Svrha PCR-a i princip metode. Lančana reakcija polimeraze (PCR) i njena primjena

SEI HPE „Državna medicinska akademija Krasnojarsk

nazvan po Yasenetsky Federalnoj agenciji za zdravstvo i društveni razvoj »

Zavod za medicinsku genetiku i kliničku neurofiziologiju, IPO

GLAVNI PRINCIPI METODE

POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA

Metodički priručnik za studente 3-4 predmeta

na specijalnostima opšte medicine (060101) i

Krasnojarsk - 2007

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Osnovni principi metode polimerazne lančane reakcije. Metodički priručnik za vannastavni rad studenata 3-4 smera na specijalnostima opšte medicine (060101) i pedijatrije (060103). - Krasnojarsk: Izdavačka kuća GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42 str.

Metodološki priručnik u potpunosti je u skladu sa zahtjevima Državnog standarda (2000) i odražava glavne aspekte moderne metode dijagnosticiranja nasljednih bolesti ljudi - metodu lančane reakcije polimeraze, obrazovni materijal je prilagođen obrazovnim tehnologijama, uzimajući u obzir specifičnosti. obuke na 3-4 kursa medicinskih i pedijatrijskih fakulteta.

Recenzenti:Šef Katedre za medicinsku genetiku Državne obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja

„Novosibirski državni medicinski univerzitet Federalne agencije za zdravstvo i socijalni razvoj“, doktor medicinskih nauka, profesor;

DNK replikacija

Predmet proučavanja ove metode je deoksiribonukleinska kiselina (DNK). DNK je univerzalni nosilac genetskih informacija u svim organizmima koji postoje na Zemlji (s izuzetkom mikroorganizama koji sadrže RNK). DNK je dvostruki lanac uvijen u spiralu. Svaki lanac se sastoji od nukleotida povezanih u nizu. Lanci DNK imaju suprotan smjer: 5'-kraj jednog lanca odgovara 3'-kraju drugog lanca. Jedinstveno svojstvo DNK je njegova sposobnost da se umnožava. Ovaj proces se zove replikacija. Replikacija molekula DNK događa se tokom sintetičkog perioda interfaze. Svaki od dva lanca "roditeljskog" molekula služi kao šablon za "ćerku". Nakon replikacije, novosintetizovana molekula DNK sadrži jedan "majčin" lanac, a drugi - "kćerku", novosintetizovanu (polukonzervativna metoda). Za sintezu nove DNK molekule potrebno je da stari molekul bude despiralizovan i rastegnut. Replikacija počinje na nekoliko lokacija u molekuli DNK. Zove se dio molekule DNK od početka jedne replikacije do početka druge replicon.

Početak replikacije je aktiviran prajmeri(sjeme), koji se sastoji od 100-200 baznih parova. Enzim DNK helikaza odmotava i razdvaja matičnu spiralu DNK u dva lanca, na kojima se, po principu komplementarnosti, uz učešće enzima DNK polimeraze, sklapaju „ćerki“ DNK lanci. Da bi enzim započeo svoj rad, potrebno je prisustvo startnog bloka - malog početnog dvolančanog fragmenta. Početni blok se formira kada prajmer stupi u interakciju sa komplementarnim regionom odgovarajućeg lanca roditeljske DNK. U svakom replikonu, DNK polimeraza se može kretati duž "majčinskog" lanca u samo jednom smjeru (5`=>3`).

Na vodećim pramenovima, kako se replikon odmotava, "kćerka" lanac postepeno kontinuirano raste. Na zaostalom lancu, lanac kćer se takođe sintetiše u pravcu (5`=>3`), ali u odvojenim fragmentima kako se replikon odmotava.

Dakle, vezanje komplementarnih nukleotida lanaca "ćerke" ide u suprotnim smjerovima (antiparalelno). Replikacija u svim replikonima se dešava istovremeno. Fragmenti i dijelovi "kćeri" lanaca sintetizirani u različitim replikonima su vezani u jedan lanac pomoću enzima ligaze. Replikaciju karakterizira polukonzervacija, antiparalelizam i diskontinuitet. Cijeli genom ćelije replicira se jednom u vremenskom periodu koji odgovara jednom mitotskom ciklusu. Kao rezultat procesa replikacije, iz jednog molekula DNK formiraju se dva molekula DNK, pri čemu je jedan lanac od roditeljskog molekula DNK, a drugi, kćerka, je novosintetiziran (slika 1).

Rice. 1. Dijagram replikacije molekula DNK.

Dakle, ciklus replikacije DNK uključuje tri glavne faze:

1. odmotavanje spirale DNK i divergencija lanaca (denaturacija);

2. pričvršćivanje prajmera;

3. završetak lanca podređene niti.

Princip PCR metode

Replikacija DNK je bila osnova PCR-a. U PCR-u se gore navedeni procesi izvode u epruveti u cikličnom režimu. Prijelaz iz jedne faze reakcije u drugu postiže se promjenom temperature inkubacione smjese. Kada se rastvor zagreje na 93-95°C, dolazi do denaturacije DNK. Za nastavak na sljedeći korak - dodavanje ili "žarenje" prajmera - smjesa za inkubaciju se ohladi na 50-65°C. Zatim se smeša zagreva na 70-72°C - što je optimalan rad taq-DNK polimeraze - u ovoj fazi se završava nova DNK lanca. Zatim se ciklus ponovo ponavlja. Drugim riječima PCR metoda je višestruko povećanje broja kopija (pojačanje) specifičan dio DNK koji katalizira enzim DNK polimeraza.

Produženje lanca DNK kćeri mora se dogoditi istovremeno na oba lanca DNK majke, tako da replikacija drugog lanca također zahtijeva vlastiti prajmer. Tako se u reakcionu smjesu uvode dva prajmera: jedan za "+"-lanac, drugi za "-"-lanac. Nakon spajanja suprotnih lanaca molekule DNK, prajmeri se ograničavaju na taj njen dio, koji će se naknadno više puta udvostručiti ili pojačati. Dužina takvog fragmenta, koji se naziva amplikon, obično je nekoliko stotina nukleotida.

PCR koraci

Svaki ciklus pojačanja uključuje 3 stupnja koji se javljaju pri različitim temperaturnim uslovima (slika 2).

· 1. faza: Denaturacija DNK . Teče na 93-95° u trajanju od 30-40 sekundi.

· 2. faza: prajmer žarenje . Pričvršćivanje prajmera se dešava komplementarno odgovarajućim sekvencama na suprotnim lancima DNK na granicama određenog mesta. Svaki par prajmera ima svoju temperaturu žarenja, čije su vrijednosti u rasponu od 50-65°C. Vrijeme žarenja 20-60 sek.

· Faza 3: produžetak DNK lanaca Komplementarno produženje DNK lanaca se dešava od 5" kraja do 3" kraja lanca u suprotnim smerovima, počevši od mesta vezivanja prajmera. Materijal za sintezu novih lanaca DNK su deoksiribonukleozid trifosfati dodani u otopinu. Proces sinteze katalizira enzim taq-polimeraza i odvija se na temperaturi od 70-72°C. Vrijeme sinteze - 20-40 sek.

Novi DNK lanci formirani u prvom ciklusu amplifikacije služe kao šabloni za drugi ciklus amplifikacije, u kojem se formira specifični amplikonski DNK fragment (slika 3). U narednim ciklusima amplifikacije, amplikoni služe kao šablon za sintezu novih lanaca.

Dakle, dolazi do akumulacije amplikona u otopini prema formuli 2", gdje je n broj ciklusa amplifikacije. Prema tome, čak i ako je samo jedan dvolančani molekul DNK u početku bio u početnoj otopini, tada oko 108 molekula amplikona akumuliraju se u rastvoru za 30-40 ciklusa.Ova količina je dovoljna za pouzdanu vizuelnu detekciju ovog fragmenta elektroforezom u agaroznom gelu.

Proces pojačanja se izvodi u posebnom programabilnom termostatu ( biciklista), koji prema datom programu automatski mijenja temperature prema broju ciklusa pojačanja.

Za pojačanje su potrebne sljedeće komponente:

· DNK šablon(DNK ili njen dio koji sadrži željeni specifični fragment);

· Prajmeri(sintetski oligonukleotidi (20-30 parova nukleotida) komplementarni DNK sekvencama na granicama specifičnog fragmenta koji se utvrđuje). Odabir specifičnog fragmenta i odabir prajmera igraju veliku ulogu u specifičnosti amplifikacije, što utiče na kvalitet analize.

· Smjesa deoksinukleotid trifosfata (dNTP)(mješavina četiri dNTP-a, koji su materijal za sintezu novih komplementarnih DNK lanaca u ekvivalentnim koncentracijama od 200-500 mikrona)

· EnzimTaq-polimeraza(termostabilna DNK polimeraza, koja katalizuje produžavanje lanaca prajmera uzastopnim dodavanjem nukleotidnih baza rastućem lancu sintetizovane DNK, 2-3 mm).

· puferski rastvor(reakcioni medij koji sadrži jone Mg2+ neophodne za održavanje aktivnosti enzima, PH 6,8-7,8).

Da bi se odredili specifični regioni genoma RNK virusa, prvo se dobije kopija DNK iz RNA šablona koristeći reakciju reverzne transkripcije (RT) koju katalizira enzim reverzna transkriptaza (reverzna transkriptaza).

Rice. 2. Amplifikacija (1. ciklus).

Rice. 3. Amplifikacija (2. ciklus).

Glavne primjene PCR-a

klinička medicina:

o dijagnoza infekcija,

o otkrivanje mutacija, uključujući dijagnozu nasljednih bolesti,

o genotipizacija, uključujući HLA genotipizaciju,

o ćelijske tehnologije

ekologija (kao način praćenja stanja i kvaliteta ekoloških objekata i hrane)

definicija transgenih organizama (GMO)

Lična identifikacija, očinstvo, forenzika

opšta i posebna biologija,

Osnovni principi

organizacija dijagnostičkih laboratorija

Rad u PCR laboratoriji odvija se u skladu sa „Pravilima za projektovanje, bezbednost, industrijsku sanitaciju, protivepidemijski režim i ličnu higijenu pri radu u laboratorijama (odeljenjima, odeljenjima) sanitarno-epidemioloških ustanova zdravstvenog sistema.

Kontaminacija DNK uzoraka

Provođenje PCR dijagnostike povezano je s problemom uzrokovanim visokom osjetljivošću metode – mogućnošću kontaminacije. Ako količine pozitivne DNK u tragovima uđu u reakcionu epruvetu (specifični proizvodi amplifikacije DNK - amplikoni; DNK standard koji se koristi kao pozitivna kontrola; pozitivna DNK kliničkog uzorka) dovodi do amplifikacije specifičnog DNK fragmenta tokom PCR-a i, kao rezultat, do pojava lažno pozitivnih rezultata.

U toku rada možete se sresti dvije vrste kontaminacije:

1. unakrsna kontaminacija od uzorka do uzorka (tokom obrade kliničkih uzoraka ili prilikom vađenja reakcione smjese), što dovodi do pojave sporadičnih lažno pozitivnih rezultata;

2. kontaminacija proizvoda amplifikacije(amplikoni), što je od najvećeg značaja, jer se tokom PCR procesa amplikoni nakupljaju u ogromnim količinama i idealni su proizvodi za reamplifikaciju.

Kontaminacija u tragovima amplikona posuđa, automatskih pipeta i laboratorijske opreme, površine laboratorijskih stolova, pa čak i površine kože laboratorijskih radnika dovodi do pojave sistematskih lažno pozitivnih rezultata. Utvrđivanje izvora kontaminacije može biti vrlo teško i zahtijeva značajno ulaganje vremena i novca. Dosadašnje iskustvo u radu laboratorija koje koriste PCR metodu za dijagnostiku omogućava nam da formulišemo osnovne zahtjeve za organizaciju takvih laboratorija i izvođenje samih analiza. Usklađenost sa ovim zahtjevima eliminira mogućnost kontaminacije i dobivanja lažno pozitivnih rezultata.

Faze PCR analize

Geografski odvojeni, raspoređeni u odvojene prostorije (slika 4.5):

· Pre-PCR soba, gdje se vrši obrada kliničkih uzoraka, ekstrakcija DNK, priprema reakcione smjese za PCR i PCR (ako postoje uslovi, preporučuje se i posljednja dva koraka da se izvedu u dodatnoj zasebnoj prostoriji). U ovim prostorijama zabranjeno je obavljanje svih drugih vrsta radova sa ispitivanim agensima, čija se PCR dijagnostika obavlja u ovoj laboratoriji.

· Post-PCR soba, gdje se vrši detekcija produkata amplifikacije. U ovoj prostoriji mogu se koristiti i druge metode detekcije. Poželjno je locirati prostoriju za detekciju produkata amplifikacije što je dalje moguće od pre-PCR prostorija.

Radne prostorije su opremljene ultraljubičastim lampama sa maksimalnim zračenjem u području od 260 nm (tip DB-60) po stopi od 2,5 W po 1 m3. Lampe su postavljene tako da su površine radnih stolova, opreme i materijala sa kojima operater dolazi u kontakt tokom PCR analize izložene direktnom zračenju. Ozračenje se vrši u roku od 1 sata prije početka rada i 1 sat nakon završetka rada.

Laboranti rade u specijalnoj laboratorijskoj odjeći, koja se mijenja pri prelasku iz jedne prostorije u drugu, te u jednokratnim rukavicama. Obrada odjeće iz različitih prostorija vrši se odvojeno. Različiti zaposlenici rade u različitim fazama PCR analize.

Za rad se koriste odvojeni setovi dozatora, plastičnog i staklenog posuđa, laboratorijske opreme, mantila i rukavica, dizajniranih za različite faze analize i nisu prenosivi iz jedne prostorije u drugu. Oprema, materijal i inventar u svakoj prostoriji su označeni na odgovarajući način.

Sve faze rada se izvode samo uz upotrebu potrošnog materijala za jednokratnu upotrebu: vrhova za automatske pipete, epruvete, rukavice itd. Obavezno promijenite vrhove kada prelazite s uzorka na uzorak. Neophodno je koristiti vrhove sa filterom za aerosolnu barijeru kako bi se spriječilo da mikrokapljice otopine uđu u pipetu. Upotrijebljene epruvete i vrhovi se bacaju u posebne posude ili posude u kojima se nalazi otopina za dezinfekciju. Klinički uzorci se čuvaju odvojeno od reagensa.

Za obradu i čišćenje radnog mesta svaka prostorija ima štapiće od pamučne gaze (salvete), pincete, dezinfekciona i inaktivirajuća rastvora.

U PCR dijagnostičkoj laboratoriji isključeni su poslovi vezani za proizvodnju (kloniranje) i izolaciju rekombinantnih plazmida koji sadrže sekvence DNK ili fragmente gena patogena koji se dijagnosticiraju u ovoj laboratoriji.

Prikupljanje kliničkog materijala

Materijal koji se proučava za PCR može biti struganje epitelnih ćelija, krvi, plazme, seruma, pleuralne i cerebrospinalne tečnosti, urina, sputuma, sluzi i drugih bioloških sekreta, uzorci biopsije.

Uzorkovanje materijala vrši se u uslovima prostorije za tretman odgovarajućeg profila. Nakon uzorkovanja, uzorke treba odnijeti u PCR dijagnostičku laboratoriju što je prije moguće.

Uzorkovanje se mora obaviti pomoću sterilnih, po mogućnosti za jednokratnu upotrebu, instrumenata samo u jednokratnim sterilnim plastičnim epruvetama ili staklenim epruvetama, prethodno tretiranih sat vremena mješavinom hroma, temeljito ispranim destilovanom vodom i kalciniranim u pećnici na temperaturi od 150°C za 1 sat.

Zona detekcije (drugi sprat ili druga zgrada).

Rice. 4. PCR laboratorijski uređaj sa detekcijom elektroforezom.

Zona detekcije (različiti sprat ili zgrada)

Rice. 5. PCR laboratorijski uređaj sa fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza).

Rice. 6. Soba za ekstrakciju DNK. Prikazana je stolna kutija sa baktericidnom lampom.

Rice. 7. amplification room.

Rice. 8. Soba za detekciju.

Rice. 9. Uzorci krvi za DNK dijagnostiku nasljednih bolesti.

Čuvanje i transport uzoraka

Za dijagnozu nasljednih bolesti, uzorci krvi se čuvaju na posebnim papirnim formularima ili u epindorfima (plastične epruvete) u zamrznutom stanju duže vrijeme (slika 9).

Za dijagnozu zaraznih bolesti, uzorci se drže na sobnoj temperaturi ne duže od 2 sata. Ako je potrebno duže skladištenje, uzorci se mogu staviti u frižider na temperaturu od 2-8°C na period ne duži od 24 sata. Duže skladištenje (do 2 sedmice) je prihvatljivo kada se zamrzne u zamrzivaču na temperaturi od minus 20°C. Ponovljeno zamrzavanje-odmrzavanje uzoraka nije dozvoljeno.

Ako su PCR dijagnostička laboratorija i prostorija za uzimanje uzoraka teritorijalno odvojeni, onda uzorke treba transportovati u termosama ili termalnim kontejnerima u skladu sa pravilima čuvanja uzoraka i pravilima transporta infektivnih materijala.

Ekstrakcija DNK iz uzoraka

Metoda sorpcije u čvrstoj fazi, koja se sastoji u dodavanju sredstva za lizu koji sadrži otopinu gvanidina, sorpciji DNK na sorbentu, ponovljenom ispiranju i resorpciji DNK puferskom otopinom, postala je široko rasprostranjena. U slučaju obrade seruma, plazme ili pune krvi, obično se koristi metoda fenolne ekstrakcije. Metoda uključuje deproteinizaciju fenolom/kloroformom nakon čega slijedi precipitacija DNK (ili RNK) etanolom ili izopropanolom. Obrada se vrši u mikrocentrifugalnim epruvetama tipa Eppendor P zapremine 1,5 ml. Vrijeme obrade je 1,5-2 sata (slika 10).

Rice. 10. Izolacija DNK.

Provođenje PCR

Određena količina uzorka iz obrađenog kliničkog uzorka prenosi se u specijalnu epruvetu tipa Eppendorf za mikrocentrifugu zapremine 0,2 ili 0,5 ml. U nju se dodaje mešavina za amplifikacija koja se sastoji od vode, PCR pufera, dNTP rastvora, rastvora prajmera i rastvora. ista epruveta Taq-polimeraza (dodata poslednja u smešu) Tipično, zapremina reakcione smeše je 25 µl Zatim se u svaku epruvetu doda jedna kap mineralnog ulja da bi se sprečilo isparavanje reakcione smeše tokom amplifikacije. Epruvete se prenose u programabilni termostat (pojačalo), pri čemu se pojačavanje vrši u automatskom režimu prema datom programu (slika 11).

Rice. jedanaest. Pojačalo" Thermocycler ».

Vrijeme reakcije, ovisno o zadatom programu, je 2-3 sata. Paralelno sa eksperimentalnim uzorcima postavljaju se kontrolni uzorci: pozitivna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto materijala kliničkog uzorka uvodi kontrolni DNK preparat ispitivanog gena. Negativna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto kliničkog materijala ili DNK preparata dodaje odgovarajuća količina deionizirane vode ili ekstrakta koji ne sadrži proučavani DNK. Negativna kontrola je neophodna kako bi se provjerili komponente reakcije na odsustvo DNK u njima zbog kontaminacije i da bi se isključili lažno pozitivni rezultati.

Registracija rezultata

Amplificirani specifični DNK fragment se detektuje elektroforezom u agaroznom gelu u prisustvu etidijum bromida. Etidijum bromid formira stabilno intersticijalno jedinjenje sa fragmentima DNK, koje se pojavljuje kao svetleće trake kada je gel zračen UV zračenjem talasne dužine 290-330 nm. U zavisnosti od veličine dobijenih PCR amplikona, koristi se gel koji sadrži 1,5% do 2,5% agaroze. Za pripremu agaroznog gela, mješavina agaroze, pufera i vode se otopi u mikrovalnoj pećnici ili u vodenom kupatilu i doda se otopina etidijevog bromida. Ohlađena na 50-60°C, smjesa se ulijeva u kalup sa slojem debljine 4-6 mm, a posebnim češljevima izrađuju se džepovi u gelu za nanošenje uzorka. Češljevi su postavljeni tako da između dna jažica i baze gela ostane sloj agaroze od 0,5-1 mm. Nakon što se gel stvrdne, na džepove se nanosi amplifikat u količini od 5-15 µl. Preporučuje se izvođenje elektroforeze mješavine markera dužine DNK fragmenta paralelno s kontrolnim i eksperimentalnim uzorcima. Tipično, takva mješavina sadrži deset fragmenata DNK 100, 200, 300 itd. dugih parova baza.

Postavljanje takvog uzorka omogućava vam da provjerite dužinu amplikona u kontrolnim i eksperimentalnim uzorcima. Gel sa nanesenim uzorkom se prenosi u komoru za elektroforezu napunjenu puferom, komora se povezuje na izvor napajanja i vrši se elektroforetsko odvajanje produkata amplifikacije 30-45 minuta pri jačini električnog polja od 10-15. V/cm. U tom slučaju, prednji dio boje, koji je dio reakcijske smjese, mora proći najmanje 3 cm.

Nakon završetka elektroforeze, gel se prenosi na staklo transiluminatora i gleda u ultraljubičastom svjetlu. Za dokumentaciju, gel se fotografiše na filmu Mikrat 300 ili snima pomoću video sistema spojenog na računar.

Kontrolni uzorci se prvo procjenjuju. U elektroforetskoj traci koja odgovara pozitivnoj kontroli, treba biti prisutna narandžasta svjetleća traka. Njegova elektroforetska pokretljivost treba odgovarati dužini amplikona navedenoj u uputama.

U elektroforetskoj stazi koja odgovara negativnoj kontroli, takva traka bi trebala biti odsutna. Prisustvo takve trake u negativnoj kontroli ukazuje na kontaminaciju – kontaminaciju reagensa korištenih sa proučavanom DNK ili amplikonom. Ispitni uzorci se procjenjuju prisustvom trake u dotičnoj traci koja se nalazi na istom nivou kao i traka u uzorku pozitivne kontrole. Intenzitet sjaja trake odgovara količini DNK koja se proučava u uzorku, što omogućava polukvantitativnu procjenu PCR-a. Obično se pozitivni rezultati vrednuju na skali od četiri stepena. Ako je sjaj trake u eksperimentalnom uzorku vrlo slab, onda takav uzorak treba preurediti (slika 12).

Rice. 12. Elektroforeza u agaroznom gelu.

PCR aplikacije zadijagnostika tačkastih mutacija i polimorfizama gena

Jedno od vodećih područja primjene PCR-a u praktičnoj zdravstvu je dijagnostika točkastih mutacija i polimorfizama gena. . Postoje direktne i indirektne metode DNK dijagnostike. U onim situacijama kada je poznat gen čije oštećenje dovodi do razvoja nasljedne bolesti, ovo oštećenje se može otkriti molekularno genetskim metodama. Takve metode se nazivaju direktnim. Direktnim metodama otkrivaju se poremećaji u primarnoj sekvenci nukleotida DNK (mutacije i njihovi tipovi). Direktne metode karakteriziraju preciznost koja dostiže gotovo 100%.

Međutim, u praksi se ove metode mogu primijeniti pod određenim uvjetima.:

s poznatom citogenetskom lokalizacijom gena odgovornog za razvoj nasljedne bolesti;

Gen bolesti mora biti kloniran i poznata njegova nukleotidna sekvenca.

Cilj direktne DNK dijagnostike je identifikacija mutantnih alela.

Tako se u onim situacijama kada se zna kakvo oštećenje DNK dovodi do nasljedne bolesti, direktno se ispituje DNK fragment koji sadrži oštećenje, odnosno koristi se direktna metoda DNK dijagnostike.

Međutim, do danas geni mnogih bolesti nisu mapirani, njihova egzon-intronska organizacija je nepoznata, a mnoge nasljedne bolesti karakterizira izražena genetska heterogenost, što ne dopušta puno korištenje direktnih DNK dijagnostičkih metoda. Stoga, u slučajevima kada lokalizacija oštećenja nije poznata, koristi se drugačiji pristup, povezan sa proučavanjem blizine gena odgovornog za bolest gena, u kombinaciji sa porodičnom analizom, odnosno indirektnim metodama molekularne genetičke dijagnoze. koriste se nasljedne bolesti.

Različite metode se mogu koristiti za otkrivanje točkastih mutacija i malih delecija, ali sve se temelje na korištenju PCR metode. Ova reakcija vam omogućava da više puta umnožavate nukleotidnu sekvencu DNK, a zatim tražite mutacije. Metode za traženje fragmenata DNK koji nose mutacije zasnivaju se na komparativnoj analizi mutantnih i normalnih DNK nukleotidnih sekvenci.

Analiza PCR proizvoda

u procesu direktne DNK dijagnostike

Uključuje proučavanje specifičnih karakteristika amplificiranog područja gena. Dakle, kod bolesti uzrokovanih ekspanzijom trinukleotidnih ponavljanja, proizvodi amplifikacije se razlikuju po dužini (što odražava različit broj tripleta u proučavanom genskom području) i, kao rezultat, po brzini kretanja u gelu. Zbog toga se postiže jasno elektroforetsko razdvajanje normalnih i mutantnih alela i precizno određivanje patološki izduženog fragmenta, odnosno DNK dijagnoza bolesti (Sl. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Rice. 14. Dijagnoza brisanja GAG u genu DYT 1 kod pacijenata sa dopa nezavisnom distonijom (elektroforeza na poliakrilamidnom gelu). Staze 2,3,6 - bolesni; trake 1,4,5 - kontrola. Tanka strelica označava normalni alel, podebljana strelica označava mutantni kraći alel (brisanje tri nukleotida).

Ako je DNK regija koja se proučava u potpunosti uključena u proširenu deleciju, tada PCR amplifikacija DNK iz ovog izbrisanog alela neće biti provedena zbog nedostatka mjesta za hibridizaciju prajmera. U ovom slučaju će se dijagnosticirati homozigotna delecija na temelju potpunog odsustva PCR produkta reakcije (sinteza DNK je nemoguća iz obje kopije gena). S heterozigotnom delecijom moguće je otkriti PCR proizvod sintetiziran iz normalnog (sigurnog) alela, međutim, za pouzdanu dijagnozu takve mutacije potrebno je koristiti sofisticiranije metode vizualizacije DNK koje omogućavaju procjenu doze konačnog PCR proizvod.

Za otkrivanje tačkastih mutacija (najčešće supstitucije nukleotida) na određenim mjestima koristi se PCR metoda u kombinaciji s drugim metodama molekularno-genetičke analize. Ako su lokacija i priroda predložene točkaste mutacije precizno poznate, onda za namjerno otkrivanje takve mutacije, restrikcijske endonukleaze (restriktaze) su posebni stanični enzimi izolirani iz različitih sojeva bakterija.

Ovi enzimi prepoznaju specifične nukleotidne sekvence u rasponu od četiri do deset nukleotida u dužini. Zatim sprovode restrikciju (lat. (presijecanje) ovih sekvenci kao dijela dvolančane DNK molekule. Svaki restrikcijski enzim prepoznaje i na fiksnom mjestu seče strogo definiranu, specifičnu nukleotidnu sekvencu - restriktivno mjesto (mjesto za prepoznavanje).

U slučajevima kada tačkasta mutacija promijeni prirodno mjesto prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim, taj enzim neće moći odcijepiti mutantni fragment amplificiran PCR-om. U nekim slučajevima, mutacija dovodi do pojave novog mjesta prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim, koji je odsutan u normi.

U obje situacije, mutantni i normalni PCR produkti tretirani odabranim restrikcijskim enzimom dat će restrikcijske fragmente različite dužine, koji se mogu lako detektirati elektroforezom (slika 15).

Dakle, ako je potrebno brzo otkriti bilo koju određenu točkastu mutaciju, zadatak se svodi na traženje odgovarajućeg restrikcijskog enzima čije je mjesto prepoznavanja lokalizirano na mjestu poremećene sekvence nukleotida. Tretman PCR proizvoda ovim restrikcijskim enzimom omogućit će laku diferencijaciju normalnih i mutantnih alela. Restrikciona analiza uvelike pojednostavljuje otkrivanje poznatih tačkastih mutacija i trenutno se široko koristi za direktnu DNK dijagnozu nasljednih bolesti.

završna faza molekularna genetska analiza mutacija je određivanje nukleotidne sekvence proučavanog DNK fragmenta (sekvenciranje), koja se upoređuje sa normom i formuliše konačna genetska dijagnoza. Zahvaljujući napretku u molekularnoj genetici, DNK dijagnostičke metode su sada razvijene za više od 400 nasljednih bolesti.

Rice. 15. Detekcija tačkaste mutacije pomoću restrikcijske analize: A - amplifibilna regija gena koja sadrži restrikcijsko mjestoAGCTza restrikcijsku endonukleazuAlu I. MutacijaG→ Amijenja ovu nukleotidnu sekvencu, što rezultira restrikcijskim enzimomAluiblokiran; B - elektroferogram restrikcijskih proizvoda: traka 1 - homozigotnost za normalni alel; traka 2, homozigotnost za mutaciju; traka 3 - heterozigotno stanje (normalan alel + mutacija).

Dijagnoza nasljednih bolesti na osnovu direktnog ispitivanja mutantnih alela kod pacijenata, članova njihovih porodica ili pretpostavljenih heterozigotnih nosilaca patoloških mutacija pogodna je za predsimptomatsku i prenatalnu dijagnostiku, koja se može primijeniti u najranijim fazama fetalnog razvoja, prije pojave bilo kakvih kliničkih ili biohemijskih simptoma, bolesti.

Bez obzira na metodu detekcije mutacije, tačna molekularna karakterizacija svake mutacije može se dobiti samo direktnim sekvenciranjem. Za automatizaciju ovog procesa posljednjih godina naširoko se koriste posebni uređaji - sekvenceri, koji omogućavaju značajno ubrzanje procesa čitanja DNK informacija.

Put za širu primjenu molekularno bioloških istraživanja u kliničko-dijagnostičkim laboratorijama otvara se ubrzavanjem analitičkog procesa izvođenjem svih postupaka u jednom kontinuumu, bez prijenosa uzorka, stvaranjem uslova za sprječavanje kontaminacije pri paralelnom ispitivanju većeg broja analita i uz objektivnu registraciju. rezultata u svakom ciklusu.

Glavne modifikacije PCR metode

Koristi se za brzo skeniranje i traženje poznatih genskih mutacija.

Multipleks (multiprimer) PCR

Ova metoda se zasniva na istovremenoj amplifikaciji nekoliko egzona proučavanog gena u jednoj reakciji. Ovo omogućava ekonomičan brzi skrining najčešćih mutacija. Na primjer, radi brzog dijagnosticiranja delecija u genu za distrofin kod pacijenata s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom, vrši se simultana amplifikacija skupa egzona koji najčešće mutiraju ovog gena. Kako se ove bolesti nasljeđuju po X-vezanom recesivnom tipu i povezane su s oštećenjem jedinog X hromozoma kod dječaka, u slučaju produžene delecije, elektroforeza produkta reakcije će otkriti odsustvo jednog ili više fragmenata DNK (egzona). ), što može poslužiti kao molekularna potvrda dijagnoze. Osim toga, odabirom specifičnih genskih regija za PCR amplifikaciju, moguća je prilično tačna procjena ukupne dužine delecije i tačaka loma gena (do egzona).

Kombinirana upotreba nekoliko multipleksnih reakcija omogućava dijagnosticiranje do 98% svih delecija koje se javljaju kod pacijenata s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom. Ovo je približno 60% od ukupnog broja poznatih mutacija u genu za distrofin i ukazuje na veoma visoku efikasnost ove metode skrininga za DNK dijagnozu distrofinopatije (Sl. 16).

Rice. 16. Direktna DNK dijagnoza Duchenneove mišićne distrofije korištenjem multipleks PCR (agaroznog gel elektroforeza). Kod svake od ispitivanih osoba istovremeno su amplificirana četiri egzona gena za distrofin (egzoni 17, 19, 44 i 45; strelice pokazuju odgovarajuće produkte amplifikacije). Traka 1 - kontrolna, traka 2-5 - pacijenti sa Duchenneovom mišićnom distrofijom sa različitim delecijama gena za distrofin (trake 2 i 5 - delecija egzona 45, traka 3 - delecija egzona 44, traka 4 - delecija egzona 17 i 19 ).

Alel-specifična amplifikacija

Metoda se zasniva na upotrebi dva nezavisna para prajmera za određeni region gena: jedan prajmer u oba para je uobičajen, a drugi prajmer u svakom paru ima drugačiju strukturu i komplementaran je normalnoj ili mutantnoj DNK. sekvenca. Kao rezultat takve reakcije u otopini, dvije vrste PCR proizvoda mogu se istovremeno sintetizirati - normalni i mutantni. Štaviše, dizajn prajmera koji se koristi omogućava jasno razlikovanje normalnih i mutantnih produkata amplifikacije prema njihovoj molekularnoj veličini. Ova metoda je vrlo jasna i omogućava vam da potvrdite i homo- i heterozigotno nošenje mutiranog alela.

Metoda za modifikaciju amplificirane DNK usmjerene na mjesto

Metoda se zasniva na upotrebi u PCR-u takozvanog mismatch prajmera (koji nije u potpunosti komplementaran šablonu), koji se od šablonske DNK sekvence razlikuje za jedan nukleotid. Kao rezultat uključivanja navedenog prajmera u sastav mutantnog PCR proizvoda, u njemu se formira umjetno stvoreno restrikcijsko mjesto za jednu od restrikcijskih endonukleaza, što omogućava direktnu dijagnozu DNK određene poznate mutacije pomoću restrikcijske analize. Stvaranje takvog umjetnog restriktivnog mjesta može biti potrebno ako pretraga nije otkrila postojanje poznatog i dostupnog enzima, čije je „prirodno” restriktivno mjesto pogođeno kao rezultat pojave proučavane mutacije u molekuli DNK. .

PCR metoda reverzne transkriptaze (RT- PCR)

Ova metoda se koristi u slučajevima kada je pogodnije koristiti ne genomsku DNK kao predmet proučavanja, već kompaktniju i informacijski bogatiju cDNK dobijenu nakon odgovarajuće obrade uzoraka tkiva, kao što su biopsijski materijal ili ćelijske linije limfocita, fibroblasta. , itd. Važan uslov ovdje je ekspresija (barem minimalna) željenog gena u tkivu koje se proučava.

U prvoj fazi se vrši reverzna transkripcija mRNA, a rezultirajući molekuli cDNK služe kao šablon za PCR. Nakon toga, kritična cDNK regija pojačana u dovoljnoj količini se podvrgava sekvenciranju i drugim metodama skrininga mutacija, direktnoj elektroforetskoj studiji (detekcija delecija, insercija, itd.) ili integraciji u sistem ekspresije kako bi se dobio proteinski proizvod i njegova direktna analiza .

Ova metoda je posebno efikasna za detekciju mutacija koje dovode do sinteze "krnjeg" proteina (besmislene mutacije, mutacije spajanja, velike delecije) - takozvana PTT analiza (Protein Truncation Test). PTT analiza se obično koristi kada se ispituju prošireni multi-egzonski geni, kao što je gen za Duchenne/Beckerovu mišićnu distrofiju, ataksiju-telangiektaziju ili neurofibromatozu tipa 1.

PCR u realnom vremenu(PCR u realnom vremenu)

Svake godine, u praktičnoj zdravstvu, PCR u realnom vremenu postaje sve popularnija dijagnostička metoda. Njegova osnovna karakteristika je praćenje i kvantitativna analiza akumulacije proizvoda lančane reakcije polimeraze i automatska registracija i interpretacija rezultata. Ova metoda ne zahtijeva korak elektroforeze, što smanjuje zahtjeve za PCR laboratorijom. Zahvaljujući uštedi u proizvodnom prostoru, smanjenju broja osoblja i potražnji za DNK/RNA kvantifikacijom, ova metoda se posljednjih godina uspješno koristi u najvećim sanitarnim epidemiološkim, dijagnostičkim i istraživačkim centrima u razvijenim zemljama svijeta, zamjenjujući PCR u njegovom trenutnom ("klasičnom") formatu.

PCR u realnom vremenu koristi fluorescentno označene oligonukleotidne sonde za otkrivanje DNK tokom amplifikacije. PCR u realnom vremenu omogućava potpunu analizu uzorka u roku od 20-60 minuta i teoretski je sposoban detektirati čak i jedan molekul DNK ili RNK u uzorku.

Rice. 17. PCR u realnom vremenu.

PCR u realnom vremenu koristi TaqMan sistem za kontrolu PCR kinetike direktno tokom amplifikacije pomoću gašenja rezonantne fluorescencije. Za detekciju se koristi sonda koja nosi fluorofor i gasitelj koji je komplementaran srednjem dijelu amplificiranog fragmenta. Kada su fluorofor i gasitelj vezani za oligonukleotidnu sondu, uočava se samo mala količina fluorescentne emisije. Tokom procesa amplifikacije, zbog 5'-egzonukleazne aktivnosti Taq polimeraze, fluorescentna oznaka prelazi u rastvor, oslobađajući se iz blizine gasitelja, i stvara fluorescentni signal koji se povećava u realnom vremenu proporcionalno akumulaciji amplificate (slika 17).

Glavne prednosti PCR-Real-Time u odnosu na PCR sa gel elektroforezom:

Cijela metoda se odvija u jednoj epruveti;

· Metoda traje 1 sat;

Dovoljno 1-2 radne sobe;

Uz kvalitativnu procjenu rezultata, postaje moguće kvantificirati ga (na primjer, kada se propisuje antivirusna terapija za AIDS ili virusni hepatitis, potrebno je znati virusno opterećenje, odnosno količinu virusa po 1 jedinici, što daje stvarnu -vremenski PCR);

· Dramatično smanjuje rizik od kontaminacije.

Zaključak

PCR metoda je jedna od najčešćih metoda molekularno bioloških istraživanja. Ovu metodu kliničari treba smisleno koristiti, a doktor koji se odluči da koristi PCR u svom radu mora imati određena znanja o karakteristikama i mogućnostima ove metode. Drugo, mora postojati bliska povratna informacija između kliničara i PCR laboratorije, što je neophodno za analizu složenih slučajeva i razvoj ispravne dijagnostičke strategije. Treće, PCR analiza nije lijek za dijagnozu (prije svega zaraznih bolesti) i ne zamjenjuje postojeće metode istraživanja, već ih samo nadopunjuje. I što je najvažnije, PCR ne može zamijeniti intuiciju i analitičko razmišljanje koje bi trebao imati liječnik koji očekuje uspjeh.

P . S . Molekularno-biološka istraživanja - promjena referentnih tačaka dijagnostike i liječenja. Upotreba molekularno bioloških metoda povezana je s perspektivom radikalne promjene naglaska u laboratorijskoj dijagnostici. Možemo govoriti ne samo o pravovremenim informacijama, već o njihovom prijemanju unaprijed. Ako se sada laboratorijske studije u većini slučajeva provode već s uznapredovalom bolešću i započetim liječenjem, onda se očekuje da će molekularno-biološki laboratorijski podaci omogućiti da se utvrdi sklonost osobe određenim vrstama patologije i stepen osjetljivosti na određene lijekove, koji omogućiće potkrepljenje prediktivnog, preventivnog i personalizovanog karaktera medicine budućnosti.

PROMJENA DIJAGNOSTIKE I TEŽIŠTA LIJEČENJA

NASLJEDNE BOLESTI

Danas U budućnosti

Dijagnoza Genetski pasoš

8. Koliko radnih prostorija je potrebno za PCR laboratoriju sa detekcijom fluorescencije (kvantitativna analiza, PCR u realnom vremenu)?

9. Šta je detekcija?

10. Koje se metode DNK dijagnostike razlikuju?

11. Koji enzim djeluje na osnovu PCR?

12. Zašto zona detekcije mora biti odvojena od ostalih radnih zona?

13. Šta je restriktivna lokacija?

14. Koja je razlika između direktne metode DNK dijagnostike i indirektne?

15. Šta je sekvenciranje?

16. Šta je multipleks PCR?

17. Koje vrste mutacija se određuju PCR-om?

18. Šta je kontaminacija?

19. Koja je suština alel-specifične metode amplifikacije?

20. Uslovi skladištenja PCR materijala?

21. Koji uređaj se koristi za pojačanje?

22. Koja je metoda PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR)?

23. Koji je materijal za PCR dijagnostiku?

24. Navedite vrste kontaminacije?

Testovi za samostalno učenje

1. Restrikcijske endonukleaze:

a) enzimi koji "razbijaju" DNK na strogo određenim mjestima;

b) enzimi koji šiju lomove u molekulu DNK;

c) enzimi koji daju spojeve koji vrše popravku DNK.

2. Amplifikacija gena:

3. Koja se od metoda molekularne genetike koristi za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih mutiranim genom poznate sekvence?

a) upotreba specifične restriktaze;

b) direktna detekcija upotrebom specifičnih molekularnih sondi;

c) porodična analiza distribucije polimorfizma dužine normalnog restriktivnog fragmenta.

4. DNK sekvenciranje:

a) identifikacija sekvence baze DNK;

b) ponovljeno ponavljanje bilo kojeg segmenta DNK;

c) izolacija fragmenta DNK koji sadrži ispitivani gen.

5. Uzorci DNK se mogu dobiti pomoću :

b) horionske resice;

c) amnionska tečnost;

d) ćelije amnionske tečnosti;

e) biopsije kože, mišića, jetre,

e) sve je tačno, osim tačke "c",

g) sve je tačno, osim tačke "d",

h) Sve gore navedeno je tačno.

6. Koje se mutacije dijagnosticiraju PCR-om?

a) genomski;

b) hromozomski;

c) gen (tačka).

7. Primer je:

a) komplementarni dio DNK;

b) sintetički oligonukleotid označen (radioaktivno ili fluorescentno) sekvencu komplementarnu mutantnom ili normalnom genu;

c) oligonukleotid koji djeluje kao "sjeme" i pokreće sintezu polinukleotidnog lanca na DNK ili RNK šablonu.

8. Ko je razvio princip PCR metode?

b) K. Mullis

9. Koristi li se PCR metoda za dijagnosticiranje ekspanzije trinukleotidnih ponavljanja (dinamički tip mutacija)?

10. U kojim oblastima se koristi PCR?

a) klinička medicina;

b) definicija transgenih organizama (GMO)

c) identifikacija lica, utvrđivanje očinstva, kriminalistika

d) sve gore navedeno

d) ništa od navedenog.

Primjeri odgovora: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - u; 7 - u; 8 - b; 9 – a, 10 – d.

Main

1. Genetika Bočkova. Moskva. GEOTAR, 2002.

Dodatno

1., Bakharev i liječenje urođenih i nasljednih bolesti kod djece. - Moskva, 2004.

2. DNK dijagnostika i medicinsko genetičko savjetovanje. - Moskva, 2004.

3. Ginter genetika. - Moskva, 2003.

4. Gorbunov osnove medicinske genetike. - Sankt Peterburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekularna klinička dijagnostika. – Svijet, 1999.

6. Menšikov - biološka istraživanja u kliničkoj laboratorijskoj dijagnostici: mogućnosti problema (predavanja). Klinička laboratorijska dijagnostika, br. 3, 2006.

7. Kornienko o radu PCR laboratorije tokom in-line analize biološkog materijala. Klinička laboratorijska dijagnostika, br. 10, 2006.

8. Organizacija rada PCR laboratorije. Metodička uputstva. MU 1.3.1794-03. Glavni sanitarni doktor Ruske Federacije, 2003.

9. Erlich H. A. PCR tehnologija. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Kvantitativni PCR u realnom vremenu. Genome Res. - br. 6, 1996.

GLAVNI PRINCIPI METODE

POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA

Metodički priručnik za vannastavni rad studenata 3-4 smera na specijalnostima opšte medicine (060101) i pedijatrije (060103).

SEI HPE "Državna medicinska akademija Krasnojarsk Federalne agencije za zdravstvo i socijalni razvoj"

Rusija, Krasnojarsk,

Federalna agencija za obrazovanje

Državna obrazovna ustanova

Visoko stručno obrazovanje

"Karelijanska državna pedagoška akademija"

Kurs na temu:

Lančana reakcija polimeraze (PCR) i njena primjena

Završila: student Koryagina Valeria Aleksandrovna

Provjerila: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

Uvod

Poglavlje 1 Pregled literature

1.5.4 Efekat platoa

1.5.6 Pojačanje

Zaključak

Uvod

Posljednjih dvadeset godina obilježeno je širokim uvođenjem molekularno genetskih metoda u biološke, medicinske i poljoprivredne nauke.

Do ranih 1970-ih, činilo se da je molekularna biologija dostigla određeni stepen savršenstva. Tokom ovog perioda, mikroorganizmi su bili glavni predmet molekularno-genetičkih istraživanja. Prelazak na eukariote je pred istraživače stavio potpuno nove probleme koji se nisu mogli riješiti metodama genetske analize koje su postojale u to vrijeme. Proboj u razvoju molekularne genetike postao je moguć zbog pojave novog eksperimentalnog alata - restrikcijskih endonukleaza. U narednim godinama, broj direktnih metoda analize DNK zasnovanih na kvalitativno različitim pristupima počeo je naglo da se povećava.

U mnogim slučajevima, moderne tehnologije su omogućile da se počne proučavati fina strukturna i funkcionalna organizacija nuklearnih i ekstranuklearnih genoma različitih organizama na dubljem nivou. To je bilo od posebnog značaja za razvoj novih metoda za dijagnostiku i liječenje različitih bolesti. Ništa manje važna je bila mogućnost korištenja dostignuća molekularne genetike u populacionoj biologiji i oplemenjivanju za identifikaciju i analizu genetske varijabilnosti populacija, varijeteta i sojeva, identifikaciju i certifikaciju ekonomski vrijednih jedinki, stvaranje genetski modificiranih organizama i rješavanje drugih pitanja.

Svaka metoda ima svoje prednosti i nedostatke. Ne postoji univerzalna metoda koja bi mogla riješiti sve probleme koji se pojave. Stoga je izbor određene metode za istraživanje koje je u toku jedna od najvažnijih faza svakog naučnog rada.

Poglavlje 1 Pregled literature

1.1 Istorija otkrića lančane reakcije polimeraze (PCR)

Godine 1983. K.B. Mullis i saradnici objavili su i patentirali metodu lančane reakcije polimeraze (PCR), koja je bila predodređena da ima dubok uticaj na sva područja istraživanja i primjene nukleinskih kiselina. Značaj ove metode za molekularnu biologiju i genetiku pokazao se toliko velikim i očiglednim da je sedam godina kasnije autoru dodijeljena Nobelova nagrada za hemiju.

Na početku upotrebe metode, nakon svakog ciklusa zagrijavanja-hlađenja, u reakcionu smjesu je morala biti dodana DNK polimeraza, jer je bila inaktivirana na visokoj temperaturi potrebnoj za razdvajanje lanaca spirale DNK. Reakciona procedura je bila relativno neefikasna, zahtevala je mnogo vremena i enzima. 1986. godine metoda lančane reakcije polimerazom je značajno poboljšana. Predloženo je korištenje DNK polimeraza iz termofilnih bakterija. Pokazalo se da su ovi enzimi termostabilni i da su mogli izdržati mnoge reakcione cikluse. Njihova upotreba omogućila je pojednostavljenje i automatizaciju PCR-a. Jedna od prvih termostabilnih DNK polimeraza je izolirana iz bakterija Thermus aquaticusi imenovani Taq-polimeraza.

Mogućnost amplifikacije bilo kojeg segmenta DNK čija je nukleotidna sekvenca poznata i dobijanja nakon PCR-a u homogenom obliku i preparativnoj količini, čini PCR alternativnom metodom za molekularno kloniranje kratkih fragmenata DNK. U ovom slučaju nema potrebe za primjenom složenih metodoloških tehnika koje se koriste u genetskom inženjeringu kod konvencionalnog kloniranja. Razvoj PCR metode uvelike je proširio metodološke mogućnosti molekularne genetike, a posebno genetskog inženjeringa, toliko da je radikalno promijenio i ojačao naučni potencijal mnogih svojih oblasti.

1.2 Vrste lančane reakcije polimeraze (PCR)

· Nested PCR- koristi se za smanjenje broja nusproizvoda reakcije. Upotrijebite dva para prajmera i izvršite dvije uzastopne reakcije. Drugi par prajmera umnožava DNK region unutar proizvoda prve reakcije.

· Invertirani PCR- koristi se kada je poznato samo malo područje unutar željenog niza. Ova metoda je posebno korisna kada je potrebno odrediti susjedne sekvence nakon što je DNK umetnuta u genom. Za implementaciju invertnog PCR-a, niz rezova DNK se provodi restrikcijskim enzimima<#"justify">prajmer za lančanu reakciju polimeraze

· Grupno specifičan PCR- PCR za rodbinu<#"center">1.3 Lančana reakcija polimeraze

Otkrivena sredinom 1980-ih, lančana reakcija polimeraze (PCR) može povećati broj kopija originalnog uzorka milione puta u roku od nekoliko sati. Tokom svakog ciklusa reakcije formiraju se dvije kopije od originalnog molekula. Svaka od sintetiziranih kopija DNK može poslužiti kao šablon za sintezu novih DNK kopija u sljedećem ciklusu. Dakle, ponovljeno ponavljanje ciklusa dovodi do eksponencijalnog povećanja broja kopija. Iz proračuna proizilazi da će čak i ako postoji 30 ciklusa, broj kopija originalnog molekula biti veći od 1 milijarde. Čak i ako uzmemo u obzir da se svi amplikoni ne dupliciraju tokom svakog ciklusa, ukupan broj kopija, uprkos tome, prilično je velika.

Svaki ciklus lančane reakcije polimeraze (PCR) sastoji se od sljedećih koraka:

· Denaturacija - Povećanje temperature uzrokuje da se dvolančani DNK molekul odmota i podijeli na dva jednolančana;

· Žarenje – Snižavanje temperature omogućava prajmerima da se vežu za komplementarne regione molekula DNK;

· Elongacija - Enzim DNK polimeraza dovršava komplementarni lanac.

Za amplifikaciju odabranog fragmenta koriste se dva oligonukleotidna prajmera (semena) koji flankiraju određeni DNK region. Prajmeri orijentisani 3 - završavaju jedan prema drugom iu pravcu sekvence koju treba pojačati. DNK polimeraza vrši sintezu (završetak) međusobno komplementarnih lanaca DNK, počevši od prajmera. Tokom sinteze DNK, prajmeri se fizički ubacuju u lanac novosintetizovanih molekula DNK. Svaki lanac molekule DNK formiran upotrebom jednog od prajmera može poslužiti kao šablon za sintezu komplementarnog lanca DNK pomoću drugog prajmera.

1.4 Provođenje lančane reakcije polimerazom (PCR)

Lančana reakcija polimeraze se izvodi u specijalnim polipropilenskim epruvetama tankih stijenki, kompatibilnim po veličini s korištenim termalnim ciklusom (pojačivačem) - uređajem koji kontrolira temperaturne i vremenske karakteristike faza lančane reakcije polimeraze (PCR) .

1.5 Princip metode polimerazne lančane reakcije

Lančana reakcija polimerazom (PCR) je in vitro metoda amplifikacije DNK koja može izolirati i umnožiti specifičnu sekvencu DNK milijarde puta u roku od nekoliko sati. Mogućnost dobivanja ogromnog broja kopija jednog strogo definiranog područja genoma uvelike pojednostavljuje proučavanje postojećeg uzorka DNK.

Za izvođenje lančane reakcije polimerazom potrebno je ispuniti niz uvjeta:

1.5.1 Prisustvo određenog broja komponenti u reakcionoj smjesi

Glavne komponente reakcione (PCR) smeše su: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, mješavina nukleotid trifosfata (ATP, GTP, CTP, TTP), prajmera (oligonukleotida), analiziranog DNK preparata, termostabilne DNK polimeraze. Svaka od komponenti reakcione smeše direktno je uključena u lančanu reakciju polimeraze (PCR), a koncentracija reagensa direktno utiče na tok amplifikacije.

· Tris-HCl - određuje pH reakcione smeše, stvara kapacitet pufera. Aktivnost DNK polimeraze zavisi od pH sredine, pa vrednost pH direktno utiče na tok lančane reakcije polimeraze. Obično je pH vrijednost u rasponu od 8 - 9,5. Visok pH je zbog činjenice da kako temperatura raste, pH pufera Tril-HCl opada.

· KCl - koncentracija kalijum hlorida do 50 mm utiče na tok procesa denaturacije i žarenja, koncentracija iznad 50 mm inhibira DNK polimerazu.

· MgCl 2- jer je DNK polimeraza Mg 2+- zavisni enzim, tada koncentracija magnezijevih jona utiče na aktivnost enzima (Mg 2+formira komplekse sa NTP - ti kompleksi su supstrat za polimerazu). Visoka koncentracija dovodi do povećanja nespecifične amplifikacije, a niska dovodi do inhibicije reakcije, optimalna (za različite polimeraze) je u području od 0,5 - 5 mM. Osim toga, koncentracija magnezijevih soli utiče na tok procesa denaturacije i žarenja - povećanje koncentracije Mg 2+uzrokuje povećanje temperature topljenja DNK (tj. temperatura na kojoj se 50% dvolančanih lanaca DNK razbija na jednolančane lance).

· NTP - nukleotidni trifosfati su direktni monomeri nukleinskih kiselina. Da bi se spriječio prekid lanca, preporučuje se jednak omjer sva četiri nukleotid trifosfata. Niska koncentracija ovih komponenti u reakcionoj smjesi povećava vjerovatnoću grešaka u konstrukciji komplementarnog lanca DNK.

· Prajmeri - Najoptimalnija je upotreba prajmera sa razlikom tačke topljenja ne većom od 2 - 4 o C. Ponekad tokom dugotrajnog skladištenja na temperaturi od 4 o Sa ili nakon velikog broja zamrzavanja - odmrzavanja, prajmeri formiraju sekundarne strukture - dimere, smanjujući efikasnost PCR-a. Otklanjanje ovog problema svodi se na inkubaciju u vodenom kupatilu (T=95 o C) 3 minuta i naknadno brzo hlađenje na 0o WITH.

· DNK preparati - količina i kvalitet DNK preparata (matrice) direktno utiče na tok i parametre lančane reakcije polimeraze. Višak uzorka DNK inhibira lančanu reakciju polimeraze (PCR). Nečistoće različitih supstanci u preparatu DNK takođe mogu smanjiti efikasnost lančane reakcije polimeraze (PCR): natrijum acetat, natrijum hlorid, izopropanol, etanol, heparin, fenol, urea, hemoglobin itd.

· DNK polimeraza - kada se koristi mala količina DNK polimeraze, uočava se smanjenje sinteze konačnog proizvoda u direktnoj proporciji s veličinom fragmenata. Višak polimeraze za 2-4 puta dovodi do pojave difuznih spektra, a 4-16 puta do pojave niskomolekularnih nespecifičnih spektra. Raspon korištenih koncentracija je 0,5 - 1,5 jedinica aktivnosti u odnosu na 25 µl PCR smjese.

Pored glavnih komponenti PCR smjese, koristi se niz dodatnih tvari koje poboljšavaju kvalitativne i kvantitativne pokazatelje PCR-a: acetamid (5%) - povećanje rastvorljivosti glavnih komponenti; betain (natrijumova so) - stabilizacija DNK polimeraze, snižavanje tačke topljenja DNK, izjednačavanje tačke topljenja; goveđi albumin (10-100 μg / ml) - stabilizacija DNK polimeraze; dimetil sulfoksid (1-10%) - povećava rastvorljivost glavnih komponenti; formamid (2-10%) - povećanje specifičnosti žarenja; glicerol (15-20%) - povećanje termičke stabilnosti enzima, smanjenje temperature denaturacije uzorka DNK; amonijum sulfat - snižava temperaturu denaturacije i žarenja.

1.5.2 Ciklus i temperatura

Opći pogled na program lančane reakcije polimeraze (PCR) je sljedeći:

pozornici. Produžena primarna denaturacija preparata DNK.1 ciklus

pozornici. Brza denaturacija DNK preparata. Prajmer žarenje. Izduženje.30 - 45 ciklusa.

pozornici. Produženo izduženje. Hlađenje reakcione smeše 1 ciklus.

Svaki element faze - denaturacija, žarenje, elongacija - ima individualne temperaturne i vremenske karakteristike. Parametri temperature i vremena protoka svakog elementa se biraju empirijski, u skladu sa kvalitativnim i kvantitativnim pokazateljima produkata pojačanja.

Denaturacija. Tokom ovog elementa lančane reakcije polimeraze, dvolančani molekul DNK se dijeli na dva jednolančana. Temperaturni parametri denaturacije su u rasponu od 90 - 95 o C, ali u slučaju uzorka DNK sa visokim sadržajem gvanina i citozina, temperaturu treba povećati na 98 o C. Temperatura denaturacije treba da bude dovoljna za potpunu denaturaciju - cijepanje lanaca DNK i izbjegavanje "naglog hlađenja" ili brzog žarenja, međutim, termostabilna DNK polimeraza je manje stabilna na visokim temperaturama. Stoga je odabir optimalnih parametara temperature denaturacije za odnos prajmer/uzorak (priprema DNK) važan uslov za amplifikaciju. Ako je temperatura denaturacije u prvom koraku iznad 95 o C, preporučuje se dodavanje DNK polimeraze u reakcionu smjesu nakon primarne denaturacije. Trajanje ovog elementa faze tokom polimerazne lančane reakcije (PCR) trebalo bi da bude dovoljno za potpunu denaturaciju DNK, ali da u isto vreme ne utiče značajno na aktivnost DNK polimeraze na datoj temperaturi.

Žarenje. Temperatura žarenja (T A ) je jedan od najvažnijih parametara lančane reakcije polimeraze. Temperatura žarenja za svaki specifični prajmer se bira pojedinačno. Zavisi od dužine i nukleotidnog sastava prajmera. Obično je manji za 2 - 4 o Od vrijednosti tačke topljenja (T m ) prajmer. Ako je temperatura žarenja sistema ispod optimalne, tada se povećava broj nespecifičnih pojačanih fragmenata i, obrnuto, viša temperatura smanjuje broj pojačanih proizvoda. U ovom slučaju, koncentracija specifičnih amplikona može se naglo smanjiti, sve do inhibicije lančane reakcije polimeraze (PCR). Povećanje vremena žarenja takođe dovodi do povećanja broja nespecifičnih amplikona.

Izduženje. Tipično, svaki tip termostabilne DNK polimeraze ima individualni temperaturni optimum aktivnosti. Brzina sinteze komplementarnog lanca DNK od strane enzima je također vrijednost specifična za svaku polimerazu (u prosjeku je 30-60 nukleotida u sekundi, ili 1-2 hiljade baza u minuti), tako da se vrijeme elongacije bira ovisno o o vrsti DNK polimeraze i dužini amplificiranog regiona.

1.5.3 Osnovni principi odabira prajmera

Prilikom kreiranja PCR test sistema, jedan od glavnih zadataka je ispravan odabir prajmera koji moraju ispunjavati niz kriterija:

Prajmeri moraju biti specifični. Posebna pažnja posvećena je 3 - krajevi prajmera, jer od njih Taq polimeraza počinje dovršavati komplementarni lanac DNK. Ako je njihova specifičnost nedovoljna, onda je vjerovatno da će se u epruveti s reakcijskom smjesom pojaviti neželjeni procesi, odnosno sinteza nespecifične DNK (kratki ili dugi fragmenti). Vidljiv je na elektroforezi u obliku teških ili lakih dodatnih traka. To otežava procjenu rezultata reakcije, jer je lako pomiješati određeni proizvod amplifikacije sa sintetiziranom stranom DNK. Dio prajmera i dNTP-a se troši za sintezu nespecifične DNK, što dovodi do značajnog gubitka osjetljivosti.

Prajmeri ne bi trebalo da formiraju dimere i petlje, tj. ne bi trebalo formirati stabilne dvostruke niti žarenjem prajmera za sebe ili jedan za drugog.

1.5.4 Efekat platoa

Treba napomenuti da proces akumulacije specifičnih produkata pojačanja eksponencijalno traje samo ograničeno vrijeme, a zatim njegova efikasnost kritično pada. To je zbog takozvanog "plato" efekta.

terminski efekat plato koristi se za opisivanje procesa akumulacije PCR proizvoda u posljednjim ciklusima amplifikacije.

U zavisnosti od uslova i broja ciklusa reakcije amplifikacije, u trenutku kada se efekat postiže plato korištenje supstrata (dNTP i prajmera), stabilnost reaktanata (dNTP i enzim), količina inhibitora, uključujući pirofosfate i DNK duplekse, konkurencija za reaktante sa nespecifičnim proizvodima ili prajmer-dimerima, koncentracija specifičnog proizvoda i nepotpuna denaturacija pri visokim koncentracijama produkata amplifikacije.

Što je niža početna koncentracija ciljne DNK, to je veći rizik od reakcije plato". Ova tačka se može dogoditi prije nego što je broj specifičnih produkata pojačanja dovoljan za analizu. Samo dobro optimizirani testni sistemi to mogu izbjeći.

1.5.5 Priprema uzoraka biološkog materijala

Za ekstrakciju DNK koriste se različite tehnike, ovisno o zadacima. Njihova suština je u ekstrakciji (ekstrakciji) DNK iz biološkog proizvoda i uklanjanju ili neutralizaciji stranih nečistoća kako bi se dobio DNK preparat čistoće pogodne za PCR.

Metoda dobivanja čistog DNK preparata, koju je opisao Marmur, smatra se standardnom i već je postala klasična. Uključuje enzimsku proteolizu praćenu deproteinizacijom i reprecipitacijom DNK alkoholom. Ova metoda omogućava dobijanje čistog DNK preparata. Međutim, prilično je naporan i uključuje rad s takvim agresivnim i oštrim tvarima kao što su fenol i kloroform.

Jedna od trenutno popularnih metoda je metoda ekstrakcije DNK koju su predložili Boom et al. Ova metoda se zasniva na upotrebi jakog haotropnog agensa, gvanidin tiocijanata (GuSCN), za lizu ćelija i naknadnu sorpciju DNK na nosaču (staklene perle, dijatomejska zemlja, stakleno mleko itd.). Nakon ispiranja, DNK ostaje u uzorku adsorbiran na nosaču, iz kojeg se lako može ukloniti pomoću pufera za eluiranje. Metoda je praktična, tehnološki napredna i pogodna za pripremu uzorka za amplifikaciju. Međutim, mogući su gubici DNK zbog ireverzibilne sorpcije na nosaču, kao i tokom brojnih pranja. Ovo je posebno važno kada se radi sa malim količinama DNK u uzorku. Štaviše, čak i količine GuSCN u tragovima mogu inhibirati PCR. Stoga je pri korištenju ove metode vrlo važan pravilan izbor sorbenta i pažljivo poštivanje tehnoloških nijansi.

Druga grupa metoda pripreme uzoraka zasniva se na upotrebi ionskih izmjenjivača tipa Chilex, koji, za razliku od stakla, ne adsorbiraju DNK, već obrnuto, nečistoće koje ometaju reakciju. U pravilu, ova tehnologija uključuje dvije faze: ključanje uzorka i adsorpciju nečistoća na ionskom izmjenjivaču. Metoda je izuzetno atraktivna zbog svoje jednostavnosti izvođenja. U većini slučajeva pogodan je za rad sa kliničkim materijalom. Nažalost, ponekad postoje uzorci s nečistoćama koje se ne mogu ukloniti pomoću ionskih izmjenjivača. Osim toga, neki mikroorganizmi se ne mogu uništiti jednostavnim kuhanjem. U ovim slučajevima potrebno je uvesti dodatne faze obrade uzorka.

Stoga, izbor metode pripreme uzorka treba tretirati s razumijevanjem svrhe namjeravanih analiza.

1.5.6 Pojačanje

Za izvođenje reakcije amplifikacije potrebno je pripremiti reakcionu smjesu i dodati joj analizirani uzorak DNK. U ovom slučaju, važno je uzeti u obzir neke karakteristike žarenja prajmera. Činjenica je da se, u pravilu, u analiziranom biološkom uzorku nalaze različiti molekuli DNK, na koje prajmeri korišteni u reakciji imaju djelomičnu, au nekim slučajevima i značajnu homologiju. Osim toga, prajmeri se mogu spajati jedni s drugima kako bi formirali prajmer-dimere. Oba dovode do značajne potrošnje prajmera za sintezu sporednih (nespecifičnih) produkta reakcije i, kao rezultat, značajno smanjuju osjetljivost sistema. To otežava ili onemogućava očitavanje rezultata reakcije tokom elektroforeze.

1.6 Sastav standardne PCR reakcijske smjese

x PCR pufer (100 mM rastvor Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM rastvor KCl, 25 mM rastvor MgCl2 ) …….2,5 µl

Voda (MilliQ) ……………………………………………………….18,8 µl

Smjesa nukleotid trifosfata (dNTP)

mM rastvora svakog ………………………………………….……….0,5 µl

Primer 1 (10 mM rastvor) ………………………………………….….1 µl

Primer 2 (10 mM rastvor) ………………………………………….….1 µl

DNK polimeraza (5 jedinica / µl) ……………………………………………0,2 µl

Uzorak DNK (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Procjena rezultata reakcije

Da bi se ispravno procijenili rezultati PCR-a, važno je shvatiti da ova metoda nije kvantitativna. Teoretski, produkti amplifikacije pojedinačnih ciljnih molekula DNK mogu se detektovati elektroforezom već nakon 30-35 ciklusa. Međutim, u praksi se to radi samo u slučajevima kada se reakcija odvija u uslovima bliskim idealnim, što se u životu ne susreće često. Stepen čistoće DNK preparata ima posebno veliki uticaj na efikasnost amplifikacije; prisutnost određenih inhibitora u reakcijskoj smjesi, kojih se u nekim slučajevima može biti izuzetno teško riješiti. Ponekad, zbog njihovog prisustva, nije moguće pojačati čak i desetine hiljada ciljnih molekula DNK. Stoga često ne postoji direktna veza između početne količine ciljne DNK i konačne količine produkata amplifikacije.

Poglavlje 2: Primjena lančane reakcije polimeraze

PCR se koristi u mnogim oblastima za analize i u naučnim eksperimentima.

Kriminalistika

PCR se koristi za poređenje takozvanih "genetskih otisaka prstiju". Potreban nam je uzorak genetskog materijala sa mesta zločina - krv, pljuvačka, sperma, kosa itd. Upoređuje se sa genetskim materijalom osumnjičenog. Dovoljna je vrlo mala količina DNK, teoretski - jedna kopija. DNK se isječe na fragmente, a zatim umnožava PCR-om. Fragmenti se odvajaju DNK elektroforezom. Dobivena slika lokacije DNK traka naziva se genetski otisak prsta.

Utvrđivanje očinstva

Rezultati elektroforeze fragmenata DNK amplificiranih PCR-om. Oče. Dijete. Majko. Dijete je naslijedilo neke karakteristike genetskog otiska oba roditelja, što je dalo novi, jedinstveni otisak.

Iako su "genetski otisci prstiju" jedinstveni, porodične veze se ipak mogu uspostaviti pravljenjem nekoliko takvih otisaka prstiju. Ista metoda se može primijeniti, uz male modifikacije, za uspostavljanje evolucijskih odnosa među organizmima.

Medicinska dijagnostika

PCR omogućava značajno ubrzanje i olakšavanje dijagnoze nasljednih i virusnih bolesti. Gen od interesa je amplificiran PCR-om koristeći odgovarajuće prajmere, a zatim sekvenciran da bi se odredile mutacije. Virusne infekcije mogu se otkriti odmah nakon infekcije, nekoliko sedmica ili mjeseci prije pojave simptoma bolesti.

Personalizirana medicina

Ponekad su lijekovi toksični ili alergeni za neke pacijente. Razlozi za to su dijelom u individualnim razlikama u osjetljivosti i metabolizmu lijekova i njihovih derivata. Ove razlike su određene na genetskom nivou. Na primjer, kod jednog pacijenta određeni citokrom može biti aktivniji, u drugom - manje. Kako bi se utvrdilo kakvu vrstu citokroma određeni pacijent ima, predlaže se da se prije upotrebe lijeka uradi PCR analiza. Ova analiza se naziva preliminarna genotipizacija.

Kloniranje gena

Kloniranje gena je proces izolacije gena i, kao rezultat manipulacija genetskim inženjeringom, dobivanje velike količine proizvoda datog gena. PCR se koristi za amplifikaciju gena, koji se zatim ubacuje u vektor, dio DNK koji nosi strani gen u isti organizam ili drugi organizam koji se lako uzgaja. Kao vektori koriste se, na primjer, plazmidi ili virusna DNK. Umetanje gena u strani organizam obično se koristi za dobijanje proizvoda ovog gena - RNK ili, najčešće, proteina. Na ovaj način se dobijaju mnogi proteini u industrijskim količinama za upotrebu u poljoprivredi, medicini itd.

DNK sekvenciranje

U metodi sekvenciranja pomoću fluorescentno ili radioaktivno obilježenih dideoksinukleotida, PCR je sastavni dio, jer se tokom polimerizacije derivati ​​nukleotida označeni fluorescentnom ili radioaktivnom oznakom ubacuju u lanac DNK. Ovo zaustavlja reakciju, omogućavajući određivanje položaja specifičnih nukleotida nakon odvajanja sintetiziranih lanaca u gelu.

Mutageneza

Trenutno je PCR postao glavna metoda mutageneze. Upotreba PCR-a omogućila je pojednostavljenje i ubrzanje postupka mutageneze, kao i njegovu pouzdanost i reproduktivnost.

PCR metoda je omogućila analizu prisutnosti sekvenci humanog papiloma virusa u dijelovima biopsija humanih neoplazmi grlića materice ugrađenih u parafin 40 godina prije ove studije. Štaviše, uz pomoć PCR-a, bilo je moguće amplificirati i klonirati fragmente mitohondrijske DNK iz fosilnih ostataka ljudskog mozga starosti od 7 hiljada godina!

Na lizatima pojedinačnih ljudskih spermatozoida pokazana je mogućnost simultane analize dva lokusa locirana na različitim nehomolognim hromozomima. Ovaj pristup pruža jedinstvenu priliku za finu genetsku analizu i proučavanje hromozomske rekombinacije, polimorfizma DNK itd. Metoda analize pojedinačnih spermatozoida odmah je našla praktičnu primenu u sudskoj medicini, jer HLA tipizacija haploidnih ćelija omogućava utvrđivanje očinstva ili identifikaciju zločinac (HLA kompleks je skup gena ljudskog kompleksa glavne histokompatibilnosti; lokusi HLA kompleksa su najpolimorfniji od svih poznatih kod viših kralježnjaka: unutar vrste, na svakom lokusu, postoji neobično veliki broj različiti aleli – alternativni oblici istog gena).

Koristeći PCR, moguće je utvrditi ispravnost integracije stranih genetskih struktura u unaprijed određenom području genoma proučavanih ćelija. Ukupna ćelijska DNK je žarena sa dva oligonukleotidna prajmera, od kojih je jedan komplementaran mestu DNK domaćina blizu tačke insercije, a drugi sekvenci integrisanog fragmenta u antiparalelnom DNK lancu. Lančana reakcija polimeraze u slučaju nepromijenjene hromozomske strukture DNK na predloženom mjestu umetanja dovodi do stvaranja jednolančanih DNK fragmenata neodređene veličine, au slučaju planiranog umetanja, dvolančanih DNK fragmenata poznatog veličina, određena razmakom između mjesta žarenja dva prajmera. Štaviše, stepen amplifikacije analiziranog regiona genoma u prvom slučaju će linearno zavisiti od broja ciklusa, au drugom - eksponencijalno. Eksponencijalna akumulacija tokom PCR-a amplificiranog fragmenta unaprijed određene veličine omogućava ga vizualno promatranje nakon elektroforetskog frakcioniranja DNK preparata i nedvosmislen zaključak o umetanju strane sekvence u datu regiju hromozomske DNK.

Zaključak

PCR metoda je trenutno najšire korištena kao metoda za dijagnosticiranje različitih zaraznih bolesti. PCR vam omogućava da identificirate etiologiju infekcije, čak i ako uzorak uzet za analizu sadrži samo nekoliko molekula DNK patogena. PCR se široko koristi u ranoj dijagnostici HIV infekcija, virusnih hepatitisa itd. Do danas gotovo da nema infektivnog agensa koji se ne može otkriti PCR-om.

Spisak korišćene literature

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Metode molekularno-genetičke analize. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 str.

2.PCR "u realnom vremenu" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. i sl.; ed. b. n. D.V. Rebrikov; predgovor L.A. Osterman i akad. RAS i RAAS E.D. Sverdlov; 2. izdanje, rev. i dodatne - M.: BINOM. Laboratorij znanja, 2009. - 223 str.

.Patrushev L.I. Veštački genetski sistemi. - M.: Nauka, 2005. - U 2 tone

.B. Glick, J. Pasternak Molekularna biotehnologija. Principi i primjena 589 strana, 2002

5.Shchelkunov S.N. genetski inženjering. - Novosibirsk: Sib. univ. izdavačka kuća, 2004. - 496 str.

Uredio A.A. Vorbyeva "Polimerazna lančana reakcija i njena primjena u dijagnostici u dermatovenerologiji"; Medicinska novinska agencija - 72 str

http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - medicinski časopis

Tutoring

Trebate pomoć u učenju teme?

Naši stručnjaci će savjetovati ili pružiti usluge podučavanja o temama koje vas zanimaju.
Pošaljite prijavu naznačivši temu upravo sada kako biste saznali o mogućnosti dobivanja konsultacija.

Međutim, u to vrijeme ova ideja je ostala nezatražena. Lančanu reakciju polimeraze ponovo je otkrio 1983. Kary Mullis. Njegov cilj je bio da stvori metodu koja bi omogućila amplifikaciju DNK tokom višestrukih uzastopnih duplikacija originalnog molekula DNK pomoću enzima DNK polimeraze. 7 godina nakon objavljivanja ove ideje, 1993. godine, Mullis je za nju dobio Nobelovu nagradu.

Na početku upotrebe metode, nakon svakog ciklusa zagrijavanja-hlađenja, u reakcionu smjesu je morala biti dodana DNK polimeraza, jer se brzo inaktivirala na visokoj temperaturi potrebnoj za razdvajanje lanaca spirale DNK. Procedura je bila vrlo neefikasna, zahtijevala je mnogo vremena i enzima. 1986. godine značajno je poboljšan. Predloženo je korištenje DNK polimeraza iz termofilnih bakterija. Pokazalo se da su ovi enzimi termostabilni i da su mogli izdržati mnoge reakcione cikluse. Njihova upotreba omogućila je pojednostavljenje i automatizaciju PCR-a. Jedna od prvih termostabilnih DNK polimeraza je izolirana iz bakterija Thermus aquaticus i imenovani Taq-polimeraza. Nedostatak ove polimeraze je u tome što je vjerovatnoća unošenja pogrešnog nukleotida prilično visoka, jer ovaj enzim nema mehanizam za ispravljanje grešaka (aktivnost egzonukleaze 3" → 5". Polimeraze pfu I Pwo, izolovane od arheja, imaju takav mehanizam, njihova upotreba značajno smanjuje broj mutacija u DNK, ali je brzina njihovog rada (procesivnost) manja od one kod Taq. Trenutno se koriste mješavine Taq I pfu kako bi se postigla velika brzina polimerizacije i visoka tačnost kopiranja.

U vrijeme pronalaska metode, Mullis je radio za kompaniju Cetus (en: Cetus Corporation), koja je patentirala PCR metodu. Godine 1992. Cetus je prodao prava na metodu i patent za korištenje Taq-polimeraza kompanije Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) za 300 miliona dolara. Međutim, ispostavilo se da Taq-polimerazu okarakterisao je ruski biohemičar Aleksej Kaledin 1980. godine, u vezi sa čime je kompanija Promega (Promega) pokušala na sudu da primora Roche da se odrekne ekskluzivnih prava na ovaj enzim. Američki patent za PCR metodu istekao je u martu 2005.

Provođenje PCR

Metoda se zasniva na višestrukom selektivnom kopiranju određenog DNK regiona uz pomoć enzima u veštačkim uslovima ( in vitro). U ovom slučaju se kopira samo ono područje koje zadovoljava navedene uslove i to samo ako je prisutno u uzorku koji se proučava. Za razliku od amplifikacije DNK u živim organizmima (replikacija), relativno kratki dijelovi DNK se amplificiraju pomoću PCR-a. U konvencionalnom PCR procesu, dužina repliciranih DNK regiona nije veća od 3000 baznih parova (3 kbp). Uz pomoć mješavine različitih polimeraza, uz upotrebu aditiva i pod određenim uvjetima, dužina PCR fragmenta može doseći 20-40 hiljada parova baza. To je još uvijek mnogo manje od dužine hromozomske DNK eukariotske ćelije. Na primjer, ljudski genom je dugačak otprilike 3 milijarde parova baza.

Komponente reakcije

Za PCR, u najjednostavnijem slučaju, potrebne su sljedeće komponente:

• DNK šablon, koji sadrži dio DNK koji treba pojačati.
• Dva prajmera, komplementarno suprotnim krajevima različitih lanaca željenog DNK fragmenta.
• termostabilan DNK polimeraza je enzim koji katalizuje polimerizaciju DNK. Polimeraza za upotrebu u PCR-u mora ostati aktivna na visokoj temperaturi dugo vremena, stoga se koriste enzimi izolirani iz termofila - Thermus aquaticus(Taq polimeraza), Pyrococcus furiosus(Pfu polimeraza), Pyrococcus woesei(Pwo-polimeraza) i drugi.
• Deoksinukleozid trifosfati(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Mg 2+ joni neophodni za rad polimeraze.
• puferski rastvor, obezbeđujući potrebne uslove reakcije - pH, jonsku snagu rastvora. Sadrži soli, goveđi serum albumin.

Da bi se izbjeglo isparavanje reakcione smjese, u epruvetu se dodaje ulje visokog ključanja, kao što je vazelin. Ako se koristi cikler s grijanim poklopcem, to nije potrebno.

Dodatak pirofosfataze može povećati prinos PCR reakcije. Ovaj enzim katalizira hidrolizu pirofosfata, nusproizvoda dodavanja nukleotid trifosfata rastućem DNK lancu, u ortofosfat. Pirofosfat može inhibirati PCR reakciju.

Prajmeri

Specifičnost PCR-a se zasniva na stvaranju komplementarnih kompleksa između šablona i prajmera, kratkih sintetičkih oligonukleotida dužine 18-30 baza. Svaki od prajmera je komplementaran jednom od lanaca dvolančanog šablona i ograničava početak i kraj amplificiranog regiona.

Nakon hibridizacije šablona sa prajmerom (žarenje), ovaj drugi služi kao prajmer za DNK polimerazu u sintezi komplementarnog lanca šablona (vidi).

Najvažnija karakteristika prajmera je tačka topljenja (Tm) kompleksa prajmer-matrica. T m je temperatura na kojoj polovina DNK šablona formira kompleks sa oligonukleotidnim prajmerom. Tačka topljenja može se približno odrediti formulom , gdje je n X broj X nukleotida u prajmeru. Ako su dužina i nukleotidni sastav prajmera ili temperatura žarenja pogrešno odabrani, moguće je formiranje djelimično komplementarnih kompleksa sa drugim regijama DNK šablona, ​​što može dovesti do pojave nespecifičnih proizvoda. Gornja granica temperature topljenja ograničena je optimalnom temperaturom djelovanja polimeraze, čija aktivnost opada na temperaturama iznad 80 °C.

Prilikom odabira prajmera poželjno je pridržavati se sljedećih kriterija:

pojačalo

Rice. 1: PCR ciklus

PCR se provodi u pojačalu - uređaju koji osigurava periodično hlađenje i zagrijavanje epruveta, obično s točnošću od najmanje 0,1 °C. Moderni cikleri vam omogućavaju postavljanje složenih programa, uključujući mogućnost "hot starta", Touchdown PCR (vidi dolje) i naknadno skladištenje pojačanih molekula na 4 °C. Za PCR u realnom vremenu proizvode se uređaji opremljeni fluorescentnim detektorom. Instrumenti su takođe dostupni sa automatskim poklopcem i pregradom za mikroploče, što im omogućava da se integrišu u automatizovane sisteme.

Napredak reakcije

Fotografija gela koji sadrži marker DNK (1) i produkte PCR reakcije (2,3). Brojevi pokazuju dužinu fragmenata DNK u parovima nukleotida.

Tipično, kada se provodi PCR, izvodi se 20-35 ciklusa, od kojih se svaki sastoji od tri faze (slika 2).

Denaturacija

Dvolančani DNK šablon se zagreva na 94-96°C (ili 98°C ako se koristi posebno termostabilna polimeraza) tokom 0,5-2 minuta kako bi se DNK lanci razdvojili. Ova faza se zove denaturacija jer su vodonične veze između dva lanca DNK prekinute. Ponekad se, prije prvog ciklusa (prije dodavanja polimeraze), reakciona smjesa prethodno zagrijava 2-5 min. za potpunu denaturaciju šablona i prajmera. Takav pristup se zove vruć start, omogućava smanjenje količine nespecifičnih produkta reakcije.

Žarenje

Kada se pramenovi razdvoje, temperatura se snižava kako bi se prajmerima omogućilo da se vežu za jednolančani šablon. Ova faza se zove žarenje. Temperatura žarenja zavisi od sastava prajmera i obično se bira 4-5°C ispod njihove tačke topljenja. Vrijeme faze - 0,5-2 min. Nepravilan izbor temperature žarenja dovodi ili do lošeg vezivanja prajmera za šablon (na povišenoj temperaturi) ili do vezivanja na pogrešnom mestu i pojave nespecifičnih proizvoda (na niskoj temperaturi).

Izduženje

Vrste PCR-a

• "Nested" PCR (Nested PCR (eng.)) - koristi se za smanjenje broja nusproizvoda reakcije. Upotrijebite dva para prajmera i izvršite dvije uzastopne reakcije. Drugi par prajmera umnožava DNK region unutar proizvoda prve reakcije.
• "Inverted" PCR (Inverse PCR (eng.)) - koristi se ako je poznato samo malo područje unutar željene sekvence. Ova metoda je posebno korisna kada je potrebno odrediti susjedne sekvence nakon što je DNK umetnuta u genom. Za implementaciju invertnog PCR-a vrši se serija rezova DNK restrikcijskim enzimima, nakon čega slijedi povezivanje fragmenata (ligacija). Kao rezultat toga, poznati fragmenti se nalaze na oba kraja nepoznatog regiona, nakon čega se PCR može izvesti kao i obično.
• PCR reverzne transkripcije (RT-PCR) se koristi za amplifikaciju, izolaciju ili identifikaciju poznate sekvence iz RNK biblioteke. Prije konvencionalnog PCR-a, jednolančana DNK molekula se sintetizira na mRNA šablonu pomoću reverznetaze i dobije se jednolančana cDNK, koja se koristi kao šablon za PCR. Ova metoda često određuje gdje i kada se ovi geni eksprimiraju.
• asimetrični PCR. Asimetrični PCR) - provodi se kada je potrebno pojačati uglavnom jedan od lanaca originalne DNK. Koristi se u nekim tehnikama analize sekvenciranja i hibridizacije. PCR se izvodi kao i obično, osim što se jedan od prajmera uzima u velikom višku.
• Kvantitativni PCR (Q-PCR) se koristi za brzo mjerenje količine specifične DNK, cDNK ili RNK u uzorku.
• Kvantitativni PCR u realnom vremenu – ova metoda koristi fluorescentno označene reagense za precizno mjerenje količine produkta reakcije dok se akumulira.
• Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR (engleski)) - korištenjem ove metode smanjuje se utjecaj nespecifičnog vezivanja prajmera na formiranje proizvoda. Prvi ciklusi se izvode na temperaturi iznad temperature žarenja, zatim se svakih nekoliko ciklusa temperatura smanjuje. Na određenoj temperaturi, sistem će proći kroz opseg optimalne specifičnosti prajmera za DNK.
• Metoda molekularne kolonije (PCR u gelu) Polony-PCR kolonija) - akrilamidni gel se polimerizira sa svim PCR komponentama na površini i provodi se PCR. Na tačkama koje sadrže analiziranu DNK dolazi do amplifikacije sa formiranjem molekularnih kolonija.
• PCR sa brzom amplifikacijom cDNK krajeva Brza amplifikacija krajeva cDNK, RACE-PCR )
• PCR dugih fragmenata PCR dugog dometa) - modifikacija PCR-a za amplifikaciju proširenih segmenata DNK (10 hiljada baza ili više). Koriste se dvije polimeraze, od kojih je jedna Taq polimeraza visoke procesivnosti (odnosno sposobna sintetizirati dugi lanac DNK u jednom prolazu), a druga je DNK polimeraza sa 3'-5' endonukleaznom aktivnošću. Druga polimeraza je potrebna da bi se ispravile greške unesene prvom.
• RAPD-PCR Slučajna amplifikacija polimorfne DNK PCR , PCR sa nasumičnom amplifikacijom polimorfne DNK - koristi se kada je potrebno razlikovati organizme koji su bliski u genetskom nizu, na primjer, različite sorte kultiviranih biljaka, pasmine pasa ili blisko srodne mikroorganizme. Ova metoda obično koristi jedan mali prajmer (20-25 bp). Ovaj prajmer će biti djelimično komplementaran nasumičnim DNK regionima organizama koji se proučavaju. Odabirom uslova (dužina prajmera, sastav prajmera, temperatura itd.), moguće je postići zadovoljavajuću razliku u PCR obrascu za dva organizma.

Ako je nukleotidna sekvenca šablona djelimično poznata ili nije poznata, može se koristiti degenerisani prajmeri, čiji niz sadrži degenerisane pozicije, koje mogu sadržavati bilo koje baze. Na primjer, sekvenca prajmera može biti: ...ATH... gdje je H A, T ili C.

Primjena PCR

PCR se koristi u mnogim oblastima za analize i u naučnim eksperimentima.

Kriminalistika

PCR se koristi za poređenje takozvanih "genetskih otisaka prstiju". Potreban je uzorak genetskog materijala sa mjesta zločina - krv, pljuvačka, sperma, kosa itd. Upoređuje se sa genetskim materijalom osumnjičenog. Dovoljna je vrlo mala količina DNK, teoretski - jedna kopija. DNK se isječe na fragmente, a zatim umnožava PCR-om. Fragmenti se odvajaju pomoću DNK elektroforeze. Rezultirajuća slika rasporeda DNK traka naziva se genetski otisak prsta(engleski) genetski otisak prsta).

Utvrđivanje očinstva

Rice. 3: Rezultati elektroforeze fragmenata DNK amplificiranih PCR-om. (1) Otac. (2) Dijete. (3) Majka. Dijete je naslijedilo neke karakteristike genetskog otiska oba roditelja, što je dalo novi, jedinstveni otisak.

Iako su "genetski otisci prstiju" jedinstveni (osim u slučaju identičnih blizanaca), porodične veze se ipak mogu uspostaviti pravljenjem nekoliko takvih otisaka prstiju (slika 3). Ista metoda se može primijeniti, uz male modifikacije, za uspostavljanje evolucijskih odnosa među organizmima.

Medicinska dijagnostika

PCR omogućava značajno ubrzanje i olakšavanje dijagnoze nasljednih i virusnih bolesti. Željeni gen se amplificira PCR-om koristeći odgovarajuće prajmere, a zatim se sekvencira kako bi se odredile mutacije. Virusne infekcije mogu se otkriti odmah nakon infekcije, nekoliko sedmica ili mjeseci prije pojave simptoma bolesti.

Personalizirana medicina

Poznato je da većina lijekova ne djeluje na sve pacijente kojima su namijenjeni, već samo na 30-70% njihovog broja. Osim toga, mnogi lijekovi su toksični ili alergeni za neke pacijente. Razlozi za to su dijelom u individualnim razlikama u osjetljivosti i metabolizmu lijekova i njihovih derivata. Ove razlike su određene na genetskom nivou. Na primjer, kod jednog pacijenta, određeni citokrom (protein jetre odgovoran za metabolizam stranih tvari) može biti aktivniji, u drugom - manje. Kako bi se utvrdilo kakvu vrstu citokroma određeni pacijent ima, predlaže se da se prije upotrebe lijeka uradi PCR analiza. Ova analiza se naziva preliminarna genotipizacija. prospektivna genotipizacija).

Kloniranje gena

Kloniranje gena (ne treba brkati sa kloniranjem organizama) je proces izolacije gena i, kao rezultat manipulacija genetskim inženjeringom, dobivanje velike količine proizvoda datog gena. PCR se koristi za amplifikaciju gena, koji se zatim ubacuje vektor- fragment DNK koji prenosi strani gen u isti ili drugi organizam pogodan za uzgoj. Kao vektori koriste se, na primjer, plazmidi ili virusna DNK. Umetanje gena u strani organizam obično se koristi za dobijanje proizvoda ovog gena - RNK ili, najčešće, proteina. Na ovaj način se dobijaju mnogi proteini u industrijskim količinama za upotrebu u poljoprivredi, medicini itd.

Rice. 4: Kloniranje gena pomoću plazmida. .
(1) Hromozomska DNK organizma A. (2) PCR. (3) Višestruke kopije gena organizma A. (4) Ubacivanje gena u plazmid. (5) Plazmid sa genom organizma A. (6) Unošenje plazmida u organizam B. (7) Umnožavanje broja kopije gena organizma A u organizmu B.

DNK sekvenciranje

U metodi sekvenciranja pomoću fluorescentno ili radioaktivno obilježenih dideoksinukleotida, PCR je sastavni dio, jer se tokom polimerizacije derivati ​​nukleotida označeni fluorescentnom ili radioaktivnom oznakom ubacuju u lanac DNK. Ovo zaustavlja reakciju, omogućavajući određivanje položaja specifičnih nukleotida nakon odvajanja sintetiziranih lanaca u gelu.

Mutageneza

Trenutno je PCR postao glavna metoda mutageneze. Upotreba PCR-a omogućila je pojednostavljenje i ubrzanje postupka mutageneze, kao i njegovu pouzdanost i reproduktivnost.

Bakterijska genetika. Informacije za drugu lekciju.

lančana reakcija polimeraze

Lančana reakcija polimerazom je metoda koja omogućava višestruko povećanje (amplifikaciju) broja određenih DNK molekula u analiziranom uzorku (uključujući biološki materijal ili čistu kulturu).

Glavne prednosti PCR-a kao dijagnostičke metode u mikrobiologiji su njegova vrlo visoka osjetljivost, koja omogućava otkrivanje ekstremno niskih koncentracija patogena u uzorcima, kao i podesiva specifičnost, koja omogućava otkrivanje ili identifikaciju patogena kod generičke vrste. , ili nivo podvrste. Glavni nedostatak PCR-a proizilazi iz njegove izuzetno visoke osjetljivosti - vrlo je lako da slike kontaminiraju DNK iz pozitivne kontrole, drugog uzorka ili PCR proizvoda, što dovodi do lažno pozitivne reakcije. Ovo nameće ozbiljna ograničenja na uslove pod kojima se PCR meša i obrađuje sa gotovim PCR proizvodima.

Provođenje PCR. Priprema se reakciona smeša koja sadrži sledeće komponente:

izolovan DNK iz uzorka za testiranje,

puferski rastvor,

Mg2+ joni (potrebni za rad enzima),

Dva prajmera su jednolančani kratki DNK molekuli (najčešće dužine 18 do 24 nukleotida) komplementarni krajevima različitih lanaca DNK sekvence koja se otkriva.

Smjesa deoksinukleotid trifosfata.

DNK polimeraza otporna na toplinu (najčešće korištena je Taq polimeraza, polimeraza izolirana iz Thermus aquaticus).

Zatim se ova reakcijska smjesa stavlja u ciklusni uređaj, koji je zapravo programabilni termostat. U ciklusu se provodi 30-40 ciklusa promjene temperature. Svaki od ovih ciklusa sastoji se od tri faze (vidi sliku 1):

Denaturacija (temperatura 94°C) - lanci vodonika su prekinuti, a lanci DNK se razilaze.

Žarenje prajmera (temperatura je obično u području od 50-60°C) - prajmeri se pričvršćuju na krajeve lanaca DNK. Općenito, kada se temperatura snizi, energetski je povoljnije ponovno spojiti originalne DNK lance iz uzorka koji se proučava (renaturacija), međutim, koncentracija prajmera u reakcionoj smjesi je mnogo reda veličine veća od koncentracije DNK iz uzorka (barem u početnim PCR ciklusima), tako da se reakcija žarenja prajmera odvija brže od renaturacije DNK. Temperatura žarenja se bira u zavisnosti od temperature topljenja (denaturacije) prajmera.

Elongacija (temperatura je obično 72°C) - DNK polimeraza dovršava prajmere duž šablona dugih DNK lanaca. Temperatura odgovara optimalnoj radnoj temperaturi za korišćenu DNK polimerazu.

Detekcija rezultata se razlikuje u različitim PCR formulacijama i opisana je u odjeljku "PCR sorte".

Dinamika PCR-a

U ranim PCR ciklusima, broj dvolančanih DNK molekula, čija je veličina određena razmakom između prajmerskih mjesta, udvostručuje se sa svakim ciklusom. Nastaje i mali broj dužih molekula DNK, koji se mogu zanemariti (vidi sliku 2).

Tako se u ranim ciklusima količina PCR proizvoda opisuje formulom m*2 n , gdje je m početna količina željene DNK u uzorku, n broj ciklusa. Tada reakcija dostiže plato. To je zbog nakupljanja produkta reakcije, smanjenja koncentracije prajmera i deoksinukleotid trifosfata, kao i zbog povećanja koncentracije pirofosfata (vidi sliku 3).

Vrste PCR-a

Konvencionalni PCR

U ovoj verziji PCR postavke, reakcija se nastavlja u unaprijed odabranom broju ciklusa (30-40), nakon čega se analizira da li je došlo do akumulacije dvolančanih DNK molekula u reakcijskoj smjesi.

Ova varijanta PCR-a, kada se koristi kao dijagnostička metoda, je kvalitativna metoda. Pozitivna reakcija ukazuje na prisustvo najmanje tragova željenih molekula DNK u uzorku. Negativna reakcija ukazuje na njihovo odsustvo. Kvantitativna procjena sadržaja početnih molekula DNK u uzorku je nemoguća zbog toga što reakcija dostiže plato.

Glavna metoda za otkrivanje prisustva proizvoda je elektroforeza u agaroznom ili poliakrilamidnom gelu. PCR proizvodi se odvajaju u gelu pod dejstvom električnog polja prema njihovoj molekularnoj težini. U gel se dodaje interkalirajuća boja (fluorescentna u stanju povezanom sa dvolančanom DNK - najčešće etidijev bromid). Dakle, kada se izloži ultraljubičastom svjetlu, bit će moguće vidjeti prisustvo ili odsustvo trake koja odgovara DNK potrebne molekularne težine. Prilikom provođenja PCR-a u dijagnostičke svrhe, uvijek se postavljaju kontrole pozitivne i negativne reakcije sa kojima se upoređuju uzorci (vidi sliku 4).

PCR u realnom vremenu

U ovoj verziji PCR podešavanja, količina PCR proizvoda u reakcionoj smeši se konstantno beleži tokom reakcije. Ovo vam omogućava da napravite krivu reakcije (vidi sliku 3) i na osnovu nje izračunate broj željenih molekula DNK u uzorcima.

Jedan tip PCR-a u realnom vremenu koristi interkalirajuću boju koja se dodaje direktno u reakcionu smjesu (najčešće se koristi SYBRGreen). Drugi tip koristi jedan od tipova fluorescentnih sondi koje se vezuju za mesto unutar PCR proizvoda, što omogućava povećanje specifičnosti detekcije (vidi sliku 5.) Detekcija fluorescencije se dešava direktno u uređaju tokom reakcije.

Pored mogućnosti kvantitativne detekcije, postoje i druge prednosti PCR-a u realnom vremenu u odnosu na konvencionalni PCR. Ova PCR varijanta je jednostavnija, brža i ne zahtijeva otvaranje epruveta sa PCR proizvodima, što smanjuje mogućnost kontaminacije drugih uzoraka. Glavni nedostatak je veća cijena pojačala s ugrađenom sposobnošću detekcije fluorescencije u odnosu na konvencionalno.

Digitalni kvantitativni PCR

Nova, skupa i još uvijek nedovoljno korištena verzija PCR-a, koja omogućava preciznije određivanje količine DNK u uzorku.U ovoj verziji reakciona smjesa koja sadrži fluorescentnu boju podijeljena je na ogroman broj mikroskopskih volumena (npr. , kapljice u emulziji). Nakon PCR-a, analizira se u kojem omjeru kapljica je reakcija bila pozitivna i, shodno tome, uočena je fluorescencija. Ova proporcija će biti proporcionalna broju DNK molekula od interesa u uzorku.

reverzna transkripcija PCR

U ovom slučaju, prije jedne ili druge varijante PCR-a, vrši se reakcija reverzne transkripcije (RNA u DNK) pomoću reverznog enzima. Dakle, ova metoda omogućava kvalitativnu ili kvantitativnu detekciju RNK molekula. Ovo se može koristiti za otkrivanje virusa koji sadrže RNK ili određivanje nivoa transkripcije (količine mRNA) određenog gena.

Slika 1. PCR koraci. Prajmeri su označeni crvenom bojom.

Slika 2. Akumulacija dvolančanih DNK molekula ograničenih prajmerom tokom PCR-a.

Slika 3 Dinamika PCR reakcije pri različitim početnim koncentracijama željenih molekula DNK u uzorku. (a) - najveća koncentracija (b) - srednja koncentracija (c) - najniža koncentracija

Slika 4 Agarozna elektroforeza PCR proizvoda. K+ - pozitivna kontrola (očigledno je prisutna potrebna DNK). 1-7 - test uzorci (od kojih je 1-2 pozitivno, 3-7 negativno). K- -negativna kontrola (definitivno nedostaje željeni DNK). U mnogim slučajevima, pored ciljnog proizvoda, vidljivi su i lakši nespecifični produkti reakcije (prajmer-dimeri).

Slika 5 Metode detekcije koristeći PCR u realnom vremenu. (a) - interkalirajuća boja - fluorescira kada se vezuje za dvolančanu DNK (b) - Taqman sonda - fluorescencija se javlja kada se sonda cijepa od strane DNK polimeraze sa 5'-3' endonukleaznom aktivnošću zbog razdvajanja fluorofora i gasitelja. (c) MolecularBeacon sonda - fluorescencija se javlja kada se sonda hibridizira sa ciljnim fragmentom zbog prostornog odvajanja fluorofora i gasitelja (d) - LightCycler sonde - fluorescencija akceptora nastaje kada se sonde (koje sadrže akceptor i donor) hibridiziraju sa metom fragment zbog prijenosa energije rezonantne fluorescencije (FRET).

1. Lančana reakcija polimeraze (PCR)

2. Princip metode polimerazne lančane reakcije

2.1 Prisustvo određenog broja komponenti u reakcionoj smjesi

2.2 Temperaturni ciklus

2.3 Osnovni principi odabira prajmera

2.4 Efekat platoa

3. Faze PCR podešavanja

3.2 Pojačanje

3.4.1 Pozitivne kontrole

3.4.2 Interne kontrole

4.1 Kvalitativna analiza

4.1.2 Detekcija RNA molekula

3.1 Priprema uzoraka biološkog materijala

Za ekstrakciju DNK koriste se različite tehnike, ovisno o zadacima. Njihova suština je u ekstrakciji (ekstrakciji) DNK iz biološkog proizvoda i uklanjanju ili neutralizaciji stranih nečistoća kako bi se dobio DNK preparat čistoće pogodne za PCR.

Metoda dobivanja čistog DNK preparata, koju je opisao Marmur, smatra se standardnom i već je postala klasična. Uključuje enzimsku proteolizu praćenu deproteinizacijom i reprecipitacijom DNK alkoholom. Ova metoda omogućava dobijanje čistog DNK preparata. Međutim, prilično je naporan i uključuje rad s takvim agresivnim i oštrim tvarima kao što su fenol i kloroform.

Jedna od trenutno popularnih metoda je metoda ekstrakcije DNK koju su predložili Boom et al. Ova metoda se zasniva na upotrebi jakog haotropnog agensa, gvanidin tiocijanata (GuSCN), za lizu ćelija i naknadnu sorpciju DNK na nosaču (staklene perle, dijatomejska zemlja, stakleno mleko itd.). Nakon ispiranja, DNK ostaje u uzorku adsorbiran na nosaču, iz kojeg se lako može ukloniti pomoću pufera za eluiranje. Metoda je praktična, tehnološki napredna i pogodna za pripremu uzorka za amplifikaciju. Međutim, mogući su gubici DNK zbog ireverzibilne sorpcije na nosaču, kao i tokom brojnih pranja. Ovo je posebno važno kada se radi sa malim količinama DNK u uzorku. Štaviše, čak i količine GuSCN u tragovima mogu inhibirati PCR. Stoga je pri korištenju ove metode vrlo važan pravilan izbor sorbenta i pažljivo poštivanje tehnoloških nijansi.

Druga grupa metoda pripreme uzoraka zasniva se na upotrebi ionskih izmjenjivača tipa Chilex, koji, za razliku od stakla, ne adsorbiraju DNK, već obrnuto, nečistoće koje ometaju reakciju. U pravilu, ova tehnologija uključuje dvije faze: ključanje uzorka i adsorpciju nečistoća na ionskom izmjenjivaču. Metoda je izuzetno atraktivna zbog svoje jednostavnosti izvođenja. U većini slučajeva pogodan je za rad sa kliničkim materijalom. Nažalost, ponekad postoje uzorci s nečistoćama koje se ne mogu ukloniti pomoću ionskih izmjenjivača. Osim toga, neki mikroorganizmi se ne mogu uništiti jednostavnim kuhanjem. U ovim slučajevima potrebno je uvesti dodatne faze obrade uzorka.

Stoga, izbor metode pripreme uzorka treba tretirati s razumijevanjem svrhe namjeravanih analiza.

3.2 Pojačanje

Za izvođenje reakcije amplifikacije potrebno je pripremiti reakcionu smjesu i dodati joj analizirani uzorak DNK. U ovom slučaju, važno je uzeti u obzir neke karakteristike žarenja prajmera. Činjenica je da se, u pravilu, u analiziranom biološkom uzorku nalaze različiti molekuli DNK, na koje prajmeri korišteni u reakciji imaju djelomičnu, au nekim slučajevima i značajnu homologiju. Osim toga, prajmeri se mogu spajati jedni s drugima kako bi formirali prajmer-dimere. Oba dovode do značajne potrošnje prajmera za sintezu sporednih (nespecifičnih) produkta reakcije i, kao rezultat, značajno smanjuju osjetljivost sistema. To otežava ili onemogućava očitavanje rezultata reakcije tokom elektroforeze.

3.3 Procjena rezultata reakcije

Da bi se ispravno procijenili rezultati PCR-a, važno je shvatiti da ova metoda nije kvantitativna. Teoretski, produkti amplifikacije pojedinačnih ciljnih molekula DNK mogu se detektovati elektroforezom već nakon 30-35 ciklusa. Međutim, u praksi se to radi samo u slučajevima kada se reakcija odvija u uslovima bliskim idealnim, što se u životu ne susreće često. Stepen čistoće DNK preparata ima posebno veliki uticaj na efikasnost amplifikacije; prisutnost određenih inhibitora u reakcijskoj smjesi, kojih se u nekim slučajevima može biti izuzetno teško riješiti. Ponekad, zbog njihovog prisustva, nije moguće pojačati čak i desetine hiljada ciljnih molekula DNK. Stoga često ne postoji direktna veza između početne količine ciljne DNK i konačne količine produkata amplifikacije.

3.3.1 Metoda horizontalne elektroforeze

Za vizualizaciju rezultata amplifikacije koriste se različite metode. Danas je najčešća metoda elektroforeze, zasnovana na razdvajanju molekula DNK po veličini. Da bi se to postiglo, priprema se ploča agaroznog gela, koja je zamrznuta agarozom nakon taljenja u elektroforetskom puferu u koncentraciji od 1,5-2,5% uz dodatak posebne DNK boje, na primjer, etidij bromida. Smrznuta agaroza formira prostornu rešetku. Prilikom izlijevanja uz pomoć češljeva, u gelu se formiraju posebne jažice u koje se naknadno dodaju proizvodi za pojačavanje. Gel ploča se postavlja u horizontalni aparat za gel elektroforezu i priključuje se izvor konstantnog napona. Negativno nabijena DNK počinje da se kreće u gelu od minusa do plusa. Istovremeno, kraći molekuli DNK kreću se brže od dugih. Na brzinu kretanja DNK u gelu utiču koncentracija agaroze, jačina električnog polja, temperatura, sastav pufera za elektroforezu i, u manjoj meri, GC sastav DNK. Svi molekuli iste veličine kreću se istom brzinom. Boja je ugrađena (interkalira) u planarnim grupama u molekule DNK. Nakon završetka elektroforeze, koja traje od 10 minuta do 1 sat, gel se stavlja na filter transiluminatora koji emituje svetlost u ultraljubičastom opsegu (254 - 310 nm). UV energija koju apsorbuje DNK na 260 nm prenosi se na boju, uzrokujući da ona fluorescira u narandžasto-crvenoj oblasti vidljivog spektra (590 nm).

Svjetlina traka proizvoda pojačanja može biti različita. Međutim, to se ne može povezati s početnom količinom ciljne DNK u uzorku.

3.3.2 Metoda vertikalne elektroforeze

Metoda vertikalne elektroforeze u osnovi je slična horizontalnoj elektroforezi. Njihova razlika leži u činjenici da se u ovom slučaju umjesto agaroze koriste poliakrilamidni gelovi. Izvodi se u posebnoj komori za vertikalnu elektroforezu. Elektroforeza na poliakrilamidnom gelu ima veću rezoluciju od elektroforeze agaroze i omogućava razlikovanje molekula DNK različitih veličina s točnošću od jednog nukleotida. Priprema poliakrilamidnog gela je nešto složenija od agaroze. Osim toga, akrilamid je toksična supstanca. Budući da se rijetko javlja potreba za određivanjem veličine produkta amplifikacije s točnošću od 1 nukleotida, u rutinskom se radu koristi metoda horizontalne elektroforeze.

3.4 Praćenje napretka reakcije amplifikacije

3.4.1 Pozitivne kontrole

Kao "pozitivnu kontrolu" koristite DNK preparat željenog mikroorganizma. Nespecifični amplikoni se razlikuju po veličini od amplikona nastalih amplifikacijom s kontrolnim DNK preparatom. Veličina nespecifičnih proizvoda može biti veća ili manja od pozitivne kontrole. U najgorem slučaju, ove dimenzije se mogu poklapati i čitaju se u elektroforezi kao pozitivne.

Da bi se kontrolisala specifičnost rezultujućeg proizvoda amplifikacije, mogu se koristiti hibridizacione sonde (regije DNK koje se nalaze unutar sekvence koja se može amplifikovati) obeležene enzimskim oznakama ili radioaktivnim izotopima i koje stupaju u interakciju sa DNK u skladu sa istim principima kao prajmeri. To uvelike komplikuje i produžava analizu, a njen trošak značajno raste.

3.4.2 Interne kontrole

Potrebno je kontrolirati napredak amplifikacije u svakoj epruveti sa reakcijskom smjesom. U tu svrhu koristi se dodatna, takozvana "interna kontrola". To je svaki preparat DNK koji nije sličan DNK željenog mikroorganizma. Ako se interna kontrola doda u reakcionu smjesu, tada će ona postati ista meta za žarenje prajmera kao hromozomska DNK željenog infektivnog agensa. Veličina internog kontrolnog proizvoda za amplifikaciju odabrana je tako da bude 2 ili više puta veća od amplikona nastalih umnožavanjem ciljne DNK mikroorganizma. Kao rezultat toga, ako se DNK interne kontrole unese u reakcionu smjesu zajedno sa test uzorkom, tada će, bez obzira na prisustvo mikroorganizma u biološkom uzorku, interna kontrola uzrokovati stvaranje specifičnih amplikona, ali mnogo duže (teže) nego amplikon mikroorganizma. Prisustvo teških amplikona u reakcionoj smjesi će ukazati na normalan tok reakcije amplifikacije i odsustvo inhibitora. Ukoliko nisu formirani amplikoni potrebne veličine, ali nisu formirani ni amplikoni interne kontrole, može se zaključiti da analizirani uzorak sadrži nepoželjne nečistoće koje treba eliminisati, ali ne i odsustvo željene DNK.

Nažalost, uprkos svoj atraktivnosti ovog pristupa, on ima značajnu manu. Ako je potrebna DNK prisutna u reakcionoj smjesi, tada se efikasnost njene amplifikacije naglo smanjuje zbog konkurencije s internom kontrolom za prajmere. Ovo je posebno važno pri niskim koncentracijama DNK u uzorku testa, što može dovesti do lažno negativnih rezultata.

Ipak, pod uslovom da se reši problem konkurencije za prajmere, ova metoda kontrole efikasnosti amplifikacije će svakako biti veoma korisna.

4. Metode zasnovane na lančanoj reakciji polimeraze

4.1 Kvalitativna analiza

Klasična metoda postavljanja PCR-a, čiji su principi gore navedeni, razvijena je u nekim modifikacijama u cilju prevazilaženja ograničenja PCR-a i povećanja efikasnosti reakcije.

4.1.1 Kako postaviti PCR koristeći “hot start”

Da bi se smanjio rizik od nastanka nespecifičnih produkata reakcije amplifikacije, koristi se pristup koji se naziva “hot-start” (hot-start), a njegova suština je da se spriječi mogućnost pokretanja reakcije sve dok se ne steknu uvjeti u epruveti koji osiguravaju specifično žarenje. prajmeri.

Činjenica je da, ovisno o sastavu i veličini HC, prajmeri imaju određenu tačku topljenja (Tm). Ako temperatura sistema prelazi Tm, prajmer nije u stanju da prione na lanac DNK i denaturira. Pod optimalnim uslovima, tj. temperatura žarenja blizu temperature topljenja, prajmer formira dvolančanu molekulu samo ako je potpuno komplementaran i time osigurava specifičnost reakcije.

Postoje različite opcije za implementaciju "hot starta":

Uvođenje Taq polimeraze u reakcionu smjesu tokom prvog ciklusa nakon zagrijavanja cijevi do temperature denaturacije.

Odvajanje sastojaka reakcione smeše parafinskim slojem na slojeve (prajmeri u donjem delu, Taq polimeraza i ciljna DNK u gornjem delu), koji se mešaju kada se parafin otopi (~65-75 0 C).

Upotreba monoklonskih antitijela na Taq polimerazu. Enzim vezan monoklonskim antitijelima postaje aktivan tek nakon prve faze denaturacije, kada monoklonska antitijela ireverzibilno denaturiraju i oslobađaju aktivna mjesta Taq polimeraze.

U svim ovim slučajevima, čak i ako je do nespecifičnog žarenja došlo prije početka termičkog ciklusa, elongacija ne dolazi, a kompleksi prajmer-DNK se denaturiraju zagrijavanjem, tako da se ne formiraju nespecifični produkti. Nakon toga, temperatura u cijevi ne pada ispod tačke topljenja, što osigurava stvaranje specifičnog proizvoda za pojačavanje.

4.1.2 Detekcija RNA molekula

Mogućnost korištenja RNK kao mete za PCR značajno proširuje opseg primjene ove metode. Na primjer, genomi mnogih virusa (hepatitis C, virus gripe, pikornavirusi, itd.) su predstavljeni RNK. Istovremeno, u njihovim životnim ciklusima ne postoji međufaza transformacije u DNK. Da bi se otkrila RNK, ona se prvo mora pretvoriti u oblik DNK. Za to se koristi reverzna transkriptaza, koja je izolirana iz dva različita virusa: virusa ptičje mijeloblastoze i Moloney virusa mišje leukemije. Upotreba ovih enzima povezana je s određenim poteškoćama. Prije svega, oni su termolabilni i stoga se mogu koristiti na temperaturi koja ne prelazi 42 ° C. Budući da na ovoj temperaturi molekule RNK lako formiraju sekundarne strukture, efikasnost reakcije značajno opada i, prema različitim procjenama, iznosi oko 5%. Pokušava se zaobići ovaj nedostatak korištenjem termostabilne polimeraze dobijene od termofilnog mikroorganizma Thermus Thermophilus, koji pokazuje aktivnost transkriptaze u prisustvu Mn 2+, kao reverzne transkriptaze. To je jedini poznati enzim sposoban da ispoljava i polimerazu i aktivnost transkriptaze.

Za izvođenje reakcije reverzne transkripcije, reakciona smjesa, kao i u PCR-u, mora sadržavati prajmere kao sjeme i mješavinu 4 dNTP kao građevinski materijal.

Nakon reakcije reverzne transkripcije, rezultirajući molekuli cDNA mogu poslužiti kao meta za PCR.

5. Organizacija tehnološkog procesa postavljanja PCR-a

Potencijalno visoka osjetljivost lančane reakcije polimeraze čini apsolutno neophodnim posebno pažljiv dizajn PCR laboratorija. To je zbog najakutnijeg problema ove metode - kontaminacije.

Kontaminacija – dolazak iz spoljašnje sredine u reakcionu mešavinu specifičnih DNK molekula koji mogu poslužiti kao mete u reakciji amplifikacije i dati lažno pozitivne rezultate.

Postoji nekoliko načina da se nosite sa ovom neprijatnom pojavom. Jedna od njih je upotreba enzima N-uracil glikozilaze (UG). Ova metoda se zasniva na sposobnosti UG da cijepa molekule DNK sa ugrađenim uracilom. Reakcija amplifikacije se izvodi pomoću dNTP smjese u kojoj je dTTP zamijenjen uracilom, a nakon termičkog ciklusa, svi amplikoni formirani u epruveti će sadržavati uracil. Ako se HC doda u reakcionu smjesu prije amplifikacije, tada će amplikoni koji uđu u reakcionu smjesu biti uništeni, dok će nativna DNK ostati netaknuta i kasnije će služiti kao meta za amplifikaciju.

Dakle, ova metoda samo u određenoj mjeri eliminira izvor kontaminacije i ne garantira lažno pozitivne rezultate.

Drugi način rješavanja rezultata kontaminacije je značajno smanjenje broja reakcionih ciklusa (do 25-30 ciklusa). Ali čak i uz ovaj pristup, rizik od dobivanja lažno pozitivnih rezultata je visok, jer je u ovom slučaju, u nedostatku inhibitora, lako dobiti proizvod za pojačavanje zbog kontaminacije.

Dakle, uprkos prednostima mjera pre-amplifikacije usmjerenih na inaktivaciju molekula DNK koji uzrokuju lažno pozitivne rezultate, najradikalniji lijek je dobro osmišljena organizacija laboratorija.

Zaključak

PCR metoda je trenutno najšire korištena kao metoda za dijagnosticiranje različitih zaraznih bolesti. PCR vam omogućava da identificirate etiologiju infekcije, čak i ako uzorak uzet za analizu sadrži samo nekoliko molekula DNK patogena. PCR se široko koristi u ranoj dijagnostici HIV infekcija, virusnih hepatitisa itd. Do danas gotovo da nema infektivnog agensa koji se ne može otkriti PCR-om.