Funkcije centromera. Metode diobe somatskih i zametnih stanica

Sredinom prošlog stoljeća brojne citološke studije pokazale su odlučujuću ulogu centromera u morfologiji hromozoma. Kasnije je otkriveno da je centromera, zajedno s kinetohorom (struktura koja se sastoji uglavnom od proteina), odgovorna za ispravnu divergenciju hromozoma u ćelije kćeri tokom ćelijske diobe. Vodeća uloga centromere u ovom procesu je očigledna: na kraju krajeva, za nju je vezano vreteno diobe, koje zajedno sa ćelijskim centrima (polovima) čini aparat stanične diobe. Usled ​​kontrakcije niti vretena, hromozomi se tokom deobe pomeraju do polova ćelije.

Obično se opisuje pet faza diobe ćelije (mitoza). Radi jednostavnosti, fokusiraćemo se na tri glavne faze u ponašanju hromozoma ćelije koja se deli (slika 2). U prvoj fazi dolazi do postupnog linearnog skupljanja i zadebljanja hromozoma, zatim se formira vreteno stanične diobe koje se sastoji od mikrotubula. Na drugom, hromozomi se postepeno pomiču prema centru jezgra i nižu se duž ekvatora, vjerovatno da bi se olakšalo vezivanje mikrotubula za centromere. U ovom slučaju, nuklearni omotač nestaje. U posljednjoj fazi, polovice hromozoma - hromatide - divergiraju. Čini se da mikrotubule pričvršćene za centromere, poput poteznice, povlače hromatide do polova ćelije. Od trenutka divergencije, bivše sestrinske hromatide nazivaju se kćerki hromozomi. Dolaze do polova vretena i spajaju se paralelno. Formira se nuklearni omotač.

Rice. 2. Glavne faze mitoze.
S lijeva na desno: zbijanje hromozoma, formiranje fisijskog vretena; poravnanje hromozoma duž ekvatora ćelije,
pričvršćivanje vretena na centromere; kretanje hromatida prema polovima ćelije.

Pažljivim posmatranjem može se vidjeti da je u procesu diobe ćelije u svakom hromozomu centromera u stalnom položaju. Održava blisku dinamičku vezu sa ćelijskim centrom (polom). Podjela centromera se događa istovremeno u svim hromozomima.

Metode sekvenciranja razvijene posljednjih godina omogućile su određivanje primarne strukture DNK proširenih dijelova ljudskih centromera, voćnih mušica Drosophila i biljke Arabidopsis. Pokazalo se da je u kromosomima ljudi i biljaka centromerna aktivnost povezana s blokom tandemski organiziranih ponavljanja (monomera) DNK koji su bliske veličine (170-180 parova nukleotida, bp). Takve regije nazivaju se satelitskom DNK. Kod mnogih vrsta, uključujući i one koje su evolucijski udaljene jedna od druge, veličina monomera je gotovo ista: različite vrste majmuna - 171 bp, kukuruz - 180 bp, riža - 168 bp, kukac Chironomus - 155 bp. Možda ovo odražava opšte zahtjeve potrebne za funkciju centromera.

Unatoč činjenici da je tercijarna struktura centromera čovjeka i Arabidopsis organizirana na isti način, pokazalo se da su primarni nukleotidni nizovi (ili red nukleotida) u njihovim monomerima potpuno drugačiji (slika 3). Ovo je iznenađujuće za regiju hromozoma koja obavlja tako važnu i svestranu funkciju. Međutim, prilikom analize molekularne organizacije centromera u Drosophili, utvrđen je određeni strukturni obrazac, odnosno prisustvo sekcija monomera približno iste veličine. Tako se kod Drosophile centromera X-hromozoma sastoji uglavnom od dva tipa vrlo kratkih jednostavnih ponavljanja (AATAT i AAGAG), prekinutih retrotranspozonima (pokretni DNK elementi) i „ostrvima“ složenije DNK. Svi ovi elementi pronađeni su u genomu Drosophila i izvan centromera, međutim u njima nisu pronađene DNK sekvence karakteristične za svaku centromeru. To znači da centromerne DNK sekvence same po sebi nisu dovoljne i nisu neophodne za formiranje centromera.

Rice. 3. Struktura DNK u ljudskim i biljnim centromerama.

Pravokutnici odgovaraju tandem organiziranim monomerima s identičnom sekvencom nukleotida unutar (primarna struktura DNK). Kod različitih vrsta, primarna struktura DNK monomera se razlikuje, a sekundarna je spirala. Niz monomera odražava strukturnu organizaciju višeg nivoa DNK.

Ovu pretpostavku potvrđuje i manifestacija centromerne aktivnosti izvan normalnih centromera. Takve necentromere se ponašaju kao obične centromere: formiraju citološki prepoznatljivu konstrikciju i formiraju kinetohor koji se vezuje za protein. Međutim, DNK analiza dvije ljudske necentromere i uobičajene centromere nije otkrila zajedničke sekvence, što ukazuje na moguću ulogu drugih strukturnih komponenti hromozoma. Oni mogu biti histonski i nehistonski proteini koji se vezuju za DNK, formirajući nukleosomsku strukturu hromatina.

Funkcionalna uloga centromerne strukture hromatina potvrđuje prisustvo histonskih H3 varijanti specifičnih za svaku biološku vrstu u centromernom hromatinu: kod ljudi se zovu CENP-A, u biljkama - CENH3. Među mnogim proteinima prisutnim u kinetohoru, samo dva, CENH3 i centromerni protein C (CENP-C), vezuju se direktno za DNK. Moguće je da je CENH3, u interakciji sa drugim histonima (H2A, H2B i H4), taj koji formira i određuje tip nukleozoma specifičnih za centromere. Takvi nukleosomi mogu poslužiti kao svojevrsno sidro za formiranje kinetohora. Varijante histona H3 u centromerama različitih vrsta slične su kanonskom H3 molekulu histona na mjestima interakcije sa drugim histonskim proteinima (H2A, H2B, H4). Međutim, mjesto centromernog histona H3, koje je u interakciji s molekulom DNK, očigledno je pod djelovanjem pokretačke selekcije. Kao što je diskutovano, primarna struktura centromerne DNK razlikuje se među vrstama, i sugerirano je da centromerni histon H3 koevoluira sa centromernom DNK, posebno kod Drosophile i Arabidopsis.

Otkriće centromernog histona H3 dovelo je do ekstremne tačke gledišta, prema kojoj je centromerna funkcija i njena potpuna nezavisnost od primarne strukture DNK određena nukleosomskom organizacijom i ovim histonom. Ali da li su ovi faktori dovoljni za punu aktivnost centromera? Modeli koji zanemaruju ulogu primarne strukture DNK moraju pretpostaviti slučajnu raspodjelu promjena u centromernoj strukturi DNK u različitim populacijama u odsustvu selekcije. Međutim, analiza satelitske DNK u ljudskim centromerama i Arabidopsis otkrili su očuvane regije kao i regije s varijabilnosti većom od prosječne, što ukazuje na pritisak selekcije na centromernu DNK. Osim toga, umjetne centromere su dobivene samo s ponavljanjima humanih a-satelita amplificiranih iz prirodnih centromera, ali ne i iz a-satelita pericentromernih regija hromozoma.

Manje je fundamentalnih poteškoća u objašnjavanju modela u kojima je odlučujući faktor u određivanju položaja centromera (koju se čuva iz generacije u generaciju) i njegovih funkcija tercijarna (ili čak višeg reda) struktura DNK. Njegov konzervativizam dozvoljava velike varijacije u sekvenci nukleotida i ne isključuje fino podešavanje primarne strukture.

Henikoff i kolege su predložili model koji opisuje koordiniranu evoluciju DNK i proteina i dovodi do pojave optimalno funkcionalnih centromera na primjeru diobe ženskih zametnih stanica. Kao što znate, u procesu mejoze, jedna roditeljska ćelija daje četiri ćelije kćeri kroz dvije uzastopne diobe. Nakon toga, samo jedna od njih se pretvara u zrelu žensku reproduktivnu ćeliju (gametu), koja prenosi genetske informacije na sljedeću generaciju, dok ostale tri stanice umiru. Prema ovom modelu, u toku evolucije zbog mutacija i drugih mehanizama u hromozomima, centromere sa dužim lancima satelitskih DNK monomera ili sa primarnom nukleotidnom strukturom koja je pogodnija za vezivanje i koordiniran rad sa specifičnim oblicima CENH3 i CENP- C histoni mogu nastati. Istovremeno, kod nekih organizama (arabidopsisa, Drosophila) dobijeni su dokazi o pozitivnom selekcijskom pritisku za CENH3, dok su za druge vrste (žitarice, sisari) za CENP-C (Sl. 4a). Kao rezultat, takve centromere sa poboljšanim kinetohorom postaju „jače“ i mogu pričvrstiti veći broj vretenastih mikrotubula (slika 4b). Ako u gametama ima više takvih “jakih” centromera, tada dolazi do procesa mejotičkog pogona, koji povećava broj takvih centromera i fiksira se nova varijanta u populaciji.

Rice. 4. Model koji objašnjava evoluciju centromera.

Iznad, centromeri (sivi ovali) sadrže specijalizirani skup proteina (kinetohore), uključujući histone CENH3 (H) i CENP-C (C), koji zauzvrat stupaju u interakciju s mikrotubulama vretena (crvene linije). U različitim taksonima, jedan od ovih proteina evoluira adaptivno iu skladu s divergencijom primarne strukture DNK centromera.

Dno – Promjene u primarnoj strukturi ili organizaciji centromerne DNK (tamno sivi oval) mogu stvoriti jače centromere, što rezultira većim pričvršćivanjem mikrotubula.

Komparativna genomika pomaže u razumijevanju mehanizama formiranja i aktivnosti centromernih regija hromozoma. Jedinstven primjer raznolike strukture centromera je hromozom 8 u genomu riže. Zajedno sa ponavljanjem satelitske DNK i retrotranspozonima, sadrži aktivno transkribovane gene; 48 od njih imalo je sekvence sa visokom homologijom sa poznatim proteinima. Ovi nalazi pobijaju mišljenje formirano na osnovu proučavanja centromera ljudi, Drosophila i Arabidopsis da u centromerama nema aktivnih gena.

Ako molekularna struktura centromera različitih eukariotskih vrsta sadrži neke univerzalne karakteristike (organizaciju DNK u obliku tandema, relativno kratkih monomera i hromatinskih proteina specifičnih za ove lokuse), onda je teško identificirati bilo kakve pravilnosti u veličinama ovih regioni. Da, kvasac Saccharomyces cerevisiae segment DNK od 125 bp uzima se kao minimalna funkcionalna centromera, a kod kvasca Schizosaccharomyces pombe mnogo je složeniji i duži (od 40.000 do 120.000 bp) i ima nekoliko nivoa organizacije. Kod ljudi, glavna komponenta hromozomske centromere, a-satelitska DNK, formira dugačke niti tandemski organiziranih monomera (od 250.000 do 4 miliona bp). Među 12 pirinčanih hromozoma u hromozomu 8, dužina lanca sa satelitom CentO je najkraća (~64 hiljade bp); odredio je položaj centromere i njegovu približnu veličinu od 2 miliona bp. Bilo je moguće dobiti kompletnu sekvencu DNK ovog centromernog regiona i odrediti region (~750 hiljada bp) unutar njega, gde se direktno formira kinetohor. Glavni CentO klaster se nalazi u ovoj oblasti.

Iznenađujuća plastičnost centromera, posebno aktivnih gena koji se nalaze u centromeri rižinog hromozoma 8, sugerira odsustvo stroge granice između centromera i ostatka hromozoma, pa čak i mogućnost raštrkane strukture centromernog hromatina. Međutim, nedavno objavljeni podaci o prisutnosti hromatinske barijere između same centromere i pericentromernog heterohromatina u kvascu govore protiv postojanja nekoliko klastera u području suženja hromozoma. Schizosaccharomyces pombe. Barijera je alanin tRNA gen. Brisanje ili modifikacija sekvence barijere dovodi do oslobađanja pericentromernog heterohromatina izvan njegovih uobičajenih granica. Štaviše, odsustvo barijere uzrokuje abnormalnu segregaciju hromozoma tokom mejoze. Naravno, treba imati na umu da se ovi najzanimljiviji rezultati do sada odnose samo na jednu vrstu kvasca.

To su dvolančani, replicirani hromozomi koji se formiraju tokom diobe. Glavna funkcija centromere je da služi kao mjesto vezivanja za vlakna fisionog vretena. Vreteno produžuje ćelije i razdvaja hromozome kako bi se osiguralo da svaki novi dobije tačan broj hromozoma kada se završi ili .

DNK u centromernom području hromozoma sastoji se od gusto zbijene ćelije poznate kao heterohromatin, koja je veoma kompaktna i stoga nije transkribovana. Zbog prisustva heterohromatina, region centromera je obojen bojama tamnijim od ostalih delova hromozoma.

Lokacija

Centromera nije uvijek smještena u središnjem dijelu hromozoma (vidi sliku iznad). Kromosom se sastoji od kratkog kraka (p) i dugog kraka (q), koji se spajaju u centromernom području. Centromere se mogu nalaziti i blizu sredine i na nekoliko pozicija duž hromozoma. Metacentrične centromere se nalaze blizu centra hromozoma. Submetacentrične centromere su pomaknute na jednu stranu od centra, tako da je jedan krak duži od drugog. Akrocentrične centromere se nalaze blizu kraja hromozoma, a telocentrične centromere se nalaze na kraju ili u predelu telomera hromozoma.

Položaj centromera se lako otkriva u ljudskom kariotipu. Hromosom 1 je primjer metacentrične centromere, hromozom 5 je primjer submetacentrične centromere, a hromozom 13 je primjer akrocentrične centromere.

Segregacija hromozoma u mitozi

Prije početka mitoze, stanica ulazi u fazu poznatu kao interfaza, gdje replicira svoju DNK u pripremi za diobu ćelije. Formiraju se sestre koje su povezane na svojim centromerama.

U profazi mitoze, specijalizovane regije na centromerama koje se nazivaju kinetohori vezuju hromozome za vlakna vretena. Kinetohori se sastoje od niza proteinskih kompleksa koji stvaraju kinetohorna vlakna koja se vežu za vreteno. Ova vlakna pomažu u manipulaciji i razdvajanju hromozoma tokom ćelijske diobe.

U fazi metafaze, hromozomi se drže na metafaznoj ploči jednakim silama polarnih vlakana, pritiskajući centromere.

Tokom anafaze, uparene centromere u svakom pojedinačnom hromozomu počinju da se razilaze jedna od druge, jer su prvo centrirane u odnosu na suprotne polove ćelije.

Tokom telofaze, novoformirani hromozomi uključuju odvojene ćerke hromozome. Nakon citokineze formiraju se dva različita.

Segregacija hromozoma u mejozi

U mejozi, stanica prolazi kroz dvije faze procesa diobe (mejoza I i mejoza II). Tokom metafaze I, centromere homolognih hromozoma su orijentisane na suprotne polove ćelija. To znači da će se homologni hromozomi vezati u svojim centromernim regijama za vretenasta vlakna koja se protežu samo od jednog od dva pola ćelije.

Kada se vlakna vretena stežu tokom anafaze I, homologni hromozomi se povlače prema suprotnim polovima ćelije, ali sestrinske hromatide ostaju zajedno. U mejozi II, vlakna vretena koja se protežu od oba ćelijska pola vezuju se za sestrinske hromatide na njihovim centromerama. Sestrinske hromatide se odvajaju u anafazi II kada ih vlakna vretena povlače prema suprotnim polovima. Mejoza rezultira podjelom i distribucijom hromozoma između četiri nove ćelije kćeri. Svaka ćelija sadrži samo polovinu broja hromozoma iz originalne ćelije.

Eukariotski hromozom se drži na mitotičkom vretenu vezivanjem mikrotubula za kinetohor, koji se formira u regionu centromera.

Tipično, centromere sadrže kromatin obogaćen satelitskim DNK sekvencama.

At mitoza sestrinske hromatide migriraju na suprotne polove ćelije. Ovo kretanje nastaje zato što su hromozomi pričvršćeni za mikrotubule, čiji su suprotni krajevi povezani sa polovima. (Mikrotubule su unutarćelijske cilindrične strukture koje se organizuju tokom mitoze da povežu hromozome sa polovima ćelije.)

Lokacije u dva regioni, gdje su krajevi mikrotubula organizirani - u blizini centriola na polovima i na hromozomima - nazivaju se MTC (centri organizacije mikrotubula).

Slika ispod šematski ilustruje proces odvajanja sestrinskih hromatida koji se javlja između metafaze i telofaze mitoze. Područje hromozoma odgovorno za njegovu segregaciju tokom mitoze i mejoze naziva se centromera. Kroz mikrotubule, centromera svake sestrinske hromatide se povlači na suprotne polove i povlači kromosom povezan s njim. Kromosom pruža mehanizam za vezivanje velikog broja gena na aparat za podjelu.

Sadrži web stranica, koji drži sestrinske hromatide zajedno do segregacije pojedinačnih hromozoma. Izgleda kao suženje za koje su pričvršćena sva četiri kraka hromozoma, kao što je prikazano na donjoj slici, koja prikazuje sestrinske hromatide u metafazi.

Centromere potrebna za segregaciju hromozoma. To potvrđuju svojstva hromozoma, čiji je integritet narušen. Kao rezultat prekida, jedan fragment hromozoma zadržava centromeru, dok je drugi, nazvan acentrični, ne sadrži. Acentrični fragment nije u stanju da se pričvrsti za mitotičko vreteno, zbog čega ne ulazi u jezgro ćelije kćeri.

Područja hromozoma, koji flankiraju centromere, obično sadrže , bogate satelitskim sekvencama, i značajnu količinu heterohromatina. Budući da je cijeli mitotički hromozom kondenziran, centromerni heterohromatin je u njemu nevidljiv. Međutim, može se vizualizirati korištenjem tehnike bojenja koja otkriva C-trake. Na slici ispod, tamno obojena regija prisutna je u području svih centromera. Ovaj obrazac se najčešće vidi, iako se heterohromatin možda ne nalazi u području svake centromere. Ovo sugerira da centromerni heterohromatin, očigledno, nije neophodna komponenta mehanizma podjele.

Oblast obrazovanja centromere u hromozomu je određena primarnom strukturom DNK (iako je specifična sekvenca poznata samo za mali broj hromozoma). Centromere DNK veže određene proteine ​​koji formiraju strukturu koja omogućava hromozomima da se vežu za mikrotubule. Ova struktura se zove kinetohor. To je obojena fibrilna struktura prečnika ili dužine od oko 400 nm.

Kinetochore obezbeđuje stvaranje CMTC na hromozomu. Slika ispod pokazuje hijerarhijsku organizaciju vezivanja DNK centromera za mikrotubule. Proteini povezani sa centromernom DNK povezani su sa drugim proteinima, koji su zauzvrat povezani sa mikrotubulama.

Kada sestrinske hromatidne centromere počnu se kretati prema polovima, hromatide ostaju na okupu "lijepljenim" proteinima zvanim kohezini. Prvo se hromatide odvajaju na centromeri, a zatim, u anafazi, kada su kohezini uništeni, potpuno se odvajaju jedna od druge.

Formacija kinetohor , konjugacije homologno hromozoma i uključen je u kontrolu ekspresije gena.

U području centromera sestrinske hromatide su povezane u profazi i metafazi. mitoza i homologni hromozomi u profazi i metafazi prve podjele mejoza. Na centromerima dolazi do formiranja kinetohora: proteini koji se vezuju za centromere formiraju tačku vezivanja za mikrotubule fisiono vreteno u anafazi i telofazi mitoze i mejoze.

Odstupanja od normalnog funkcioniranja centromera dovode do problema u međusobnom rasporedu hromozoma u jezgri koja dijeli, a kao rezultat toga i do poremećaja u procesu segregacije hromozoma (njihova distribucija između ćelija kćeri). Ova kršenja vode do aneuploidijašto može imati ozbiljne posljedice (npr. down sindrom kod ljudi, povezan sa aneuploidijom (trizomijom) na 21. hromozomu).

Centromerni niz

Kod većine eukariota, centromera nema specifičnu, koja joj odgovara nukleotidna sekvenca. Obično se sastoji od velikog broja ponavljanja DNK (npr. satelitske DNK) u kojima je sekvenca unutar pojedinačnih ponavljajućih elemenata slična, ali ne i identična. Kod ljudi se glavna ponavljajuća sekvenca naziva α-satelit, ali postoji nekoliko drugih tipova sekvenci u ovoj regiji. Međutim, utvrđeno je da nema dovoljno ponavljanja α-satelita za formiranje kinetohora, te da su poznate funkcionalne centromere koje ne sadrže α-satelitnu DNK.

Nasljedstvo

U određivanju lokacije centromere kod većine organizama značajnu ulogu igra epigenetsko nasleđe. Kćerki hromozomi formiraju centromere na istim mestima kao i majčinski hromozom, bez obzira na prirodu sekvence koja se nalazi u regionu centromera. Pretpostavlja se da mora postojati neki primarni način da se odredi lokacija centromere, čak i ako je njena lokacija naknadno određena epigenetskim mehanizmima.

Struktura

Obično je predstavljena centromerna DNK heterohromatin, što je neophodno za njen rad. U ovom hromatinu, normalno histon H3 je zamijenjen histonom CENP-A specifičnim za centromere (CENP-A je karakterističan za pekarski kvasac S.cerevisiae, ali izgleda da su slični specijalizovani nukleosomi prisutni u svima eukariotskićelije). Smatra se da je prisustvo CENP-A potrebno za sklapanje kinetohora na centromeri i može igrati ulogu u epigenetskom nasljeđivanju lokacije centromera.

U nekim slučajevima, na primjer, u nematodi Caenorhabditis elegans , y Lepidoptera, a u nekim biljkama i hromozomi holocentričan. To znači da hromozom nema karakteristiku primarna konstrikcija- specifično mjesto za koje su pretežno pričvršćene mikrotubule fisijskog vretena. Kao rezultat toga, kinetohor je difuzne prirode, a mikrotubule se mogu pričvrstiti duž cijele dužine hromozoma.

aberacije centromera

U nekim slučajevima, osoba je primijetila formiranje dodatnih neocentromere. Ovo se obično kombinuje sa inaktivacijom stare centromere, pošto dicentrično hromozomi (hromozomi sa dve aktivne centromere) se obično uništavaju tokom mitoze.

U nekim neuobičajenim slučajevima zabilježeno je spontano formiranje necentromera na fragmentima dezintegrisanih hromozoma. Neke od ovih novih pozicija su izvorno bile euhromatin i uopće nisu sadržavale alfa satelitsku DNK.