Virološke metode istraživanja. Virološka studija

Virološke studije u klinici zaraznih bolesti postaju sve značajnije, prvenstveno zbog povećanja udjela infekcija virusne prirode, čija klinika nije uvijek tipična. Istovremeno, za sve zarazne bolesti nisu razvijene brze i pouzdane metode virološke dijagnostike, mnoge od njih su naporne, zahtijevaju posebne uvjete, eksperimentalne životinje, hranljive podloge i obučeno osoblje. Trenutno se koriste 3 glavne vrste istraživanja za dijagnosticiranje virusnih infekcija.
1. Mikroskopski pregled infektivnog materijala u cilju otkrivanja virusnog antigena ili patognomoničnih promjena u tkivima. U dijagnostičke svrhe koristi se direktan mikroskopski pregled infektivnog materijala pacijenata kod ograničenog broja virusnih infekcija (bjesnilo, vodene kozice, žuta groznica, herpes itd.). Metoda zasnovana na detekciji virusnog antigena pomoću fluorescentnih antitela dobila je širu primenu. Metoda imunofluorescencije može biti pouzdana samo ako su svi tehnički zahtjevi strogo ispunjeni.
2. Virološke metode.
3. Serološke studije za određivanje porasta titra antitela u toku bolesti. Serološke metode istraživanja su dostupnije u laboratoriji.
Za ove studije potrebno je uzimanje krvnog seruma u akutnom periodu bolesti iu periodu rekonvalescencije (upareni serumi). Uzorci krvi za serološke studije uzimaju se sterilni bez antikoagulansa i konzervansa.
Glavne faze viroloških istraživanja su izolacija virusa, njihova identifikacija i karakterizacija glavnih bioloških svojstava. Trenutno ne postoji jedinstvena metoda za izolaciju različitih grupa virusa. To je prvenstveno zbog raznolikosti njihovih svojstava i karakteristika uzgoja izvan organizma domaćina. Za proučavanje se koriste biosupstrati (ispiranje sa sluzokože, krv i njenih komponenti, likvor, urin i feces, uzorci biopsije organa i tkiva ili njihovi komadići uzeti tokom obdukcije), koji se podvrgavaju posebnoj obradi nakon čega slijedi prolaz materijal. Materijal uzet za istraživanje treba čuvati na temperaturi od -20 °C do -70 °C. U zavisnosti od preliminarne dijagnoze, obrada materijala ima svoje karakteristike, ali se u svim slučajevima pretpostavlja da se dobije supstrat koji je maksimalno pročišćen od nečistoća sluzi, ćelija organa i tkiva ili njihovih fragmenata, bakterija. To se postiže homogenizacijom ispitivanog materijala u posebnoj aparaturi ili mljevenjem u porculanskom malteru na hladnom sa kvarcnim staklom (komadići organa i tkiva) uz dodatak sterilno ohlađenog (+4 C) 0,9 %

rastvor natrijum hlorida da se dobije 10-30% suspenzija i naknadno centrifugiranje na 1500-3000 o/min tokom 10-15 minuta. Tako dobijeni supernatant se koristi za dalja istraživanja.
Prije intenzivnog razvoja i uvođenja u široku praksu metode kulture tkiva i stanica, korištena je infekcija eksperimentalnih životinja ili pilećih embrija. Ove metode se i danas koriste. Otkrivanje virusa pomoću životinja najprikladnije je u slučajevima kada je u eksperimentu moguće reproducirati tipičnu sliku zarazne bolesti ili njenih pojedinačnih manifestacija. Dakle, patogeni arbovirusa i Coxsackie grupa mogu se otkriti infekcijom u mozgu miševa koji sišu, gripa - infekcijom pilećih embrija ili intranazalnim davanjem test materijala miševima. Posljednjih godina virusološke laboratorije najviše koriste metodu kulture stanica i tkiva koja omogućava izolaciju adenovirusa, virusa herpesa, respiratornog sincicijalnog virusa, miksovirusa i drugih, te postavljanje etiološke dijagnostike bolesti već u prve faze studije. Osnova za to su dobro proučene citološke karakteristike interakcije većine virusa i ćelija. Tako infekcija HeLa, Hep-2 ćelija materijalom koji sadrži adenovirus tipa 2 dovodi već 3. dan do promjene obrasca rasta staničnog monosloja i do pojave tipičnih stanica u obliku grozdova itd. , koji su dobro definisani u uobičajenom svetlosnom mikroskopu pri malom uvećanju.
Od izuzetne važnosti za etiološku dijagnostiku zarazne bolesti je standardizacija izolacije virusa iz ispitivanog materijala, koja u ovoj fazi rada podrazumijeva korištenje genetski čistih linearnih životinja, uzimajući u obzir njihove fenotipske (prije svega starosne) karakteristike. To je prvenstveno zbog činjenice da su eksperimentalne životinje različitih genetskih linija i dobi podložne virusima u različitom stupnju. Tako su kod intracerebralne infekcije miševa neurotropnim WSN sojem virusa gripe najveću osjetljivost pokazale linije BALB/c, A, CBA i vanbrodnih životinja, isti obrazac je ustanovljen i u slučajevima intranazalne primjene test materijala. Za konačne rezultate izolacije virusa bitno je preliminarno ispitivanje životinja, pilećih embrija, kultura ćelija i tkiva na latentne nosioce virusa. U vrlo širokoj primjeni u laboratorijskoj praksi, pileći embriji mogu biti inficirani virusima ptičje leukemije, encefalomijelitisa ptica, infektivnog sinusitisa, psitakoze, Newcastleske bolesti, patogena nekih bakterijskih infekcija (paratifus i dr.), kao i mikoplazmom. Još veći broj bakterijskih, a posebno virusnih agenasa sposoban je spontano inficirati kulture stanica i tkiva i preživjeti u njima. Njihovo prisustvo značajno utiče na ocjenu materijala koji se proučava. Neke vrste mikoplazmi u ćelijskoj kulturi
može izazvati hemaglutinaciju i hemadsorpciju, pa čak i formirati plakove ispod agar premaza, slično nastalim virusima. Ne mali značaj je i kontaminacija ćelijskih kultura jedne vrste drugima, najčešće je povezana sa HeLa ćelijama i uočava se pri radu sa različitim vrstama kultura u istoj prostoriji, kod loše obrade laboratorijskog staklenog posuđa itd. prisutnost kontaminacije staničnih kultura ili infekcija životinja bakterijskim agensima, kao što se u pravilu manifestira prilično jasno (promjene u obrascu rasta staničnog monosloja, svojstva podloge za kulturu, uginuće pilećih embrija ili životinja sa određenim simptomima itd.) i ne predstavlja posebne poteškoće u evaluaciji rezultata. Situacija je složenija kod latentnih oblika infekcije, gdje je potrebna upotreba seroloških i drugih metoda. Ove upute treba uzeti u obzir u radu virologa, posebno prilikom provođenja etiološke dijagnoze nejasnih slučajeva bolesti.

Dijagnoza akutnih crijevnih infekcija postavlja se na osnovu kliničkih i epidemioloških podataka, uz obaveznu laboratorijsku potvrdu. Bez laboratorijske potvrde, dijagnoza akutnih crijevnih infekcija može se postaviti samo u slučajevima kada postoje jasno utvrđeni epidemiološki podaci (u žarištu infekcije i laboratorijski dešifrovanim grupnim izbijanjem bolesti kod većine pacijenata).

Za konačnu dijagnozu koriste se bakteriološke, virološke i serološke metode istraživanja.Koprološka metoda, kao i rezultati sigmoidoskopije (za šigelozu) su od sekundarnog značaja.

I. Bakteriološka metoda je od najveće važnosti kod AII uzrokovane bakterijskom florom (invazivna i sekretorna dijareja). Najbolji rezultati se postižu sejanjem fekalija direktno uz krevet pacijenta, prije određivanja antibiotske terapije i njegovom dostavom u bakteriološku laboratoriju u prva dva sata od trenutka uzimanja uzorka. Za studiju je potrebno odabrati čestice koje sadrže patološke nečistoće, ali ne i krv. Biomaterijal se sije na selektivne podloge Ploskireva, Levina i drugih. Učestalost pozitivnih rezultata (inokulacija patogena i njegova identifikacija), čak i u prisustvu tipičnih kliničkih manifestacija AII. Ne prelazi 70-80%.

II. Serološke metode dijagnostika se u pravilu koristi u sumnjivim slučajevima i s negativnim rezultatima bakteriološkog pregleda fecesa. Kod djece prvih mjeseci života, to je neinformativno, ali u svim slučajevima je važno povećanje titra antitijela za 4 ili više puta. Provode se u dva smjera - određivanje titra specifičnih antitijela u krvnom serumu pacijenta i antigena u stolici.

Za određivanje titra specifičnih antitijela obično se koristi RNHA, rjeđe RPHA ili RA. Kao antigeni uzima se suspenzija dnevne kulture bakterija (RA) ili dijagnostikum eritrocita. ( RPGA, RNGA). Pouzdanije treba smatrati povećanje titra antitijela u dinamici bolesti. Specifična antitijela u krvi bolesnika s AII pojavljuju se 3.-5. dana bolesti i povećavaju se do maksimuma u roku od 2-3 tjedna, a zatim se postepeno smanjuju. Kod male djece, posebno one sa izmijenjenom premorbidnom pozadinom, specifična antitijela u krvi nisu otkrivena ili imaju niske titre (1:50 - 1:100).

U prisustvu tipičnih kliničkih simptoma i otkrivanja dijagnostičkog titra specifičnih antitijela (1:200) i više uz odgovarajući dijagnostikum), ili povećanja njihovog titra u dinamici bolesti, klinička dijagnoza crijevne infekcije treba smatra se ustanovljenim čak iu odsustvu sjemena patogena iz fecesa pacijenta.

III. Metode ekspresne dijagnostike Intestinalne infekcije se zasnivaju na detekciji antigena patogena (bakterije ili virusa) iz fecesa, za šta se koristi direktna metoda luminescentnih antitijela (PMLA) ili imunoadsorpciona metoda - reakcija aglomeracije ugljena (RCA). Preliminarni rezultat se može dobiti za 2-3 sata, a konačni za jedan dan. Specifičnost metode je 82-94,6%.

Poslednjih godina za brzu dijagnozu dijareje koriste se enzimski imunosorbentni test (ELISA) i lateks aglutinacija (RLA).

Etiološko dekodiranje virusne dijareje provodi se virološkim i bakteriološkim metodama.

Optimalnim periodom za otkrivanje virusa u izmetu smatra se od 1 do 4 dana bolesti, iako uzročnik često traje duže.

Osnovna metoda koja se koristi je metoda elektronske mikroskopije, koja omogućava, po morfološkim karakteristikama, identifikaciju širokog spektra virusnih agenasa koji uzrokuju gastroenteritis.

Koristi se i imunoelektronska mikroskopija (zasnovana na sposobnosti virusnih čestica u prisustvu homolognih seruma ili rekonvalescentnih seruma da formiraju agregate rotavirusnih čestica s imunoglobulinima.

Među metodama serodijagnostike, tradicionalne uključuju reakciju neutralizacije, inhibiciju hemaglutinacije, fiksaciju komplementa.Dva do četiri puta povećanje antitijela u parnim serumima ima retrospektivnu vrijednost za dijagnozu rotavirusne infekcije. ELISA, difuzna precipitacija, lateks aglutinacija, reakcija koaglutinacije koriste se za otkrivanje rotavirusa ili njihovih antigena.

U praktičnom radu IFA je zauzela najšire mjesto – izolacija rotavirusnih antigena u koprofilterima. Ove metode je bolje koristiti u dinamici (prvi dan hospitalizacije i nakon kliničkog oporavka).

Kako bi se isključila bakterijska etiologija AII, provodi se i bakteriološka studija fecesa inokulacijom na hranljive podloge.

sigmoidoskopija Metoda se rijetko koristi kod djece, uglavnom radi utvrđivanja uzroka produženog izlučivanja bakterija i dijagnoze dugotrajnih i kroničnih oblika bolesti. Ova metoda ispitivanja omogućava samo procjenu prirode morfoloških promjena na sluznicama distalnog crijeva, ali se ne može koristiti za postavljanje etiološke dijagnoze crijevne infekcije.

Indikacije za instrumentalni pregled (ultrazvuk, rendgenski pregled trbušnih organa, FGS) kod akutnih crijevnih infekcija je potreba za diferencijalnom dijagnozom sa hirurškim oboljenjima trbušnih organa (invaginacija, upala slijepog crijeva), somatskim bolestima (gastritis, peptički ulkus, holecistopankreatitis i dr.) i funkcionalni poremećaji gastrointestinalnog trakta.

Određivanje kliničkog oblika toksikoze (neurotoksikoza, toksikoza sa eksikozom, TSS), njenog stepena (stadijuma), vrste dehidracije kod infektivne dijareje kod dece i hitne pomoći

15.1. Karakteristike mikrobioloških i imunoloških laboratorija

Sav rad s mikrobima obavlja se u laboratorijima, koji, ovisno o glavnim zadacima, mogu biti istraživački, dijagnostički ili proizvodni.

Zdravstveni sistem ima:

Kliničko-dijagnostičke laboratorije opšte ili posebne (biohemijske, bakteriološke, imunološke, citološke i dr.) vrste koje su u sastavu bolnica, poliklinika, ambulanti i drugih zdravstvenih ustanova;

Bakteriološke laboratorije Državnog sanitarno-epidemiološkog nadzora (GSN);

Sanitarne i bakteriološke laboratorije GOS-a;

Sanitarno-hemijske laboratorije GOS-a;

Centralne (TsNIL), problemske, granske, obrazovne laboratorije univerziteta;

Specijalizovane laboratorije (posebno opasne infekcije, itd.).

Trenutno su laboratorije i veće laboratorijske institucije (odjeljenja, instituti, proizvodni pogoni) obično specijalizirane i rade sa jednom ili drugom grupom mikroba.

Virusi se rade u virološkim laboratorijama koje imaju odgovarajuću opremu i koriste posebne metode istraživanja. Postoje mikološke i protozoološke laboratorije. Specijalizovani karakter

nabavljaju se i bakteriološke laboratorije u kojima se rad koncentriše na određene grupe bakterija, na primjer, rikecijske, tuberkulozne, leptospiralne, anaerobne itd. Imunološke studije se rade u imunološkim laboratorijama, iako se određene vrste studija mogu izvoditi i u mikrobiološkim laboratorije, na primjer, serodijagnostika zaraznih bolesti.

Laboratorijski rad sa patogenim mikrobima obavlja se u posebno opremljenim laboratorijama koje osiguravaju režim rada i sigurnosne mjere koje isključuju mogućnost infekcije osoblja i curenja mikroba izvan laboratorije.

Potreba za jasnim regulisanjem uslova rada sa mikrobima, koji su u različitom stepenu opasni za laboratorijske radnike i okolno stanovništvo, dovela je do razvoja klasifikacije mikroba, koja ih deli u 4 grupe prema stepenu biološke opasnosti (klasifikacija SZO). ). U Rusiji, u skladu s preporukama SZO, patogeni mikrobi su također podijeljeni u 4 grupe: Grupa 1 - patogeni posebno opasnih infekcija; grupa 2 - uzročnici visoko zaraznih ljudskih epidemijskih bolesti; 3. grupa - uzročnici zaraznih bolesti, raspoređeni u nezavisne nozološke grupe; 4. grupa - uslovno patogeni mikrobi - uzročnici oportunističkih infekcija. Numeracija grupa mikroba usvojena u Rusiji razlikuje se obrnutim redoslijedom od klasifikacije SZO, gdje mikrobi najniže patogenosti spadaju u 1. grupu, a posebno opasni u 4. grupu.

U skladu sa podjelom mikroba na grupe prema stepenu biološke opasnosti, laboratorije su također podijeljene u kategorije. Prema nomenklaturi SZO, postoje 3 kategorije mikrobioloških laboratorija:

Osnovne (osnovne ili opšte) laboratorije, koje zbog specifičnosti rada mogu biti opremljene raznim zaštitnim uređajima;

Sigurnosne (izolovane) laboratorije i laboratorije sa posebnim režimom (maksimalno izolovane).

Sigurnost rada u laboratorijama svih kategorija obezbjeđuje se primjenom rutine i pravila rada u laboratoriji, ispunjavanjem zahtjeva za laboratorijske prostorije i njihovu opremu, obezbjeđenjem laboratorija odgovarajućom opremom.

praćenje, medicinski nadzor nad zdravstvenim stanjem zaposlenih, obuka i obuka osoblja za bezbednost u laboratoriji.

15.2. Oprema za mikrobiološke i imunološke laboratorije

Prostorije bazne laboratorije trebaju biti prostrane kako bi se osiguralo sigurno obavljanje laboratorijskog rada. Zidovi, plafoni i podovi treba da imaju glatku površinu koja se lako čisti, nepropusna za tečnosti i otporna na dezinfekciona sredstva koja se obično koriste u laboratoriji. Površina radnih stolova mora biti vodootporna, otporna na dezinfekciona sredstva, kiseline, lužine, organske rastvarače i umerenu toplotu. Laboratorijski namještaj mora biti izdržljiv. Prostor ispod stolova i između namještaja treba biti lako dostupan za čišćenje. Laboratorija treba da ima autoklav za dezinfekciju otpada.

Osnovna laboratorijska oprema treba da ograniči ili spreči kontakt mikrobiologa sa infektivnim materijalom, treba da bude izrađena od izdržljivih materijala, nepropusna za tečnosti i otporna na koroziju. Oprema mora biti projektovana i instalirana tako da se može lako očistiti, dekontaminirati i pregledati.

Laboratorija je opremljena mikroskopom, autoklavom, termostatima, ormarićima za sušenje, sterilizacijom, aparatom za koagulaciju seruma, destilatorom, centrifugama, laboratorijskim vagama, pH metrom, FEC-om, magnetnom miješalicom i kadom za pranje.

Radne prostorije laboratorije moraju biti snabdevene hladnom i toplom vodom, strujom, vakuumom, kiseonikom, vazduhom pod visokim pritiskom i dr. Neki ormarići su opremljeni kutijama i dimovodima.

Obavezni prostori obuhvataju laboratorije za crijevne i kapljične infekcije, sanitarne i bakteriološke, serološke, kao i pomoćne prostorije: srednji štednjak, vešeraj, prostoriju za sterilizaciju (čistu i prljavu), registraturu, ostave, kupatilo za zaposlene, vivarijum. U laboratorijama sa punktovima za ispitivanje na prenosivost mikroorganizama dodatno će se opremiti prijemna soba, soba za tretmane, toaleti za uzorkovanje

materijal. Uredite prostorije tako da se prljavi i čisti potoci ne ukrštaju i ne dodiruju.

Što se tiče prostorija zaštićenih laboratorija, moraju se poštovati isti zahtjevi kao i za baznu laboratoriju. Osim toga, ovakav tip laboratorije treba odvojiti od onih dijelova zgrade u kojima nije ograničeno kretanje zaposlenih. Uređaji za pranje ruku trebaju biti opremljeni uređajima za otvaranje vode nožnom pedalom ili laktom. Prozori moraju biti zatvoreni i zapečaćeni. Ulazna vrata u laboratorijske prostorije trebaju biti samozatvarajuća i zaključana. Odsisna ventilacija je projektovana tako da se u prostorijama sa najvećim rizikom od infekcije stvara najniži pritisak. U tom slučaju, kretanje zraka će se dogoditi iz pomoćnih prostorija u smjeru glavne radne prostorije. Izduvni vazduh se ispušta u okolinu tek nakon što se filtrira kroz bakterijske filtere. Prilikom opremanja visokobezbednih laboratorija opremom, rukovode se preporukama razvijenim za osnovne laboratorije, uz dodatak da se sav rad sa infektivnim materijalom u njima obavlja u zaštitnim kutijama. U režimu maksimalno izolovanih laboratorija postoji niz karakteristika koje osiguravaju maksimalnu biološku sigurnost osoblja, javnosti i životne sredine. Ulaz u laboratoriju i izlaz iz nje se vrši preko sanitarnog punkta. Na ulazu se obavezno potpuno presvući u specijalnu odjeću, a pri izlasku, prije presvlačenja, obavezna je ciljana dezinfekcija (tuširanje, dezinfekciona sredstva) osoblja. Boks se koristi za smanjenje rizika od ulaska infektivnog materijala u okolinu. Korišćenjem kutije (stolni, laminarni) stvaraju fizičke barijere kako bi se spriječio mogući kontakt radnog osoblja sa infektivnim materijalom.

15.3. Pravila za rad u mikrobiološkoj laboratoriji

Osnovna pravila za rad u baznoj laboratoriji uključuju:

Zabrana rada sa pipetom na usta;

Zabrana jela, pijenja, pušenja, čuvanja hrane i upotrebe kozmetike u radnim prostorima;

Održavanje čistoće i reda;

Dezinfekcija radnih površina najmanje jednom dnevno i nakon svakog kontakta sa infektivnim materijalom;

Pranje ruku od strane osoblja nakon rukovanja infektivnim materijalom, životinjama, prije napuštanja laboratorija;

Izvođenje svih radova na način da se minimizira mogućnost stvaranja aerosola;

Dekontaminacija svih zaraženih materijala prije odlaganja ili ponovne upotrebe.

15.4. Principi mikrobiološke dijagnostike zaraznih bolesti

Najvažnije mjesto u laboratorijskoj dijagnostici zaraznih bolesti zauzima specifična mikrobiološka dijagnostika koja se provodi u bakteriološkim, virološkim, imunološkim i drugim laboratorijama. Sastoji se od tri faze: predanalitičke, analitičke i postanalitičke.

Prva faza mikrobiološke dijagnostike je preanalitički, uključujući uzimanje materijala za istraživanje. Izbor materijala za ispitivanje određen je patogenezom i kliničkom slikom zarazne bolesti. Ispitni materijal se uzima, ako je moguće, u aseptičnim uslovima, stavlja u sterilnu posudu i dostavlja u laboratoriju što je pre moguće (po mogućnosti u roku od 1 sata). U nekim slučajevima, sjetva materijala se vrši uz krevet pacijenta. Ponekad je dozvoljeno kratkotrajno skladištenje materijala pod propisanim uslovima. Proučavani materijal prati dokument u kojem se mora naznačiti vrijeme uzimanja, priroda materijala, izvor i precizno određena svrha studije.

Materijal za istraživanja u medicinskoj mikrobiologiji su različite biološke i patološke tjelesne tekućine (krv, gnoj, urin, sputum, likvor, izmet, povraćanje, ispiranje itd.) i tkivo - biopsijski materijal iz živog ili obdukcija s leša. U sanitarnoj mikrobiologiji za istraživanje se uzimaju predmeti iz okoline (vazduh, voda, hrana itd.) ili brisevi od njih. Prilikom preuzimanja materijala

la za mikrobiološka istraživanja moraju se poštovati sljedeća pravila:

Materijal se uzima direktno iz izvora infekcije ili se ispituje odgovarajući iscjedak (gnoj, urin, žuč, itd.);

Količina materijala treba da bude dovoljna za sprovođenje studije i ponavljanje ako je potrebno;

Materijal se uzima, ako je moguće, u početnom periodu bolesti, jer se u tom periodu češće izoluju patogeni, ima ih više, imaju tipičniju lokalizaciju;

Materijal se uzima prije početka antimikrobne kemoterapije ili nakon određenog vremena nakon uzimanja antibakterijskog lijeka, neophodnog za njegovo uklanjanje iz organizma;

Neophodno je spriječiti mogućnost ulaska u materijal antimikrobnih preparata (dezinficijensa, antiseptika, antibiotika);

Transport materijala u laboratoriju treba izvršiti što je prije moguće, pod uvjetima koji isključuju smrt nestabilnih mikrobnih vrsta, ili staviti u posebne transportne medije;

Prilikom transporta moraju se poštovati sva pravila biološke sigurnosti;

Uz materijal se prilaže i prateći dokument koji sadrži osnovne podatke potrebne za provođenje mikrobiološke studije (prezime, ime, prezime pacijenta, broj anamneze, klinička dijagnoza itd.).

15.5. Metode mikrobiološke dijagnostike

Analitička faza obuhvata mikroskopske, kulturološke, biološke, serološke i alergološke metode mikrobiološke dijagnostike.

Mikroskopska metoda sastoji se u pripremi preparata (nativnih ili obojenih jednostavnim ili složenim metodama) od materijala koji se proučava i njihovo mikroskopiranje uz pomoć različitih vrsta mikroskopske opreme (svjetlosne, tamnopoljske, fazno-kontrastne, luminiscentne, elektronske itd.). U bakteriologiji se mikroskopska metoda naziva bakterioskopska, u virologiji - viroskopija.

Kulturni metod sastoji se u inokulaciji ispitnog materijala na umjetne hranjive podloge, ćelijske kulture ili pileće embrije kako bi se izolirala i identificirala čista kultura patogena ili patogena. U bakteriologiji se metoda kulture naziva bakteriološki, u mikologiji - mikološki, u protozoologiji - protozoološki, u virologiji - virološki.

biološka metoda (eksperimentalni ili biološki test) se sastoji u inficiranju osjetljivih laboratorijskih životinja ili drugih bioloških objekata (pileći embrioni, ćelijske kulture) ispitnim materijalom. Koristi se za izolaciju čiste kulture patogena, određivanje vrste toksina, aktivnosti antimikrobnih kemoterapeutskih lijekova itd.

Serološka metoda sastoji se u određivanju titra specifičnih antitijela u krvnom serumu pacijenta, rjeđe u detekciji mikrobnog antigena u ispitivanom materijalu. U tu svrhu koriste se imuni odgovori.

Alergološka metoda sastoji se u identifikaciji infektivne alergije (HRT) na dijagnostički mikrobni alergen lijeka. U tu svrhu se rade kožni alergijski testovi na odgovarajuće alergene.

Dijagnostička vrijednost ovih metoda je nejednaka. Vodeća metoda mikrobiološke dijagnostike je bakteriološka metoda, budući da omogućava izolaciju i identifikaciju uzročnika mikroba, tj. osnovni uzrok bolesti. Preostale metode su manje informativne, jer vam omogućavaju da otkrijete promjene u tijelu zbog prisustva mikroba u njemu. Drugo po važnosti je serološka metoda, budući da je interakcija antigena i antitijela karakterizirana visokim stepenom specifičnosti. Informativni sadržaj ostale tri metode je nizak i obično služe kao dodatak bakteriološkim i serološkim metodama. Dakle, mikroskopija materijala koji se proučava ne omogućava nam uvijek da vidimo i identifikujemo mikrobe pod mikroskopom. Mogu se otkriti samo kada je materijal njima jako kontaminiran. Čak i pronalaženjem bakterija pod mikroskopom, nemoguće ih je morfološki identificirati prema vrsti. Kao što je poznato, sva vrsta bakterija je svedena na 4 glavna morfološka oblika: koke, štapići, uvijeni i razgranati oblici. Stoga, prema mikro

U skopskoj slici, promatrane bakterije se vrlo okvirno mogu pripisati velikom taksonu, na primjer, gram-pozitivnim kokama. Samo u izoliranim slučajevima, kada bakterije imaju jedinstvenu morfologiju, mogu mikroskopski odrediti svoj rod. Informativni sadržaj mikroskopske metode gljiva i protozoa je veći, jer gljive i protozoe, kao eukarioti, imaju veće veličine i karakterističniju morfologiju.

Dijagnostičke mogućnosti biološke metode ograničene su činjenicom da su laboratorijske životinje imune na većinu uzročnika ljudskih antroponotskih infekcija, pa kod njih nije moguće izazvati eksperimentalnu infekciju.

Mogućnosti alergološke metode ograničene su činjenicom da većina mikroba u ljudskom tijelu ne uzrokuje HNL.

Budući da su mikrobiološke studije jedna od najskupljih vrsta laboratorijskih istraživanja, mikrobiolog se suočava sa zadatkom postavljanja pouzdane mikrobiološke dijagnoze uz što manje vremena, truda i novca. Stoga se za postavljanje dijagnoze koristi 1-5 dijagnostičkih metoda, tako da odabrani skup metoda garantuje tačan odgovor.

Od posebnog značaja su metode ekspresne dijagnostike, koje omogućavaju postavljanje mikrobiološke dijagnoze u kratkom vremenskom periodu (od nekoliko minuta do nekoliko sati) od momenta isporuke materijala za ispitivanje u laboratoriju. Ekspresne metode uključuju RIF, ELISA, RIA, PCR, upotrebu biočipova, hromatografiju, itd. Karakteristike dijagnoze anaerobnih infekcija opisane su u materijalima diska.

Uz tradicionalne klasične metode mikrobiološke dijagnostike, posljednjih godina sve su važnije molekularne biološke dijagnostičke metode (DNK sonde, PCR, ligazna lančana reakcija - LCR, hromatografija, elektroforeza, imunoblot, biočipovi itd.).

Metode molekularne biološke dijagnostike zasnivaju se na identifikaciji DNK i RNK specifičnih za datu mikrobnu vrstu, a uključuju hibridizaciju zasnovanu na DNK sondi i dijagnostiku zasnovanu na PCR-u.

postanalitički faza mikrobiološke dijagnostike sastoji se u kliničkoj interpretaciji rezultata laboratorijskih pretraga. Istovremeno, ljekar koji prisustvuje treba procijeniti etiološki značaj mikroba izolovanih od pacijenta, prilagoditi empirijsku antimikrobnu kemoterapiju koja se daje pacijentu na osnovu podataka mikrobiološkog praćenja itd.

15.5.1. Metode mikrobiološke dijagnostike bakterijskih infekcija

U bakteriologiji se koriste bakterioskopske, bakteriološke i biološke metode za otkrivanje patogena u ispitivanom materijalu.

Prednosti bakterioskopske metode su jednostavnost, brzina, ekonomičnost. Međutim, on nalazi ograničenu upotrebu, jer se može koristiti samo ako postoje morfološke ili tinktorijalne karakteristike patogena i njegov dovoljan sadržaj u materijalu za ispitivanje. Ova metoda je indikativna.

Glavna i najpreciznija metoda za dijagnosticiranje bakterijskih infekcija je bakteriološka, ​​koja se koristi za gotovo sve bolesti, unatoč svojim nedostacima: trajanje studije (od 4-5 dana do 2 mjeseca), opasnost (od čiste kulture patogena akumulira), relativno visok trošak. U slučaju da se očekuje da ispitni materijal sadrži patogene u dovoljnim količinama, materijal se sije na guste hranjive podloge kako bi se dobile izolirane kolonije. Sa niskim sadržajem mikroba, ispitni materijal se prvo sije na tečne hranljive podloge - podloge za obogaćivanje. Izolovana čista kultura se identifikuje po morfološkim, tinktorijalnim, kulturnim, biohemijskim, antigenskim i toksigenim svojstvima (u zavisnosti od vrste patogena). Definicija navedenih svojstava vam omogućava da postavite vrstu patogena. U svrhu epidemiološkog obilježavanja vrši se intraspecifična identifikacija izolirane kulture: određuje se njen fagovar, biovar i dr. Osim toga, radi propisivanja racionalnog tretmana, u pravilu se utvrđuje osjetljivost izolirane kulture na antibiotike.

U mikrobiološkoj dijagnostici bolesti uzrokovanih oportunističkim mikrobima, predstavnicima normalne mikroflore, obavezno je određivanje broja patogena u ispitivanom materijalu.

Biološka metoda je neekonomična, nehumana i stoga nalazi ograničenu primjenu. Kao pokusne životinje koriste se bijeli miševi, zamorci, zečevi, majmuni i druge životinje.

Dijagnoza zarazne bolesti može se postaviti i serološkom metodom, koja omogućava otkrivanje ili specifičnih antitijela u serumu pacijenta, ili specifičnih antigena direktno u test materijalu. Antitijela na uzročnika bolesti pojavljuju se u pravilu do kraja prve sedmice bolesti. Nemogućnost njihovog otkrivanja u prvim danima bolesti ozbiljan je nedostatak metode, posebno u slučajevima kada je bolest akutna. Osim toga, mnoge bolesti zahtijevaju proučavanje stvaranja antitijela u dinamici i otkrivanje povećanja broja antitijela, što također ne omogućava brzu dijagnozu. Nedostatak metode je što ne može precizno identificirati patogen i odrediti njegov antibiogram. Ali u isto vrijeme, to je potpuno sigurna, relativno jeftina metoda koja vam omogućava da postavite dijagnozu u kratkom vremenu. Trenutno se kod brojnih bolesti određuju ne samo količine, već i klase imunoglobulina.

U nekim bolestima serološka metoda se koristi za otkrivanje specifičnih antigena u ispitivanom materijalu. Budući da se specifični antigeni koji čine patogen nalaze u patološkom materijalu od prvih minuta bolesti, ova varijanta serološke metode se koristi za ubrzanu (u toku prvog dana bolesti) ili čak ekspresnu dijagnostiku (u roku od nekoliko sati) zarazne bolesti.

Kao pomoćno sredstvo u maloj grupi zaraznih bolesti koristi se alergološka metoda koja omogućava otkrivanje preosjetljivosti na specifični antigen (alergen), koji je uzročnik bolesti.

15.5.2. Metode mikrobiološke dijagnostike virusnih infekcija

U virologiji metode laboratorijske dijagnostike virusnih infekcija imaju svoje specifičnosti, uzimajući u obzir karakteristike biologije virusa. Koriste se viroskopske, virološke i serološke metode laboratorijske dijagnostike.

Metoda viroskopije se sastoji u otkrivanju virusa u ispitivanom materijalu pod mikroskopom. Češće se koristi elektronski mikroskop, rjeđe fluorescentni mikroskop. Zbog zanemarive veličine virusa, svjetlosna mikroskopija se praktički ne koristi. Svjetlosni mikroskop može se koristiti samo za detekciju velikih virusa, korištenjem metoda superbojenja. Osim toga, uz pomoć svjetlosnog mikroskopa mogu se otkriti intracelularne inkluzije koje nastaju u zahvaćenim stanicama tijekom određenih infekcija.

Virološka metoda se sastoji u inficiranju osjetljivog biološkog modela (laboratorijske životinje, pileći embriji ili ćelijske kulture) testnim materijalom, naznačavajući virus i njegovu naknadnu identifikaciju. Kada su laboratorijske životinje inficirane, virusi se indiciraju, u pravilu, prema kliničkoj slici bolesti, približno patološkim i anatomskim promjenama i na kraju, na primjer, reakcijom hemaglutinacije. Ista reakcija omogućava otkrivanje virusa u pilećem embrionu, koji u pravilu ne pokazuje vidljive promjene prilikom otvaranja. U ćelijskoj kulturi prisustvo virusa određuje se citopatskim djelovanjem (uključujući stvaranje intracelularnih inkluzija), hemadsorpcijom, pojavom stvaranja plaka, reakcijom hemaglutinacije i odsutnošću promjene boje indikatora. Identifikacija virusa se vrši serološkim testovima (RPGA, RTGA, RN, RSK, ELISA itd.). Virološka metoda omogućava vam da precizno odredite prirodu patogena, ali zahtijeva dovoljno vremena (5-7 dana ili više), značajne materijalne troškove i nije sigurna.

Karakteristika serološke metode u virologiji je proučavanje uparenih seruma. Prvi serum se uzima od bolesnika u akutnom periodu na početku bolesti, čuva se na temperaturi od 4-8°C, a drugi serum se uzima nakon 10-14 dana. Serumi

istražuje u isto vrijeme. Bolest se dokazuje serokonverzijom, tj. povećanje titra antitijela u drugom serumu u odnosu na prvi. Serokonverzija 4 ili više puta je dijagnostička. Budući da su mnoge virusne bolesti akutne, ova varijanta serološke metode obično se koristi za retrospektivnu dijagnozu.

Vodeća metoda laboratorijske dijagnostike virusnih infekcija je virološka.

Ubrzana i ekspresna dijagnostika virusnih bolesti vrši se na isti način kao i kod bakterijskih infekcija.

15.5.3. Karakteristike mikrobiološke dijagnostike mikoza

Mikroskopska metoda se obično koristi za dijagnosticiranje gljivičnih infekcija. Mikološka metoda se sastoji u sejanju patološkog materijala na posebne hranljive podloge, izolaciji čiste kulture patogena i identifikaciji po morfološkim, kulturnim i biohemijskim svojstvima. Karakteristika ove metode je njeno trajanje - nekoliko sedmica zbog sporog rasta gljivica. Otkrivanje antitela tokom serološkog pregleda moguće je od 2.-4. nedelje bolesti. Kod nekih bolesti, specifični antigeni se otkrivaju u test materijalu. Alergološka metoda se rijetko koristi. Često se kod mikoza koristi histološka metoda koja se sastoji u otkrivanju elemenata gljive (spore, konidijalne glave itd.) U organima i tkivima zahvaćenim gljivicama. U tu svrhu se pripremaju histološki tanki ili ultratanki isječci tkiva, boje se posebnim histološkim i histohemijskim metodama i pregledavaju svjetlosnom i po potrebi elektronskom mikroskopijom.

15.5.4. Osobine mikrobiološke dijagnostike protozojskih infekcija

Mikroskopsko ispitivanje patološkog materijala sastoji se od pripreme i nativnih preparata (“debele kapi”) i razmaza obojenih po metodi Romanovsky-Giemsa i glavna je metoda za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih protozoama. U nekim slučajevima se koriste serološke i alergološke dijagnostičke metode.

15.6. Principi imunološke dijagnostike ljudskih bolesti

Imunodijagnostika je dio imunologije koji proučava i razvija metode za dijagnosticiranje infektivnih i neinfektivnih bolesti povezanih s funkcijom imunološkog sistema.

Mnoge zarazne bolesti su danas pretrpjele značajne promjene, što se ogleda u povećanju udjela lakših, izbrisanih i asimptomatskih oblika, povećanju alergijske komponente, te visokoj učestalosti mješovitih infekcija. To otežava tradicionalnu dijagnostiku bolesti, pa je sve veći značaj imunodijagnostike, usmjerene na traženje antigena patogena ili specifičnih imunoloških promjena u tijelu pacijenta.

Pod imunoreaktivnošću (imuni status, imuni profil) podrazumijeva se sposobnost imunog sistema da imuni odgovor u datom trenutku. Karakterizira ga koncentracija imunoglobulina, broj limfocita i leukocita, omjer T- i B-ćelija i funkcionalni indikatori, posebno sposobnost imunokompetentnih stanica da odgovore na stimulaciju.

15.7. Kontrola kvaliteta laboratorijskih istraživanja

Važan element rada mikrobiološke i imunološke laboratorije je dobijanje tačnih i uporedivih rezultata ispitivanja, za šta je neophodna kontrola kvaliteta studija. Kontrola kvaliteta može biti interna ili eksterna.

Intralaboratorijska kontrola kvaliteta - sistem kontrolnih mjera koje se u posebnoj laboratoriji sprovode od strane osoblja ove laboratorije i imaju za cilj obezbjeđivanje odgovarajućeg nivoa kvaliteta rada laboratorije.

Eksterna kontrola kvaliteta - sistem kontrolnih mjera koje se provode u okviru jedinstvenog Federalnog sistema za eksternu ocjenu kvaliteta (FSVOK) laboratorijskih istraživanja od strane grupa stručnjaka i usmjerene su na osiguranje ispravne organizacije tehnoloških procesa za proizvodnju laboratorijskih istraživanja.

Federalni sistem eksterne procjene kvaliteta laboratorijskih istraživanja sastoji se od odjeljaka u okviru kojih svaki

vrši se procjena kvaliteta određene vrste laboratorijskih istraživanja. Struktura FSVOK-a uključuje stručne grupe za razvoj i implementaciju eksterne kontrole kvaliteta u različitim vrstama laboratorijskih istraživanja.

Zadaci za samoobuku (samokontrola)

A.Navedite metodu mikrobiološkog istraživanja koja omogućava utvrđivanje vrste patogena:

1. Alergični.

2. Mikroskopski.

3. Kulturni.

4. Biološki.

B.Navedite glavni zadatak metode bakteriološkog istraživanja.

b.Serum je uzet od pacijenta sa sumnjom na virusnu infekciju 7. dana bolesti, kod kojeg su pronađena specifična antivirusna antitijela. Procijenite pouzdanost rezultata istraživanja.

G.Navedite vrstu laboratorije u koju treba poslati materijal od pacijenta za kojeg se sumnja da ima posebno opasnu infekciju.

Virološke metode istraživanja— metode za proučavanje biologije virusa i njihovu identifikaciju. U virologiji se široko koriste metode molekularne biologije, uz pomoć kojih je bilo moguće utvrditi molekularnu strukturu virusnih čestica, kako one prodiru u ćeliju i karakteristike reprodukcije virusa, primarnu strukturu virusnih nukleinskih kiselina. i proteini. Razvijaju se metode za određivanje redoslijeda sastavnih elemenata virusnih nukleinskih kiselina i proteinskih aminokiselina. Postaje moguće povezati funkcije nukleinskih kiselina i proteina koji su njima kodirani s nukleotidnom sekvencom i utvrditi uzroke unutarćelijskih procesa koji igraju važnu ulogu u patogenezi virusne infekcije.

Virološke metode istraživanja također se temelje na imunološkim procesima (interakcija antigena s antitijelima), biološkim svojstvima virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemolize, enzimska aktivnost), osobinama interakcije virusa sa ćelijom domaćinom (priroda citopatske efekat, formiranje intracelularnih inkluzija itd.) .

U dijagnostici virusnih infekcija, u uzgoju, izolaciji i identifikaciji virusa, kao i u pripremi vakcinskih preparata, široko se koristi metoda kulture tkiva i ćelija. Koriste se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane i diploidne ćelijske kulture. Primarne kulture se dobijaju raspršivanjem tkiva proteolitičkim enzimima (tripsin, kolagenaza). Izvor ćelija mogu biti tkiva i organi (češće bubrezi) ljudskih i životinjskih embrija. Suspenzija stanica u hranjivom mediju stavlja se u takozvane madrace, boce ili Petrijeve posude, gdje se, nakon pričvršćivanja na površinu posude, stanice počinju razmnožavati. Za infekciju virusom obično se koristi stanični monosloj. Hranljiva tečnost se odvodi, virusna suspenzija se unosi u određenim razblaženjima, a nakon kontakta sa ćelijama dodaje se svež hranljivi medij, obično bez seruma.

Ćelije iz većine primarnih kultura mogu se subkulturisati i nazivaju se sekundarnim kulturama. Daljnjim prolaskom ćelija formira se populacija ćelija sličnih fibroblastima, sposobnih za brzu reprodukciju, od kojih većina zadržava originalni skup hromozoma. To su takozvane diploidne ćelije. Serijskom kultivacijom ćelija dobijaju se stabilne kontinuirane ćelijske kulture. Tokom pasaža pojavljuju se brzo dijeleće se homogene ćelije sa heteroploidnim skupom hromozoma. Stabilne ćelijske linije mogu biti jednoslojne i suspenzijske. Jednoslojne kulture rastu u obliku kontinuiranog sloja na staklenoj površini, suspenzijske kulture rastu u obliku suspenzija u različitim posudama uz pomoć miješalica. Postoji preko 400 ćelijskih linija koje potiču od 40 različitih životinjskih vrsta (uključujući primate, ptice, gmizavce, vodozemce, ribe, insekte) i ljudi.

Komadi pojedinih organa i tkiva (kulture organa) mogu se uzgajati u vještačkim hranljivim podlogama. Ove vrste kultura čuvaju strukturu tkiva, što je posebno važno za izolaciju i prolaz virusa koji se ne razmnožavaju u nediferenciranim kulturama tkiva (na primjer, koronavirusi).

U inficiranim ćelijskim kulturama virusi se mogu otkriti promjenom ćelijske morfologije, citopatskim djelovanjem koje može biti specifično, pojavom inkluzija, određivanjem virusnih antigena u ćeliji i u tečnosti kulture; određivanje bioloških svojstava virusnog potomstva u tečnosti kulture i titracija virusa u kulturi tkiva, pilećih embriona ili osetljivih životinja; otkrivanjem pojedinačnih virusnih nukleinskih kiselina u ćelijama molekularnom hibridizacijom ili klastera nukleinskih kiselina citokemijskom metodom pomoću fluorescentne mikroskopije.

Izolacija virusa je naporan i dugotrajan proces. Provodi se kako bi se utvrdio tip ili varijanta virusa koji cirkulira među populacijom (na primjer, da bi se identificirala serovarijanta virusa gripe, divljeg ili vakcinalnog soja virusa dječje paralize, itd.); u slučajevima kada je potrebno sprovesti hitne epidemiološke mere; kada se pojave novi tipovi ili varijante virusa; ako je potrebno, potvrdite preliminarnu dijagnozu; za indikaciju virusa u objektima okoline. Prilikom izolacije virusa uzima se u obzir mogućnost njihove perzistencije u ljudskom organizmu, kao i pojava mješovite infekcije uzrokovane sa dva ili više virusa. Genetski homogena populacija virusa dobijena iz jednog viriona naziva se virusni klon, a proces njegovog dobijanja naziva se kloniranje.

Za izolaciju virusa, infekcije osjetljivih laboratorijskih životinja, koriste se pileći embriji, ali se najčešće koristi kultura tkiva. Prisutnost virusa se obično utvrđuje specifičnom degeneracijom ćelije (citopatski efekat), formiranjem simplasta i sincicija, detekcijom intracelularnih inkluzija, kao i specifičnim antigenom otkrivenim imunofluorescencijom, hemadsorpcijom, hemaglutinacijom (kod hemaglutinirajućih virusa) itd. . Ovi znakovi se mogu otkriti tek nakon 2-3 prolaza virusa.

Za izolaciju niza virusa, kao što su virusi gripe, koriste se pileći embriji, za izolaciju nekih Coxsackie virusa i niza arbovirusa koriste se novorođeni miševi. Identifikacija izoliranih virusa provodi se serološkim testovima i drugim metodama.

Prilikom rada s virusima određuje se njihov titar. Titracija virusa se obično provodi u kulturi tkiva, određujući najveće razrjeđenje tekućine koja sadrži virus, pri čemu dolazi do degeneracije tkiva, formiranja inkluzija i virusa specifičnih antigena. Metoda plaka može se koristiti za titriranje brojnih virusa. Plakovi ili negativne kolonije virusa su žarišta virusom uništenih ćelija jednoslojne kulture tkiva pod prevlakom agar. Brojanje kolonija omogućava kvantitativnu analizu infektivne aktivnosti virusa na osnovu toga da jedna čestica infektivnog virusa formira jedan plak. Plakovi se identifikuju bojenjem kulture vitalnim bojama, obično neutralnom crvenom; plakovi ne adsorbiraju boju i stoga su vidljivi kao svjetlosne mrlje na pozadini obojenih živih stanica. Titar virusa izražava se kao broj jedinica koje formiraju plak u 1 ml.

Pročišćavanje i koncentracija virusa se obično provodi diferencijalnim ultracentrifugiranjem nakon čega slijedi centrifugiranje u gradijentima koncentracije ili gustoće. Za pročišćavanje virusa koriste se imunološke metode, ionsko-izmjenjivačka hromatografija, imunosorbenti itd.

Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uključuje otkrivanje patogena ili njegovih komponenti u kliničkom materijalu; izolacija virusa iz ovog materijala; serodijagnostika. Izbor laboratorijske dijagnostičke metode u svakom pojedinačnom slučaju ovisi o prirodi bolesti, periodu bolesti i mogućnostima laboratorije. Savremena dijagnostika virusnih infekcija bazira se na ekspresnim metodama koje omogućavaju dobijanje odgovora nekoliko sati nakon uzimanja kliničkog materijala u ranim stadijumima bolesti, uključujući elektronsku i imunološku elektronsku mikroskopiju, kao i imunofluorescenciju, metodu molekularne hibridizacije, otkrivanje antitela klase lgM itd.

Elektronska mikroskopija negativno obojenih virusa omogućava diferencijaciju virusa i određivanje njihove koncentracije. Upotreba elektronske mikroskopije u dijagnostici virusnih infekcija ograničena je na one slučajeve kada je koncentracija virusnih čestica u kliničkom materijalu dovoljno visoka (10 5 u 1 ml i više). Nedostatak metode je nemogućnost razlikovanja virusa koji pripadaju istoj taksonomskoj grupi. Ovaj nedostatak se eliminiše upotrebom imunološke elektronske mikroskopije. Metoda se zasniva na stvaranju imunoloških kompleksa kada se virusnim česticama doda specifični serum, a istovremeno dolazi do koncentracije virusnih čestica, što omogućava njihovu identifikaciju. Metoda se također koristi za otkrivanje antitijela. U svrhu ekspresne dijagnostike vrši se elektronski mikroskopski pregled ekstrakata tkiva, fecesa, tečnosti iz vezikula i sekreta iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija se široko koristi za proučavanje morfogeneze virusa; njene mogućnosti se proširuju upotrebom obilježenih antitijela.

Metoda molekularne hibridizacije, zasnovana na detekciji nukleinskih kiselina specifičnih za virus, omogućava otkrivanje pojedinačnih kopija gena i nema premca u smislu osjetljivosti. Reakcija se zasniva na hibridizaciji komplementarnih lanaca DNK ili RNK (sonde) i formiranju dvolančanih struktura. Najjeftinija sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena radioaktivnim prekursorima (obično radioaktivnim fosforom). Upotreba kolorimetrijskih reakcija je obećavajuća. Postoji nekoliko varijanti molekularne hibridizacije: tačkasta hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija itd.

Antitijela klase lgM pojavljuju se ranije od antitijela klase G (3-5. dana bolesti) i nestaju nakon nekoliko sedmica, pa njihovo otkrivanje ukazuje na nedavnu infekciju. Antitijela IgM klase se otkrivaju imunofluorescencijom ili enzimskim imunotestom korištenjem anti-m antiseruma (anti-IgM seruma teškog lanca).

Serološke metode u virologiji temelje se na klasičnim imunološkim reakcijama (vidi. Imunološke metode istraživanja ): reakcije fiksacije komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka neutralizacija, imunodifuzija, indirektna hemaglutinacija, radijalna hemoliza, imunofluorescencija, enzimski imunotest, radioimunotest. Razvijene su mikrometode za mnoge reakcije, a njihove tehnike se kontinuirano usavršavaju. Ove metode se koriste za identifikaciju virusa korištenjem skupa poznatih seruma i za serodijagnostiku kako bi se utvrdilo povećanje antitijela u drugom serumu u odnosu na prvi (prvi serum se uzima u prvim danima nakon bolesti, drugi - nakon 2-3 sedmice). Dijagnostička vrijednost nije manja od četverostrukog povećanja antitijela u drugom serumu. Ako otkrivanje antitijela lgM klase ukazuje na nedavnu infekciju, tada antitijela lgC klase perzistiraju nekoliko godina, a ponekad i doživotno.

Za identifikaciju pojedinačnih antigena virusa i antitijela na njih u složenim smjesama bez prethodnog pročišćavanja proteina, koristi se imunoblotiranje. Metoda kombinuje frakcionisanje proteina korišćenjem elektroforeze u poliakrilamidnom gelu sa naknadnim imunotestom proteina enzimskim imunotestom. Odvajanje proteina smanjuje zahtjeve za hemijskom čistoćom antigena i omogućava identifikaciju pojedinačnih parova antigen-antitijelo. Ovaj zadatak je relevantan, na primjer, u serodijagnostici HIV infekcije, gdje su lažno pozitivne reakcije enzimske imunoanalize uzrokovane prisustvom antitijela na ćelijske antigene, koja su prisutna kao rezultat nedovoljnog pročišćavanja virusnih proteina. Identifikacija antitela u serumu pacijenata na unutrašnje i spoljašnje virusne antigene omogućava određivanje stadijuma bolesti, au analizi populacija i varijabilnost virusnih proteina. Imunobloting kod HIV infekcije koristi se kao potvrdni test za otkrivanje pojedinačnih virusnih antigena i antitijela na njih. Prilikom analize populacija, metoda se koristi za određivanje varijabilnosti virusnih proteina. Velika vrijednost metode je u mogućnosti analize antigena sintetiziranih tehnologijom rekombinantne DNK, utvrđivanja njihove veličine i prisutnosti antigenskih determinanti.

Glavne metode koje se koriste u dijagnostici virusnih bolesti su uzgoj i identifikacija virusa.

Da bi se dokazala virusna etiologija bolesti, potrebno je virus izolirati iz tijela bolesne ribe, prenijeti ga na kulturu stanica ili osjetljivu ribu, reproducirati bolest kod zdravih riba iste ili srodne vrste i ponovno izolirati isti virus iz eksperimentalnih životinja.

Za identifikaciju virusa koristi se nekoliko komplementarnih metoda: elektronska mikroskopija virusa, proučavanje njegovih fizičko-hemijskih svojstava, otkrivanje karakterističnih morfoloških promjena u inficiranim stanicama i simptoma kod zaraženih životinja, različite imunološke metode.

Virusi se izoluju uglavnom na jednoslojnim primarnim ili presađenim ćelijskim kulturama, birajući kulture koje su u svakom slučaju osjetljive na dati virus. Za dobivanje primarnih kultura ribljih stanica najčešće se koriste spolne žlijezde ženke ili karasa. Gonade treba da budu II ili II-III stepena zrelosti prema Kiselevičevoj skali. Takve gonade ne sadrže jajašca vidljiva golim okom. Inače će sadržaj jaja negativno utjecati na rast stanica. Ćelijske kulture iz spolnih žlijezda šarana i karasa pripremaju se prema odobrenoj metodi.

Kao kontinuirane kulture, najčešće se koriste sljedeće ćelijske linije: FHM - iz tkiva kaudalne peteljke debeloglave goveđe; RTG - od gonada kalifornijske pastrmke; EPC - od izraslina velikih boginja na koži šarana. Ove linije se održavaju u specijalizovanim laboratorijama za proučavanje bolesti riba veterinarskih i ribarskih istraživačkih instituta, gde se mogu naručiti i primiti.

Prilikom dijagnosticiranja dobro proučenih virusnih bolesti, ispituju se organi i tkiva u kojima je koncentriran patogen.

U slučaju bolesti riba, o kojima nema dovoljno podataka, virološki se ispituju najugroženiji organi. Struganje sa kože i škrga, komadići ovih organa, zajedno sa sluzi, stavljaju se u sterilne bočice sa 2-3 ml sterilne fiziološke otopine ili puferske otopine. Uzorci iz unutrašnjih organa uzimaju se u strogo aseptičnim uslovima.

U slučajevima kada je nemoguće brzo ispitati materijal, čuva se ne više od jednog dana u hladnjaku na temperaturi ne višoj od 5 ° C. Zamrznuti materijal može se čuvati duže vrijeme.

Patološki materijal namijenjen za istraživanje usitnjava se u homogenizatoru ili melje u porculanskom malteru s kvarcnim pijeskom. 10% suspenzija se priprema od usitnjenog tkiva u Hank's, Earl's rastvorima, puferu ili fiziološkom rastvoru i centrifugira 10-15 minuta na 2000-3000 rpm, supernatant se odsisa pipetom i stavi u sterilne bočice. Ako suspenzija nije sterilna, pripremljeni materijali se filtriraju kroz membranske filtere sa prečnikom pora od 0,2-0,45 µm ili tretiraju antibioticima (penicilin 1000 IU/ml i streptomicin 1000 µg/ml).

Od crijevnog sadržaja u sterilnoj destilovanoj vodi priprema se 20% suspenzija i centrifugira 10-15 minuta na 2000 o/min. Supernatant se ponovo centrifugira na 4000-5000 o/min tokom 30 minuta. Supernatant se zatim aspirira u sterilnu bočicu i tretira antibioticima. Za 1 ml dodajte 1000 µg/ml streptomicina i 1000 IU/ml penicilina. Smjesa se drži 2-3 sata na: sobnoj temperaturi. Svi materijali su testirani na bakterijsku sterilnost inokulacijom na BCH i MPA. Pripremljeni materijali se odmah koriste za rad ili, u ekstremnim slučajevima, čuvaju u smrznutom stanju (na temperaturi od minus 20°C).

Infekcija ćelijske kulture. Za infekciju se koriste epruvete sa dobrim monoslojem ćelija ili zonom rasta oko eksplantata. Hranljivi medij se isisa i u svaku epruvetu se doda 0,2-0,3 ml test suspenzije. Istovremeno se u epruvete dodaje 0,8-0,9 ml hranljive podloge sa 2-3% seruma.

Materijal pripremljen od svakog uzorka inficira se kulturom tkiva u 4-6 epruveta. Iz svake serije studija, isti broj epruveta se ostavlja kao kontrole, dodajući im 1 ml hranljive podloge. Epruvete se ostavljaju na sobnoj temperaturi 1-2 sata radi adsorpcije virusa na ćelije, zatim se supernatantna tečnost odsisava pipetom i dodaje se hranljivi medij u prvobitni volumen.

Zaražene i kontrolne ćelijske kulture inkubiraju se na temperaturi od 22-26°C i svakodnevno se pregledavaju pod malim povećanjem mikroskopa kako bi se otkrile morfološke promjene koje se pojavljuju u stanicama. Kod teške ćelijske degeneracije, tečnost kulture se aspirira i prave se pasaži, a u nedostatku citopatogenog efekta (CPE), izvode se dva uzastopna pasaža. Da biste to učinili, koristite tečnost kulture zajedno sa ćelijskom frakcijom uništenom ponovljenim zamrzavanjem i odmrzavanjem. Supernatant centrifugirane ćelijske mase koristi se za inficiranje svježih kultura. CPP nakon trećeg pasusa uzima se u obzir kao specifično djelovanje virusnog agensa.

Stepen oštećenja monosloja ćelije se procenjuje prema sistemu 4 ukrštanja; "+" - oštećenje do 25%, "+ +" - do 50%, "+ + +" - do 75% i "+ + + +" - do 100% monosloja.

Kod nekih virusnih bolesti riba, inkluzijska tijela se pojavljuju u stanicama (citoplazma jezgra) različitih organa i tkiva. Materijal za proučavanje virusnih inkluzija su zaražene kulture tkiva, struganje i bris-otisci sa organa i tkiva, naznačeni materijali se fiksiraju prije bojenja prema opšteprihvaćenim metodama, korištenjem Dubosque-Brazil-Bouena, Bouena, Carnoy tekućine ili 10% rastvor neutralnog formalina.

Virusne inkluzije se boje različitim metodama: prema Muromtsev, ruby, Mann, Sellex, Klisenko, Romanovsky-Giemsa, May-Grunald-Giemsa, itd.

Titracija virusa- kvantitativno određivanje aktivnosti virusa. Titar virusa se izražava kao broj infektivnih jedinica sadržanih u jedinici zapremine suspenzije virusa. Infektivnom jedinicom virusa smatra se takva doza koja izaziva infekciju u 50% osjetljivih objekata zaraženih njime. Ova doza virusa naziva se infektivnom i označena je ID 50.

Ćelijske kulture se uglavnom koriste kao osjetljivi objekti u titraciji ribljih virusa. Titracija u ćelijskoj kulturi vrši se prema citopatogenom dejstvu virusa. U ovom slučaju, ID 50 se naziva tkivna citopatogena doza (TCD 50), a titar virusa se izražava kao količina TCD 50 u 1 ml virusne suspenzije. Titar virusa se određuje metodom konačnog razrjeđivanja. Prema ovoj metodi, osjetljive ćelijske kulture ubrizgavaju određenu količinu virusne suspenzije u sukcesivno rastućim razrjeđenjima i, uzimajući u obzir rezultat za svaku injekciju kao pozitivan (ako je CPE prisutan) ili negativan ako CPE nema, krajnja točka titracija se izračunava - 1 TCD 50 .

Za titraciju virusa koji daju izraženu CPP koristi se i metoda plaka. U ovom slučaju, monosloj ćelija inficiranih virusom prelije se mješavinom hranjivog medija s agarom kako bi se spriječio prijenos virusa na druge stanice koje su značajno udaljene od inicijalno zaraženih i kako bi mogle inficirati početna žarišta. infekcije plaka).

Svaki plak nastaje iz jedne infektivne jedinice, koja je označena kao PFU (plaque-forming unit), a titar virusa se izražava kao broj PFU po jedinici zapremine suspenzije.

Reakcija neutralizacije(PH) u ćelijskoj kulturi.

Reakcija se zasniva na vezivanju antigena antitijelima homolognog antiseruma. Reakcija se koristi za identifikaciju patogena u dijagnozi bolesti virusne etiologije. Omogućava vam da pomoću poznatih antitijela odredite nepoznati virusni antigen ili poznati (standardni) antigen - nepoznata antitijela u serumu bolesnih ili oporavljenih riba.

Određivanje izolovanog virusa u reakciji neutralizacije provodi se pomoću seta dijagnostičkih hiperimunih antiseruma (antitijela) antigena (virusa) koji su im homologni.

Hiperimuni antiserumi se dobivaju inficiranjem laboratorijskih životinja (na primjer, zečeva) poznatim sojevima virusa koji uzrokuju bolesti riba. Dobijeni antiserumi određuju titar specifičnih antitijela. Za rad se uzimaju antiserumi koji sadrže antitijela u visokim titrima.

Redosled reakcije.

1. Inaktivacija normalnog i hiperimunog seruma zagrijavanjem na 56°C u trajanju od 30 minuta.

2. Priprema razblaženja reakcionih sastojaka. Antigen i serum se razblažuju hranljivom podlogom bez seruma i antibiotika, počevši od 1:5, 1:50, 1:500 pa sve dok se ne dobije razblaživanje sa sadržajem manjim od 1 TCD 50 / 0,2 ml. Hiperimuni serum se razblaži 1:2 ili 1:5. Kod niskog titra serum se koristi nerazblažen. Normalni serum se razrjeđuje na isti način kao i hiperimuni serum.

3. Izjava o reakciji. Tri reda sterilnih epruveta se stavljaju u stalak. U prvi red se sipa razblaženi hiperimuni serum, u drugi razblažen normalni serum, a u treći hranljivi medij. Svaki sastojak se dodaje u zapremini od 0,5 ml.

Pripremljena razblaženja virusa prenose se u 0,5 ml u odgovarajuće epruvete svakog od tri reda, a virus svakog razblaženja I prenosi se posebnom pipetom, počevši od najvećeg razblaženja. Tako se u svakom redu epruveta dobijaju serijska 10-struka razrjeđenja virusa: 10-1, 10-2 itd.

Za kontrolu toksičnosti seruma, 0,5 ml pripremljenog razrjeđenja hiperimunog seruma dodaje se u posebnu epruvetu, a zatim se dodaje jednaka količina hranjivog medija. Isto se radi i sa normalnim serumom.

Temeljno protresite epruvete sa mješavinama i inkubirajte na sobnoj temperaturi 1 sat. Zatim inficirajte staničnu kulturu sa svakim razblaženjem virusa (0,2 ml po epruveti) hiperimunim normalnim serumom i hranljivim medijumom, 4 epruvete ćelijske kulture. Paralelno, stavite kontrole toksičnosti korištenih ćelija i kontrolne uzorke stanične kulture.

Epruvete sa staničnom kulturom inkubiraju se u termostatu na optimalnoj temperaturi za reprodukciju ovog virusa i svakodnevno se pregledavaju pod malim povećanjem mikroskopa kako bi se otkrio CPE virusa. Rezultati se unose u tabelu (Tabela 11).

Titar virusa se izražava kao broj infektivnih jedinica sadržanih u jedinici zapremine suspenzije virusa. Pronađite indeks neutralizacije (IN). Odgovara maksimalnoj količini ID 50 koja se može neutralizirati hiperimunim serumom. Izračun IN vodi se po formuli: lgIN = lgT 1 -lgT 2 gdje je T 1 - titar virusa u prisustvu normalnog seruma; T 2 - titar virusa u prisustvu hiperimunog seruma. Vrijednost IN se nalazi iz tabele antilogaritama. Uobičajeno je da se vrijednost IN do 10 smatra negativnim, od 10 do 49 - sumnjivim, 50 ili više - pozitivnim rezultatom.

Rezultati reakcije mogu se smatrati pouzdanim samo ako se hiperimuni serum testira na specifičnu neutralizirajuću aktivnost. Da biste to učinili, unaprijed odredite titar neutralizirajućih antitijela u ovom serumu ili njegov indeks neutralizacije u reakciji s homolognim virusom.

Izolacija plaka rabdovirusa. Ova metoda je specifična, koristi se za izolaciju, preliminarnu tipizaciju i selekciju rabdovirusa šarana i pastrmke u prisustvu specifičnih imunoloških seruma za identifikaciju virusa.

Zaobljene kolonije (plakovi) se formiraju u ćelijskim kulturama pod prevlakom od agara u prisustvu virusa u ispitivanom materijalu.

U aseptičnim uslovima, tkivo bubrega, jetre, slezene i tečnosti iz trbušne šupljine sakupljaju se Pasteurom pipetom, prebacuju u bočicu sa medijumom koji sadrži 500 IU (mcg)/ml antibiotika u omjeru 1:10. inkubirano 60-90 minuta na temperaturi od 18-22 °C, zatim centrifugirano na 2-3 hiljade o/min 10 minuta. Supernatant se razblaži hranljivim medijumom 1:10 (razblaživanje 1:100). Oba razrjeđenja supernatanta se koriste za inficiranje ćelijskih kultura.

Za studiju, 3-dnevna kontinuirana ćelijska kultura uzgajana u madracima s dobro definiranim monoslojem je odabrana po stopi od 2 dušeka za svako razrjeđivanje patološkog materijala i 2 dušeka za kontrolu. Hranljivi medij se uklanja iz bočica i dodaje se 2 ml podloge bez fetalnog seruma. Zatim se doda 0,2 ml proučavanog patološkog materijala i ostavi za adsorpciju virusa 60 minuta na optimalnoj temperaturi za viruse koji inficiraju ribu (za viruse šarana - 24-26°C i za viruse pastrmke - 16-18°C ).

Kontrolu staviti u 2 dušeka sa ćelijskim kulturama od 0,2 ml, koje sadrže 100 TCD 50/ml poznatog virusa i 2 - 0,2 ml hranljive podloge bez virusa.

Nakon 60 minuta, tečnost iz bočica se uklanja. Na zid nasuprot monosloju, 5 ml agar obloge zagrijane na 40-42°C (pri izolaciji HCV virusa - ne više od 38°C) se unosi u bočicu od 50 ml. Dušeci su jednoslojno okrenuti prema dolje, obloženi crnim papirom. Nakon 15-20 minuta, dušeci se prenose na inkubaciju na optimalnoj temperaturi za proučavane viruse. Dušeci su položeni agarom premazanom stranom prema gore. Kod nepoznatog virusa, kulture se čuvaju na dva temperaturna uslova - 14-18 i 22-24°C.

Zaražene ćelijske kulture se gledaju na bijeloj pozadini. Ako se u proučavanom materijalu u ćelijskoj kulturi nalazi virus, prvo se pojavljuju prozirne tačke na ružičasto-mat pozadini kulture. U budućnosti se povećavaju u veličini, formirajući okrugle prozirne kolonije - plakove, čije prisustvo ukazuje na prisutnost rabdovirusa u patološkom materijalu.

Pasteur-ovom pipetom skuplja se komad plaka na granici zahvaćenih i nezahvaćenih dijelova na način da u njega uđe ne samo agar, već i ćelijski sloj. Odabrani komad se stavlja u epruvetu sa 1 ml medijuma za rast, zamrzava na minus 20°C i inkubira 60 min. U slučaju velikog broja plakova (cijeli ćelijski sloj je providan), studije se ponavljaju u razrjeđenjima od 10 -3 i 10 -4.

Plakovi prečnika 3-8 mm rabdovirusa šarana na kontinuiranoj kulturi EPC i FHM, inkubirani na temperaturi od 24-26°C, pojavljuju se 4-7.

U odsustvu plakova i prisutnosti CPD-a u ćelijskim kulturama, provode se dodatna ispitivanja tečnosti kulture koja sadrži virus u razblaženjima od 10 -2 -10 -3 (2-3 pasaža). Kao dodatne metode za identifikaciju virusa koriste se: metoda fluorescentnih antitijela; određivanje osjetljivosti virusa na hloroform, eter, pH vrijednost, zagrijavanje; elektronsko mikroskopsko proučavanje morfologije virusa.