Citokinska terapija. Citokini i upala Ispoljava se funkcionalna aktivnost citokina

Citokini su oko 100 kompleksnih proteina uključenih u mnoge imunološke i upalne procese u ljudskom tijelu. Ne akumuliraju se u stanicama koje ih proizvode i brzo se sintetiziraju i izlučuju.

Citokini koji pravilno funkcionišu održavaju imuni sistem nesmetano i efikasno. Njihova karakteristična karakteristika je svestranost djelovanja. U većini slučajeva pokazuju kaskadni efekat koji se zasniva na međusobnoj nezavisnoj sintezi drugih citokina. Inflamatorni proces koji se razvija kontroliraju međusobno povezani proupalni citokini.

Šta su citokini

Citokini su velika grupa regulatornih proteina čija se molekularna težina kreće od 15 do 25 kDa (kilodalton je jedinica atomske mase). Oni djeluju kao posrednici međustanične signalizacije. Njihova karakteristična karakteristika je prijenos informacija između stanica na kratkim udaljenostima. Oni su uključeni u kontrolu ključnih životnih procesa u tijelu. Oni su odgovorni za početak proliferacija, tj. proces umnožavanja stanica, nakon čega slijedi njihova diferencijacija, rast, aktivnost i apoptoza. Citokini određuju humoralnu i ćelijsku fazu imunološkog odgovora.

Citokini se mogu smatrati vrstom hormoni imunog sistema. Od ostalih svojstava ovih proteina izdvajaju se posebno sposobnost uticaja na energetsku ravnotežu organizma kroz promjene apetita i brzine metabolizma, efekte na raspoloženje, funkcije i strukture kardiovaskularnog sistema, te povećanu pospanost.

Posebnu pažnju treba obratiti na proinflamatorni i antiinflamatorni citokini. Prevladavanje prvih dovodi do upalne reakcije s groznicom, ubrzanim disanjem i leukocitozom. Drugi imaju prednost u stvaranju protuupalnog odgovora.

Karakteristike citokina

Glavne karakteristike citokina:

  • redundantnost- sposobnost da se proizvede isti efekat
  • pliotropija- sposobnost uticaja na različite tipove ćelija i izazivanja različitih akcija u njima
  • sinergija- interakcija
  • indukcija faze pozitivne i negativne povratne sprege
  • antagonizam– Međusobno blokiranje efekata delovanja

Citokini i njihov učinak na druge stanice

Citokini posebno djeluju na:

  • B limfociti su ćelije imunog sistema odgovorne za humoralni imuni odgovor, tj. proizvodnja antitijela;
  • T-limfociti - ćelije imunog sistema odgovorne za ćelijski imuni odgovor; proizvode, posebno, Th1 i Th2 limfocite, između kojih se opaža antagonizam; Th1 podržava ćelijski odgovor i Th2 humoralni odgovor; Th1 citokini negativno utiču na razvoj Th2, i obrnuto;
  • NK ćelije - grupa ćelija imunog sistema koja je odgovorna za fenomene prirodne citotoksičnosti (toksični efekti na citokine koji ne zahtevaju stimulaciju specifičnih mehanizama u obliku antitela);
  • Monociti su morfološki elementi krvi, zovu se bela krvna zrnca;
  • Makrofagi su populacija ćelija u imunološkom sistemu koja dolazi od prekursora krvnih monocita; djeluju kako u procesima urođenog imuniteta tako i stečenog (prilagodljivog);
  • Granulociti su vrsta bijelih krvnih stanica koje pokazuju svojstva fagocita, što treba shvatiti kao sposobnost apsorpcije i uništavanja bakterija, mrtvih stanica i nekih virusa.

Proinflamatorni citokini

Proinflamatorni citokini sudjeluju u regulaciji imunološkog odgovora i hematopoeze (proces proizvodnje i diferencijacije morfotskih krvnih elemenata) i iniciraju razvoj upalne reakcije. Često se nazivaju imunotransmiterima.

Glavni proinflamatorni citokini uključuju:

  • TNF ili faktor nekroze tumora, koji se ranije zvao kektsin. Pod ovim imenom je grupa proteina koji određuju aktivnost limfocita. Oni mogu pokrenuti apoptozu, prirodni proces programirane smrti ćelija raka. TNF-α i TNF-β su izolovani.
  • IL-1, tj. interleukin 1. Jedan je od glavnih regulatora upalnog imunološkog odgovora. Posebno aktivno uključen u upalne reakcije crijeva. Među njegovih 10 varijeteta izdvajaju se IL-1α, IL-1β, IL-1γ. Trenutno se opisuje kao interleukin 18.
  • IL-6, odnosno interleukin 6, koji ima pleiotropni ili višesmjerni učinak. Njegova koncentracija raste u serumu pacijenata s ulceroznim kolitisom. Stimuliše hematopoezu, pokazujući sinergiju sa interleukinom 3. Stimuliše diferencijaciju B-limfocita u plazma ćelije.

Protuupalni citokini

Protuupalni citokini smanjuju inflamatorni odgovor potiskivanjem proizvodnje proupalnih citokina od strane monocita i makrofaga, posebno IL-1, IL-6, IL-8.

Među glavnim protuupalnim citokinima posebno se spominje IL-10, odnosno interleukin 10 (faktor koji inhibira sintezu citokina), IL 13, IL 4, koji kao rezultat indukcije lučenja citokina koji utiču na hematopoezu, pozitivno utiču na proizvodnju krvnih zrnaca.


Aktivacija stanica upalne zone očituje se u tome što stanice počinju sintetizirati i lučiti mnoge citokine koji djeluju na obližnje stanice i stanice udaljenih organa. Među svim ovim citokinima postoje oni koji potiču (proinflamatorni) i oni koji sprečavaju razvoj upalnog procesa (protuupalni). Citokini izazivaju efekte slične manifestacijama akutnih i kroničnih zaraznih bolesti.

Proinflamatorni citokini


90% limfocita (vrsta leukocita), 60% tkivnih makrofaga (ćelije sposobne za hvatanje i varenje bakterija) sposobno je da luči proupalne citokine. Infektivni agensi i sami citokini (ili drugi inflamatorni faktori) su stimulatori proizvodnje citokina.

Lokalno oslobađanje proinflamatornih citokina uzrokuje stvaranje žarišta upale. Uz pomoć specifičnih receptora, proinflamatorni citokini se vezuju i u proces uključuju druge vrste ćelija: kožu, vezivno tkivo, unutrašnji zid krvnih sudova, epitelne ćelije. Sve ove stanice također počinju proizvoditi proupalne citokine.

Najvažniji proinflamatorni citokini su IL-1 (interleukin-1) i TNF-alfa (faktor nekroze tumora-alfa). Oni uzrokuju stvaranje žarišta adhezije (ljepljenja) na unutarnjoj ljusci stijenke žile: prvo se leukociti prianjaju na endotel, a zatim prodiru u vaskularni zid.

Ovi proupalni citokini stimuliraju sintezu i oslobađanje drugih proupalnih citokina (IL-8 i drugih) od strane leukocita i endotelnih stanica i na taj način aktiviraju stanice da proizvode medijatore upale (leukotriene, histamin, prostaglandine, dušikov oksid i druge).

Kada infekcija uđe u organizam, proizvodnja i oslobađanje IL-1, IL-8, IL-6, TNF-alfa počinje na mestu unošenja mikroorganizma (u ćelije sluzokože, kože, regionalne limfe). čvorovi) - to jest, citokini aktiviraju lokalne odbrambene reakcije.

I TNF-alfa i IL-1, osim lokalnog djelovanja, imaju i sistemsko djelovanje: aktiviraju imunološki, endokrini, nervni i hematopoetski sistem. Proinflamatorni citokini mogu izazvati oko 50 različitih bioloških efekata. Njihove mete mogu biti gotovo sva tkiva i organi.

Na primjer, anemija kod akutnih i kroničnih zaraznih bolesti rezultat je izloženosti tijelu proinflamatornih citokina (interleukin-1, interferon-beta, interferon-gama, TNF, neopterin). Oni inhibiraju rast eritroidne klice, oslobađanje željeza iz stanica makrofaga i inhibiraju proizvodnju eritropoetina u bubrezima. Citokini djeluju vrlo efikasno i brzo.

Protuupalni citokini


Kontrolu nad djelovanjem proinflamatornih citokina vrše protuupalni citokini, koji uključuju IL-4, IL-13, IL-10, TGF-beta. Oni ne samo da mogu potisnuti sintezu proinflamatornih citokina, već i promovirati sintezu antagonista interleukina receptora (RAIL ili RAIL).

Odnos između protuupalnih i proinflamatornih citokina važna je točka u regulaciji nastanka i razvoja upalnog procesa. Od ove ravnoteže zavisi i tok bolesti i njen ishod. Upravo citokini potiču proizvodnju faktora zgrušavanja krvi u vaskularnim endotelnim stanicama, proizvodnju hondrolitičkih enzima i doprinose stvaranju ožiljnog tkiva.

Citokini i imuni odgovor


Sve ćelije u imunološkom sistemu imaju određene različite funkcije. Njihovu koordiniranu interakciju provode citokini - regulatori imunoloških odgovora. Oni su ti koji osiguravaju razmjenu informacija između ćelija imunološkog sistema i koordinaciju njihovih akcija.

Skup i količina citokina je matrica signala (često se mijenja) koji djeluju na ćelijske receptore. Složena priroda ovih signala objašnjava se činjenicom da svaki citokin može inhibirati ili aktivirati nekoliko procesa (uključujući sintezu vlastitih ili drugih citokina), formiranje receptora na površini stanice.

Citokini obezbeđuju međuodnos unutar imunog sistema između specifičnog imuniteta i nespecifične zaštitne reakcije organizma, između humoralnog i ćelijskog imuniteta. Citokini su ti koji komuniciraju između fagocita (koji obezbjeđuju ćelijski imunitet) i limfocita (ćelija humoralnog imuniteta), kao i između limfocita različitih funkcija.

Preko citokina T-pomagači (limfociti koji "prepoznaju" strane proteine ​​mikroorganizama) prenose komandu T-ubicama (ćelijama koje uništavaju strani protein). Slično, uz pomoć citokina, T-supresori (vrsta limfocita) kontroliraju funkciju T-ubica i prenose im informacije kako bi zaustavili uništavanje stanica.

Ako se takva veza prekine, onda će se smrt ćelija (već vlastitih za tijelo, a ne tuđih) nastaviti. Ovako se razvijaju autoimune bolesti: sinteza IL-12 nije kontrolirana, ćelijski posredovan imuni odgovor će biti preterano aktivan.

Tok i ishod zarazne bolesti zavise od sposobnosti njenog patogena (ili njegovih komponenti) da induciraju sintezu citokina IL-12. Na primjer, vrsta gljivica Candida albicans može inducirati sintezu IL-12, što doprinosi razvoju efikasne ćelijske odbrane od ovog patogena. Leishmania inhibira sintezu IL-12 - razvija se kronična infekcija. HIV potiskuje sintezu IL-12, a to dovodi do kvarova u ćelijskom imunitetu kod AIDS-a.

Citokini takođe regulišu specifičan imuni odgovor organizma na unošenje patogena. Ako su lokalne odbrambene reakcije neefikasne, tada citokini djeluju na sistemskom nivou, odnosno djeluju na sve sisteme i organe koji su uključeni u održavanje homeostaze.

Kada djeluju na centralni nervni sistem, mijenja se čitav kompleks bihevioralnih reakcija, mijenja se sinteza većine hormona, sinteza proteina i sastav plazme. Ali sve promjene koje se događaju nisu slučajne: ili su neophodne za povećanje zaštitnih reakcija, ili pomažu u prebacivanju energije tijela u borbu protiv patogenih učinaka.

Upravo citokini, komunicirajući između endokrinog, nervnog, hematopoetskog i imunog sistema, uključuju sve ove sisteme u formiranje složene zaštitne reakcije organizma na unošenje patogena.

Makrofag guta bakterije i oslobađa citokine (3D model) - video

Analiza polimorfizma citokinskih gena

Analiza polimorfizma gena citokina je genetska studija na molekularnom nivou. Ovakve studije daju širok spektar informacija koje omogućavaju da se utvrdi prisustvo polimorfnih gena (proinflamatornih varijanti) kod ispitivane osobe, predvidi predispozicija za različite bolesti, razvije program prevencije takvih bolesti za tu osobu, itd.

Za razliku od pojedinačnih (sporadičnih) mutacija, polimorfni geni se nalaze u približno 10% populacije. Nosioci ovakvih polimorfnih gena imaju povećanu aktivnost imunog sistema tokom hirurških intervencija, zaraznih bolesti i mehaničkih efekata na tkiva. U imunogramu takvih osoba često se otkriva visoka koncentracija citotoksičnih stanica (ćelija ubojica). Kod takvih pacijenata često se razvijaju septičke, gnojne komplikacije bolesti.

Ali u nekim situacijama, tako povećana aktivnost imunološkog sistema može ometati: na primjer, kod vantjelesne oplodnje i presađivanja embrija. A kombinacija proinflamatornih gena interleukina-1 ili IL-1 (IL-1), antagonista interleukina-1 receptora (RAIL-1), tumor nekrotizirajućeg faktora-alfa (TNF-alfa) je predisponirajući faktor za pobačaj tokom trudnoća. Ako se pregledom otkrije prisustvo proinflamatornih citokinskih gena, potrebna je posebna priprema za trudnoću ili IVF (in vitro oplodnju).

Analiza profila citokina uključuje detekciju 4 polimorfne varijante gena:


  • interleukin 1-beta (IL-beta);

  • antagonist receptora interleukina-1 (ILRA-1);

  • interleukin-4 (IL-4);

  • tumor nekrotizirajući faktor-alfa (TNF-alfa).

Za isporuku analize nije potrebna posebna priprema. Materijal za studiju je struganje sa bukalne sluznice.

Moderne studije su pokazale da se kod uobičajenog pobačaja u tijelu žene često otkrivaju genetski faktori trombofilije (sklonosti trombozi). Ovi geni mogu dovesti ne samo do pobačaja, već i do insuficijencije placente, usporavanja rasta fetusa i kasne toksikoze.

U nekim slučajevima polimorfizam gena trombofilije kod fetusa je izraženiji nego kod majke, budući da i fetus prima gene od oca. Mutacije protrombinskog gena dovode do gotovo stopostotne intrauterine smrti fetusa. Stoga, posebno teški slučajevi pobačaja zahtijevaju pregled i muža.

Imunološki pregled muža pomoći će ne samo u određivanju prognoze trudnoće, već i identificirati faktore rizika za njegovo zdravlje i mogućnost primjene preventivnih mjera. Ako se kod majke identifikuju faktori rizika, preporučljivo je da se nakon toga obavi pregled djeteta - to će pomoći u razvoju individualnog programa za prevenciju bolesti kod djeteta.

Kod neplodnosti preporučljivo je identificirati sve trenutno poznate faktore koji mogu dovesti do neplodnosti. Kompletna genetska studija polimorfizma gena uključuje 11 indikatora. Pregledom se može utvrditi predispozicija za disfunkciju placente, visok krvni pritisak, preeklampsiju. Precizna dijagnoza uzroka neplodnosti omogućit će neophodan tretman i omogućiti održavanje trudnoće.

Prošireni hemostaziogram može pružiti informacije ne samo za opstetričku praksu. Koristeći proučavanje polimorfizma gena, moguće je identificirati faktore genetske predispozicije za razvoj ateroskleroze, koronarne bolesti srca, predvidjeti njen tok i vjerojatnost razvoja infarkta miokarda. Čak se i vjerovatnoća iznenadne smrti može izračunati korištenjem genetskog istraživanja.

Proučavan je i utjecaj polimorfizma gena na brzinu razvoja fibroze kod bolesnika s kroničnim hepatitisom C, koji se može koristiti za predviđanje toka i ishoda kroničnog hepatitisa.

Molekularno genetičke studije multifaktorskih bolesti pomažu ne samo u stvaranju individualne zdravstvene prognoze i preventivnih mjera, već i u razvoju novih terapijskih metoda korištenjem anticitokinskih i citokinskih lijekova.

Citokinska terapija

Liječenje tumorskih bolesti
Terapija citokinom može se koristiti u bilo kojoj (čak i IV) fazi maligne bolesti, uz prisustvo teške prateće patologije (hepatičko-bubrežna ili kardiovaskularna insuficijencija). Citokini selektivno uništavaju samo maligne tumorske ćelije i ne utiču na zdrave. Citokinoterapija se može koristiti kao samostalna metoda liječenja ili kao dio kompleksne terapije.

Imunološke studije kod oboljelih od karcinoma pokazale su da je većina malignih bolesti praćena poremećenim imunološkim odgovorom. Stepen njegove supresije ovisi o veličini tumora i načinu liječenja (radioterapija i kemoterapija). Dobijeni su podaci o biološkim efektima citokina (interleukina-2, interferona, faktora tumorske nekroze i dr.).

Citokinska terapija se u onkologiji koristi već nekoliko decenija. Ali ranije su se uglavnom koristili interleukin-2 (IL-2) i interferon-alfa (IFN-alfa) - efikasni samo za melanom kože i rak bubrega. Posljednjih godina stvoreni su novi lijekovi, proširene su indikacije za njihovu efikasnu upotrebu.

Jedan od preparata citokina - faktor tumorske nekroze (TNF-alfa) - djeluje preko receptora koji se nalaze na malignoj ćeliji. Ovaj citokin u ljudskom tijelu proizvode monociti i makrofagi. U interakciji sa receptorima maligne ćelije, citokin pokreće program smrti ove ćelije.

TNF-alfa je počeo da se koristi u onkološkoj praksi u SAD i Evropi još 1980-ih. I danas je u upotrebi. Ali visoka toksičnost lijeka ograničava njegovu upotrebu samo u slučajevima kada je moguće izolirati organ s tumorskim procesom iz općeg krvotoka (bubrezi, udovi). Lijek u ovom slučaju cirkuliše uz pomoć srčano-plućnog aparata samo u zahvaćenom organu, a ne ulazi u opću cirkulaciju.

U Rusiji je Refnot (TNF-T) nastao 1990. godine kao rezultat fuzije gena timozin-alfa i faktora tumorske nekroze. 100 puta je manje toksičan od TNF-a, prošao je klinička ispitivanja, a od 2009. je odobren za primjenu u liječenju različitih vrsta i lokalizacija malignih tumora.

S obzirom na smanjenje toksičnosti lijeka, može se primijeniti intramuskularno ili subkutano. Lijek djeluje i na primarni fokus tumora i na metastaze (uključujući i udaljene), za razliku od TNF-alfa, koji može djelovati samo na primarni fokus.

Još jedan obećavajući citokinski lijek je Interferon-gama (IFN-gama). Na njegovoj osnovi je 1990. godine u Rusiji stvoren lijek Ingaron. Ima direktan uticaj na tumorske ćelije ili pokreće program apoptoze (ćelija sama programira i sprovodi svoju smrt), povećava efikasnost imunih ćelija.

Lijek je također prošao klinička ispitivanja i odobren je za upotrebu u liječenju malignih tumora od 2005. godine. Lijek aktivira te receptore na malignoj ćeliji, s kojima Refnot zatim stupa u interakciju. Stoga se najčešće citokinoterapija s Refnotom kombinira s primjenom Ingarona.

Način primjene ovih lijekova (intramuskularno ili subkutano) omogućava liječenje na ambulantnoj osnovi. Citokinoterapija je kontraindicirana samo tokom trudnoće i autoimunih bolesti. Osim direktnog djelovanja na malignu ćeliju, Ingaron i Refnot imaju indirektno djelovanje - aktiviraju vlastite ćelije imunog sistema (T-limfocite i fagocite), povećavaju ukupni imunitet.

Nažalost, efikasnost citokinske terapije je samo 30-60%, u zavisnosti od stadijuma i lokacije tumora, vrste maligne neoplazme, prevalencije procesa i opšteg stanja pacijenta. Što je viši stadijum bolesti, to je manje izražen učinak liječenja.

Ali čak i u prisustvu višestrukih i udaljenih metastaza i nemogućnosti kemoterapije (zbog težine općeg stanja pacijenta), bilježe se pozitivni rezultati u vidu poboljšanja općeg blagostanja i obustave daljnjeg razvoja. bolesti.

Glavni pravci djelovanja modernih lijekova-citokina:


  • direktan utjecaj na ćelije samog tumora i metastaze;

  • pojačavanje antitumorskog učinka kemoterapije;

  • prevencija metastaza i recidiva tumora;

  • smanjenje neželjenih reakcija kemoterapije inhibicijom hematopoeze i imunosupresijom;

  • liječenje i prevencija infektivnih komplikacija tokom liječenja.

Mogući rezultati primjene citokinske terapije:


  • potpuni nestanak tumora ili smanjenje njegove veličine (zbog pokretanja apoptoze - programirane smrti tumorskih stanica);

  • stabilizacija procesa ili djelomična regresija tumora (kada je ćelijski ciklus zaustavljen u tumorskim stanicama);

  • nedostatak efekta - nastavlja se rast i metastaziranje tumora (uz neosjetljivost tumorskih stanica na lijek zbog mutacija).

Iz navedenog se može vidjeti da klinički rezultat primjene citokinske terapije ovisi o karakteristikama tumorskih stanica kod samog pacijenta. Da bi se procijenila efikasnost upotrebe citokina, provode se 1-2 ciklusa liječenja i procjenjuje se dinamika procesa različitim instrumentalnim metodama ispitivanja.

Mogućnost primjene terapije citokinom ne znači odustajanje od drugih metoda liječenja (operacija, kemoterapija ili zračenje). Svaki od njih ima svoje prednosti u utjecaju na tumor. Sve indicirane i dostupne tretmane treba koristiti u svakom pojedinačnom slučaju.

Citokini uvelike olakšavaju podnošljivost zračenja i kemoterapije, sprječavaju nastanak neutropenije (smanjenje broja leukocita) i razvoj infekcija tokom kemoradioterapije. Osim toga, Refnot povećava učinkovitost većine lijekova za kemoterapiju. Korištenje u kombinaciji s Ingaronom tjedan dana prije početka kemoterapije i nastavak korištenja citokina nakon kemoterapije će zaštititi od infekcija ili ih izliječiti bez antibiotika.

Shema citokinske terapije dodjeljuje se svakom pacijentu pojedinačno. Oba lijeka praktički ne pokazuju toksičnost (za razliku od lijekova za kemoterapiju), nemaju nuspojave i dobro ih podnose pacijenti, nemaju inhibitorni učinak na hematopoezu i povećavaju specifični antitumorski imunitet.

Liječenje šizofrenije

Istraživanja su pokazala da su citokini uključeni u psihoneuroimune reakcije i osiguravaju konjugovani rad nervnog i imunološkog sistema. Ravnoteža citokina reguliše proces regeneracije defektnih ili oštećenih neurona. To je osnova za primjenu novih metoda liječenja shizofrenije - citokinoterapija: primjena imunotropnih lijekova koji sadrže citokine.

Jedan od načina je korištenje anti-TNF-alfa i anti-IFN-gama antitijela (anti-tumorski faktor nekroze-alfa i interferon-gama antitijela). Lijek se primjenjuje intramuskularno 5 dana, 2 r. za jedan dan.

Postoji i tehnika za korišćenje kompozitnog rastvora citokina. Primjenjuje se u obliku inhalacije pomoću nebulizatora, 10 ml po 1 injekciji. Ovisno o stanju pacijenta, lijek se primjenjuje svakih 8 sati prvih 3-5 dana, zatim 5-10 dana - 1-2 rublja / dan, a zatim se doza smanjuje na 1 r. za 3 dana dugo (do 3 mjeseca) uz potpuno ukidanje psihotropnih lijekova.

Intranazalna upotreba rastvora citokina (koji sadrži IL-2, IL-3, GM-CSF, IL-1beta, IFN-gama, TNF-alfa, eritropoetin) poboljšava efikasnost lečenja pacijenata sa šizofrenijom (uključujući i pri prvom napadu). bolesti), dugotrajnija i stabilnija remisija. Ove metode se koriste u klinikama u Izraelu i Rusiji.


Više o šizofreniji

Citokini, po svojoj prirodi, su proteini koje proizvode ćelije imunog sistema (u literaturi se često nazivaju "faktori"). Oni su uključeni u diferencijaciju novorođenih ćelija imunološkog sistema, dajući im određene karakteristike koje su izvor raznolikosti imunoloških ćelija, a također pružaju međućelijsku interakciju. Kako bismo olakšali razumijevanje ovog procesa, možemo usporediti proizvodnju imunoloških stanica s tvornicom. U prvoj fazi, identične prazne ćelije napuštaju transporter, zatim u drugoj fazi, uz pomoć različitih grupa citokina, svaka stanica je obdarena posebnim funkcijama i sortirana u grupe za naknadno sudjelovanje u imunološkim procesima. Tako se iz identičnih ćelija dobijaju T-limfociti, B-limfociti, neutrofili, bazofili, eozinofili, monociti.

Za nauku je zanimljiva posebnost utjecaja citokina na ćeliju, koji stvara proizvodnju drugih citokina od strane ove stanice. To jest, jedan citokin pokreće proizvodnju drugih citokini.

Citokini se, ovisno o utjecaju na imunološke stanice, dijele u šest grupa:

  • Interferoni
  • Interleukini
  • faktori stimulacije kolonija
  • faktori rasta
  • Hemokini
  • Faktori nekroze tumora

Interferoni su citokini koje proizvode stanice kao odgovor na virusnu infekciju ili druge opcije stimulansa. Ovi proteini (citokini) blokiraju reprodukciju virusa u drugim ćelijama i učestvuju u međućelijskoj interakciji imunog sistema.

Prvi tip (ima antivirusno i antitumorsko djelovanje):

interferon-alfa

interferon-beta

Interferon-gama

Interferoni alfa i beta imaju sličan mehanizam djelovanja, ali ih proizvode različite stanice.

Interferon-alfa proizvode mononuklearni fagociti. Odatle sledi i njegovo ime - " leukocitni interferon».

Interferon-beta proizvode fibroblasti. Otuda mu i naziv - fibroblast interferon».

Interferoni prve vrste imaju svoje zadatke:

  • Povećajte proizvodnju interleukina (IL1)
  • Snizite pH nivo u međućelijskoj sredini sa povećanjem temperature
  • Veže se za zdrave ćelije i štiti ih od virusa
  • Sposoban da inhibira proliferaciju (rast) stanica blokiranjem sinteze aminokiselina
  • Zajedno sa prirodnim stanicama ubojicama, one induciraju ili potiskuju (u zavisnosti od situacije) stvaranje antigena

Interferon-gama proizvode T-limfociti i prirodne ćelije ubice. Nosi ime - imuni interferon»

Interferon druge vrste također ima zadatke:

  • Aktivira T-limfocite, B-limfocite, makrofage, neutrofile,
  • inhibira proliferaciju timocita,
  • Jača ćelijski imunitet i autoimunitet,
  • Reguliše apoptozu normalnih i inficiranih ćelija.

Interleukini(skraćeno IL) su citokini koji regulišu interakciju između leukocita. Nauka je identifikovala 27 interleukina.

faktori stimulacije kolonija su citokini koji reguliraju diobu i diferencijaciju matičnih stanica koštane srži i prekursora krvnih stanica. Ovi citokini su odgovorni za sposobnost limfocita da kloniraju, a također su u stanju stimulirati funkcionalnost stanica izvan koštane srži.

Faktori rasta - regulišu rast, diferencijaciju i funkcionalnost ćelija u različitim tkivima

Do danas su otkriveni sljedeći faktori rasta:

  • transformirajući faktori rasta alfa i beta
  • epidermalni faktor rasta
  • faktor rasta fibroblasta
  • faktor rasta trombocita
  • faktor rasta nerava
  • faktor rasta sličan insulinu
  • faktor rasta koji vezuje heparin
  • faktor rasta endotelnih ćelija

Najviše proučavane su funkcije transformacije faktora rasta beta. Odgovoran je za suzbijanje rasta i aktivnosti T-limfocita, inhibira neke funkcije makrofaga, neutrofila, B-limfocita. Iako se ovaj faktor odnosi na faktore rasta, zapravo je uključen u obrnute procese, odnosno potiskuje imuni odgovor (suprimira funkcije ćelija koje su uključene u imunološku odbranu), kada se infekcija eliminiše i rad imunoloških ćelija više nije potrebno. Pod uticajem ovog faktora pojačava se sinteza kolagena i proizvodnja IgA imunoglobulina tokom zarastanja rana, a stvaraju se memorijske ćelije.

Hemokini su citokini niske molekularne težine. Njihova glavna funkcija je privlačenje leukocita iz krvotoka u žarište upale, kao i regulacija pokretljivosti leukocita.

Faktori tumorske nekroze(skraćeno TNF) su dvije vrste citokina (TNF-alfa i TNF-beta). Rezultati njihovog djelovanja: razvoj kaheksije (ekstremna iscrpljenost tijela kao rezultat usporava aktivnost enzima, što doprinosi nakupljanju masti u tijelu); razvoj toksičnog šoka; inhibicija apoptoze (ćelijske smrti) ćelija imunog sistema, indukcija apoptoze tumorskih i drugih ćelija; aktivacija trombocita i zacjeljivanje rana; inhibicija angiogeneze (proliferacija krvnih sudova) i fibrogeneze (degeneracija tkiva u vezivno tkivo), granulomatoze (formiranje granuloma - proliferacija i transformacija fagocita) i mnogi drugi rezultati.

U ovom poglavlju razmatrat će se integrirani pristup evaluaciji citokinskog sistema korištenjem prethodno opisanih savremenih istraživačkih metoda.

Prvo, izlažemo osnovne koncepte citokinskog sistema.

Citokini se trenutno smatraju proteinsko-peptidnim molekulima koje proizvode različite ćelije u tijelu i provode međućelijske i međusistemske interakcije. Citokini su univerzalni regulatori životnog ciklusa ćelije; oni kontrolišu procese diferencijacije, proliferacije, funkcionalne aktivacije i apoptoze potonje.

Citokini koje proizvode ćelije imunog sistema nazivaju se imunocitokini; oni predstavljaju klasu rastvorljivih peptidnih medijatora imunog sistema neophodnih za njegov razvoj, funkcionisanje i interakciju sa drugim sistemima tela (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Kao regulatorni molekuli, citokini imaju važnu ulogu u realizaciji reakcija urođenog i adaptivnog imuniteta, osiguravaju njihovu međusobnu povezanost, kontrolišu hematopoezu, upalu, zacjeljivanje rana, stvaranje novih krvnih žila (angiogeneza) i mnoge druge vitalne procese.

Trenutno postoji nekoliko različitih klasifikacija citokina, uzimajući u obzir njihovu strukturu, funkcionalnu aktivnost, porijeklo i tip citokinskih receptora. Tradicionalno, u skladu sa biološkim efektima, uobičajeno je razlikovati sljedeće grupe citokina.

1. Interleukini(IL-1-IL-33) - sekretorni regulatorni proteini imunog sistema, koji obezbeđuju posredničke interakcije u imunom sistemu i njegovu vezu sa drugim sistemima tela. Interleukini se prema svom funkcionalnom djelovanju dijele na pro- i antiinflamatorne citokine, faktore rasta limfocita, regulatorne citokine itd.

3. Faktori tumorske nekroze (TNF)- citokini sa citotoksičnim i regulatornim djelovanjem: TNFa i limfotoksini (LT).

4. Faktori rasta hematopoetskih ćelija- faktor rasta matičnih ćelija (Kit - ligand), IL-3, IL-7, IL-11, eritropoetin, trobopoetin, faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga - GM-CSF, granulocitni CSF - G-CSF, makrofag-

ny KSF - M-CSF).

5. Hemokini- S, SS, SHS (IL-8), SH3S - regulatori hemotakse različitih tipova ćelija.

6. Faktori rasta nelimfoidnih ćelija- regulatori rasta, diferencijacije i funkcionalne aktivnosti ćelija različite tkivne pripadnosti (faktor rasta fibroblasta - FGF, faktor rasta endotelnih ćelija, epidermalni faktor rasta - epidermalni EGF) i transformacioni faktori rasta (TGFβ, TGFα).

Između ostalog, posljednjih godina, aktivno se proučava faktor koji inhibira migraciju makrofaga (migracioni inhibitorni faktor - MIF), koji se smatra neurohormonom s citokinskom i enzimskom aktivnošću (Suslov A.P., 2003; Kovalchuk L.V. et al. ,

Citokini se razlikuju po strukturi, biološkoj aktivnosti i drugim svojstvima. Međutim, uz razlike, citokini imaju opšta svojstva, karakterističan za ovu klasu bioregulatornih molekula.

1. Citokini su, po pravilu, glikozilovani polipeptidi srednje molekularne težine (manje od 30 kD).

2. Citokine proizvode ćelije imunološkog sistema i druge ćelije (na primjer, endotel, fibroblasti, itd.) kao odgovor na aktivirajući stimulus (molekularne strukture povezane s patogenom, antigeni, citokini, itd.) i učestvuju u reakcijama. urođenog i adaptivnog imuniteta, regulišući njihovu snagu i trajanje. Neki citokini se sintetiziraju konstitutivno.

3. Lučenje citokina je kratak proces. Citokini ne perzistiraju kao preformirani molekuli, već prije

sinteza uvijek počinje transkripcijom gena. Ćelije proizvode citokine u niskim koncentracijama (pikogrami po mililitru).

4. U većini slučajeva, citokini se proizvode i djeluju na ciljne stanice koje su u neposrednoj blizini (djelovanje kratkog dometa). Glavno mjesto djelovanja citokina je međućelijska sinapsa.

5. Redundantnost Citokinski sistem se manifestuje u činjenici da je svaki tip ćelije sposoban da proizvede nekoliko citokina, a svaki citokin mogu da luče različite ćelije.

6. Svi citokini su okarakterisani pleiotropija, ili multifunkcionalnost akcije. Dakle, manifestacija znakova upale je posljedica utjecaja IL-1, TNFα, IL-6, IL-8. Dupliranje funkcija osigurava pouzdanost citokinskog sistema.

7. Djelovanje citokina na ciljne stanice posredovano je visoko specifičnim membranskim receptorima visokog afiniteta, koji su transmembranski glikoproteini, koji se obično sastoje od više od jedne podjedinice. Ekstracelularni dio receptora odgovoran je za vezivanje citokina. Postoje receptori koji eliminiraju višak citokina u patološkom žarištu. To su takozvani mamac receptori. Topljivi receptori su ekstracelularni domen membranskog receptora odvojen enzimom. Topljivi receptori su u stanju da neutrališu citokine, učestvuju u njihovom transportu do žarišta upale i izlučivanju iz organizma.

8. Citokini rade kao mreža. Oni mogu djelovati zajedno. Čini se da su mnoge funkcije koje su prvobitno pripisane jednom citokinu posljedica usklađenog djelovanja nekoliko citokina. (sinergizam akcije). Primjeri sinergističke interakcije citokina su stimulacija upalnih reakcija (IL-1, IL-6 i TNFa), kao i sinteza IgE

(IL-4, IL-5 i IL-13).

Neki citokini induciraju sintezu drugih citokina (kaskada). Kaskadno djelovanje citokina neophodno je za razvoj upalnih i imunoloških odgovora. Sposobnost nekih citokina da povećaju ili smanje proizvodnju drugih određuje važne pozitivne i negativne regulatorne mehanizme.

Poznato je antagonističko djelovanje citokina, na primjer, proizvodnja IL-6 kao odgovor na povećanje koncentracije TNF-a može biti

negativan regulatorni mehanizam za kontrolu proizvodnje ovog medijatora tokom upale.

Citokinska regulacija funkcija ciljnih stanica provodi se autokrinim, parakrinim ili endokrinim mehanizmima. Neki citokini (IL-1, IL-6, TNFα, itd.) su u stanju da učestvuju u implementaciji svih navedenih mehanizama.

Odgovor ćelije na uticaj citokina zavisi od nekoliko faktora:

Od vrste ćelija i njihove početne funkcionalne aktivnosti;

Od lokalne koncentracije citokina;

Od prisustva drugih molekula posrednika.

Dakle, ćelije proizvođači, citokini i njihovi specifični receptori na ciljnim ćelijama formiraju jednu mrežu medijatora. To je skup regulatornih peptida, a ne pojedinačnih citokina, koji određuju konačni odgovor ćelije. Trenutno se citokinski sistem smatra univerzalnim sistemom regulacije na nivou cijelog organizma, koji osigurava razvoj zaštitnih reakcija (na primjer, tokom infekcije).

Poslednjih godina pojavila se ideja o citokinskom sistemu koji kombinuje:

1) ćelije proizvođači;

2) rastvorljivi citokini i njihovi antagonisti;

3) ciljne ćelije i njihovi receptori (slika 7.1).

Povrede različitih komponenti citokinskog sistema dovode do razvoja brojnih patoloških procesa, te je stoga otkrivanje nedostataka u ovom regulatornom sistemu važno za ispravnu dijagnozu i određivanje adekvatne terapije.

Razmotrimo prvo glavne komponente citokinskog sistema.

Ćelije koje proizvode citokine

I. Glavna grupa ćelija koje proizvode citokine u adaptivnom imunološkom odgovoru su limfociti. Ćelije u mirovanju ne luče citokine. Nakon prepoznavanja antigena i uz učešće receptorskih interakcija (CD28-CD80/86 za T-limfocite i CD40-CD40L za B-limfocite), dolazi do aktivacije ćelije, što dovodi do transkripcije citokinskih gena, translacije i sekrecije glikozilovanih peptida. u ekstracelularni prostor.

Rice. 7.1. Citokinski sistem

CD4 T-pomagači su predstavljeni subpopulacijama: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, koje se međusobno razlikuju po spektru izlučenih citokina kao odgovor na različite antigene.

Th0 proizvodi širok spektar citokina u vrlo niskim koncentracijama.

Smjer diferencijacije Th0 određuje razvoj dva oblika imunog odgovora sa prevlašću humoralnih ili ćelijskih mehanizama.

Priroda antigena, njegova koncentracija, lokalizacija u ćeliji, tip ćelija koje predstavljaju antigen i određeni skup citokina regulišu pravac diferencijacije Th0.

Dendritske ćelije, nakon hvatanja i obrade antigena, predstavljaju antigene peptide Th0 ćelijama i proizvode citokine koji regulišu pravac njihove diferencijacije u efektorske ćelije. Uloga pojedinačnih citokina u ovom procesu prikazana je na sl. 7.2. IL-12 indukuje sintezu IFNγ od strane T-limfocita i ]ChGK. IFNu obezbeđuje diferencijaciju Th1, koji počinju da luče citokine (IL-2, IFNu, IL-3, TNFa, limfotoksini), koji regulišu razvoj reakcija na intracelularne patogene

(preosjetljivost odgođenog tipa (DTH) i različite vrste stanične citotoksičnosti).

IL-4 osigurava diferencijaciju Th0 u Th2. Aktivirani Th2 proizvodi citokine (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, itd.), koji određuju proliferaciju B-limfocita, njihovu dalju diferencijaciju u plazma ćelije i razvoj odgovora antitijela, uglavnom na ekstracelularni patogeni.

IFNy negativno reguliše funkciju Th2 ćelija i obrnuto, IL-4, IL-10, koje luči Th2, inhibiraju funkciju Th1 (slika 7.3). Molekularni mehanizam ove regulacije povezan je sa faktorima transkripcije. Ekspresija T-bet i STAT4, određena IFNy, usmjerava diferencijaciju T-ćelija duž Th1 puta i potiskuje razvoj Th2. IL-4 indukuje ekspresiju GATA-3 i STAT6, što, shodno tome, obezbeđuje konverziju naivnih Th0 u Th2 ćelije (slika 7.2).

Poslednjih godina opisana je posebna subpopulacija T pomoćnih ćelija (Th17) koje proizvode IL-17. Članovi porodice IL-17 mogu se eksprimirati aktiviranim memorijskim ćelijama (CD4CD45RO), y5T ćelijama, NKT ćelijama, neutrofilima, monocitima pod uticajem IL-23, IL-6, TGFβ koje proizvode makrofagi i dendritske ćelije. ROR-C je glavni faktor diferencijacije kod ljudi i ROR-γ kod miševa. l Pokazana je kardinalna uloga IL-17 u razvoju hronične upale i autoimune patologije (vidi sliku 7.2).

Osim toga, T limfociti u timusu mogu se diferencirati u prirodne regulatorne ćelije (Treg) koje eksprimiraju CD4+ CD25+ površinske markere i FOXP3 faktor transkripcije. Ove ćelije su u stanju da potisnu imuni odgovor posredovan Th1 i Th2 ćelijama kroz direktan međućelijski kontakt i sintezu TGFβ i IL-10.

Šeme diferencijacije Th0 klonova i citokina koje oni luče prikazani su na Sl. 7.2 i 7.3 (vidi i umetak u boji).

T-citotoksične ćelije (CD8+), prirodni ubice - slabi proizvođači citokina, kao što su interferoni, TNFa i limfotoksini.

Prekomjerna aktivacija jedne od Th subpopulacija može odrediti razvoj jedne od varijanti imunološkog odgovora. Hronični disbalans aktivacije Th može dovesti do stvaranja imunopatoloških stanja povezanih s manifestacijama

mi alergije, autoimuna patologija, hronični upalni procesi itd.

Rice. 7.2. Različite subpopulacije T-limfocita koji proizvode citokine

II. U urođenom imunološkom sistemu, glavni proizvođači citokina su mijeloične ćelije. Koristeći Toll-like receptore (TLR), oni prepoznaju slične molekularne strukture različitih patogena, takozvane molekularne obrasce povezane s patogenom (PAMP), npr. ponavljanja, itd.

Ova interakcija sa TLR pokreće kaskadu intracelularne signalne transdukcije koja vodi do ekspresije gena za dve glavne grupe citokina: proinflamatorne i IFN tipa 1 (slika 7.4, vidi i umetak u boji). Uglavnom ovi citokini (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, hemokini, itd.) izazivaju razvoj upale i učestvuju u zaštiti organizma od bakterijskih i virusnih infekcija.

Rice. 7.3. Spektar citokina koje luče Th1 i Th12 ćelije

III. Ćelije koje nisu dio imunog sistema (ćelije vezivnog tkiva, epitela, endotela) konstitutivno luče autokrine faktore rasta (GGF, EGF, TGFr, itd.). i citokini koji podržavaju proliferaciju hematopoetskih ćelija.

Citokini i njihovi antagonisti su detaljno opisani u brojnim monografijama (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Rice. 7.4. TLR posredovana indukcija proizvodnje citokina od strane urođenih imunoloških stanica

Prekomjerna ekspresija citokina je nesigurna za tijelo i može dovesti do razvoja pretjerane upalne reakcije, odgovora akutne faze. Različiti inhibitori su uključeni u regulaciju proizvodnje proupalnih citokina. Tako je opisan niz supstanci koje nespecifično vezuju citokin IL-1 i sprečavaju ispoljavanje njegovog biološkog delovanja (a2-makroglobulin, C3-komponenta komplementa, uromodulin). Specifični inhibitori IL-1 mogu biti rastvorljivi mamac receptori, antitela i antagonist IL-1 receptora (IL-1RA). Sa razvojem upale dolazi do povećanja ekspresije gena IL-1RA. Ali čak i normalno, ovaj antagonist je prisutan u krvi u visokoj koncentraciji (do 1 ng/ml ili više), blokirajući djelovanje endogenog IL-1.

ciljne ćelije

Djelovanje citokina na ciljne stanice je posredovano preko specifičnih receptora koji vežu citokine s vrlo visokim afinitetom, a pojedinačni citokini mogu koristiti

zajedničke receptorske podjedinice. Svaki citokin se vezuje za svoj specifični receptor.

Citokinski receptori su transmembranski proteini i podijeljeni su u 5 glavnih tipova. Najčešći je takozvani hematopoetski tip receptora, koji ima dva ekstracelularna domena, od kojih jedan sadrži zajedničku sekvencu aminokiselinskih ostataka dva triptofanska i serinska ponavljanja razdvojenih bilo kojom aminokiselinom (motiv WSXWS). Drugi tip receptora može imati dva ekstracelularna domena sa velikim brojem konzerviranih cisteina. To su receptori porodice IL-10 i IFN. Treći tip predstavljaju citokinski receptori koji pripadaju TNF grupi. Četvrti tip citokinskih receptora pripada superfamiliji imunoglobulinskih receptora, koji imaju ekstracelularne domene slične strukture kao i molekule imunoglobulina. Peti tip receptora koji vezuju molekule iz porodice hemokina predstavljaju transmembranski proteini koji prelaze ćelijsku membranu na 7 mesta. Citokinski receptori mogu postojati u rastvorljivom obliku, zadržavajući sposobnost vezivanja liganada (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Citokini su u stanju da utiču na proliferaciju, diferencijaciju, funkcionalnu aktivnost i apoptozu ciljnih ćelija (videti sliku 7.1). Manifestacija biološke aktivnosti citokina u ciljnim ćelijama zavisi od učešća različitih intracelularnih sistema u prenosu signala sa receptora, što je povezano sa karakteristikama ciljnih ćelija. Signal za apoptozu se izvodi, između ostalog, uz pomoć specifičnog regiona porodice TNF receptora, takozvanog domena "smrti" (slika 7.5, vidi umetak u boji). Signali diferencijacije i aktivacije se prenose preko intracelularnih Jak-STAT proteina - pretvarača signala i aktivatora transkripcije (slika 7.6, vidi umetak u boji). G-proteini su uključeni u prijenos signala iz hemokina, što dovodi do povećane migracije stanica i adhezije.

Kompleksna analiza citokinskog sistema uključuje sljedeće.

I. Procjena ćelija proizvođača.

1. Definicija izraza:

Receptori koji prepoznaju patogen ili TCR antigen, TLR) na nivou gena i proteinskih molekula (PCR, metoda protočne citometrije);

Adapterski molekuli koji provode signal koji pokreće transkripciju citokinskih gena (PCR, itd.);

Rice. 7.5. Transdukcija signala sa TNF receptora

Rice. 7.6. Jak-STAT - signalni put receptora citokina tipa 1

Citokinski geni (PCR); proteinski molekuli citokina (procjena funkcije sintetiziranja citokina u ljudskim mononuklearnim stanicama).

2. Kvantitativno određivanje subpopulacija ćelija koje sadrže određene citokine: Th1, Th2 Th17 (metoda intracelularnog bojenja citokina); određivanje broja ćelija koje luče određene citokine (ELISPOT metoda, vidi Poglavlje 4).

II. Procjena citokina i njihovih antagonista u biološkim medijima tijela.

1. Ispitivanje biološke aktivnosti citokina.

2. Kvantitativno određivanje citokina pomoću ELISA.

3. Imunohistohemijsko bojenje citokina u tkivima.

4. Određivanje omjera suprotnih citokina (pro- i antiinflamatornih), citokina i antagonista citokinskih receptora.

III. Evaluacija ciljne ćelije.

1. Određivanje ekspresije citokinskih receptora na nivou gena i proteinskih molekula (PCR, metoda protočne citometrije).

2. Određivanje signalnih molekula u intracelularnom sadržaju.

3. Određivanje funkcionalne aktivnosti ciljnih ćelija.

Razvijene su brojne metode za procjenu citokinskog sistema kako bi se pružile različite informacije. Među njima se razlikuju:

1) molekularne biološke metode;

2) metode za kvantitativno određivanje citokina imunotestom;

3) ispitivanje biološke aktivnosti citokina;

4) intracelularno bojenje citokina;

5) ELISPOT metoda, koja omogućava detekciju citokina oko jedne ćelije koja proizvodi citokine;

6) imunofluorescencija.

Dajemo kratak opis ovih metoda.

Korišćenjem molekularne biološke metode moguće je proučavati ekspresiju gena citokina, njihovih receptora, signalnih molekula, proučavati polimorfizam ovih gena. Posljednjih godina izveden je veliki broj istraživanja koja su otkrila povezanost između alela varijanti gena molekula citokinskog sistema i predispozicije

na niz bolesti. Proučavanje alelnih varijanti citokinskih gena može pružiti informacije o genetski programiranoj proizvodnji određenog citokina. Najosjetljivija je lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu - PCR-RT (vidi Poglavlje 6). metoda hibridizacije in situ omogućava vam da razjasnite tkivnu i ćelijsku lokalizaciju ekspresije citokinskih gena.

Kvantitativno određivanje citokina u biološkim tečnostima i u kulturama mononuklearnih ćelija periferne krvi pomoću ELISA može se okarakterisati na sledeći način. Budući da su citokini lokalni medijatori, prikladnije je mjeriti njihov nivo u odgovarajućim tkivima nakon ekstrakcije tkivnih proteina ili u prirodnim tečnostima, kao što su suze, ispiranje šupljina, urin, amnionska tečnost, cerebrospinalna tečnost itd. Nivoi citokina u serumu ili drugim tjelesnim tečnostima odražavaju trenutno stanje imunog sistema, tj. sinteza citokina u tjelesnim stanicama in vivo.

Određivanje nivoa proizvodnje citokina mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC) pokazuje funkcionalno stanje ćelija. Spontana proizvodnja MNC citokina u kulturi ukazuje da su ćelije već aktivirane. in vivo. Inducirana (različitim stimulansima, mitogenima) sinteza citokina odražava potencijalnu, rezervnu sposobnost stanica da odgovore na antigenski stimulus (posebno na djelovanje lijekova). Smanjena indukovana proizvodnja citokina može poslužiti kao jedan od znakova stanja imunodeficijencije. Citokini nisu specifični za određeni antigen. Stoga je nemoguća specifična dijagnoza infektivnih, autoimunih i alergijskih bolesti određivanjem nivoa određenih citokina. Istovremeno, procjena nivoa citokina omogućava dobijanje podataka o težini upalnog procesa, njegovom prelasku na sistemski nivo i prognozi, funkcionalnoj aktivnosti ćelija imunog sistema i odnosu Th1 i Th2 ćelija, što je vrlo važno u diferencijalnoj dijagnozi niza infektivnih i imunopatoloških procesa.

U biološkim medijima, citokini se mogu kvantificirati korištenjem niza metode imunotestiranja, korištenjem poliklonskih i monoklonskih antitijela (vidi Poglavlje 4). ELISA vam omogućava da saznate koje su točne koncentracije citokina u bio-

logične telesne tečnosti. ELISA detekcija citokina ima niz prednosti u odnosu na druge metode (visoka osjetljivost, specifičnost, neovisnost od prisustva antagonista, mogućnost preciznog automatiziranog obračuna, standardizacija računovodstva). Međutim, ova metoda ima i svoja ograničenja: ELISA ne karakterizira biološku aktivnost citokina i može dati lažne rezultate zbog unakrsne reakcije epitopa.

biološko testiranje provodi se na osnovu poznavanja osnovnih svojstava citokina, njihovog djelovanja na ciljne stanice. Proučavanje bioloških efekata citokina dovelo je do razvoja četiri tipa testiranja citokina:

1) indukcijom proliferacije ciljnih ćelija;

2) citotoksičnim dejstvom;

3) indukcijom diferencijacije progenitora koštane srži;

4) antivirusnim djelovanjem.

IL-1 je određen stimulirajućim djelovanjem na proliferaciju timocita miša aktiviranih mitogenom in vitro; IL-2 - prema sposobnosti da stimuliše proliferativnu aktivnost limfoblasta; za citotoksične efekte na mišje fibroblaste (L929), testirani su TNFa i limfotoksini. Faktori koji stimulišu kolonije se procjenjuju prema njihovoj sposobnosti da podrže rast progenitora koštane srži kao kolonija na agaru. Antivirusna aktivnost IFN-a je otkrivena inhibicijom citopatskog djelovanja virusa u kulturi diploidnih humanih fibroblasta i tumorske linije mišjih fibroblasta L-929.

Stvorene su ćelijske linije čiji rast zavisi od prisustva određenih citokina. U tabeli. 7.1 je lista ćelijskih linija koje se koriste za testiranje citokina. Prema sposobnosti induciranja proliferacije osjetljivih ciljnih stanica, vrši se biotestiranje IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 itd. Međutim, ove metode ispitivanja nisu previše osjetljivi i informativni. Molekuli inhibitora i antagonista mogu prikriti biološku aktivnost citokina. Neki citokini pokazuju opću biološku aktivnost. Ipak, ove metode su idealne za ispitivanje specifične aktivnosti rekombinantnih citokina.

Tabela 7.1.Ćelijske linije koje se koriste za testiranje biološke aktivnosti citokina

Kraj stola. 7.1

Laboratorija 7-1

Određivanje biološke aktivnosti IL-1 njegovim komitogenim učinkom na proliferaciju timocita miša

Metoda biološkog testiranja IL-1 zasniva se na sposobnosti citokina da stimuliše proliferaciju timocita miša.

IL-1 se može odrediti u kulturi monocita stimuliranih LPS-om, kao iu bilo kojoj tjelesnoj tekućini. Potrebno je obratiti pažnju na niz detalja.

1. Za testiranje se koriste timociti C3H/HeJ miševa stimuliranih na proliferaciju mitogenima (konkanavalin A - ConA i fitohemaglutinin - PHA). C3H/HeJ timociti nisu odabrani nasumično: miševi ove inbred linije ne reaguju na LPS, koji može biti prisutan u test materijalu i uzrokovati proizvodnju IL-1.

2. Timociti reaguju na IL-2 i mitogene, stoga, u preparatima testiranim na IL-1, takođe treba utvrditi prisustvo IL-2 i mitogena.

Operativni postupak

1. Dobiti suspenziju timocita u koncentraciji 12×10 6 /ml medijum RPMI 1640 koji sadrži 10% seruma fetalnih krava i 2-merkaptoetanol (5×10 -5 M).

2. Priprema se serija uzastopnih dvostrukih razblaženja eksperimentalnih (tjelesnih tekućina) i kontrolnih uzoraka. Kao kontrole se koriste biološke tekućine koje sadrže IL-1 ili uzorci dobijeni inkubacijom mononuklearnih ćelija bez LPS-a i laboratorijski standardni preparat koji sadrži IL-1. U pločama sa okruglim dnom sa 96 jažica, 50 µl svakog razblaženja se prenosi u 6 jažica.

3. Dodajte 50 µl prečišćenog PHA (Dobrodošli) rastvorenog u kompletnom mediju u koncentraciji od 3 µg/ml u tri jažice svakog razblaženja i 50 µl medijuma u ostale 3 jažice.

4. Dodajte 50 µl suspenzije timocita u svaku jažicu i inkubirajte 48 sati na 37°C.

6. Pre završetka kultivacije, 50 μl rastvora (1 μCi / ml) [" 3 H]-timidina se doda u jažice i inkubira još 20 sati.

7. Da bi se odredio nivo radioaktivnosti, ćelije kulture se prenose na filter papir pomoću automatskog sakupljača ćelija, filteri se suše i uključivanje etikete se određuje pomoću tečnog scintilacionog brojača.

8. Rezultati su izraženi kao koeficijent stimulacije.

gdje je m cp prosječan broj impulsa u 3 rupe.

Ako timociti reaguju na stimulaciju standardnim IL-1, onda indeks stimulacije testnog uzorka, koji prelazi 3, pouzdano ukazuje na aktivnost IL-1.

Biotest je jedina metoda za procjenu funkcionisanja citokina, ali ovu metodu treba dopuniti različitim tipovima odgovarajućih kontrola za specifičnost korištenjem monoklonskih antitijela. Dodatak određenih monoklonskih antitijela na citokin u kulturi blokira biološku aktivnost citokina, što dokazuje da je signal za proliferaciju ćelijske linije determinirani citokin.

Korištenje biološke analize za otkrivanje interferona. Princip procene biološke aktivnosti IFN-a zasniva se na njegovom antivirusnom učinku, koji je određen stepenom inhibicije reprodukcije test virusa u ćelijskoj kulturi.

U radu se mogu koristiti ćelije osjetljive na djelovanje IFN-a: inicijalno tripsinizirane ćelije fibroblasta pilića i embriona čovjeka, transplantirane ćelije humanih diploidnih fibroblasta i ćelijska kultura miša (L929).

Prilikom procjene antivirusnog djelovanja IFN-a, preporučljivo je koristiti viruse s kratkim ciklusom reprodukcije, visokom osjetljivošću na djelovanje IFN-a: virus mišjeg encefalomijelitisa, mišji vezikularni stomatitis itd.

Laboratorija 7-2

Određivanje aktivnosti interferona

1. Suspenzija diploidnih humanih fetalnih fibroblasta na mediju sa 10% seruma goveđih embriona (koncentracija ćelija - 15-20×10 6 /ml) se sipa u sterilne ploče ravnog dna sa 96 jažica, 100 μl po jažici i stavlja u CO 2 -inkubatoru na temperaturi od 37 °C.

2. Nakon formiranja potpunog monosloja, medij za rast se uklanja iz jažica i u svaku jažicu se dodaje 100 µl medijuma za održavanje.

3. Titracija aktivnosti IFN u ispitivanim uzorcima vrši se metodom dvostrukih razblaženja na monosloju fibroblasta.

Istovremeno sa uzorcima, virus mišjeg encefalomijelitisa (MEM) se unosi u jažice u dozi koja uzrokuje 100% oštećenja ćelija 48 sati nakon infekcije.

4. Jažice sa intaktnim (netretiranim) virusom inficiranim ćelijama se koriste kao kontrole.

Referentni uzorci IFN sa poznatom aktivnošću se koriste kao referentni preparati u svakoj studiji.

5. Ploče za razblaživanje uzoraka se inkubiraju 24 sata na 37°C u atmosferi od 5% CO2.

6. Nivo aktivnosti IFN-a je određen recipročnom vrijednošću maksimalnog razrjeđenja test uzorka, što odgađa citopatsko djelovanje virusa za 50%, a izražava se u jedinicama aktivnosti po 1 ml.

7. Da bi se odredio tip IFN, sistemu se dodaje antiserum protiv IFNα, IFNβ ili IFNγ. Antiserum poništava djelovanje odgovarajućeg citokina, što omogućava identifikaciju tipa IFN-a.

Određivanje biološke aktivnosti migracije inhibitornog faktora. Trenutno su se formirale potpuno nove ideje o prirodi i svojstvima MIT-a, otkrivenog 60-ih godina prošlog stoljeća kao posrednika ćelijskog imuniteta i dugi niz godina ostavljenog bez dužne pažnje (Bloom B.R., Bennet B., 1966; David J.R. , 1966). Tek u posljednjih 10-15 godina postalo je jasno da je MIT jedan od najvažnijih bioloških medijatora u tijelu sa širokim spektrom bioloških funkcija citokina, hormona i enzima. Djelovanje MIF-a na ciljne stanice ostvaruje se preko CD74 - receptora ili neklasičnim putem endocitoze.

MIT se smatra važnim inflamatornim medijatorom koji aktivira funkciju makrofaga (proizvodnja citokina, fagocitoza, citotoksičnost, itd.), kao i endogenim imunoregulatornim hormonom koji modulira aktivnost glukokortikoida.

Akumulira se sve više informacija o ulozi MIT-a u patogenezi mnogih upalnih bolesti, uključujući sepsu, reumatoidni artritis (RA), glomerulonefritis itd. Kod RA je koncentracija MIT-a u tekućini zahvaćenih zglobova značajno povećana. , što je u korelaciji sa težinom bolesti. Pod uticajem MIF-a povećava se proizvodnja proinflamatornih citokina od strane makrofaga i sinovijalnih ćelija.

Postoje različite metode za ispitivanje aktivnosti MIF-a, kada se migrirajuće ćelije (ciljne ćelije za MIF) stavljaju u staklenu kapilaru (kapilarni test), u kap agaroze ili u agaroznu jažicu.

Predstavljamo relativno jednostavnu metodu skrininga zasnovanu na formiranju staničnih mikrokultura (leukocita ili makrofaga) standardne površine i broja ćelija na dnu jažica ploče s ravnim dnom sa 96 jažica, nakon čega slijedi njihova kultivacija u hranjivom mediju. i određivanje promjene područja ovih mikrokultura pod djelovanjem MIF-a (Suslov A.P., 1989).

Laboratorija 7-3

Definicija aktivnosti MIT-a

Određivanje biološke aktivnosti MIF-a vrši se pomoću uređaja za formiranje ćelijskih mikrokultura (slika 7.7) - MIGROSCRIN (Istraživački institut za epidemiologiju i mikrobiologiju nazvan N.F. Gamaleya Ruske akademije medicinskih nauka).

1. U jažice ploče sa 96 jažica (Flow, UK ili slično) dodajte 100 µl uzorka razrijeđenog u mediju kulture, u kojem se određuje MIF aktivnost (svako razrjeđivanje u 4 paralele, eksperimentalni uzorci). Podloga za kulturu uključuje RPMI 1640, 2 mM L-glutamina, 5% fetalnog goveđeg seruma, 40 μg/ml gentamicina.

2. U kontrolne jažice dodati medijum za kulturu (u 4 paralele) 100 µl.

3. Pripremi se ćelijska suspenzija peritonealnih makrofaga za koju se 2 hibridna miša (CBAxC57B1/6) F1 intraperitonealno ubrizgava 10 ml Hankovog rastvora sa heparinom (10 U/ml), stomak se lagano masira 2-3 minuta. . Zatim se životinja zakolje dekapitacijom, trbušni zid se pažljivo probuši u području prepona, a eksudat se aspirira kroz iglu štrcaljkom. Ćelije peritonealnog eksudata se dva puta isperu Hankovom otopinom, centrifugirajući 10-15 minuta na 200 g. Zatim se priprema ćelijska suspenzija sa koncentracijom od 10±1 milion/ml medijuma RPMI 1640. Brojanje se vrši u komori Goryaev.

4. Sastavljen je MIGROSCRIN sistem, koji je postolje za usmjereno i standardno fiksiranje vrhova sa ćelijskim kulturama u strogo vertikalnom položaju na zadatoj visini iznad središta jažice ploče za kulturu sa 96 jažica, a uključuje i 92 vrha. za automatsku pipetu iz Costara, SAD (sl. 7.7).

Umetnite noge stativa u kutne udubine ploče. Suspenzija ćelija se sakuplja automatskom pipetom u vrhove - po 5 μl, ispere se od viška ćelija jednim potapanjem u medijum i ubacuje se vertikalno u utičnice postolja sistema. Napunjeni stalak sa vrhovima drži se na sobnoj temperaturi 1 sat na strogo horizontalnoj površini. Za to vrijeme, ćelije suspenzije se talože na dno jažica, gdje se formiraju standardne ćelijske mikrokulture.

5. Pažljivo uklonite nosač vrhova sa ploče. Ploča sa mikrokulturom ćelija stavlja se u strogo horizontalan položaj u CO 2 inkubator, gde se kultiviše 20 sati.U toku kultivacije ćelije migriraju po dnu bunara.

6. Kvantifikacija rezultata nakon inkubacije vrši se na binokularnoj lupi, vizualno procjenjujući veličinu kolonije na skali unutar okulara. Mikrokulture su oblikovane kao krug. Istraživači zatim određuju prosječni prečnik kolonije iz rezultata mjerenja kolonije u 4 eksperimentalna ili kontrolna bunara. Greška mjerenja je ±1 mm.

Indeks migracije (MI) se izračunava po formuli:

Uzorak ima MIT aktivnost ako su MI vrijednosti jednake

Za konvencionalnu jedinicu (U) aktivnosti MIT-a, inverzna vrijednost se uzima jednaka vrijednosti najvećeg razrjeđenja uzorka (uzorka), pri čemu je indeks migracije 0,6 ± 0,2.

Biološka aktivnost PEOα se procjenjuje po njegovom citotoksičnom efektu na liniju transformiranih fibroblasta L-929. Rekombinantni TNFa se koristi kao pozitivna kontrola, a ćelije u mediju kulture se koriste kao negativna kontrola.

Citotoksični indeks (CI) se izračunava:

Gdje a- broj živih ćelija u kontroli; b- broj živih ćelija u eksperimentu.

Rice. 7.7. Shema MIGROSCRIN - uređaji za kvantitativnu procjenu migracije ćelijskih kultura

Ćelije su obojene bojom (metilensko plavo), koja je uključena samo u mrtve ćelije.

Za konvencionalnu jedinicu aktivnosti TNF-a uzima se vrijednost obrnutog razrjeđenja uzorka, što je neophodno za postizanje 50% ćelijske citotoksičnosti. Specifična aktivnost uzorka je omjer aktivnosti u proizvoljnim jedinicama po 1 ml prema koncentraciji proteina sadržanog u uzorku.

Intracelularno bojenje citokina. Promjena u omjeru stanica koje proizvode različite citokine može odražavati patogenezu bolesti i služiti kao kriterij za prognozu bolesti i evaluaciju terapije.

Metoda intracelularnog bojenja određuje ekspresiju citokina na nivou jedne ćelije. Protočna citometrija vam omogućava da izbrojite broj ćelija koje eksprimiraju određeni citokin.

Nabrojimo glavne korake u određivanju intracelularnih citokina.

Nestimulisane ćelije proizvode male količine citokina, koji se u pravilu ne talože, stoga je važan korak u proceni intracelularnih citokina stimulacija limfocita i blokada oslobađanja ovih produkata iz ćelija.

Kao induktor citokina najčešće se koristi aktivator protein kinaze C forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) u kombinaciji sa kalcijum jonoforom jonomicinom (IN). Upotreba ove kombinacije izaziva sintezu širokog spektra citokina: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. Nedostatak upotrebe FMA-IN je problem detekcije CD4 molekula na površini limfocita nakon takve aktivacije. Takođe, proizvodnja citokina od strane T-limfocita se indukuje korišćenjem mitogena (PGA). B ćelije i monociti stimulišu

Mononuklearne ćelije se inkubiraju u prisustvu induktora proizvodnje citokina i blokatora njihovog intracelularnog transporta, brefeldina A ili monenzina, 2-6 sati.

Ćelije se zatim resuspendiraju u puferskom rastvoru. Za fiksaciju dodati 2% formaldehida, inkubirati 10-15 min na sobnoj temperaturi.

Zatim se ćelije tretiraju saponinom, koji povećava propusnost stanične membrane, i boje se monoklonskim antitijelima specifičnim za citokine koje treba odrediti. Preliminarno bojenje površinskih markera (CD4, CD8) povećava količinu dobijenih informacija o ćeliji i omogućava preciznije određivanje njene populacijske pripadnosti.

Postoje neka ograničenja u primjeni gore opisanih metoda. Stoga je pomoću njih nemoguće analizirati sintezu citokina u jednoj ćeliji, nemoguće je odrediti broj stanica koje proizvode citokine u subpopulaciji, nemoguće je utvrditi da li stanice koje proizvode citokine izražavaju jedinstvene markere, da li različite citokine sintetiziraju različite stanice ili iste. Odgovor na ova pitanja dobija se drugim istraživačkim metodama. Da bi se odredila učestalost ćelija koje proizvode citokine u populaciji, koriste se metoda ograničavanja razblaženja i ELISPOT varijanta enzimskog imunosorbentnog testa (vidi Poglavlje 4).

Metoda hibridizacije in situ. Metoda uključuje:

2) fiksacija paraformaldehidom;

3) detekcija mRNA korištenjem označene cDNK. U nekim slučajevima, mRNA citokina se određuje na rezovima korištenjem radioizotopa PCR.

Imunofluorescencija. Metoda uključuje:

1) zamrzavanje organa i priprema kriostatskih rezova;

2) fiksacija;

3) tretman preseka anti-citokinskim antitelima obeleženim fluoresceinom;

4) vizuelno posmatranje fluorescencije.

Ove tehnike (hibridizacija in situ i imunofluorescencija) su brzi i ne zavise od graničnih koncentracija izlučenog proizvoda. Međutim, oni ne određuju količinu izlučenog citokina i mogu biti tehnički složeni. Neophodan je niz pažljivog praćenja nespecifičnih reakcija.

Koristeći predstavljene metode za procjenu citokina, identifikovani su patološki procesi povezani sa poremećajima u citokinskom sistemu na različitim nivoima.

Stoga je procjena citokinskog sistema izuzetno važna za karakterizaciju stanja imunološkog sistema organizma. Proučavanje različitih nivoa citokinskog sistema omogućava dobijanje informacija o funkcionalnoj aktivnosti različitih tipova imunokompetentnih ćelija, ozbiljnosti upalnog procesa, njegovom prelasku na sistemski nivo i prognozi bolesti.

Pitanja i zadaci

1. Navedite opšta svojstva citokina.

2. Navedite klasifikaciju citokina.

3. Navedite glavne komponente citokinskog sistema.

4. Navedite ćelije koje proizvode citokine.

5. Opišite porodice citokinskih receptora.

6. Koji su mehanizmi funkcionisanja citokinske mreže?

7. Recite nam nešto o proizvodnji citokina u urođenom imunološkom sistemu.

8. Koji su glavni pristupi kompleksnoj proceni citokinskog sistema?

9. Koje su metode za ispitivanje citokina u tjelesnim tečnostima?

10. Koji su defekti citokinskog sistema kod raznih patologija?

11. Koje su glavne metode biološkog ispitivanja IL-1, IFN, MIF, TNFa u biološkim tekućinama?

12. Opišite proces određivanja intracelularnog sadržaja citokina.

13. Opišite proces određivanja citokina koje luči jedna ćelija.

14. Opišite redoslijed metoda koje se koriste za otkrivanje defekta na nivou citokinskog receptora.

15. Opišite redoslijed metoda koje se koriste za otkrivanje defekta na nivou ćelija koje proizvode citokine.

16. Koje informacije se mogu dobiti proučavanjem proizvodnje citokina u kulturi mononuklearnih ćelija, u krvnom serumu?

Citokini uključuju različite proteine ​​s molekularnom težinom od 15-40 kDa, koje sintetiziraju različite stanice u tijelu. Citokini su molekuli koji osiguravaju interakciju ćelija imunog sistema, vaskularnog endotela, nervnog sistema i jetre. Trenutno je poznato više od 200 citokina.

Iste citokine mogu sintetizirati ćelije različitih tipova - imuni sistem, slezina, timus, vezivno tkivo. S druge strane, određena stanica je sposobna proizvesti mnogo različitih citokina. Najveću raznolikost citokina formiraju limfociti, zbog čega limfocitni imunitet stupa u interakciju s drugim imunološkim mehanizmima i sa tijelom u cjelini.

Bitna karakteristika citokina, za razliku od hormona i drugih signalnih molekula, je isti, različit ili čak suprotan rezultat njihovog djelovanja na različite stanice. One. Konačan rezultat uticaja citokina ne zavisi od njegovog tipa, već od unutrašnjeg programa ciljne ćelije, od njenih pojedinačnih zadataka!

Funkcije citokina

Uloga citokina u regulaciji tjelesnih funkcija može se podijeliti u 4 glavne komponente:

1. Regulacija embriogeneze, polaganja i razvoja organa, uključujući i organe imunog sistema.

2. Regulacija procesa rasta tkiva:

3. Regulacija individualnih fizioloških funkcija:

  • osigurava funkcionalnu aktivnost stanica,
  • koordinacija reakcija endokrinog, imunološkog i nervnog sistema,
  • održavanje homeostaze (dinamičke konstantnosti) organizma.

4. Regulacija zaštitnih reakcija organizma na lokalnom i sistemskom nivou:

  • promjene u trajanju i intenzitetu imunoloških odgovora (antitumorska i antivirusna zaštita organizma),
  • modulacija upalnih odgovora,
  • učešće u razvoju autoimunih reakcija.
  • stimulacija ili inhibicija rasta stanica,
  • učešće u procesu hematopoeze.