bez poteškoća se izvodi pomoću kalibriranog uređaja serije Biotester.

2.3.4.1. U opštem slučaju, koncentracija cilijatnih ćelija se određuje prebrojavanjem ćelija pod mikroskopom prema metodama koje su opšte prihvaćene u mikrobiološkoj praksi: pomoću mernih rešetki, komora za brojanje itd. Izračunati broj ćelija se ponovo izračunava po jedinici zapremine medijuma i izražava kao koncentracija (ćelije/ml). Slijedi primjer metode za brojanje ćelija trepavica. Promućkajte početnu suspenziju cilijata, uzmite 0,5 ml suspenzije pipetom. Ovoj zapremini dodati 9,5 ml 1% rastvora NaCl. Na ovaj način se postiže imobilizacija cilijata. Bez čekanja na potpunu imobilizaciju cilijata (nakon oko 2-5 minuta), 0,5 ml se uzima iz razrijeđene suspenzije i ovaj volumen se raspoređuje u obliku 6-10 velikih kapi na suho staklo (na primjer, u Petrijevoj posudi). jelo). Uz pomoć mikroskopa (lupe) cilijati se broje u svim kapima. Dobijeni rezultat se ponovo izračunava za 1 ml početne suspenzije.

Na primjer: 0,5 ml suspenzije imobiliziranih cilijata se rasporedi u 6 kapi, u kojima je izbrojano 29, 38, 32, 31, 28, 35 ćelija - ukupno 193. 1 ml razrijeđene suspenzije sadrži 386 ćelija, a 1 ml početne suspenzije, dakle, 3860 ćelija cilijata će biti sadržano.

2.3.4.2. Specijalizirani alat za određivanje broja pokretnih stanica u cilijatima je uređaj serije "Biotester". Određivanje koncentracije pokretnih ćelija vrši se prema unapred napravljenoj kalibracionoj krivulji.

Da bi se konstruisala kalibraciona kriva, suspenzija cilijatnih ćelija se uzima u medijumu L-L u skladu sa tačkom 2.3.2. Od suspenzije se priprema serija razrjeđenja, od kojih je svako po koncentraciji 2 puta manje od prethodnog, volumen suspenzije svakog razrjeđenja je najmanje 5 ml. Posljednje razrjeđivanje može sadržavati 5-10 kp/ml. Početna koncentracija ćelija se određuje prebrojavanjem broja ćelija pod mikroskopom (vidi paragraf 2.3.4.1). Koncentracije ćelija u seriji razblaženja određuju se odgovarajućim proračunom. Istovremeno, koncentracija mobilnih ćelija trepavica u početnoj radnoj suspenziji iu svim razrjeđenjima se dosljedno određuje, uzimajući očitanja na uređaju. Da biste to učinili, napunite kivetu kontroliranom suspenzijom ćelija do vrha (ne imobilizirajte cilijate!), stavite je u modul kivete uređaja i izvršite nekoliko očitavanja.

Postupak brojanja ćelija u početnoj suspenziji, pripremanja razblaženja, merenja početne suspenzije i razblaženja na instrumentu se ponavlja najmanje 3 puta, a rezultati se usrednjavaju. Na osnovu dobijenih podataka, gradi se kalibraciona kriva kao zavisnost očitavanja instrumenta od logaritma koncentracije ćelije. Konstruisana kriva može se koristiti dugo vremena sa istim mjernim uređajem.

2.4. Priprema cilijata za analizu

2.4.1. Kultura cilijata uzgojena prema tački 2.3 se ispere od metaboličkih produkata i hrane za životinje, koncentracija se prilagodi radnoj vrijednosti, provjerava se spremnost kulture za analizu u smislu njene osjetljivosti na model toksičnosti i njene sposobnosti da uđe u čisti uzorak.

2.4.2. kultura pranja

Prilikom pranja, normalna fiziološka reakcija cilijata se koristi za sakupljanje u gornjim slojevima tečnosti. Korištenje posuda s uskim dugim vratom omogućava koncentriranje cilijata u gornjoj zoni i ispuštanje u drugu posudu s minimalnom količinom kontaminiranog medija za kulturu. Koncentrat se razblaži čistim L-L medijumom, ćelije u gornjoj zoni se ponovo sakupljaju i dreniraju. Kao rezultat pranja cilijata, stepen razblaženja tečnosti kulture čistim medijumom treba da bude najmanje 1:200.

Primjer. Kultura je uzgajana na podlozi L-L. Sredstvo za pranje - L-L. U 50 ml kulture dodajte 50 ml L-L medija, pažljivo sipajte u volumetrijsku tikvicu od 100 ml, obavezno napunite vrat. Nakon 5-15 minuta, cilijati se sakupljaju u gornjoj zoni. Ocijedite gornji dio tečnosti iz tikvice. Suspenzija ćelija se dobija razblaživanjem tečnosti kulture dva puta i zapreminom od, na primer, 20 ml. Postupak ispiranja se ponavlja još 2 puta, dodajući 80 ml L-L medijuma u 20 ml suspenzije i dobije se suspenzija ćelija, na primer, u zapremini od 10 ml sa 50-strukim razblaženjem početne suspenzije cilijata. Volumen dobivene suspenzije se podesi (10 ml) i dobije se razrjeđenje od 250 puta. Odredite koncentraciju ćelija u nastaloj suspenziji prema tački 2.3.4 i dovedite je na vrijednost od 1000±200 ćelija/ml. Rezultirajuća radna suspenzija ćelija cilijata nakon preliminarne provjere se koristi u roku od 1,5 sata.

2.4.3. Provjera spremnosti suspenzije cilijata za analizu

Provjera se vrši na dva parametra istovremeno:

- prema stepenu oslobađanja trepavica u kontrolni čisti uzorak;

- prema osjetljivosti na model toksičnosti.

2.4.3.1. Za provjeru prinosa cilijata u kontrolnom uzorku, prema klauzuli 4.1, tri kivete se pune suspenzijom ćelija, L-L podlogom ili se slojevito očito netoksična voda (ali ne destilat). Nakon 30 minuta, koncentracija ćelija u gornjim zonama kiveta se mjeri prema tački 4.2. Rezultat se usrednjava na 3 kivete i utvrđuje se spremnost test kulture za biotest analizu prema uslovu: prinos mora biti najmanje 70% koncentracije radne suspenzije.

2.4.3.2. Da bi se ispitala osjetljivost na model toksičnog supstanca, otopina bakar sulfata koncentracije 0,1 mg/l, pripremljena u skladu s tačkom 3.4, nanosi se u tri kivete. Nakon 30 minuta mjeri se koncentracija u gornjim zonama kivete prema tački 4.2 i izračunava se indeks toksičnosti za otopinu bakar sulfata.

Kada se kultura koristi u analizi biološke analize.

3. Merni instrumenti, pomoćni uređaji, materijali, rešenja.

3.1. mjerni instrumenti:

- binokularni mikroskop sa uvećanjem od oko 10-50;

- uređaj serije BIOTESTER, na primjer, BIOTESTER-2 - specijalizovani pulsni fotometar prema TU 401-51-005-91 * sa setom fotometrijskih kiveta;
________________
* U daljem tekstu navedene specifikacije nisu date. Pogledajte link za više informacija. - Napomena proizvođača baze podataka.

- Laboratorijske vage opšte namene (GOST 8.520-84).

3.2. Pomoćni uređaji:

- posude za uzgoj od kemijski inertnog materijala, na primjer, hemijske čaše, konične tikvice sa širokim grlom, Petrijeve zdjelice (GOST 25336-82);

- pipete, volumetrijske tikvice, epruvete (GOST 20292-74, 1770-74).

3.3. Materijali:

- soli analitičke čistoće ili hemijski čisti: natrijum hlorid, kalijum hlorid, kalcijum hlorid, magnezijum sulfat, natrijum karbonatna kiselina, bakar sulfat pentahidrat;

- polivinil alkohol PVA - marka 11/2, premium (GOST 10779-78);

- vazdušno suvi pekarski kvasac - koristi se kao hrana za infuzorije.

3.4. rješenja:

- suspenzija ćelija trepavica dobijena uzgojem testnog objekta pod određenim uslovima (videti tačku 2.3), isprana od metaboličkih proizvoda i hrane za životinje (videti tačku 2.4) i dovedena do radne koncentracije (gustine) od 1000±200 ćelija/ml;

- medijum za uzgoj i razblaživanje: pripremljen sa destilovanom vodom (Lozin-Lozinsky medijum, u daljem tekstu L-L). Moguće je koristiti vodu iz slavine, koja se mora pravilno tretirati (dehlorisati i stajati 5-10 dana).

Za pripremu koncentrata L-L medijuma u 1 litru vode rastvore se sledeće soli (klasa analitičke ili hemijski čiste): NaCI - 1,0 g, KCI - 0,1 g, MgSO - 0,1 g, CaCIx2HO - 0,1 g, NaHCO - 0,2 g Ovaj rastvor se može čuvati u frižideru do 7 dana. Za rad se koristi L-L medijum dobijen desetostrukim razblaženjem originalnog koncentrata. Podloga za razrjeđivanje i podloga za kulturu moraju biti identični i osigurati preživljavanje infuzorije 5 dana;

- model toksičnog sredstva na bazi bakar sulfata. Matični rastvor bakar sulfata (10 mg/l) u destilovanoj vodi čuva se najviše nedelju dana. Radne koncentracije bakar sulfata pripremaju se neposredno prije određivanja. Rastvori soli sa koncentracijama do 1 mg/l pripremaju se u destilovanoj vodi, a sa koncentracijama od 0,1 mg/l i manje - u medijumu L-L;

- PVA rastvor u L-L medijumu: 5% rastvor se koristi kao neutralni zgušnjivač. Za pripremu rastvora PVA, 0,5 g PVA praha se pomeša sa 9,5 ml L-L medijuma. Smjesa se zagrijava na vodenom kupatilu dok se prah ne otopi. Koristite rastvor tokom dana.

4. Metoda određivanja

4.1. Metoda za određivanje toksičnosti tekućih medija temelji se na sposobnosti testnih objekata da reagiraju na pojavu u vodenoj sredini tvari koje predstavljaju opasnost po njihov život, a usmjerena je na kretanje po gradijentu koncentracije ovih tvari ( hemotaktička reakcija), izbjegavajući njihovo štetno djelovanje.

Hemotaktička reakcija se ostvaruje pod uslovom da postoji stabilan i ponovljiv gradijent hemijske koncentracije. Sličan gradijent se stvara nanošenjem slojeva u vertikalnoj kiveti (epruveti) na suspenziju cilijata u zgušnjivaču uzorka vode za ispitivanje. U tom slučaju se u mjernoj kiveti formira stabilna granica koja se održava tijekom cijelog vremena biotestiranja. Ovo sučelje ne sprječava slobodno kretanje cilijata u njihovom željenom smjeru i istovremeno sprječava miješanje tekućina iz donje i gornje zone.

Nakon stvaranja dvije zone u kiveti u roku od 30 minuta, cilijati se redistribuiraju u zone. Važna karakteristika bihevioralnog odgovora cilijata je masivno kretanje ćelija u gornje slojeve tečnosti. Ako ispitni uzorak ne sadrži toksične supstance, u kiveti će se posmatrati koncentracija cilijatnih ćelija u gornjoj zoni. Prisutnost toksičnih supstanci u ispitnom uzorku dovodi do drugačije prirode preraspodjele trepavica u kiveti, naime što je toksičnost uzorka veća, to manji udio trepavica prelazi u gornju zonu (testni uzorak).

4.2. Kriterij toksičnog djelovanja je značajna razlika u broju cilijatnih stanica uočenih u gornjoj zoni kivete u uzorku koji ne sadrži toksične tvari (kontrola), u usporedbi s ovim pokazateljem uočenim u ispitnom uzorku (eksperiment)

4.3. Kvantitativna procjena parametra test reakcije koji karakterizira toksični učinak vrši se izračunavanjem omjera broja cilijatnih ćelija uočenih u kontrolnim i ispitnim uzorcima (prema tački 8.1), a izražava se kao bezdimenzionalna vrijednost - indeks toksičnosti ( T).

5. Uslovi definicije

5.1. Određivanje toksičnosti po ovoj metodi vrši operater sa kvalifikacijom laboratorijskog asistenta.

5.2. Tehnika podliježe općim sigurnosnim pravilima za rad s kemijskim reagensima opće upotrebe i laboratorijskom opremom (navedeno u pasošu za uređaj).

5.3. Cilijati rade u temperaturnom rasponu od 10-30°C, pod uslovom da su njihova svojstva u skladu sa zahtjevima iz klauzule 2.3.

6. Priprema za izvođenje definicije

6.1. Uzorkovanje i skladištenje

Opšti postupci uzorkovanja definisani su u sljedećim dokumentima: ISO 5667/2. Kvalitet vode. Izbor uzorka. dio 2; GOST 24481-80. Pije vodu. Izbor uzorka.

6.2. Biotestiranje uzoraka vode vrši se najkasnije 6 sati nakon njihovog odabira. Ako je nemoguće izvršiti analizu u navedenom roku, uzorci vode se hlade (+4 °C). Konzerviranje uzoraka hemijskim konzervansima nije dozvoljeno.

6.3. Zapremina uzorka vode potrebna za analizu (u tri primjerka) je oko 10 ml. Za jedno određivanje dovoljno je 2 ml.

6.4. Prilikom provođenja biotestiranja, temperatura uzorka za ispitivanje mora odgovarati temperaturi suspenzije ispitnog objekta. Cilijati ne podnose nagle promjene temperature (!).

6.5. Ako u uzorku postoje grube inkluzije, veličine srazmjerne cilijatnoj ćeliji ili velike veličine, potrebno je uzorak filtrirati.

7. Analiza

7.1. Punjenje kiveta

2,0 ml suspenzije cilijata se dodaje u kivetu u radnoj koncentraciji, prethodno provjerenoj za dva parametra: osjetljivost na model otrovne tvari (vidi paragraf 2.4.3.2) i izlaz u medijum za razrjeđivanje (vidi paragraf 2.4.3.1). U suspenziju se dodaje 0,35 ml 5% rastvora PVA, sve se dobro promeša, bez greške vlaže zidove kivete, a 1,8 ml analiziranog vodenog uzorka se slojevito (na primer, pipetom), sprečava mešanje sa donji sloj. Nakon 30 minuta (trajanje test reakcije), konzistentno se određuje koncentracija cilijata u gornjoj zoni kivete u kontrolnim () i eksperimentalnim () uzorcima. Kontrolni i eksperimentalni uzorci se pripremaju istovremeno.

7.2. Mjerenje koncentracije cilijata na aparatu "BIOTESTER-2"

Kivete pripremljene u skladu sa tačkom 7.1 se uzastopno postavljaju u modul kivete i uzimaju se očitanja instrumenta. Uređaj "BIOTESTER-2" ima tri načina rada:

- mjerenje i indikacija rezultata svakih 22 s;

- mjerenje i indikacija prosječne vrijednosti rezultata 5 očitavanja (svakih 110 s);

- mjerenje i indikacija prosječne vrijednosti rezultata 10 očitavanja (svakih 220 s).

Rad sa uređajem:

a) podesite režim usrednjavanja na "1" (LED iznad dugmeta svetli, susedne LED diode su isključene);

b) ubacite kivetu u nišu kivete, zatvorite poklopac, pritisnite dugme "START";

c) indikacija se gasi, na 12 s (vrijeme autopodešavanja) svijetli LED "COUNTER", a nakon još 22 s na displeju se pojavljuje prva vrijednost koncentracije u proizvoljnim jedinicama. Izdavanje očitanja je praćeno svjetlosnim i zvučnim signalom u trajanju od 2 s;

d) u roku od 22 s memorira se vrijednost prethodnog očitanja, ovo vrijeme je dovoljno da se registruje rezultat.

Ako je koncentracija otrovnih tvari toliko visoka da cilijati praktički ne ulaze u uzorak (očitavanja instrumenta u konvencionalnim jedinicama su u rasponu od 000-008), tada LED "ALARM" počinje treptati. To znači da se ispitni uzorak mora razrijediti dok se na instrumentu ne dobiju značajne vrijednosti. (Ne zaboravite prilagoditi procjenu toksičnosti prema razrjeđenju originalnog uzorka).

Redoslijed operacija kada se koriste drugi načini mjerenja je identičan gore opisanom. Obično rade u režimu usrednjavanja preko 5 očitavanja. Kontrolni i ispitni uzorci izrađuju se u tri primjerka. Vrijednosti replikacije se prosječuju i izračunava se indeks toksičnosti prema tački 8.1.

8.Obrada i prezentacija rezultata

8.1 Procjena toksičnosti vodenog uzorka vrši se prema relativnoj razlici u broju ćelija u gornjim zonama kiveta sa kontrolnim i analiziranim uzorcima.

Indeks toksičnosti je definiran kao:

gdje je , - prosječna očitavanja instrumenta za kontrolne i analizirane uzorke, respektivno.

Indeks toksičnosti () je bezdimenzionalna vrijednost i može imati vrijednosti od 0 do 1 u skladu sa stupnjem toksičnosti analiziranog uzorka.

Prema vrijednosti indeksa toksičnosti, analizirani uzorci vode klasifikovani su prema stepenu njihove kontaminacije u 4 grupe:

I. Dozvoljeni stepen zagađenja ();

II. Umjereni stepen zagađenja ();

III. Visok stepen kontaminacije (kao i značajne vrednosti dobijene 2, 4, 6-strukim razblaženjem analiziranog uzorka);

IV. Izuzetno visok stepen kontaminacije (značajne vrednosti dobijene pri 8-strukim i više razblaženja analiziranog uzorka).

8.2. Primjer snimanja rezultata mjerenja


Broj uzorka	Pov- tor- nos- ti	Očitavanje instrumenata I c.u.		Avg. 5 promjena renijum, c.u.	Avg. 3 ponavljanja tornos- tyam 4 c.u.	Indeks toksičnosti, c.u.
Kontrolno okruženje LL


Uzorak 1			[email protected] Ako postupak plaćanja na web stranici platnog sistema nije završen, gotovinom sredstva NEĆE biti zadužena sa vašeg računa i nećemo dobiti potvrdu o uplati. U tom slučaju možete ponoviti kupovinu dokumenta pomoću dugmeta sa desne strane. Došlo je do greške Plaćanje nije izvršeno zbog tehničke greške, sredstva sa vašeg računa nisu otpisani. Pokušajte sačekati nekoliko minuta i ponoviti plaćanje.

Uvod

Mnoge poznate ljudske bolesti imaju podudaranje u genetskom kodu voćne mušice. Istraživanje drozofile pomaže u razumijevanju osnovnih bioloških procesa koji su direktno povezani s ljudima i njihovim zdravljem. Koriste se u modeliranju nekih ljudskih bolesti, poput Parkinsonove, Huntingtonove i Alchajmerove bolesti, kao i za proučavanje mehanizama koji leže u osnovi raka, dijabetesa, imuniteta, ovisnosti o drogama i mnogih drugih.

Drosophila melanogaster se takođe široko koristi za procenu kvaliteta životne sredine. To je i genetski model u proučavanju insekata koji mogu prenositi opasne ljudske zarazne bolesti (na primjer, Culex pipiens - virus Zapadnog Nila, Anopheles gambiae - malarija, Aedes aegypu - denga groznica). Rezultati studija na Drosophila također daju naznake genetskih procesa identificiranih u proučavanju poljoprivredno važnih insekata kao što su pčele i svilene bube, te štetočina insekata kao što su skakavci i mnoge vrste buba i lisnih uši.

Relevantnost teme diplomskog rada je da je Drosophila melanogaster u širokoj upotrebi i da je od velikog značaja u ljudskom životu. Ali tokom njegovog uzgoja i upotrebe u istraživanju može se naići na niz problema koje je potrebno proučiti kako bi se olakšao rad s njim. Osim toga, postoji malo literature o metodama njegovog uzgoja.

Predmet istraživanja je način uzgoja i upotreba Drosophila melanogaster u biotestiranju.

Predmet istraživanja je efikasnost tehnike.

Svrha rada je razvoj metoda za optimizaciju upotrebe Drosophila melanogaster u svrhe biotestiranja.

U cilju ostvarenja ovog cilja postavljeni su sljedeći zadaci:

1. Istaknite probleme povezane s biotestom Drosophila melanogaster.

2. Pronađite pristup za implementaciju rješavanja problema.

3. Eksperimentalno utvrditi efikasnost sopstvenih i poznatih iz literature načina za poboljšanje efikasnosti korišćenja Drosophila melanogaster kao test objekta.

Biotestiranje kao metoda ekološkog istraživanja

Suština biotestiranja i zahtjevi za njegove metode

molekularno genetsko biotestiranje drozofila

Biotestiranje je takav postupak utvrđivanja toksičnosti okoliša, u kojem posebni ispitni objekti obavještavaju o opasnosti, a ne ovisno o tome koje tvari iu kakvoj kombinaciji uzrokuju promjene u vitalnim funkcijama [Lyashenko, 2012].

Cilj biotestiranja je određivanje prirode i stepena toksičnosti ispitne sredine.

Samo biotestiranje se bazira na registraciji biološki važnih indikatora, takozvanih test-funkcija, test-objekata koji se proučavaju. Nakon registrovanja ovih indikatora, ocjenjuje se njihovo stanje prema odabranom kriteriju toksičnosti. Zauzvrat, test - funkcije su biološke i fiziološke. Biološke funkcije uključuju preživljavanje, plodnost, reprodukciju i kvalitetu potomstva, dok fiziološke funkcije uključuju disanje, krvnu sliku, aktivnost hranjenja i metabolizam [Lyashenko, 2012].

Test - objekti (ili na drugi način test - organizmi) nazivaju se takvi biološki objekti koji se koriste za procjenu toksičnosti hemikalija. Ispoljeni toksični efekat se bilježi i evaluira u eksperimentu.

Biotestiranje, za razliku od analitičkih metoda, podrazumijeva praćenje antropogenih i prirodnih procesa u biološkim sredinama, koji uključuju ukupnost interakcije agenata životne sredine sa živim bićima, uključujući i razjašnjavanje odgovora biološke sredine na antropogene i prirodne uticaje [Ivanykina, 2010. ]. Takve reakcije mogu poslužiti kao reakcije na faktore stresa. Metode imaju mnoge prednosti. Na primjer, oni su informativniji za određivanje direktnog odgovora ekosistema na antropogeni utjecaj. Uz pomoć ovih pristupa u monitoringu životne sredine moguće je dobiti objektivnu, kao i kvantitativnu procenu procesa regeneracije objekata životne sredine. Takođe je moguće, zahvaljujući ovim metodama, proceniti efikasnost mera zaštite životne sredine [Balakirev, 2013]. Takođe, još jedna prednost metode je određivanje opšte toksičnosti, koje nastaju prisustvom ekotoksikanata, koji nisu standardizovani postojećim standardima, ali imaju sposobnost da izazovu različite genotoksične, toksične, citotoksične ili mutagene efekte [Zhuravleva, 2006].

Osim toga, hemijsko-analitičke i hidrohemijske metode mogu biti neefikasne zbog svoje nedovoljno visoke osjetljivosti. Biota može biti izložena toksičnim efektima koji se ne bilježe tehničkim sredstvima komunikacije zbog činjenice da nijedan analitički senzor nije u stanju da percipira tako niske koncentracije tvari u odnosu na žive objekte [Melekhova, 2007].

Biotestiranje se zasniva na metodi biološkog modeliranja. U određenoj mjeri, svaki model je specifičan oblik odraza stvarnosti. Tokom biotestiranja, znanje se prenosi sa primitivnog sistema (modeliranog u laboratoriji) na složeniji sistem (ekosistem u realnim uslovima) [Mayachkina, 2009]. Prema nekim podacima, biotestiranje je obavezan dodatak hemijskoj analizi, a takođe je i integralna metoda za procenu toksičnosti vodene sredine [Tumanov, Postnov, 1983]. Standardi za kontrolu kvaliteta vode za različite namjene uključuju i metode biotestiranja (Aleksandrova, 2013).

Kako bi se procijenilo stanje različitih organizama pod uticajem prirodnih ili antropogenih faktora, testiranje se vrši na biološkim objektima koji predstavljaju kompleks različitih pristupa. Efikasnost fizioloških procesa koji osiguravaju normalno funkcioniranje tijela (kao što su disanje, metabolizam, nutritivna aktivnost itd.) glavni je pokazatelj njihovog stanja. Tijelo reaguje na uticaj okoline kroz složen fiziološki sistem puferskih homeostatskih mehanizama, ali samo u optimalnim uslovima održava optimalan tok razvojnih procesa. Pod uticajem nepovoljnih uslova može doći do poremećaja homeostaze, što dovodi do stanja stresa. Ova kršenja se mogu pojaviti prije promjena koje koriste parametri održivosti. Dakle, metode biotestiranja se zasnivaju na proučavanju mehanizama homeostaze i njene efikasnosti, a takođe omogućavaju da se uoči prisustvo uticaja faktora stresa ranije od drugih uobičajenih metoda [Melekhova, 2007].

Pošaljite svoj dobar rad u bazu znanja je jednostavno. Koristite obrazac ispod

Studenti, postdiplomci, mladi naučnici koji koriste bazu znanja u svom studiranju i radu biće vam veoma zahvalni.

Objavljeno na http://www.allbest.ru/

Metode za biotestiranje prirodnih i otpadnih voda

1. Osnovni principi metoda biotestiranja i kriteriji toksičnosti vode

Biotestiranje (biološko ispitivanje) - procjena kvaliteta objekata životne sredine (vode i sl.) prema odgovorima živih organizama koji su objekti za ispitivanje.

Zahtjevi koji se primjenjuju na metode biotestiranja:

Osetljivost test organizama na dovoljno niske koncentracije zagađivača.

Odsustvo inverzije odgovora test organizama na različite koncentracije zagađivača u granicama onih vrijednosti zabilježenih u prirodnim vodama;

Mogućnost dobijanja pouzdanih rezultata, metrološko osiguranje metoda;

Dostupnost test organizama za sakupljanje, jednostavnost uzgoja i održavanja u laboratoriji;

Jednostavnost izvođenja postupka i tehnike biotesta;

Niska cijena rada biotestiranja.

Razvijaju se dva glavna područja rada na biotestiranju:

Odabir metoda korištenjem hidrobionta, koji pokrivaju glavne hijerarhijske strukture vodenog ekosistema i karike u trofičkom lancu;

Potraga za najosetljivijim test organizmima, koji bi omogućili hvatanje niskog nivoa toksičnosti uz obezbeđivanje pouzdanosti informacija.

Protozoa. Dafnija. DDT, (HCCH) heksahlorcikloheksan, TEŠKI metali (bakar-cink-kadmijum-hrom), biogeni elementi. Daphnia magna.

Rotiferi

Riba. Gupi (Poecillia reticulata) - metali, pesticidi; zebra (Brachidanio rerio).

Ribe prirodnih voda. Visoko osjetljivi: - losos (pastrmka), šiljak, gudak, plotica, ćugar, smuđ, vrh; srednje osjetljivi: smuđ, crvendać, deverika, gavčica, šaran, ukljeva.

Toksičnost vode

O prisutnosti toksičnosti sudi se prema manifestacijama negativnih efekata u ispitivanim objektima, koji se smatraju pokazateljima toksičnosti.

Među indikatorima toksičnosti izdvajaju se: opšti biološki, fiziološki, biohemijski, hemijski, biofizički itd.

Indikator toksičnosti je testna reakcija, čije promjene se bilježe tokom toksikološkog eksperimenta.

Prilikom biotestiranja uzoraka prirodne vode obično se postavljaju dva pitanja: - da li je uzorak prirodne vode toksičan; - koji je stepen toksičnosti, ako postoji?

Akutni toksični učinak - učinak koji uzrokuje brzu reakciju ispitivanog objekta. Najčešće se mjeri testnom reakcijom "preživljavanje" u relativno kratkom vremenskom periodu.

Izloženost - period tokom kojeg je tijelo pod uticajem proučavanog faktora, posebno hemijske supstance. Ovisno o izloženosti, razlikuju se akutni ili kronični toksični efekti.

gdje je E efekat (rezultat) uticaja;

C je koncentracija aktivne tvari;

T - vrijeme ekspozicije (ekspozicija).

E - predstavlja bilo koji rezultat izlaganja (smrt test objekata), a vrijednosti C i T - mogu se izraziti u odgovarajućim mjernim jedinicama.

Parametri hemijske toksičnosti:

Smrtonosna koncentracija (LC50) - koncentracija otrovne tvari koja uzrokuje smrt 50% testiranih organizama u određenom vremenu (što je niži LC50, to je veća toksičnost kemikalije ili vode)

Maksimalna mrtva koncentracija - najviša izmjerena koncentracija hemikalije (testna voda) koja ne izaziva vidljivi hemijski efekat (što je niži MNC, to je veća toksičnost hemikalije ili otpadne vode).

Ne reaguju svi organizmi na isti način na istu izloženost. Reakcija zavisi od osetljivosti na vazduh.

Prema seriji osjetljivosti koju je razvio S.A. Patin (1988), ispitni objekti se mogu rasporediti na sljedeći način:

Riba-zooplankton-zoobentos-fitoplankton-bakterije-protozoe-makrofiti.

Postoje i druge serije osjetljivosti.

Na primjer, kod biotestiranja voda preduzeća za celulozu i papir: alge-bakterije-ribe (za smanjenje osjetljivosti).

Faktori koji utiču na biotestiranje:

Faktori koji utiču na test organizme (izloženost; uslovi uzgoja; u prirodi - životni uslovi biljaka i životinja; starosne karakteristike, godišnje doba, snabdevenost test organizmima hranom, temperatura (pesimum i optimum), osvetljenost);

Faktori koji određuju fizička i hemijska svojstva ispitivane prirodne vode, od kojih zavisi njena toksičnost za ispitivane organizme (svježina uzorka, prisustvo suspendovanih čestica u njemu).

2. Metode biotestiranja na različitim grupama organizama za procjenu kvaliteta prirodnih i otpadnih voda

Razmotriti glavne metode za određivanje akutnog toksičnog efekta vode tokom kratkotrajnog biotestiranja na rakovima, algama i cilijatima; metoda za određivanje kroničnog toksičnog djelovanja vode na alge.

Metode obrade i evaluacije rezultata biotestiranja baziraju se na standardnim metodama statističke obrade eksperimentalnih podataka koje se široko koriste u domaćoj i međunarodnoj praksi.

Prije izvođenja eksperimenata biotestiranja potrebno je uzgajati kulturu test organizama.

Biotestiranje na rakovima

Tehnika je dizajnirana da odredi akutnu toksičnost prirodnih i otpadnih voda koje se ispuštaju u vodena tijela.

1. Principi uzgoja rakova Daphnia magna Straus i Ceriodaphnia affinis Lilljeborg

Period sazrijevanja Daphnia magna prije legla mladunaca na optimalnoj temperaturi i dobroj ishrani traje 5-10 dana. Očekivano trajanje života je 110-150 dana, na temperaturama iznad 25°C može se smanjiti na 25 dana.

U optimalnim uslovima partenogenetske generacije se nižu jedna za drugom svaka 3-4 dana. Kod mladih dafnije, broj jaja u kladilici je 10-15, zatim se povećava na 30-40 ili više, smanjujući se na 3-8 i na 0 2-3 dana prije smrti.

Kultura dafnije se uzgaja u termostatski kontrolisanom luminostatu na 18-22 °C (osvetljenost 400-600 luksa, dnevno svetlo 12-14 sati). Poželjno je provesti eksperimente na biotestiranju vode u istom luminostatu.

Da bi se dobio početni materijal za biotestiranje, 30-40 ženki sa leglom punim jaja ili embriona presađuje se u posude od 0,5-2 litre 1 dan prije biotestiranja. Nakon pojave juvenila, oni se odvajaju od odraslih jedinki pomoću najlonskih sita različitog promjera pora.

Principi uzgoja ceriodafnije slični su onima opisanim za dafnije. Treba imati na umu da su ceriodafnije zahtjevnije prema sadržaju kisika u vodi (najmanje 5 mg/l), optimalna temperatura uzgoja je 23-27°C. Period sazrijevanja rakova od rođenja do trenutka mrijesta mladunaca kraći je od perioda dafnije - od 4 do 5 dana.

Prilikom biotestiranja važno je uzeti u obzir sljedeće točke:

Mladi rakovi su 4-5 puta osjetljiviji na djelovanje otrovnih tvari od odraslih.

Hranjenje rakova tokom akutnog eksperimenta smanjuje toksičnost za oko 4 puta.

U mekoj vodi povećava se toksičnost tvari. Ioni magnezija obično smanjuju toksičnost soli, ioni kalcija - smanjuju toksičnost.

Prisustvo kompleksnih supstanci (huminske kiseline, aminokiseline itd.) povećava nakupljanje toksikanata, ali smanjuje njihovu toksičnost.

Nedostatak kisika u vodi ubrzava nakupljanje toksičnih tvari u vodenoj sredini.

Sunčeva svjetlost povećava toksičnost uglavnom povećanjem slobodnih radikala.

Određivanje otpornosti Daphnia Magna Straus na kalijev dihromat

Prije svega, potrebno je procijeniti prikladnost laboratorijske kulture dafnije za naknadno biotestiranje voda. Referentni toksikant je kalijum dihromat.

Čaša kapaciteta 100-250 ml (21 komad).

Pipete mjerene za 1, 10, 25 ml 2. klase tačnosti (po 1 komad). Tikvica za razrjeđivanje (kontrolne) vode (RV) kapaciteta 3 litre. Odmjerne tikvice 100 ml (1 kom.), 250 ml (1 kom.), 500 ml (2 kom.), 1000 ml (1 kom.).

210 rakova starosti 4-24 sata. Razlika u starosti pojedinaca ne bi trebalo da prelazi 4 sata.

Pripremite 100 ml 0,1% rastvora K 2 Cr 2 O 7 (1000 mg/l).

Da biste to učinili, otopite 0,1 g osušenog K 2 Cr 2 O 7 u 100 ml destilovane vode.

Rasporedite 21 čašu sa natpisima prema sljedećoj shemi:

K1 0,25 mg/l 0,5 mg/l 0,75 mg/l 1 mg/l 2 mg/l 3 mg/l

K2 0,25 mg/l 0,5 mg/l 0,75 mg/l 1 mg/l 2 mg/l 3 mg/l

SC 0,25 mg/l 0,5 mg/l 0,75 mg/l 1 mg/l 2 mg/l 3 mg/l

Slijetanje rakova

U sve čaše sa rastvorima posadite po 10 ljuskara u starosti od 4-24 sata. Slijetanje se vrši pomoću mikropipeta s plastičnim vrhovima koji se mogu ukloniti. Krajevi vrhova prvo se moraju odrezati na veličinu jedno-dvodnevne dafnije.

Eksperimentiraj

Preživjeli rakovi se vizualno broje nakon 24 sata. Tokom eksperimenta, rakovi se ne hrane. Smrtnost rakova u kontroli ne bi trebala prelaziti 10%. Rezultati se zapisuju u protokol eksperimenta.

3. Određivanje toksičnosti otpadnih (prirodnih) voda na Daphnia magna

materijala

Čaše kapaciteta 150-250 ml (8-16 komada).

Tikvica za razrjeđivanje (kontrolne) vode kapaciteta 3 litre.

Odmjerne tikvice za 100 ml (1 kom.), 1 l (1 kom.).

Merni cilindar ili mernica za 150-200 ml.

Od 40 do 80 rakova u dobi od 4-24 sata. Razlika u starosti pojedinaca ne bi trebalo da prelazi 4 sata.

Doživite pripremu

Rasporedite 16 čaša sa natpisima prema sljedećoj shemi:

K1 Sv. voda b/r N 1 Sv. voda 1:10 N 5 Sv. voda 1:100 N 9

K2 Sv. voda b/r N 2 Sv. voda 1:10 N 6 Sv. voda 1:100 N 10

KZ Sv. voda b/r N 3 Sv. voda 1:10 N 7 Sv. voda 1:100 N 11

K4 Sv. voda b/r N 4 Sv. voda 1:10 N 8 Sv. voda 1:100 N 12

U čaše sipajte kontrolnu (vodu za razrjeđivanje) i ispitnu vodu (sv. vodu), 150 ml po čaši:

K1-K4 - 600 ml vode za razrjeđivanje (RV),

Sveta voda bez razblaženja (bez razblaženja) - 600 ml (4 x 150 ml).

Sveta voda 1:10 - 100 ml Sv. voda b/r + 900 ml RW = 1 l Sveta voda 1:10.

Sveta voda 1:100 - 100 ml Sv. voda 1:10 + 900 ml RW = 1 l Sveta voda 1:100

Postavite čaše sa rastvorima u luminostat.

Obavezno je podesiti pH uzoraka na 6,5-8,5 pomoću NaOH ili HCl rastvora ako ne zadovoljavaju gore navedene standarde.

Zasićenost ispitivanih uzoraka kiseonikom takođe treba da bude u određenim granicama.

Slijetanje rakova

U sve čaše posadite 5 ljuskara u dobi od 4-24 sata.

Eksperimentiraj

Uginuli rakovi se vizualno broje nakon 1, 6, 24, 48, 72, 96 sati (kraj određivanja akutne toksičnosti). Smrtnost rakova u kontroli ne bi trebala prelaziti 10%.

Rezultati se zapisuju u protokol eksperimenta.

Biotestiranje se prekida ako 50% ili više pojedinaca u eksperimentu umre u bilo kom vremenskom periodu.

Ako je A >= 50%, onda je ispitana voda (eksperiment) akutno toksična.

Ako je A< 50%, то тестируемая вода не оказывает острого токсического действия.

Za preciznije određivanje akutne toksičnosti, crta se grafik, gdje je vrijeme u satima prikazano duž apscise (X-osa), a mortalitet kao postotak kontrole (A) duž ordinate (Y-osa). Iz grafikona se nalazi LT50 - vrijeme tokom kojeg 50% dafnije umre.

Određivanje toksičnosti otpadne (prirodne) vode na Ceriodaphnia affinis

materijala

Epruvete kapaciteta 20 ml (20-40 komada).

Tikvica za razrjeđivanje (kontrolne) vode kapaciteta 1 l.

Od 40 do 80 rakova u dobi od 0,1-8 sati. Razlika u starosti rakova ne bi trebala prelaziti 4 sata.

Doživite pripremu

Rasporedite epruvete od 10 komada u nizu prema sljedećoj shemi:

K1 Sv. voda b/r N 1 Sv. voda 1:10 N 1 Sv. voda 1:100 N 1

K2 Sv. voda b/r N 2 Sv. voda 1:10 N 2 Sv. voda 1:100 N 2

K3 Sv. voda b/r N 3 Sv. voda 1:10 N 3 Sv. voda 1:100 N 3

K4 Sv. voda b/r N 4 Sv. voda 1:10 N 4 Sv. voda 1:100 N 4

K5 Sv. voda b/r N 5 Sv. voda 1:10 N 5 Sv. voda 1:100 N 5

K6 Sv. voda b/r N 6 Sv. voda 1:10 N 6 Sv. voda 1:100 N 6

K7 Sv. voda b/r N 7 Sv. voda 1:10 N 7 Sv. voda 1:100 N 7

K8 Sv. voda b/r N 8 Sv. voda 1:10 N 8 Sv. voda 1:100 N 8

K9 Sv. voda b/r N 9 Sv. voda 1:10 N 9 Sv. voda 1:100 N 9

K10 Sv. voda b/r N 10 Sv. voda 1:10 N 10 Sv. voda 1:100 N 10

Sipati u epruvete kontrolnu (voda za razrjeđivanje) i otpadnu vodu (sv. voda) po 15 ml:

K1-K10 - 150 ml vode za razrjeđivanje (W).

Otpadna voda bez razrjeđivanja (bez razrjeđivanja) - 150 ml (10 * 15 ml).

Otpadne vode 1:10 - 25 ml sv. vode b / r + 225 ml RW = 250 ml sv. vode 1:10.

Otpadna voda 1:100 - 25 ml Sv. voda 1:10 + 225 ml RW = 250 ml Sv. voda 1:100.

Postavite epruvete sa rastvorima u luminostat.

Izmjerite temperaturu u luminostatu (norma 23-27 °C), pH otopine (norma 6,5-8,5), koncentraciju otopljenog kisika (norma prije početka eksperimenta 6 mg/l, na kraju eksperimenta - na najmanje 4 mg/l).

Obavezno je podesiti pH uzoraka na 6,5-8,5 pomoću NaOH ili HCl rastvora ako ne zadovoljavaju gore navedene standarde. Zasićenost ispitivanih uzoraka kiseonikom takođe treba da bude u određenim granicama.

Režim osvetljenja u luminostatu je 12 sati sa intenzitetom od 400-600 luksa.

Slijetanje rakova

U sve epruvete posadite po 1 rak u dobi od 0,1-8 sati. Razlika u starosti rakova ne bi trebala prelaziti 4 sata.

Eksperimentiraj

Uginuli rakovi se vizualno broje nakon 1, 6, 24, 48 sati (kraj određivanja akutne toksičnosti). Tokom eksperimenta, rakovi se ne hrane. Rezultati se zapisuju u protokol eksperimenta.

Obrada rezultata je slična prethodnoj.

4. Biotest korištenjem algi

Scenedesmus quadricauda

Tehnika je dizajnirana da odredi toksičnost prirodnih i otpadnih voda.

Opći principi uzgoja mikroalgi

Efikasno uzgajanje jednoćelijskih zelenih algi u laboratoriji je određeno uglavnom prisustvom mineralnih elemenata u hranljivom mediju, dovoljno intenzivnim osvjetljenjem (2000-3000 luxa) i određenom temperaturom (18-20 °C).

Najbolje okruženje za uzgoj zelenih algi u toksikološke svrhe je hranljivi medij Uspensky N 1, koji sadrži nižu ukupnu koncentraciju soli.

Sve manipulacije sa Uspensky N 1 medijumom pri radu sa algama Scenedesmus provode se uz strogo poštovanje uslova sterilnosti.

Zajednički uzgoj ove alge sa hlorelom u jednom luminostatu je neprihvatljiv (hlorela brzo začepljuje i potiskuje kulturu sceneesmus).

Trajanje eksperimenata za utvrđivanje toksičnosti vode može biti 4, 7, 14 ili više dana, ovisno o zadatku. Maksimalna akumulacija toksičnog sredstva u stanicama algi obično se bilježi do kraja 3-4 dana, stoga je najčešće određivanje akutne toksičnosti ograničeno na 4 dana.

Ako je kao rezultat biotestiranja na akutnu toksičnost otkrivena značajna stimulacija rasta algi, tada je za konačnu procjenu o toksičnosti uzorka potrebno postaviti kronični eksperiment (do 14 dana).

Značajna stimulacija rasta algi ukazuje na prisustvo eutrofnog zagađenja, a značajna inhibicija rasta algi ukazuje na prisustvo toksičnog zagađenja.

Priprema kulture

U eksperimentu koristite kulturu staru 5-10 dana koja je u fazi eksponencijalnog rasta.

Prije sjetve, kultura se zgušnjava na jedan od tri načina: - taloženje 2-3 dana, centrifugiranje, filtriranje kroz membranski filter br. 4 ili filter papir sa plavom trakom. Dobivena ćelijska suspenzija (koncentrat) se koristi za naknadno zasijavanje.

Proizvodi se u velikoj eksperimentalnoj tikvici kapaciteta 1,5 l, u slučaju biotestiranja u bocama (po 100 ml) ili u boci od 150 ml za biotestiranje u penicilinskim bočicama (po 10 ml). Obično je potrebno oko 30 µl suspenzije na 30 ml vode.

U eksperimentalnim bocama nakon sjetve treba biti oko 200-300 hiljada ćelija algi po 1 ml (ne više od 500 hiljada / ml) - jedva primjetna zelenkasta boja na bijeloj pozadini.

Iz velike tikvice sipajte kulturu u tikvice (3 ponavljanja od 100 ml) ili penicilinske bočice (3 ponavljanja od 10 ml).

5. Procjena rezultata eksperimenta za određivanje otpornosti kulture na kalij bihromat

Brojanje se vrši pomoću mikroskopa (na primjer, tipa "Biolam") uz povećanje od 80-100 puta.

Za brojanje broja ćelija koristi se komora za brojanje Goryaev ili Fuchs-Rosenthal. Odmašćuju se komora i pokrovno staklo povezano s njom, komora se prekriva pokrovnim staklom i trlja dok se ne formiraju dugini prstenovi smetnji. Iz svake tikvice pipetirajte po jednu kap dobro izmiješane suspenzije na gornji i donji rub pokrovnog stakla. Komora se puni tako da se ne stvaraju mjehurići zraka, višak suspenzije se pomiče duž žljebova. Dijagonalno se skenira 16 kvadrata ili cijelo polje komore u slučaju malog broja algi (sa jednim punjenjem komore računa se najmanje 50 ćelija).

Iz svake tikvice se ispituju najmanje tri uzorka.

Procjena toksičnosti nekog hemijskog spoja ili ispitne vode vrši se na osnovu pouzdanosti razlika između indikatora broja ćelija algi u kontroli i ogledu.

Ovo izračunava:

a) srednje aritmetičke vrijednosti broja ćelija - Xi i X (od dva i šest broja, respektivno).

b) broj ćelija kao procenat kontrole. Iznos (X - Xi)

c) standardna devijacija (b):

gdje je n broj ponavljanja; u ovom slučaju (vidi tabelu 3.1) n = 3;

c) greška aritmetičke sredine (X): S = b / korijen od n;

d) Td - kriterijum pouzdanosti razlika između dve upoređene vrednosti:

gdje su Xk i Xo upoređene prosječne vrijednosti (u kontroli i eksperimentu),

Sk - So - kvadrati srednjih grešaka u kontroli i eksperimentu.

Td se izračunava za svaki dan i upoređuje sa tabelarnom vrijednošću Tst – standardnom vrijednošću Studentovog kriterija.

Uzimaju se nivo značajnosti P = 0,05 i stepen slobode (n1 + n2 - 2), tj. (3 + 3 - 2) = 4.

Tst na 4 stepena slobode je 2,78.

Ako je Td veći ili jednak Tst, tada je razlika između kontrolne i eksperimentalne vode značajna - ispitivana voda je kontaminirana (toksično ili eutrofno zagađenje)

Ako je Td manji od Tst, onda razlika između kontrole i eksperimenta nije značajna – ispitna voda nije kontaminirana.

Za izračunavanje Td možete koristiti kalkulatore tipa MK-51 i MK-71, kao i kompjuterske proračunske tablice (na primjer, program Sigma CSIAC-a), što značajno ubrzava rad.

Za grafički prikaz rezultata biotestiranja, vrijeme u danima je iscrtano duž apscisne osi, a ili broj ćelija algi u 1 ml, ili broj ćelija algi kao postotak kontrole, iscrtan je duž ordinatne osi. .

6. Određivanje otpornosti Scenedesmus quadricauda na djelovanje kalijevog bihromata

Dodajte sukcesivno u 30 ml destilovane vode (kontrola) 30 µl KNO 3 , 30 µl MgSO 4 , 30 µl Ca(NO 3) 2 , 30 µl KH 2 RO 4 , 30 µl K 2 CO 3 .

Hronična iskustva (u vezikulama)

Sedmog dana biotestiranja kontrolna i ispitna voda se mijenjaju u sterilnim uslovima. Istovremeno, 7,5 ml kontrolne i ispitne vode se sipa u novu seriju bočica. Zatim se u bočice doda 0,01 ml (10 μl) svake od 5 osnovnih rastvora soli i 2,5 ml stare kulture iz bočica u kojima je u akutnom eksperimentu izvršeno biotestiranje. Broj ćelija se vrši 7., 10. i 14. dana.

U praksi je zgodno koristiti tabelu za evaluaciju rezultata biotestiranja na skali od 5 tačaka (Tabela 3.3).

Mora se imati na umu da povećanje biomase algi može biti povezano s prisustvom eutrofnih zagađivača u ispitnoj vodi, u kom slučaju se o prisutnosti toksičnog efekta može procijeniti nakon testiranja na nekoliko testnih objekata.

7. Biotestiranje na cilijatama

Metoda se zasniva na jednoj od opcija za određivanje akutne toksičnosti vode po preživljavanju cilijata Paramecium caudatum.

Korišteno:

Utvrditi toksičnost otpadnih voda koje ulaze u objekte za biološki tretman, što omogućava tehnološko prilagođavanje načina pripreme i tretmana otpadnih voda;

Određivanje toksičnosti lokalnih tokova otpadnih voda, što omogućava utvrđivanje njihove interakcije, utvrđivanje doprinosa svakog toka toksičnosti otpadnih voda iz pojedinačnog preduzeća, ukupne toksičnosti otpadnih voda koje ulaze u objekte za biološki tretman;

Odrediti toksičnost vodenih otopina pojedinih tvari i njihovih smjesa.

Princip tehnike

Metoda za određivanje akutne smrtonosne toksičnosti otpadnih voda prema preživljavanju cilijata zasniva se na određivanju broja mrtvih ili imobiliziranih jedinki nakon izlaganja ispitivanoj vodi. Kriterijum za akutnu smrtonosnu toksičnost je smrt ili imobilizacija 50% ili više jedinki u roku od 1 sata u ispitnoj vodi u odnosu na njihov početni broj.

test organizam

Kao ispitni objekt korištena je laboratorijska monokultura Paramecium caudatum Ehrenberg.

Paramecium caudatum - jednoćelijski organizmi veličine 180-300 mikrona. Tijelo je cigarastog ili vretenastog oblika, prekriveno gustom ljuskom (pelikulom).

Paramecium caudatum je uobičajena vrsta u slatkoj vodi sa visokim sadržajem organske materije. U otpadnim vodama često je glavna vrsta, poli-alfa-mesosaprobe. Protozoe, uključujući trepavice, čine većinu mikrofaune aktivnog mulja. Oni su uključeni u oslobađanje pročišćene vode iz suspendiranih bakterijskih stanica i iz labavih, slabo taloženih bakterijskih aglomerata, čime doprinose povećanju efikasnosti pročišćavanja.

Izolacija i kultivacija

Odvajanje od aktivnog mulja. Najmobilnija i najveća jedinka hvata se iz uzorka aktivnog mulja iz postrojenja za tretman i prenosi u mikroakvarijum sa sterilnom vodom iz slavine.

Uzastopnim prenošenjem ove jedinke iz rupe u rupu, ona se odvaja od ostalih protozoa i cista. Zatim se isprana infuzorija stavlja u epruvetu sa podlogom za kulturu.

Nakon 7-8 dana, iz tako dobijene monokulture, jedna od najvećih i najpokretnijih jedinki se ponovo prenosi u svježu podlogu.

Nakon 8-10 dana, kultura se može koristiti za određivanje toksičnosti.

Uzgoj cilijata u mlijeku. Kultura paramecijuma se uzgaja na dehlorisanoj vodi iz slavine, kojoj se dodaje pasterizovano mleko razblaženo 20 puta istom vodom. Kultura cilijata se ponovo zaseje jednom mesečno (ako je potrebno, jednom u tri nedelje).

Materijali i oprema

Paramecium caudatum se broji pomoću binokularnog mikroskopa MBS-9, MBS-10 ili drugog koji omogućava povećanje od 8-24 puta. Dizajn mikroakvarija od prozirnog organskog stakla prikazan je na Sl.1. Koristite standardne staklene pipete da razrijedite i dodajte istu količinu testnog uzorka.

Biotestiranje uzoraka vode vrši se najkasnije 6 sati nakon njihovog odabira, a ukoliko je nemoguće izvršiti analizu u navedenom roku, uzorci vode se hlade (+4°C).

Konzerviranje uzoraka hemijskim konzervansima nije dozvoljeno.

Kao kontrola koristi se voda iz slavine koja se dehloriše taloženjem i aeracijom mikrokompresorom 7 dana.

Da bi se utvrdila toksičnost pojedinih supstanci ili njihovih smeša, od njih se pripremaju rastvori dodavanjem određenih količina matične tečnosti, ispitivane supstance u dehlorisanu vodu iz slavine. Osnovni rastvori se pripremaju u destilovanoj vodi.

Prilikom provođenja biotestiranja, temperatura uzorka za ispitivanje mora odgovarati temperaturi kulture.

Ako u uzorku postoje grube suspenzije, potrebno je filtriranje.

Prilikom provođenja biotestiranja pH vrijednosti ispitivanih otopina trebaju biti u rasponu od 6,5 do 7,6.

Biotestiranje se vrši u prostoriji koja ne sadrži štetne pare i gasove, sa difuznom svetlošću i temperaturom vazduha od 18-28°C.

Provođenje biotestiranja

Za biotestiranje nerazređene otpadne vode ili njenih razblaženja, kao i rastvora pojedinačnih toksičnih supstanci (mešavina supstanci), koristi se mikroakvarijum sa bunarima koji se postavlja na pozornicu predmeta stereomikroskopa.

Jedna od jažica se puni kulturom cilijata pomoću kapilarne pipete.

U slobodne jažice sa kapilarnom pipetom u svaku jažicu stavlja se 10-12 jedinki, tako da po uzorku ispitivane vode bude najmanje 30 trepavica u tri jažice (trostruko ponavljanje).

Prilikom sadnje ispitnog objekta, količina tečnosti za kulturu u bunar ne bi trebalo da prelazi 0,02 ml.

Kao kontrole se koriste tri bunara.

Nakon sadnje, cilijati se u kontrolne jažice sipaju u 0,3 ml dehlorisane vode iz slavine, u ogledne - u 0,3 ml uzorka vode za ispitivanje. Zabilježi se vrijeme početka biotestiranja i broj jedinki u svakoj jažici se broji pod mikroskopom.

Mikroakvarijum sa napunjenim jamicama stavlja se u Petrijevu posudu na čije se dno stavlja filter papir navlažen vodom da sadržaj jažica ne ispari i drži se 1 sat na temperaturi od 22-24°C. Nakon tog vremena, preživjeli pojedinci se broje pod mikroskopom. Preživjeli su trepavice koje se slobodno kreću u vodenom stupcu. Imobilisane osobe se klasifikuju kao mrtve. Rezultati prebrojavanja se bilježe u dnevnik rada.

Rezultati biotestiranja se smatraju ispravnim i uzimaju se u obzir ako smrt cilijata u kontrolnim bunarima ne prelazi 10%.

Nakon prebrojavanja jedinki u svakom od tri bunara, nalazi se aritmetička sredina broja trepavica koje su preživjele u ispitnoj vodi.

Voda za ispitivanje se procjenjuje da ima akutni smrtonosni učinak ako 50% ili više cilijata umre u njoj u roku od 1 sata.

Prilikom određivanja akutne smrtonosne toksičnosti razblaženja uzorka otpadne vode ili vodenog rastvora pojedine supstance (mešavine), utvrđuje se prosečna smrtonosna množina razblaženja (srednja smrtonosna koncentracija) koja izaziva smrt 50% ispitivanih objekata u roku od 1 sat - LC 50 - 1 sat (LC 50 - 1 h).

Za crtanje grafika za potrebe izračunavanja LKr 50 - 1 h (LK 50 - 1 h), test parametar se izražava u proizvoljnim jedinicama - probit, a faktor razblaženja (koncentracija) - u logaritamskim vrijednostima.

Na osi apscise ucrtani su logaritmi koncentracija višestrukih razrjeđenja otpadnih voda (koncentracija tvari), a na osi ordinata vrijednosti parametra ispitivanja u probitima. Rezultirajuće tačke su povezane ravnom linijom.

Od tačke na osi ordinata koja odgovara 50% smrti ispitnog objekta, povlači se linija paralelna sa apscisnom osom sve dok se ne siječe sa linijom grafikona.

Od tačke njihovog presjeka, okomica se spušta na osu apscise i nalaze se logaritmi LKR 50 - 1 h.

Vrijednost pronađenog logaritma pretvara se u vrijednost faktora razblaženja (koncentracija izražena u mg/l supstance).

Rezultati biotestiranja su predstavljeni u obliku protokola.

Nakon biotestiranja, mikroakvarijumi se isperu vodom (temperatura ne veća od 40°C), obrišu pamučnim štapićem umočenim u alkohol, isperu destilovanom vodom.

Procjena toksičnosti vode korištenjem biološke analize algi.

Koristeći formulu izračunavamo koeficijent rasta broja algi za 96 sati (4 dana).

M= 10 3 ,

gdje je M broj ćelija algi, hiljada ćelija/ml;

m je broj prebrojanih ćelija;

n je broj izračunatih malih kvadrata kamere;

V je volumen dijela komore koji odgovara površini malog kvadrata, ml.

8. Procjena toksičnosti vode pomoću ekspresnog biotesta na rotiferima

Za utvrđivanje mogućeg akutnog toksičnog efekta ispitivane vode provodimo ekspresno biotestiranje na masovnoj kulturi rotifera.

Za procjenu toksičnog efekta ispitivane vode koristimo prosječne podatke o SOS (pokazatelj brzine bistrenja podloge). Izračunajmo SOS za eksperiment prema formuli (2).

biotestiranje toksičnosti vode kalijum

SOS \u003d [(C 0 - C t) / (C 0 N t)] V,

gdje je COS brzina bistrenja medija, µl/(ind. . min);

C 0 i C t - broj ćelija algi u jednom velikom kvadratu komore Goryaev na početku i kraju biotestiranja, respektivno;

N je broj rotifera u mikroakvarijumu;

t - vrijeme biološke analize, min;

V je zapremina vode u mikroakvarijumu, µl.

Književnost

1. Bakaeva E.N., Nikanorov A.M. Hidrobionti u procjeni toksičnosti kopnenih voda. M.: Nauka, 2006. 257 str.

2. Bakaeva E.N. Određivanje toksičnosti vodene sredine. Smjernice. Rostov na Donu: Everest 1999. 48 str.

4. Nikanorov A.M., Khoruzhaya T.A., Brazhnikova L.V., Zhulidov A.V. Praćenje kvaliteta vode: procjena toksičnosti. - Sankt Peterburg: Gidrometeoizdat, 2000, str. 10-15, 39-42.

5. Bakaeva E.N. Ekološke i biološke osnove vitalne aktivnosti rotifera u kulturi. Rostov na Donu: SKNTS VSh, 1999. 51 str.

6. Bakaeva E.N. Mogućnost osiguranja kvaliteta informacija korištenjem tehnika biotestiranja na rotiferima // Naučna misao Kavkaza. 1999. br. 5. S. 26-36

7. Bakaeva E.N., Makarov E.V. Ekološke i biološke osnove vitalne aktivnosti rotifera u normi i pod uslovima antropogenog opterećenja. Rostov na Donu: SKNTS VSh, 1999. 206 str.

9. Nikanorov A.M., Khoruzhaya T.A., Brazhnikova L.V., Zhulidov A.V. Praćenje kvaliteta vode: procjena toksičnosti. - Sankt Peterburg: Gidrometeoizdat, 2000, str. 16-39.

Hostirano na Allbest.ru

...

Slični dokumenti

Bioindikacija algi i metode bioindikacije Lepidium sativum L. Vrsni sastav algi i cijanobakterija u otpadnim vodama MUP-a "Ufavodokanal". Proučavanje kvantitativnog razvoja algi i cijanobakterija u zagađenoj i pročišćenoj vodi.

teze, dodato 09.06.2014

Klasifikacija otpadnih voda i metode njihovog prečišćavanja. Kvalitativno i kvantitativno obračunavanje algi i cijanobakterija. Metoda za određivanje toksičnosti vode prema potočarki (Lepidium sativum L.). Biotestiranje otpadnih voda UPCG "Ufavodokanal".

teze, dodato 06.06.2014

Sastav otpadnih voda iz prehrambene industrije. Procjena uticaja otpadnih voda iz prehrambene industrije na stanje prirodnih voda, na faunu akumulacija. Pravni osnov i načini obezbjeđivanja ekološkog zakonodavstva u oblasti zaštite prirodnih voda.

teza, dodana 10.08.2010

Utjecaj vode i tvari otopljenih u njoj na ljudski organizam. Sanitarno-toksikološki i organoleptički pokazatelji štetnosti vode za piće. Savremene tehnologije i metode prečišćavanja prirodnih i otpadnih voda, procjena njihove praktične efikasnosti.

seminarski rad, dodan 03.01.2013

Osobine upotrebe biotestiranja i bioindikacijskih metoda za praćenje stanja životne sredine. Kontrola kvaliteta prirodnih i otpadnih voda na bioindikatoru Daphnia magna Strauss. Osetljivost indikatora na različite hemikalije.

teza, dodana 06.10.2009

Svrha i osnovne metode biološkog tretmana vode. Značaj kvalitetnog tretmana otpadnih voda za zaštitu prirodnih vodnih tijela. Razgradnja organskih materija mikroorganizmima u aerobnim i anaerobnim uslovima, procena prednosti ove metode.

sažetak, dodan 14.11.2010

Ponovno korištenje otpadnih voda kao higijenski problem. Biološko i hemijsko zagađenje kanalizacije. Metode prečišćavanja otpadnih voda i problemi sigurnosti pri korišćenju regenerisanih voda. Ekološka procjena primjene mulja.

seminarski rad, dodan 27.12.2009

Problem postupanja sa proizvodnim i potrošnim otpadom. Proučavanje metoda biotestiranja. Evaluacija testnih objekata. Svrsishodnost utvrđivanja klase opasnosti otpada metodom biotestiranja za CJSC "Trolza" sa ekonomskog stanovišta.

prezentacija, dodano 21.06.2012

Izvori zagađenja kopnenih voda. Metode tretmana otpadnih voda. Izbor tehnološke sheme prečišćavanja otpadnih voda. Fizičko-hemijske metode prečišćavanja otpadnih voda primjenom koagulansa. Odvajanje suspendovanih čestica iz vode.

sažetak, dodan 12.05.2003

Prečišćavanje i izbjeljivanje prirodne vode koagulansima i flokulantima. Uslovi za upotrebu flokulanata za tretman vode. Metode za određivanje indikatora kvaliteta vode za piće. Istraživanje flokulacijskih svojstava novih akrilamidnih kopolimera u vodi.

Katerinenko Maria

Proučavanje kvaliteta vode biotestiranjem. Metoda za određivanje toksičnosti različitih medija na aparatu "Biotester-2" zasniva se na kontroli hemotaktičke reakcije cilijata-cipela.

Skinuti:

Pregled:

Proučavanje kvaliteta vode biotestiranjem.

Katerinenko Maria. 8. razred, GBOU škola br. 359.
Rukovodilac: Nabatova A.V.

Cilj rada: Istražite mogućnosti korištenja biotestiranja kao načina za procjenu kvaliteta vode.

Relevantnost: Uloga vode u ljudskom životu ne može se precijeniti. Mozak odrasle osobe sastoji se od 74,5% vode, krvi - 83%, u mišićima vode 75,8%, u kostima - 22%.

Gubitak samo 3% vode u organizmu onemogućava čovjeku da trči, 5% - onemogućava izdržavanje većeg fizičkog napora, a gubitak 10% vode u tijelu je opasan po život. Metoda biotestiranja omogućava brzu i relativno jeftinu analizu, eliminirajući rizike povezane s korištenjem vode lošeg kvaliteta.

Ciljevi istraživanja:

Poznavati karakteristike cipela cilijata kao test objekta;
Razumjeti mehanizam utjecaja na objekt testiranja i njegov odgovor;
Znajte eksperimentirati
Usporedite reakciju ispitivanog objekta u različitim uzorcima vode;
Ocijenite dobijene rezultate i na osnovu dobijenih rezultata izvedite zaključke.

Naslovi slajdova:

Proučavanje kvaliteta vode biotestiranjem. Posao je uradila: Katerinenko Maria Vadimovna. Klasa 8 "A". GBOU škola br. 359. Rukovodilac: Nabatova A.V.

Svrha studije: Proučiti mogućnosti korištenja biotestiranja kao načina procjene kvaliteta vode.

Ciljevi istraživanja: Upoznati karakteristike cipela infuzorije kao ispitnog objekta. Razumjeti mehanizam djelovanja na objektu testiranja koji uzrokuje odgovor. Znajte eksperimentirati.

Ciljevi istraživanja: Uporediti reakciju ispitivanog objekta u različitim uzorcima vode. Procijenite rezultate. Izvucite zaključke na osnovu dobijenih rezultata.

Biotestiranje. Biotestiranje je određivanje stepena ekološke opasnosti uz pomoć bioloških objekata: algi, protozoa itd.

Struktura Ciliates cipela: 1. veliko jezgro; 2. mala jezgra; 3 - cilije; 4 - preoralni udubljenje; 5 - digestivne vakuole; 6 - prah; 7 - ekskretorne vakuole sa aferentnim tubulima.

Srijeda Lozin-Lozinsky. Destilirana voda - 100 ml; 0,1 g - NaCl; 0,01 g - COP l; 0,01 g - CaC l 2; 0,01 g - MgC l 2; 0,02 g - NaHCO 2.

Brojanje Infuzoria papuče u kapi vode.

Biotestiranje.

Rezultati istraživanja:

Zaključak: Kvalitet sirove vode dao je najniže rezultate. Prokuhana voda je pokazala najbolje rezultate. Flaširana voda je prosječna. Kvalitet filtrirane vode nije indikativan u ovoj studiji.

Literatura Bukhvalov V., Bogdanova L. Ekološka ekspertiza.-M.: LA Varyag, 1995 Green N., Stout W., Taylor D. Biology in 3-vol. Ed. R. Sopera. - M.: Mir, 1996 Dogel V.A. Zoologija beskičmenjaka.-M.: Viša škola, Život životinja 1981. T.1.-M.: Obrazovanje, 1986. Zakharov I.S., Velichko A.N. Studija mogućnosti korištenja temperaturnih populacijskih reakcija cilijata kao informativnih indikatora štetnih faktora u okolišu.-Sankt Peterburg: IBRR, 2013. Zakharov I.S., Pozharov A.V. Biotehničke metode zaštite životne sredine. - Sankt Peterburg: Izdavačka kuća Sankt Peterburgskog elektrotehničkog univerziteta "LETI", 2001. Zakharov I.S., Pozharov A.V., Sidorenko V.M. Ekspresne metode integralne procjene ekološkog stanja objekata životne sredine. Sankt Peterburg: SPbGETU "LETI", 2007. Enciklopedija za decu T.2 Biologija.-M.: Avanta+, 1999 http://chemister.ru/Database/words-description.php?dbid=1&id=49 http: //www.bioind.narod.ru/Articles/guppi.htm http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%91%D0%B8%D0%BE%D0%B8%D0%BD% D0% B4%D0%B8%D0%BA%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F

Hvala vam na pažnji!

Biotestiranje otpadnih voda metodom Daphnia. Počni u nauci

OPĆE ODREDBE

KARAKTERISTIKE METODA BIOTESTIRANJA KOJE SE KORISTE ZA KONTROLU KVALITETA VODE U JAVNIM SISTEMIMA I SISTEMIMA SNABDIJEVANJA VODOM ZA PIĆE

OPĆA PRAVILA ZA PRIMJENU METODA BIOTESTIRANJA ZA KONTROLU KVALITETA VODE U CENTRALIZOVANIM SISTEMIMA KUĆANSTVA I SNABDIJEVANJA VODOM ZA PIĆE

DODATAK 1: BIOTESTIRANJE KORIŠĆENJEM STANIČNOG TEST OBJEKTA (granulirano sperma bikova)

Fig.1. Blok dijagram sistema

DODATAK 2: BIOTESTIRANJE KORIŠĆENJEM PARAMECIUM INFUSORIANS

Uvod

Biotestiranje kao metoda ekološkog istraživanja

Suština biotestiranja i zahtjevi za njegove metode

Pošaljite svoj dobar rad u bazu znanja je jednostavno. Koristite obrazac ispod

Slični dokumenti

Skinuti:

Pregled:

Naslovi slajdova:

Najnoviji

To se mora znati