Greben direktne i indirektne metode. Laboratorijska dijagnostika spolno prenosivih infekcija
Trenutno se široko koriste serološki testovi u kojima su uključeni označeni AG ili AT-la. To uključuje imunofluorescentne reakcije, radioimune i enzimske imunološke metode.
Primjenjuju se:
1) za serodijagnostiku zaraznih bolesti, odnosno za detekciju antitela korišćenjem seta poznatih konjugovanih (hemijski kombinovanih) antigena sa različitim oznakama (enzimi, fluorohromne boje);
2) određivanje mikroorganizma ili njegovog serovara pomoću standardno označenih dijagnostičkih antitela (brza dijagnostika).
Serumi se pripremaju imunizacijom životinja odgovarajućim antigenima, zatim se izoluju imunoglobulini i konjugiraju sa svjetlećim bojama (fluorohromima), enzimima i radioizotopima.
Označeni SR nisu inferiorni u odnosu na druge SR u specifičnosti, a po svojoj osjetljivosti nadmašuju sve SR.
Nema povezanog sadržaja
Kao etikete koriste se svjetleće fluorohromne boje (fluoriscein izotiocijanat, itd.).
Postoje različite modifikacije RIF-a. Za ekspresnu dijagnostiku zaraznih bolesti – za otkrivanje mikroba ili njihovih antigena u test materijalu koristi se RIF po Koonsu.
Postoje dvije metode RIF-a prema Koonsu: direktna i indirektna.
Direktne RIF komponente:
1) materijal koji se proučava (pražnjenje crijeva odvojeno nazofarinksom, itd.);
2) označeni specifični imuni serum koji sadrži AT-la na željeni antigen;
3) izotonični rastvor natrijum hlorida.
Razmaz sa test materijala tretira se označenim antiserumom.
Dolazi do AG-AT reakcije. Luminiscentnim mikroskopskim pregledom u području gdje su lokalizirani AG-AT kompleksi otkriva se fluorescencija – luminescencija.
Indirektne RIF komponente:
1) materijal koji se proučava;
2) specifični antiserum;
3) antiglobulinski serum (AT-la protiv imunoglobulina) obeležen fluorohromom;
4) Izotonični rastvor natrijum hlorida.
Bris iz test materijala prvo se tretira imunim serumom na željeni antigen, a zatim obilježenim antiglobulinskim serumom.
Svetleći AG-AT kompleksi - označeni AT se detektuju pomoću fluorescentnog mikroskopa.
Prednost indirektne metode je u tome što nema potrebe za pripremanjem širokog spektra fluorescentnih specifičnih seruma, a koristi se samo jedan fluorescentni antiglobulinski serum.
Izoluje se i 4-komponentna varijanta indirektnog RIF-a, kada se dodatno uvodi komplement (serum zamorca). Uz pozitivnu reakciju, formira se AG-AT kompleks - označen - AT-komplement.
RIF se zasniva na kombinaciji antigena bakterija, rikecija i virusa sa specifičnim antitijelima obilježenim fluorescentnim bojama (fluorescein izotiocijanat, rodamin, B-izotiocijanit, lisatinrodamin B-200, sulfohlorid, itd.) koji imaju reaktivne grupe (sulfodioklorid itd.) .) . Ove grupe se kombinuju sa slobodnim amino grupama molekula antitijela, koje ne gube svoj specifični afinitet za odgovarajući antigen kada se tretiraju fluorohromom. Rezultirajući AG-AT kompleksi postaju jasno vidljive, blistave strukture pod fluorescentnim mikroskopom (slika 7). RIF može otkriti male količine bakterijskih i virusnih antigena. RIF metoda se koristi u dvije verzije: direktna i indirektna metoda.
Direktna metoda se zasniva na direktnom povezivanju antigena sa obilježenim antitijelom. Indirektna metoda se zasniva na faznoj detekciji AG-AT kompleksa upotrebom fluorescentnih boja. Prva faza se sastoji u formiranju imunoloških kompleksa određenog antigena sa specifičnim antitijelima. Druga faza je identifikacija ovog kompleksa tretiranjem obilježenim antigamaglobulinom.
Prednost RIF-a je jednostavnost, visoka osjetljivost, brzina dobivanja rezultata. RIF se koristi kao metoda za ranu ekspresnu dijagnozu gripa, dizenterije, malarije, kuge, tularemije, sifilisa itd. Za sprovođenje takve studije koristi se luminiscentni mikroskop.
Radioimunotest (RIA)
RIA je jedna od najosetljivijih metoda imunodijagnostike. Koristi se za otkrivanje antigena virusa hepatitisa B kod pacijenata sa virusnim hepatitisom. Da biste to učinili, referentni serum (serum koji sadrži antitijela na virus hepatitisa B) se dodaje u test serum. Smjesa se inkubira 1-2 dana na temperaturi od 40°C, zatim se dodaje referentni antigen (antigen označen sa 125 J izotopom) i inkubacija se nastavlja još 24 sata. Precipitirajući antiimunoglobulini protiv referentnih serumskih proteina dodaju se u nastali kompleks antigen-antitijelo, što dovodi do stvaranja precipitata (slika 8). Rezultat se uzima u obzir prisustvom i brojem impulsa u precipitatu koje snima brojač. Ako postoji antigen vezan za specifična antitijela u test serumu, potonja se ne vezuju za obilježeni antigen i stoga se ne otkrivaju u precipitatu. Dakle, RIA se zasniva na principu kompetitivne interakcije utvrđenog antigena i poznate količine obeleženog antigena sa aktivnim centrima antitela, a kao oznaka se koriste radioaktivni izotopi.
U zavisnosti od tehnike postavljanja, razlikuju se dve metode RIA.
1) Tehnika "tečna faza" (klasična RIA). Nedostatak ove tehnike uprizorenja je potreba
posebno odvajanje slobodnih i vezanih obilježenih antigena (ili antitijela).
2) Tehnika "čvrsta faza".
AG ili AT poznate specifičnosti vezuju se za sorbente (čvrsta faza) - zidove polistirenskog bunara ili plastične cijevi. Ostatak IC komponenti se sekvencijalno sorbuje na imobilisani AG (AT).
Ovisno o prirodi reakcije, razlikuju se sljedeće metode:
1) Konkurentska metoda - metoda zasnovana na konkurenciji AG.
Komponente reakcije:
a) detektabilni AG (testni materijal - krv, sputum, itd.);
b) antigen obeležen radioizotopom, identičan ispitivanom antigenu;
c) specifična antitijela poznate koncentracije vezana na sorbent;
d) standardni AG (kontrola);
e) puferski rastvor.
Prvo se proučavani AG uvodi u reakciju. AG-AT kompleks se formira na površini sorbenta. Sorbent se ispere, zatim se unosi označeni AG.Što je veći sadržaj ispitivanog AG, to se manje označeni AG vezuje za AT-m na površini sorbenta. Koncentracija obilježenog antigena se određuje mjerenjem radioaktivnosti reakcije pomoću brojača. Vrijednost radioaktivnosti reakcije bit će obrnuto proporcionalna količini AG u uzorku za ispitivanje.
2) Nekonkurentna metoda.
Komponente reakcije:
a) utvrđena AG;
b) specifični AT-a poznate koncentracije, vezan
nye na sorbentu;
c) antitela identična vezanom antitelu, obeležena
radioizotop;
d) standard AG;
e) puferski rastvor.
Proučeni AG se dodaje vezanim antitijelima. U procesu inkubacije na sorbentu se formiraju AG-AT kompleksi. Sorbent se ispere od slobodnih komponenti i dodaju obilježena antitijela koja se vezuju za slobodne valence AG-on u kompleksu. Količina radioaktivnosti je proporcionalna koncentraciji ispitivanog AG.
3) "Sendvič metoda" (indirektna metoda) - najčešća metoda.
Komponente:
a) test serum (ili test AG);
b) AG vezane za sorbent (ili AT-la vezane za sorbent pri određivanju AG-a);
c) dijagnostička antitela protiv imunoglobulina obeleženih radioizotopima;
d) kontrolni serum (ili antigeni);
e) puferske otopine.
Proučavana antitela (ili AG) reaguju sa AG u čvrstoj fazi (AT), nakon čega se inkubata uklanja i u reakciju se uvode obeležena antiglobulinska antitela koja se vezuju za specifične AG-AT komplekse na površini sorbenta. Veličina radioaktivnosti reakcije je direktno proporcionalna količini proučavanog AT (ili AG).
Prednosti RIA:
1) visoka specifičnost i osetljivost;
2) jednostavnost tehnike postavljanja;
3) tačnost kvantitativne procene rezultata;
4) lako se automatizuje.
Nedostatak: upotreba radioaktivnih izotopa.
Nema povezanog sadržaja
ELISA metoda (ELISA)
Metoda se koristi za detekciju antigena korištenjem njihovih odgovarajućih antitijela konjugiranih s obilježenim enzimom (peroksidaza rena, b-galaktoza ili alkalna fosfataza). Nakon što se antigen kombinuje sa enzimom obeleženim imunološkim serumom, supstrat i hromogen se dodaju u smešu. Enzim cijepa supstrat, a proizvodi njegove razgradnje uzrokuju kemijsku modifikaciju hromogena. U tom slučaju hromogen menja boju – intenzitet boje je direktno proporcionalan broju vezanih molekula antigena i antitela (slika 9).
Najčešća je čvrsta faza ELISA, u kojoj se jedna od komponenti imunološkog odgovora (antigen ili antitijelo) adsorbira na čvrstom nosaču. Polistirenski mikropaneli se koriste kao čvrsti nosač. Prilikom određivanja antitijela, u jažice sa adsorbiranim antigenom uzastopno se dodaju krvni serum pacijenata, enzimom obilježen antiglobulinski serum i mješavina otopina supstrata za enzim i hromogena. Svaki put nakon dodavanja sljedeće komponente, nevezani reagensi se uklanjaju iz jažica temeljnim pranjem. Uz pozitivan rezultat, boja otopine hromogena se mijenja. Čvrstofazni nosač može biti senzibiliziran ne samo antigenom, već i antitijelom. Zatim se u jažice sa sorbovanim antitelima unosi željeni antigen, dodaje se imuni serum protiv antigena obeleženog enzimom, a zatim se dodaje mešavina rastvora supstrata za enzim i hromogen.
ELISA se koristi za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih virusnim i bakterijskim patogenima.Kao oznaka se koriste enzimi: peroksidaza, alkalna fosfataza itd.
Pokazatelj reakcije je sposobnost enzima da izazovu reakcije u boji kada su izloženi odgovarajućem supstratu. Na primjer, supstrat za peroksidazu je otopina ortofenildiamina.
Najrasprostranjenija ELISA čvrsta faza. Suština ELISA-e je slična RIA.
Rezultati ELISA-e mogu se procijeniti vizualno i mjerenjem optičke gustine na spektrofotometru.
Prednosti ELISA-e uključuju:
Nema kontakta sa radioaktivnim supstancama;
Jednostavnost metoda evaluacije odgovora;
Stabilnost konjugata;
Lako podložan automatizaciji.
Međutim, u poređenju sa RIA, primećuje se niža osetljivost metode, ali je u nekim slučajevima osetljivost superiornija u odnosu na RIF i RIM.
Sljedeći tipovi ELISA-e su dati kao primjeri:
takmičarski tip.
Imenovanje.
Dizajniran za otkrivanje površinskog antigena virusa hepatitisa B (HB3 Ad) u serumu i plazmi u dijagnozi virusnog hepatitisa B i određivanje prijenosa HB5 Ad.
Komponente:
1) ispitni materijal serum ili krvna plazma;
2) antitela na HB3 Ad adsorbovana na površini bazenčića polistirenske mikroploče;
3) konjugat - mišja monoklonska antitela na HB3 Ad obeležena peroksidazom,
4) ortofenilendiamin (OPD) -supstrat;
5) fiziološki rastvor fosfatnog pufera;
6) kontrolni serumi:
Pozitivan (serum sa HBe Ad);
Negativno (serum bez HBs Ad). Napredak
1) Uvođenje kontrolnih i test seruma.
2) Inkubacija 1 sat na 37°C.
3) Pranje bunara.
4) Uvođenje konjugata.
5) Inkubacija 1 sat na 37°C.
6) Pranje bunara.
7) Uvođenje OFD-a. U prisustvu HBs Ad, rastvor postaje žut u jamicama.
ELISA se uzima u obzir optičkom gustoćom pomoću fotometra. Stepen optičke gustoće će biti obrnuto proporcionalan koncentraciji proučavanog HBs Ad.
Mehanizam
Reakcija se odvija u tri faze:
1) HB3 Krvni pritisak ispitivanog seruma (plazme) se vezuje za homologna antitela adsorbovana na površini jažice. Formira se IR AG-AT. (NVz Ad - agl \ NVz AT).
2) HBs Ad antitela obeležena peroksidazom vezuju se za preostale slobodne HBs Ad determinante AG-AT kompleksa. Formira se kompleks AT-AG označenih Abs (an!1 HBs AT-HBs Ad-ap (1 HBs Abs označen peroksidazom).
3) OPD interakcija (sa peroksidazom) kompleksa AT-AG-AT i dolazi do žute boje.
indirektnog tipa
To je glavna test reakcija za dijagnozu HIV infekcije.
Svrha: serološka dijagnoza HIV infekcije - otkrivanje antitela na HIV antigene, Komponente:
1) materijal za ispitivanje - krvni serum;
2) sintetički
Reakcija imunofluorescencije - RIF (Koons metoda) Postoje tri vrste direktne metode, indirektna metoda, sa komplementom. Koonsova reakcija je brza dijagnostička metoda za otkrivanje mikrobnih antigena ili otkrivanje antitijela.
Direktna RIF metoda zasniva se na činjenici da su tkivni antigeni ili mikrobi tretirani imunim serumima s antitijelima označenim fluorohromima u stanju da svijetle u UV zracima fluorescentnog mikroskopa. Bakterije u razmazu, tretirane takvim luminiscentnim serumom, sijaju duž periferije ćelije u obliku zelene ivice.
Indirektna RIF metoda se sastoji u identifikaciji kompleksa antigen-antitijelo korištenjem
antiglobulinski (anti-antitijela) serum obilježen fluorohromom. Da bi se to postiglo, razmazi iz suspenzije mikroba tretiraju se antitijelima antimikrobnog zečjeg dijagnostičkog seruma. Zatim se antitela koja nisu vezana mikrobnim antigenima ispiru, a preostala antitela na mikrobima se detektuju tretiranjem razmaza sa serumom označenim antiglobulinom (anti-zečjim).
fluorohromi. Kao rezultat, formira se kompleks mikroba + antimikrobna zečja antitijela + anti-zečja antitijela označena fluorohromom. Ovaj kompleks se uočava u fluorescentnom zračenju
mikroskop, kao u direktnoj metodi.
23. Enzimski imunotest Sastojci, formulacija, računovodstvo, evaluacija. Područja upotrebe.
I Radioimunotest.
Radioimuna metoda ili analiza (RIA) je visoko osjetljiva metoda zasnovana na reakciji antigen-antitijelo korištenjem antigena ili antitijela obilježenih radionuklidom (125J, 14C, 3H, 51Cr, itd.). Nakon njihove interakcije, nastali radioaktivni imunološki kompleks se odvaja i njegova radioaktivnost se utvrđuje u odgovarajućem brojaču (beta ili gama zračenje). Intenzitet zračenja je direktno proporcionalan broju vezanih molekula antigena i antitijela.
dodati pacijentov serum, antiglobulinski serum označen enzimom i supstrat/hromogen za enzim.
II. Prilikom određivanja antigena, antigen (na primjer, krvni serum sa željenim antigenom) se unosi u jažice sa sorbiranim antitijelima, dodaju se dijagnostički serum protiv njega i sekundarna antitijela (protiv dijagnostičkog seruma) označena enzimom, i onda supstrat/hromogen za enzim.
24. Reakcije imunološke lize, primjena. Reakcija vezivanja komplementa. Sastojci, formulacija, računovodstvo, evaluacija. Aplikacija.
Reakcija fiksacije komplementa (RCC) se sastoji u tome da kada antigeni i antitela odgovaraju jedan drugom, oni formiraju imuni kompleks za koji je komplement (C) vezan preko Fc fragmenta antitela, a komplement je vezan antigen-antitelom. kompleks. Ako se kompleks antigen-antitijelo ne formira, komplement ostaje slobodan. RSC se izvodi u dvije faze: 1. faza - inkubacija smjese koja sadrži antigen + antitijelo + komplement, 2. faza (indikator) - detekcija slobodnog komplementa u smjesi dodavanjem hemolitičkog sistema koji se sastoji od ovčijih eritrocita, i hemolitičkog seruma koji sadrže antitijela na njih. U 1. fazi reakcije, kada se formira kompleks antigen-antitijelo, dolazi do vezivanja komplementa, a zatim u 2. fazi neće doći do hemolize eritrocita senzibiliziranih antitijelima (reakcija je pozitivna). Ako se antigen i antitijelo ne poklapaju (nema antigena ili antitijela u uzorku testa), komplement ostaje slobodan i u 2. fazi će se pridružiti kompleksu eritrocit-antieritrocitno antitijelo, uzrokujući hemolizu (negativna reakcija).
25. Dinamika formiranja ćelijskog imunološkog odgovora, njegove manifestacije. Imunološki
memorija.
Imuni ćelijski odgovor (CIR) je složena, višekomponentna kooperativna reakcija imunog sistema izazvana stranim antigenom (epitopi T-ćelija). Implementirano T-sistemom imuniteta. KIO faze
1. Hvatanje APC antigena
2. Procesor. AG u proteazomima.
3. Formiranje kompleksa peptida + MHC klase I i II.
4. Transport komplementa do APC membrane.
5. Prepoznavanje komplementa od strane T-pomagača specifičnih za AG 1
6. aktivacija APC i T-pomagača 1, oslobađanje IL-2 i gama-interferona od strane E-pomoćnika1. Proliferacija i diferencijacija u području AG-ovisnih T-limfocita.
7. Formiranje zrelih T-limfocita različitih populacija i memorijskih T-limfocita.
8. Interakcija zrelih T-limfocita sa AH i realizacija krajnjeg efektora.
Manifestacije KIO:
antiinfektivna AI:
antivirusno,
antibakterijski (intracelularno locirane bakterije);,
alergije IV i I vrste;
antitumorski IO;
transplant AI;
imunološka tolerancija;
imunološka memorija;
autoimunih procesa.
26. Karakterizacija regulatornih i efektorskih subpopulacija T-limfocita. Main
markeri. T-ćelijski receptor (TCR). Genetska kontrola diverziteta TCR-a
T-limfociti predstavljaju drugu važnu populaciju limfocita, čiji se prekursori formiraju u koštanoj srži, a zatim migriraju radi daljeg sazrijevanja i
diferencijacija u timus (naziv "T-limfocit" odražava ovisnost o timusu, kao glavnom mjestu rane faze sazrijevanja).
Prema spektru biološke aktivnosti, T-limfociti su regulatorne i efektorske ćelije koje obezbeđuju adaptivnu funkciju T-sistema imuniteta. Ne proizvode molekule antitijela. TCR je membranski molekul koji se razlikuje od HCR-a, ali je strukturno i funkcionalno sličan antitijelima.
TCR - AG-specifičan. receptor. To je glavni molekul koji pripada Ig superfamiliji. Ima 3 dijela: supramembranozni, membranski i citoplazmatski. TCR rep je formiran od 2 globularna alfa i beta molekula koji imaju varijabilne i konstantne domene (Vα i Vβ, Sa i Sβ).
Vα i Vβ formiraju aktivni TCR kompleks. Postoje 3 hipervarijabilne regije - konstantne determinističke regije (CDO). Funkcija KDO je prepoznavanje i vezivanje peptida T-ćelija, tj. determinantne grupe AG. TCR čvrsto sjedi na ćeliji i njegov citoplazmatski rep, njegov citoplazmatski dio, uključen je u provođenje inf. U jezgru tokom njegove interakcije sa AG. Približno 90% TCR. Oni nose alfa i beta lance, a otprilike 10% nosi gama i delta lance.
TCR je genetski kodiran. α i γ lanci, po analogiji sa lakim lancima IG, kodirani su V, G i C genima, a β i δ, po analogiji sa IG teškim lancima, V, G, E. α i γ na hromozomu 7, i β i δ na hromozomu 14.
CD-3 receptor je komplementarna struktura, Ig molekul. Formiraju ga 3 transmembranska proteina: εδ, εγ i dimer-zeta., supramembranski, vembranski i citosolni rep. Oni predstavljaju jedan kompleks sa TCR-om, koji osigurava provođenje AG-specifičnih signala do ćelijskog jezgra.
CD4 i CD8. Oni se izražavaju ili istovremeno sa TCR ili odvojeno od njega. Oni igraju funkciju ko-receptora. Oni povećavaju adheziju na ćeliju koja predstavlja AG. Oni osiguravaju provođenje AG-specifičnog signala do ćelijskog jezgra.
T-limfociti se dijele prema vrsti prepoznavanja, MOLEKULU:
CD4 rec. Peptid MHC 2. klase
CD8 peptid + MHC 1. klase
Karakteristike glavnih subpopulacija T-limfocita: populacija T-limfocita može se klasificirati u tri klase:
A. Pomagači, HST efektori (CD 4+) i citotoksični supresori (CD 8+);
B. Nestimulisane (CD 45 RA+) i memorijske ćelije (CD 45 RO+);
C. Tip 1 - (proizvodnja IL-2, INF-gama, TNF-beta);
Tip 2 - (proizvodnja IL-4, IL-5, IL-6, IL9, IL 10).
Ova metoda koristi fenomen luminescencije.
Suština fenomena luminescencije leži u činjenici da kada različite vrste energije (svjetlosna, električna, itd.) apsorbiraju molekule određenih tvari, njihovi atomi prelaze u pobuđeno stanje, a zatim se vraćaju u prvobitno stanje. , emituju apsorbovanu energiju u obliku svetlosnog zračenja.
U RIF-u, luminiscencija se manifestira u obliku fluorescencije - to je sjaj koji se javlja u trenutku ozračivanja uzbudljivom svjetlošću i prestaje odmah nakon što prestane.
Mnoge tvari i živi mikroorganizmi imaju vlastitu fluorescenciju (tzv. primarnu), ali je njen intenzitet vrlo nizak. Supstance koje imaju intenzivnu primarnu fluorescenciju i koje se koriste za davanje fluorescentnih svojstava nefluorescentnim supstancama nazivaju se fluorohromi. Takva indukovana fluorescencija naziva se sekundarna.
Za pobuđivanje fluorescencije u fluorescentnoj mikroskopiji najčešće se koristi ultraljubičasti ili plavo-ljubičasti dio spektra (talasna dužina 300-460 nm). U ove svrhe laboratorije imaju luminiscentne mikroskope različitih modela - ML-1-ML-4, "Lumam".
U virološkoj praksi koriste se dvije glavne metode fluorescentne mikroskopije: fluorohromizacija i fluorescentna antitijela (ili RIF).
Fluorohromizacija- ovo je tretman preparata fluorohromom u cilju povećanja jačine i kontrasta njihove luminiscencije. Najveći interes je fluorohrom akridin narandžasta, koja izaziva polihromatsku fluorescenciju nukleinskih kiselina. Dakle, kada se preparati tretiraju ovim fluorohromom, deoksiribonukleinska kiselina fluorescira blistavo zelenom, a ribonukleinska kiselina - rubin crvenom.
RIF metoda se sastoji u činjenici da antitijela povezana s fluorohromom zadržavaju sposobnost ulaska u specifičnu vezu sa homolognim antigenom. Nastali kompleks antigen + antitijelo, zbog prisustva fluorohroma u njemu, detektuje se pod fluorescentnim mikroskopom karakterističnim sjajem.
Za dobivanje antitijela koriste se visokoaktivni hiperimuni serumi iz kojih se izoluju antitijela i obilježavaju fluorohromom. Najčešće korišćeni fluorohromi su FITC-fluorescein izotiocijanat (zeleno svetlo) i PCX-rodamin sulfohlorid (crveno svetlo). Antitijelo označeno fluorohromom naziva se konjugat.
Način pripreme i bojenja preparata je sljedeći:
- pripremiti razmaze, otiske sa organa ili na pokrovnim stakalcima - zaraženu ćelijsku kulturu na stakalcima; Histosekcije se također mogu koristiti;
- preparati se suše na vazduhu i fiksiraju u ohlađenom acetonu na sobnoj temperaturi ili na minus 15 °C (od 15 minuta do 4-16 sati);
- bojeno direktnom ili indirektnom metodom; voditi evidenciju pod fluorescentnim mikroskopom prema intenzitetu sjaja, procijenjenom u krstovima.
Paralelno pripremite i bojite preparate od zdrave životinje - kontrola.
Postoje dvije glavne metode primjene fluorescentnih antitijela: direktna i indirektna.
Direktna metoda (jedan korak). Na fiksirani preparat se nanosi konjugat (fluorescentni serum za sumnjivi virus), koji se inkubira 30 minuta na temperaturi od 37°C u vlažnoj komori. Zatim se lijek ispere od nevezanog konjugata fiziološkim rastvorom (pH 7,2 - 7,5), osuši na zraku, nanese se nefluorescentno ulje i pregleda se pod mikroskopom.
Direktna metoda omogućava detekciju i identifikaciju antigena. Da biste to učinili, morate imati fluorescentni serum za svaki virus.
Indirektna metoda (dvostepena). Neobilježeni serum koji sadrži antitijela na sumnjivi virus nanosi se na fiksirani preparat, inkubira 30 minuta na 37 °C, nevezana antitijela se isperu. Na preparat se nanosi fluorescentni serum protiv vrsta, koji odgovara vrsti životinje koja proizvodi homologna antivirusna antitijela, i inkubira se 30 minuta na 37 °C. Zatim se lijek ispere od nevezanih označenih antitijela, osuši na zraku, nanese se nefluorescentno ulje i pregleda pod fluorescentnim mikroskopom.
Anti-species serumi se dobijaju imunizacijom životinja globulinima onih vrsta koje služe kao proizvođači antivirusnih antitijela. Dakle, ako su antivirusna antitijela dobivena na zečevima, tada se koristi fluorescentni anti-zečji serum.
Indirektna metoda omogućava ne samo otkrivanje i identifikaciju antigena, već i otkrivanje i određivanje titra antitijela. Osim toga, ova metoda može detektirati antigene različitih virusa jednim obilježenim serumom, budući da se zasniva na korištenju seruma protiv vrsta. Češće se koriste serumi protiv zeca, goveda, konji i serumi protiv globulina zamorca.
Razvijeno je nekoliko modifikacija indirektne metode. Metoda koja koristi komplement zaslužuje najveću pažnju. Metoda se sastoji u nanošenju inaktiviranog nefluorescentnog specifičnog seruma i komplementa zamorčića na fiksirani preparat, držanja 30 minuta na 37 °C, ispiranja i detekcije kompleksa antigen + antitijelo + komplement, primjena fluorescentnog antikomplementarnog seruma , držeći ga 30 minuta na 37 °C, oprati, osušiti na zraku i pregledati pod fluorescentnim mikroskopom.
Prednosti RIF-a: visoka specifičnost i osjetljivost; lakoća tehnike postavljanja; zahtijeva minimalan broj komponenti. Ovo je ekspresna dijagnostička metoda, jer odgovor možete dobiti u roku od nekoliko sati. Nedostaci uključuju subjektivnost u procjeni intenziteta luminescencije i, nažalost, ponekad su fluorescentni serumi lošeg kvaliteta. Trenutno se RIF široko koristi u dijagnostici virusnih bolesti životinja.
Ako pronađete grešku, označite dio teksta i kliknite Ctrl+Enter.
Otkrivena 1942. godine od strane Koonsa, reakcija imunofluorescencije nije nova istraživačka metoda. Međutim, pojava hibridomskih tehnologija, koja je omogućila dobivanje monoklonskih antitijela, dala je "drugi život" ovoj reakciji, jer je njihova upotreba omogućila da se osjetljivost ove reakcije i njena specifičnost poveća za nekoliko puta.
A danas ćemo vam detaljno reći o reakciji direktne i indirektne imunofluorescencije (RIF) kao Koons dijagnostičkoj metodi za odrasle muškarce i žene tijekom trudnoće.
Šta je reakcija imunofluorescencije
Predstavljajući odličnu priliku za brzo postavljanje tačne dijagnoze, reakcija imunofluorescencije omogućava vam da utvrdite prisutnost uzročnika u patološkom materijalu. Za to se koristi razmaz od materijala koji je posebno obrađen sa označenim FITC (fluorescein izotiocijanat) i proučavan kao heterogena analiza.
Za dobijanje rezultata koristi se fluorescentni mikroskop, u njegovom optičkom sistemu postoji set svetlosnih filtera koji obezbeđuju preparat plavo-ljubičastom ili ultraljubičastom svetlošću zadate talasne dužine. Ovo stanje omogućava fluorohromu da sija u datom opsegu. Istraživač procjenjuje svojstva sjaja, njegovu prirodu, veličinu objekata i njihov relativni položaj.
Kome je dodijeljen
Provođenje imunofluorescentne reakcije može se propisati u dijagnozi mnogih virusnih bolesti. Posebno je propisano sveobuhvatno ispitivanje kako bi se identificirali sljedeći faktori:
- prisutnost virusa u tijelu;
- infekcija salmonelom;
- postojanje određenih antigena u tijelu;
- otkriva se vjerojatnost infekcije tijela klamidijom, mikoplazmama i drugim mikroorganizmima koji imaju sposobnost iniciranja ljudskih virusnih bolesti;
- dijagnostika virusnih bolesti kod životinja.
Ove indikacije omogućuju primjenu imunofluorescentne reakcije u otkrivanju virusnih bolesti različite prirode u ljudskom i životinjskom tijelu.
Ciljevi
S obzirom na to da ova dijagnostička metoda ima brojne prednosti, koje uključuju visoku efikasnost, brzinu provođenja i dobijanja rezultata, kao i odsustvo velikog broja kontraindikacija, koristi se za utvrđivanje prisutnosti virusnih infekcija u organizmu. Stoga se ova analiza može propisati i za postavljanje i za razjašnjavanje dijagnoze, na osnovu koje se propisuje režim liječenja.
Postupak ne izaziva nelagodu, za njega je potrebno pribaviti materijal za analizu, koji se uzima iz bilo koje tjelesne tekućine: pljuvačke, sputuma, strugotina s površine sluznice. Krv se takođe može uzeti za analizu. Učestalost reakcije imunofluorescencije propisuje liječnik, koji treba dobiti podatke o dinamici procesa koji se odvijaju u tijelu.
Budući da ova analiza ne šteti ni tijelu ni općem blagostanju osobe, po potrebi se može propisati.
Vrste takvog postupka
Danas se koristi nekoliko varijanti ove analize, od kojih svaka ima niz specifičnih karakteristika i omogućava vam da dobijete najdetaljniju sliku procesa koji se odvijaju u tijelu.
Vrste imunofluorescentnih reakcija uključuju:
- - jedna od najbrže razvijajućih vrsta dijagnostike, ova analiza omogućava dobijanje kvantitativnih podataka bez upotrebe serijskih razblaženja. Korišćenjem dobijenih merenja optičke gustine tečnosti moguće je precizno odrediti nivo koncentracije željene komponente. Široke mogućnosti ove vrste analize koriste se kada se za njegovu provedbu koriste monoklonska antitijela, što omogućava određivanje faze zaraznog procesa, njegove težine;
- DNK dijagnostika- ova metoda se zasniva na komplementarnom vezivanju nukleotida, za šta se mogu koristiti tečnosti kao što su pljuvačka, krv, likvor, urin, sputum, uzorci biopsije i krv. Ova metoda najefikasnije otkriva prisutnost papiloma virusa u tijelu, međutim, mnogi moderni sistemi testiranja mogu povremeno dati lažno pozitivne i lažno negativne rezultate. Razlog za njih može biti kontaminacija uzoraka tekućine za analizu specifične DNK, čije prisustvo može imati ugniježđeni ili totalni karakter;
- imunohromatografija- specifičnost ove metode za određivanje prisustva patološkog okruženja i virusa u organizmu je upotreba obilježenih antitijela tokom reakcije. Ova dijagnostička metoda se koristi za identifikaciju i stepen aktivnosti procesa infekcije streptokokom grupe A, kao i klamidijama sljedećih tipova: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia iz Oxoida. Poseduju najveću osetljivost, test sistemi koji su zasnovani na ovoj metodologiji istraživanja. obično se koriste kao orijentacijski test.
Navedene sorte imaju karakteristike ponašanja i specifične karakteristike rezultata, međutim, sve one imaju za cilj dobijanje podataka o prisutnosti patoloških mikroorganizama i virusa u organizmu, kao io stepenu njihove reprodukcije i aktivnosti.
Indikacije za provođenje
Reakcija imunofluorescencije može se propisati za otkrivanje bilo koje vrste patološkog okruženja u tijelu.
Ovom vrstom dijagnoze određuju se klamidija, trihomonade, gonokoke i, kao i lamblije svih vrsta. i druge bolesti takođe zahtevaju RIF. Imenovanje ljekara za njegovu provedbu je obavezno.
Kontraindikacije za držanje
Budući da je za ovu reakciju potrebna bilo koja vrsta tjelesnih tekućina kao test materijala, njihovo uzimanje obično nije teško i nema kontraindikacija za izvođenje imunofluorescentne reakcije. Međutim, tokom trudnoće i kod djece mlađe od 6 mjeseci, uzorkovanje za istraživanje se provodi uz krajnje mjere opreza.
Odsustvo kontraindikacija omogućava da se ova vrsta dijagnoze provodi kada ljekar prepiše svim pacijentima. Njegova sigurnost je zagarantovana upotrebom dezinfikovanog instrumenta i špriceva za jednokratnu upotrebu.
Priprema za proceduru
Ne postoje karakteristike uzimanja materijala za ovu analizu. Krv mu se uzima na prazan želudac, tako da u njoj nema visokog sadržaja tvari koje mogu promijeniti istinito svjedočenje i dati lažnu sliku.
Kako je uzorkovanje
Kako za analizu nije potrebna posebna priprema, isključuje se samo jelo 12 sati prije nje i izostanak upotrebe lijekova, testni materijal se uzima kao normalan proces uzimanja tjelesne tečnosti na analizu.
Subjektivni osjećaji tokom postupka mogu varirati ovisno o osjetljivosti.
Dešifrovanje rezultata
Upotreba savremenih sistema za testiranje omogućava vam da dobijete najtačnije rezultate analize. Za dešifriranje rezultata koriste se sljedeći podaci:
- stepen intenziteta fluorescencije;
- fluorescentna nijansa;
- periferna priroda procesa usijanja objekta;
- karakteristike morfologije, lokaciju patogena u uzetom razmazu test materijala i njegove dimenzije.
Prilikom proučavanja velikih objekata (na primjer, gardenerella, Trichomonas, ćelije koje su već zahvaćene virusima), gore navedeni kriteriji omogućavaju dobivanje najpouzdanijih rezultata. Međutim, elementarna tijela mikoplazme i klamidije imaju veličine koje leže na granici rezolucije fluorescentnog mikroskopa, što otežava
otežava postizanje tačnog rezultata, jer periferni sjaj gubi dio svog intenziteta. Preostali kriterijumi više nisu dovoljni za tačnu identifikaciju proučavanih mikroorganizama. Iz tog razloga se postavljaju posebni zahtjevi za specijaliste koji sprovode ovu vrstu istraživanja: nivo njihove kvalifikacije mora biti dovoljan za rad sa dostupnim podacima.
Iz tog razloga, samo liječnik sa odgovarajućim nivoom kvalifikacije može se baviti dekodiranjem dobijene analize. U nastavku pročitajte o cijeni istraživanja RIF-a.
prosječna cijena
Cijena imunofluorescentnog testa zavisi od lokacije i nivoa zdravstvene ustanove, kao i od kvalifikacije specijaliste koji vrši analizu. Danas se cijena kreće od 1280 do 2160 rubalja.
Video u nastavku će vam reći više o imunološkim reakcijama:
Postoje dvije opcije za podešavanje RIF (Coons reakcija) - direktne i indirektne reakcije imunofluorescencije.
Direktni RIF je jednostavna reakcija u jednom koraku, ali pošto zahtijeva veliku količinu
označeni antimikrobni serumi, tada je rjeđe indirektan, čiju proizvodnju osigurava jedan označeni antiserum.
Indirektni RIF je dvostepena reakcija u kojoj se antigen prvo vezuje za serum neobeležene vrste, a zatim se formirani imunološki kompleks antigen-antitijelo tretira FITC-obilježenim antiserumom koji sadrži antitijela protiv imunoglobulina ovog kompleksa. Obično se u fazi I njegove formulacije kao serum vrste koristi imuni zečji serum dobijen imunizacijom životinja odgovarajućim mikroorganizmom, a u fazi II, FITC-obilježen anti-zečji serum magaraca ili drugih životinja imuniziranih zečjim gama globulinima ( Slika 9).
Direktna RIF postavka. Na staklenom predmetu bez masnoće od ispitivanog materijala se prave tanki razmazi, a od organa i tkiva prave se brisevi-otisci. Preparati se osuše, fiksiraju, na njih se nanese luminiscentni serum uzet u radnom razblaženju i stavi u vlažnu komoru na temperaturi od 37°C 20-30 minuta (25-40 minuta - na sobnoj temperaturi). Zatim, da bi se uklonila višak fluorescentnih antitijela, preparat se ispire u puferiranom izotoničnom rastvoru natrijum hlorida 10-15 minuta, nakon čega sledi ispiranje u destilovanoj ili tekućoj vodi 10 minuta. Osušite na sobnoj temperaturi i pregledajte pod fluorescentnim mikroskopom koristeći sistem za uranjanje u ulje.
Za procjenu intenziteta specifične fluorescencije bakterijskih ćelija koristi se skala četiri plus: "++++", "+++" - vrlo svijetla i svijetla; "++", "+" - izražena i slaba zelena fluorescencija ćelija debelog creva. Obavezne su tri kontrole: 1) tretman fluorescentnim antitelima homolognih bakterija (pozitivna kontrola); 2) heterologna kultura (negativna kontrola); 3) neinficirani materijal (negativna kontrola).
Antikomplementarni RIF. Reakcija je modifikacija CSC, u kojoj antikomplementarna antitela obeležena FITC služe kao indikatorski sistem (slika 10).
Indirektni antikomplementarni RIF se postavlja na sljedeći način: pripravak antigena se priprema na staklenom predmetu, kao i za RIF, ali se u stadijumu I obrađuje ne jednim imunološkim serumom, već njegovom mješavinom sa komplementom zamorca, a u fazi II sa antiserumom koji sadrži FITC-označena antitela za komplementar. Široka upotreba antikomplementarnog RIF-a ograničena je teškoćom dobijanja antikomplementarnih antitijela i načinom na koji su "označena".