Polimeráz láncreakció a kozmetológiában. Polimeráz láncreakció (PCR)

A cikk végén lásd
Polimeráz láncreakció (PCR, PCR) Carey Mullis (amerikai tudós) találta fel 1983-ban. Ezt követően a találmányért Nobel-díjat kapott. Jelenleg a PCR diagnosztika az egyik legpontosabb és legérzékenyebb módszer a fertőző betegségek diagnosztizálására.
Polimeráz láncreakció (PCR)- a molekuláris biológia kísérleti módszere, bizonyos nukleinsav-fragmensek (DNS) kis koncentrációjának jelentős növelésére szolgáló módszer egy biológiai anyagban (mintában).
A PCR módszer a DNS egy bizonyos szakaszának ismételt megkettőzésén alapul enzimek segítségével mesterséges körülmények között (in vitro). Ennek eredményeként elegendő mennyiségű DNS termelődik a vizuális kimutatáshoz. Ebben az esetben csak az a terület kerül másolásra, amely megfelel a meghatározott feltételeknek, és csak akkor, ha az jelen van a vizsgált mintában.
Amellett, hogy egyszerűen növeli a DNS-másolatok számát (ezt a folyamatot amplifikációnak nevezik), a PCR számos egyéb genetikai anyaggal végzett manipulációt tesz lehetővé (mutációk bevezetése, DNS-fragmensek splicingje), és széles körben alkalmazzák például a biológiai és orvosi gyakorlatban. betegségek (örökletes, fertőző) diagnosztizálására, apaság megállapítására, gének klónozására, mutációk bevezetésére, új gének izolálására.

Specifikusság és alkalmazás

PCR lefolytatása

A PCR-hez a legegyszerűbb esetben a következő összetevőkre van szükség:

  • Az amplifikálandó DNS szakaszt tartalmazó DNS-templát;
  • két, a kívánt fragmens végével komplementer primer;
  • hőstabil DNS-polimeráz;
  • dezoxinukleotid-trifoszfátok (A, G, C, T);
  • a polimeráz működéséhez szükséges Mg2+ ionok;
  • pufferelési megoldás.

A PCR-t egy erősítőben hajtják végre - olyan eszközben, amely a kémcsövek időszakos hűtését és melegítését biztosítja, általában legalább 0,1 ° C-os pontossággal. A reakcióelegy elpárolgásának elkerülése érdekében magas forráspontú olajat, például vazelint adunk a kémcsőbe. Specifikus enzimek hozzáadása növelheti a PCR reakció hozamát.
A reakció előrehaladása

A PCR végrehajtása során általában 20-35 ciklust hajtanak végre, amelyek mindegyike három szakaszból áll. A kettős szálú DNS-templátot 94-96 °C-ra (vagy 98 °C-ra, ha különösen hőstabil polimerázt használunk) 0,5-2 percig melegítjük, hogy lehetővé tegyük a DNS-szálak elválását. Ezt a szakaszt denaturációnak nevezik – a két lánc közötti hidrogénkötések megsemmisülnek. Néha az első ciklus előtt a reakcióelegyet 2-5 percig előmelegítik, hogy a templát és a primerek teljesen denaturálódjanak.
Amikor a szálakat szétválasztjuk, a hőmérsékletet lecsökkentjük, hogy lehetővé tegyük a primerek kötődését az egyszálú sablonhoz. Ezt a szakaszt lágyításnak nevezik. A lágyítási hőmérséklet a primerektől függ, és általában 4-5°C-kal az olvadáspontjuk alatt van kiválasztva. Színpadi idő - 0,5 - 2 perc.

A DNS-polimeráz replikálja a templátszálat, a primert primerként használva. Ez a megnyúlás szakasza. A nyúlási hőmérséklet a polimeráztól függ. A gyakran használt polimerázok 72 °C-on a legaktívabbak. Az elongációs idő mind a DNS-polimeráz típusától, mind az amplifikálandó fragmens hosszától függ. A nyúlási időt jellemzően minden ezer bázispáronként egy percnek vesszük. Az összes ciklus lejárta után gyakran a végső megnyújtás egy további szakaszát hajtják végre az összes egyszálú fragmentum elkészítése érdekében. Ez a szakasz 10-15 percig tart.
Kutatási anyag előkészítése és laboratóriumba szállítása

A sikeres elemzéshez fontos, hogy helyesen gyűjtsük össze az anyagot a pácienstől és megfelelően készítsük elő. Ismeretes, hogy a laboratóriumi diagnosztikában a hibák többsége (legfeljebb 70%) a minta-előkészítés szakaszában történik. Az INVITRO laboratóriumban történő vérvételhez jelenleg vákuumrendszereket használnak, amelyek egyrészt minimálisan sértik meg a beteget, másrészt lehetővé teszik az anyag felvételét úgy, hogy az ne érintkezzen. akár a személyzettel, akár a környezettel. Ez elkerüli az anyag szennyeződését (szennyeződését), és biztosítja a PCR elemzés objektivitását.

DNS - dezoxiribonukleinsav - egy biológiai polimer, a kétféle nukleinsav egyike, amelyek biztosítják a tárolást, a nemzedékről nemzedékre történő átvitelt és az élő szervezetek fejlődésének és működésének genetikai programjának végrehajtását. A DNS fő szerepe a sejtekben az RNS és a fehérjék szerkezetére vonatkozó információk hosszú távú tárolása.


Az RNS - ribonukleinsav egy biológiai polimer, kémiai szerkezetében hasonló a DNS-hez. Az RNS-molekula ugyanazokból a monomer egységekből - nukleotidokból - épül fel, mint a DNS. A természetben az RNS általában egyetlen szálként létezik. Egyes vírusokban az RNS a genetikai információ hordozója. A sejtben fontos szerepet játszik a DNS-ből a fehérjébe történő információátvitelben. Az RNS-t DNS-templáton szintetizálják. Ezt a folyamatot transzkripciónak nevezik. A DNS-ben vannak olyan szakaszok, amelyek háromféle RNS szintéziséért felelős információt tartalmaznak, amelyek funkciójukban különböznek egymástól: hírvivő vagy hírvivő RNS (mRNS), riboszómális (rRNS) és transzport (tRNS). Az RNS mindhárom típusa valamilyen módon részt vesz a fehérjeszintézisben. A fehérjeszintézissel kapcsolatos információk azonban csak az mRNS-ben találhatók.


A nukleotidok a nukleinsavmolekulák alapvető ismétlődő egységei, egy nitrogéntartalmú bázis, egy öt szénatomos cukor (pentóz) és egy vagy több foszfátcsoport kémiai vegyületének terméke. A nukleinsavakban jelenlévő nukleotidok egy foszfátcsoportot tartalmaznak. Nevüket a bennük található nitrogénbázis szerint kapják - adenint tartalmazó adenin (A), guanin (G) - guanin, citozin (C) - citozin, timin (T) - timin, uracil (U) - uracil. A DNS 4 típusú nukleotidból áll - A, T, G, C, az RNS-nek is 4 típusa van - A, U, G, C. Az összes DNS nukleotid összetételében a cukor dezoxiribóz, az RNS ribóz. A nukleinsavak képződése során a nukleotidok kötődés útján a molekula cukor-foszfát gerincét képezik, melynek egyik oldalán bázisok találhatók.


A primer egy rövid DNS, amelyet a templátszál replikációjára használnak. A primerek mindegyike komplementer a kétszálú templát egyik láncához, keretezve az amplifikált régió elejét és végét.


Irodalom

  1. Glick B., Pasternak J. Molekuláris biotechnológia. Alapelvek és alkalmazás. Per. angolról. - M.: Mir, 2002. - 589 p., illusztráció. ISBN 5-03-003328-9
  2. Shchelkunov S.N. Géntechnológia - Novoszibirszk: Sib. univ. kiadó, 2004. - 496 p.; beteg. ISBN 5-94087-098-8
  3. Patrushev L.I. Mesterséges genetikai rendszerek - M .: Nauka, 2005 - 2 kötetben - ISBN 5-02-033278-X

FONTOS!

Az ebben a részben található információkat nem szabad öndiagnózisra vagy önkezelésre használni. Fájdalom vagy a betegség egyéb súlyosbodása esetén csak a kezelőorvos írhat elő diagnosztikai vizsgálatokat. A diagnózis és a megfelelő kezelés érdekében orvoshoz kell fordulni.

A PCR diagnosztika alapelvei

ABSZTRAKT

szakaszok, 34 oldal, 5 ábra, 5 hivatkozás

Jelen munka célja a PCR-módszer főbb elveinek és technológiai jellemzőinek rövid összefoglalása, tudományos és gyakorlati alkalmazása a fertőző betegségek diagnosztizálásában.

A HAGYOMÁNYOS RÖVIDÍTÉSEK LISTÁJA

HCV - hepatitis C vírus

dATP - dezoxiadenozin-trifoszfát

dGTP - dezoxiguanozin-trifoszfát

dNTP - dezoxinukleotid-trifoszfát

dTTP - dezoxitimidin-trifoszfát

dCTP - dezoxicitozin-trifoszfát

DNS - dezoxiribonukleinsav

PCR - polimeráz láncreakció

RNS - ribonukleinsav - immunglobulin osztály GTime PCR - valós idejű PCR módszer

BEVEZETÉS

A PCR-MÓDSZER ELVE

A PCR-ANALÍZIS SZAKASZAI

VALÓS idejű PCR MÓDSZER

A PCR MÓDSZER ELŐNYEI

A PCR-MÓDSZER KORLÁTAI

A PCR-MÓDSZER ALKALMAZÁSA

KÖVETKEZTETÉS

HASZNÁLT IRODALOM JEGYZÉKE

BEVEZETÉS

A polimeráz láncreakció (PCR) módszerének felfedezése az elmúlt évtizedek egyik legkiemelkedőbb eseményévé vált a molekuláris biológia területén. Ez lehetővé tette az orvosi diagnosztika minőségileg új szintre emelését. A polimeráz láncreakciós módszer elvét Carrie Mullis dolgozta ki 1983-ban. A PCR-analízis fejlesztéséért K. Mullis 1993-ban kémiai Nobel-díjat kapott.

A PCR felfedezése után nagyon gyorsan átültették a gyakorlatba. A módszer olyan népszerűvé vált, hogy ma már nehéz elképzelni a munkát a molekuláris biológia területén alkalmazása nélkül. A PCR módszer különösen gyors fejlődésen ment keresztül a „Human Genome” nemzetközi programnak köszönhetően. A szekvenálásra (DNS nukleotid szekvenciák megfejtésére) modern lézeres technológiákat hoztak létre. Ha a közelmúltban egy hetet vett igénybe egy 250 bázispárból álló DNS-szekvencia dekódolása, a modern lézerszekvenátorok akár 5000 bp-t is képesek meghatározni. egy napon belül. Ez pedig hozzájárul a DNS-szekvenciákat tartalmazó információs adatbázisok jelentős növekedéséhez. Jelenleg a PCR különféle módosításait javasolták, bemutatták a mikroorganizmusok kimutatására, pontmutációk kimutatására szolgáló tesztrendszerek létrehozásának lehetőségét, és a módszer több tucat lehetséges alkalmazását ismertették.

A PCR-módszer megjelenése a molekuláris genetika területén elért bizonyos eredményeknek, elsősorban számos mikroorganizmus genomjának nukleotidszekvenciájának dekódolásának volt köszönhető. Meg kell jegyezni, hogy ezt a felfedezést néhány technológia fejlesztése kísérte. Különösen az egyszálú DNS-fragmensek (oligonukleotidok) automatikus szintézisét lehetővé tevő eszközök megjelenése. Ugyanebben az időszakban fedezték fel a gejzírekben élő egyedülálló mikroorganizmusokat. Enzimatikus rendszerük, különösen a DNS-polimeráz, ellenáll a forró források magas hőmérsékletének, és 95 °C-ig megőrzi biológiai aktivitását, ami a polimeráz láncreakció elengedhetetlen feltétele.

A polimeráz láncreakció jelenleg a legfejlettebb diagnosztikai módszer a molekuláris biológiában, a molekuláris genetikában és a klinikai laboratóriumi diagnosztikában, amely lehetővé teszi számos fertőző betegség kórokozójának egyetlen sejtjének kimutatását a szövetekben és a test biológiai folyadékaiban.

A PCR-módszer a kórokozó genomiális DNS-ének vagy RNS-ének egy szakaszának komplementer befejezésén alapul, amelyet hőstabil DNS-polimeráz enzim segítségével in vitro hajtanak végre. A módszer specifitását a kimutatott fertőző ágensek genetikai anyagának egyedisége határozza meg, amelyhez az amplifikációs folyamatban résztvevő oligonukleotid primereket kiválasztjuk.

Fertőző betegségek diagnosztizálása, beleértve a nehezen tenyészthető kórokozók által okozottakat is, a mikroorganizmusok genotipizálása, virulenciájuk felmérése, a mikroflóra antibiotikumokkal szembeni rezisztenciájának meghatározása, prenatális diagnosztika, vérkészítmények biológiai kontrollja - ez az orvostudomány területeinek hiányos listája PCR segítségével. A mai napig a PCR analízis a legelterjedtebb és legdinamikusabban fejlődő technológia. Évente több tucat új PCR-elemzési tesztrendszer jelenik meg a piacon, amelyek egyrészt különböző betegségeket okozó mikroorganizmusok nukleotidszekvenciájának azonosítására, másrészt emberi gének tanulmányozására szolgálnak. A PCR analízis költsége folyamatosan csökken, ami hozzájárul a módszer elterjedtebbé válásához az orvosi és diagnosztikai intézményekben. A PCR-laboratóriumok száma a FÁK-országokban exponenciálisan növekszik, és úgy tűnik, a közeljövőben a PCR-elemzés a laboratóriumi diagnosztika egyik leggyakoribb módszere lesz.

1. A PCR-MÓDSZER ELVE

A polimeráz láncreakció egy olyan módszer, amely utánozza a DNS természetes replikációját, és lehetővé teszi egyetlen specifikus DNS-molekula kimutatását több millió más molekula jelenlétében.

A módszer lényege bizonyos DNS-szakaszok ismételt másolása (amplifikálása) egy kémcsőben, ismételt hőmérsékleti ciklusok során. Minden egyes amplifikációs ciklusban a korábban szintetizált fragmentumokat a DNS-polimeráz újramásolja. Ennek köszönhetően többszörösen megnövekszik a specifikus DNS-fragmensek száma, ami nagyban leegyszerűsíti a további elemzést.

A PCR módszer egy természetes folyamaton alapul - a DNS-templát komplementer kiegészítésén, amelyet a DNS-polimeráz enzim segítségével hajtanak végre. Ezt a reakciót DNS-replikációnak nevezik.

A természetes DNS-replikáció több lépésből áll:

) DNS denaturációja (a kettős hélix feltekercselése, a DNS-szálak divergenciája);

) Rövid kétszálú DNS-szakaszok kialakulása (a DNS-szintézis elindításához szükséges magvak);

) Új DNS-lánc szintézise (mindkét szál komplementer kiteljesedése).

Ezzel az eljárással specifikus mikroorganizmusokra specifikus rövid DNS-fragmensek másolatai készíthetők, pl. ilyen specifikus területek célzott felkutatása, amely a géndiagnosztika célja a fertőző betegségek kórokozóinak azonosítása.

A hőstabil DNS polimeráz (Taq polimeráz) felfedezése termofil baktériumokból Thermisaquaticus, melynek optimuma a 70-72°C tartományban van, lehetővé tette a DNS-replikáció folyamatának ciklikussá tételét és in vitro munkára való felhasználását. A programozható termosztátok (erősítők) megalkotása, amelyek adott program szerint ciklikus hőmérséklet-változásokat hajtanak végre, megteremtették az előfeltételeket a PCR módszer széleskörű bevezetéséhez a laboratóriumi klinikai diagnosztika gyakorlatába. A szintézisciklusok ismételt megismétlésével exponenciálisan megnövekszik egy adott DNS-fragmens másolatainak száma, ami lehetővé teszi azonosításukhoz elegendő számú DNS-másolat előállítását az elemzett anyag kis mennyiségéből, amely tartalmazhat egyetlen fragmentumot. mikroorganizmusok sejtjei.

A lánc komplementer befejezése nem a DNS-szekvencia bármely pontján kezdődik, hanem csak bizonyos kiindulási blokkokban - rövid, kétszálú szakaszokban. Az ilyen blokkokat a DNS meghatározott régióihoz kapcsolva lehetséges egy új szál szintézisének folyamata csak ebben a régióban irányítani, nem pedig a DNS-szál teljes hosszában. Két oligonukleotid primert (20 nukleotidpár), úgynevezett primereket használnak a kiindulási blokkok létrehozására adott DNS-régiókban. A primerek komplementerek egy adott fragmens bal és jobb oldali határán lévő DNS-szekvenciákkal, és úgy vannak orientálva, hogy egy új DNS-szál befejeződése csak közöttük fordul elő.

Így a PCR egy specifikus DNS-régió másolatainak számának (amplifikációjának) többszörös növelése, amelyet a DNS-polimeráz enzim katalizál.

. A PCR-ANALÍZIS SZAKASZAI

A PCR-módszert használó elemzési technika három szakaszból áll:

1. DNS (RNS) izolálása klinikai mintából;

2. Specifikus DNS-fragmensek amplifikációja;

. Erősítő termékek kimutatása.

. DNS (RNS) izolálása

Az elemzés ezen szakaszában a klinikai mintát speciális feldolgozásnak vetik alá, melynek eredményeként a sejtanyag lízise, ​​a fehérje és poliszacharid frakciók eltávolítása, valamint inhibitoroktól mentes, további amplifikációra kész DNS vagy RNS oldat készül. . A DNS (RNS) extrakciós technika megválasztását elsősorban a feldolgozott klinikai anyag jellege határozza meg.

2. Specifikus DNS-fragmensek amplifikációja

Ebben a szakaszban rövid specifikus DNS-fragmensek halmozódnak fel a további kimutatáshoz szükséges mennyiségben.

A polimeráz láncreakció végrehajtásához a reakcióelegyben számos komponensnek jelen kell lennie:

· Alapozók- mesterségesen szintetizált oligonukleotidok, amelyek mérete általában 15-30 bp, és azonosak a cél-DNS megfelelő szakaszaival. Kulcsszerepet játszanak az amplifikációs reakciótermékek képződésében. A megfelelően kiválasztott primerek biztosítják a tesztrendszer specificitását és érzékenységét.

· Taq polimeráz- hőstabil enzim, amely a 3 befejezését biztosítja - a második DNS-szál vége a komplementaritás elve szerint.

· Dezoxinukleotid-trifoszfátok (dNTP-k) keveréke- dezoxiadenozin-trifoszfát (dATP), dezoxiguanozin-trifoszfát (dGTP), dezoxicitozin-trifoszfát (dCTP) és dezoxitimidin-trifoszfát (dTTP) - a Taq polimeráz által a második DNS-szál szintéziséhez használt "építőanyag".

· Puffer -kationok és anionok meghatározott koncentrációjú keveréke, amely optimális feltételeket biztosít a reakcióhoz, valamint stabil pH-értéket.

· A minta elemzése folyamatban van- a reakcióelegybe való bejuttatásra előkészített készítmény, amely tartalmazhatja a kívánt DNS-t, például mikroorganizmusok DNS-ét, amely célpontként szolgál a későbbi többszöri másoláshoz.

1. ábra A reakcióelegy komponensei

Minden amplifikációs ciklus 3 szakaszból áll, amelyek különböző hőmérsékleti körülmények között fordulnak elő:

1. szakasz:DNS denaturáció (kettős spirál letekercselés). 93-95°C-on folyik 30-40 másodpercig.

Az egyik lánc (+) a fő mátrix. Öt rúdvégét a DNS-polimeráz enzim rögzíti, amely biztosítja az egyes nukleotidokból egy második DNS-lánc felépítését, amely komplementer az elsővel. Ugyanez történik, csak ellenkező irányban, a második DNS-szálon, azonban mivel a DNS-molekula letekeredése fordított sorrendben megy végbe, egy új lánc épül kis fragmentumokból, amelyeket aztán összevarrnak. Ahhoz, hogy a DNS-polimeráz enzim elkezdje működését, primerre vagy primerre van szükség - egy kis egyszálú DNS-fragmensre, amely az egyik szülő DNS-lánc komplementer szakaszához kapcsolódva kiindulási blokkot képez a lánya növekedéséhez. part.

2. szakasz:Alapozók rögzítése (analing). A primer kapcsolódása komplementeren megy végbe az ellentétes DNS-szálak megfelelő szekvenciáival egy adott régió határain. Minden alapozópárnak megvan a maga lágyítási hőmérséklete, melynek értéke 50-65°C között van. A pontosan kiszámított és kísérletileg igazolt primer csatolási hőmérséklet az egyik olyan reakcióspecifitást meghatározó jellemző, amely kizárja a primer kötődését a nem teljesen komplementer szekvenciákhoz.

Mivel a leány-DNS-szálak kiterjesztése egyidejűleg is megtörténhet az anya-DNS mindkét szálán, egy primerre is szükség van ahhoz, hogy a DNS-polimeráz működjön a második szálon. Így két primert adunk a reakcióelegyhez. Valójában a primerek, miután a DNS-molekula ellentétes szálaihoz csatlakoztak, a DNS-molekula azon részére korlátozódnak, amely a későbbiekben ismételten megkétszereződik vagy amplifikálódik. Az ilyen DNS-fragmenseket amplikonoknak nevezzük. Az amplikon hossza több száz nukleotid lehet. Egy primerpár megváltoztatásával az egyik kórokozó elemzésétől egy másik kórokozó elemzése felé léphetünk át.

Izzítási idő -20-60 mp.

3. szakasz:DNS-láncok felépítése (elongáció).

A másolás mechanizmusa olyan, hogy a komplementer szál kiterjesztése nem kezdődhet meg a DNS-szekvencia bármely pontján, hanem csak bizonyos kiindulási blokkokban (rövid kétszálú szakaszok). A kiindulási blokkok létrehozásához adott DNS-régiókban primereket használnak, amelyek körülbelül 20 bp hosszú oligonukleotidok, más néven primerek. Komplementerek egy adott fragmens bal és jobb oldali határán lévő DNS-szekvenciákkal, és úgy vannak orientálva, hogy a DNS-polimeráz által végrehajtott DNS-szintézis csak közöttük megy végbe.

A DNS-láncok komplementer befejeződése a lánc 5'-végétől a 3'-végéig, ellentétes irányban halad, a primer kapcsolódási helyeitől kezdve. A bevezetett dezoxiribonukleotid-foszfát anyagként szolgál új DNS-szálak szintéziséhez. Ezt a folyamatot a Tag polimeráz enzim katalizálja. A szintézis első ciklusában képződött új DNS a második ciklus kiindulási anyagaként szolgál, amelyben a kívánt specifikus DNS-fragmens (amplikon) keletkezik stb.

2. ábra A DNS-amplifikáció elve

Jelenleg számos módszert alkalmaznak a minta PCR-re való előkészítésére. A minta-előkészítési eljárás magában foglalja a mikrobiális lízist és a nukleinsav extrakciót. A mikrobiális sejtek elpusztítására egyszerű forralást, lizozim jelenlétében történő fagyasztást-olvasztást, valamint speciális detergenseket és proteinázt tartalmazó lízispuffereket használnak. A módszer megválasztását általában a mikroba természete, pontosabban sejtfalának jellege határozza meg. A tiszta DNS-preparátum előállításának módszere, amelyet B. R. Marmionetal ír le, standardnak számít, és már klasszikussá vált. (1993). Ez magában foglalja az enzimatikus proteolízist, amelyet fehérjementesítés és a DNS alkohollal történő kicsapása követ. Ez a módszer lehetővé teszi a tiszta DNS-készítmény előállítását, de meglehetősen munkaigényes, és olyan agresszív és csípős anyagokkal dolgozik, mint a fenol és a kloroform.

Az egyik legnépszerűbb az R. Boometal által javasolt DNS-kivonási módszer. (1990), egy erős lizálószer - guanidin-tiocianát (GuSCN) - felhasználásán alapul a sejtlízishez és a DNS későbbi szorpciójához egy hordozón (üveggyöngyök, kovaföld, üveg "tej" stb.). Mosások után a DNS a hordozón adszorbeált mintában marad, ahonnan elúciós puffer segítségével könnyen eltávolítható. A módszer kényelmes, technológiailag fejlett és alkalmas amplifikációs minta-előkészítésre. Azonban DNS-vesztések lehetségesek a hordozón történő visszafordíthatatlan szorpció miatt, valamint számos mosás során. Ez különösen fontos, ha kis mennyiségű DNS-sel dolgozunk a mintában. Ráadásul a GuSCN nyomokban is gátolhatja a PCR-t, ezért ennek a módszernek a használatakor nagyon fontos a szorbens helyes megválasztása és a technológiai árnyalatok gondos betartása. Meg kell jegyezni, hogy az oldatok hozzáadásának és eltávolításának nagy száma miatt óvatosság szükséges a mintával végzett munka során, mivel lehetséges a minták és a keletkező DNS-aeroszol közötti keresztszennyeződés.

A fenol-kloroform DNS extrakció klasszikus eljárása a DNS jó tisztítását biztosítja, elsősorban a Tag-polimeráz inhibitoroktól, de elkerülhetetlen a nagy nukleinsavveszteség, különösen akkor, ha kis térfogatú mintákkal dolgozunk, alacsony koncentrációjú fertőző ágenssel.

A minta-előkészítési módszerek másik csoportja a Chilex típusú (USA) ioncserélők használatán alapul, amelyek az üveggel ellentétben nem DNS-t, hanem a reakciót zavaró szennyeződéseket szorbeálják. Ez a technológia általában két szakaszból áll: a minta felforralását és a szennyeződések adszorpcióját egy ioncserélőn. A módszer rendkívül vonzó a kivitelezés egyszerűsége miatt. A legtöbb esetben alkalmas klinikai anyagokkal való munkavégzésre. Sajnos néha előfordulnak olyan szennyeződéseket tartalmazó minták, amelyeket nem lehet ioncserélővel eltávolítani. Ezenkívül egyes mikroorganizmusokat nem lehet elpusztítani egyszerű forralással. Ezekben az esetekben a mintafeldolgozás további szakaszait kell bevezetni.

A tömeges szűrésnél, amikor fontos a statisztikai adatok beszerzése, lehetőség van egyszerű módszerek alkalmazására mosószerek használatával vagy a biológiai anyagok lúgokkal történő kezelésével, majd azok semlegesítésével. Ugyanakkor az ilyen módszerek alkalmazása a klinikai diagnosztikában hamis negatív eredményekhez vezethet, mivel rossz minőségű DNS-készítményt használnak a reakcióelegyben. Ezért a minta-előkészítési módszer kiválasztását a tervezett elemzések céljának megértésével kell kezelni.

A következő eljárás - amplifikáció - során a kórokozó DNS-t tartalmazó mintát egy kis kémcsőbe vezetjük, a polimeráz reakciót biztosító komponensekkel, kétféle primerrel, két enzimmel (Tag polimeráz és N-uracil glikoláz) és négyféle A nukleotiddal, D, C, U. A polimeráz reakció végrehajtásához egy speciális eszközt (termociklert vagy DNS-erősítőt) használnak, amely lehetővé teszi a reakcióelegy hőmérsékleti rendszerének automatikus megváltoztatását egy bizonyos program szerint. A PCR első ciklusában a mintát 94 °C hőmérsékletre melegítjük, hogy elválassza a két komplementer DNS-szálat. Ezután a hőmérsékletet 40-60 °C-ra csökkentjük, ekkor a primerek egyetlen DNS-szálhoz kapcsolódnak, majd a hőmérséklet ismét 72 °C-ra emelkedik, amikor a polimeráz aktivitása a legkifejezettebb. A teljes ciklus hőmérséklet-változásokkal kevesebb, mint 3 percig tart.

A PCR eredményeinek helyes értékelése érdekében fontos megérteni, hogy ez a módszer nem kvantitatív. Elméletileg az egyedi cél DNS-molekulák amplifikációs termékei elektroforézissel már 30-35 ciklus után kimutathatók. A gyakorlatban azonban erre csak olyan esetekben kerül sor, amikor a reakció az ideálishoz közeli körülmények között megy végbe, ami ritka. A DNS-preparátum tisztasági foka különösen nagy hatással van az amplifikáció hatékonyságára; bizonyos inhibitorok jelenléte a reakcióelegyben, amelyektől bizonyos esetekben rendkívül nehéz megszabadulni. Előfordul, hogy jelenlétük miatt még több tízezer cél DNS-molekulát sem lehet amplifikálni. Így gyakran nincs közvetlen kapcsolat a cél DNS kezdeti mennyisége és az amplifikációs termékek végső mennyisége között.

Különféle módszereket alkalmaznak az amplifikáció eredményeinek megjelenítésére. Ma a legelterjedtebb az elektroforézis, amely a DNS-molekulák méret szerinti szétválasztásán alapul. Ehhez egy lemezt agaróz gélt készítünk, amelyet elektroforézispufferben történő megolvadás után 1,5-2,5% koncentrációban lefagyasztanak egy speciális DNS-festék, például etidium-bromid hozzáadásával. A fagyasztott agaróz térhálót képez. Fésűk segítségével történő öntéskor a gélben speciális lyukak képződnek, amelyekbe ezt követően amplifikációs termékeket adnak. A géllemezt vízszintes gélelektroforézis készülékbe helyezzük, és állandó feszültségű forrást csatlakoztatunk. A negatív töltésű DNS mínuszból pluszba kezd mozogni a gélben. Ugyanakkor a rövidebb DNS-molekulák gyorsabban mozognak, mint a hosszúak. A DNS mozgásának sebességét a gélben befolyásolja az agaróz koncentrációja, az elektromos térerősség, a hőmérséklet, az elektroforézispuffer összetétele, és kisebb mértékben a DNS összetétele. Minden azonos méretű molekula azonos sebességgel mozog. A festék síkbeli csoportokban DNS-molekulákba ágyazódik (interkalálódik). A 10 perctől 1 óráig tartó elektroforézis befejezése után a gélt egy ultraibolya tartományban (254-310 nm) fényt kibocsátó transzilluminátor szűrőjére helyezzük. A DNS által 260 nm-en elnyelt UV-energia átkerül a festékre, ami a látható spektrum narancsvörös tartományában (590 nm) fluoreszkál.

"Pozitív kontrollként" használja a kívánt mikroorganizmus standard DNS-ét. A nem specifikus amplikonok mérete lehet nagyobb vagy kisebb a „pozitív kontrollhoz képest”. A legrosszabb esetben ezek a méretek egybeeshetnek, és az elektroforézisben pozitívnak olvashatók.

A "pozitív kontroll" lehetővé teszi, hogy megbizonyosodjon arról, hogy a reakcióelegyet alkotó összes komponens biztosítja a reakció normális lefolyását. Ugyanakkor egy biológiai anyagból PCR-re készített DNS-készítmény tartalmazhat olyan inhibitor szennyeződéseket, amelyek jelentősen csökkentik a reakció hatékonyságát, és bizonyos esetekben a kívánt kórokozó jelenlétében is specifikus amplikonok hiányához vezethetnek. A reakciókeverékkel minden kémcsőben ellenőrizni kell az amplifikáció előrehaladását, amelyhez egy további, úgynevezett "belső kontrollt" alkalmaznak, amely bármely olyan DNS standard, amely nem hasonlít a kívánt mikroorganizmus DNS-éhez.

A fertőző tesztrendszerekhez esetenként például p-globin gént használnak, amelynek végére géntechnológiai manipulációkkal olyan DNS-szakaszokat varrnak, amelyek homológok a tesztrendszert alkotó primerekkel. Ha a „belső kontrollt” bevisszük a reakcióelegybe, akkor az ugyanolyan célponttá válik a primer annealing számára, mint a kívánt fertőző ágens kromoszómális DNS-e. A belső kontroll amplifikációs termék méretét úgy választjuk meg, hogy az 2-szer vagy többször nagyobb legyen, mint a mikroorganizmus cél DNS-ének amplifikációjából származó amplikonok. Ennek eredményeként, ha „belső kontroll” DNS kerül a reakcióelegybe a vizsgált mintával együtt, akkor függetlenül attól, hogy mikroorganizmus van a biológiai mintában, a „belső kontroll” specifikus amplikonok képződését okozza, de sokkal hosszabb (nehezebb), mint a mikroorganizmus amplikonja. A nehéz amplikonok jelenléte a reakcióelegyben az amplifikációs reakció normális lefolyását és az inhibitorok hiányát jelzi. Ha a kívánt méretű és "belső kontroll" amplikonok nem képződtek, megállapítható, hogy a vizsgált minta nem kívánatos szennyeződéseket tartalmaz, amelyeket el kell távolítani, de a kívánt DNS hiányát nem.

Ennek a megközelítésnek a vonzereje ellenére van egy jelentős hibája. Tehát, ha a szükséges DNS benne van a reakcióelegyben, akkor az amplifikációjának hatékonysága meredeken csökken a primerek „belső kontrolljával” való versengés miatt. Ez alapvetően fontos a vizsgálati minta alacsony DNS-koncentrációja esetén, és hamis negatív eredményekhez vezethet. Mindazonáltal, feltéve, hogy a primerekért való versengés problémáját megoldják, az amplifikáció hatékonyságának szabályozására szolgáló módszer minden bizonnyal nagyon hasznos lesz.

3. ábra A DNS-amplifikáció második köre

. Erősítő termékek kimutatása

). Vízszintes elektroforézis módszer

Az amplifikáció eredményeinek megjelenítésére az egyik módszer az elektroforézis módszer, amely a DNS-molekulák méret szerinti szétválasztásán alapul. A legtöbb technikában ebben a szakaszban a 2. szakaszban kapott amplifikációs termékek keverékét vízszintes agaróz gélelektroforézissel választják el. Az elektroforetikus elválasztás előtt etidium-bromid oldatot adnak az amplifikációs keverékhez, amely erős intersticiális kötéseket képez a kettős szálú DNS-fragmensekkel. Ezek a vegyületek UV besugárzás hatására képesek fluoreszkálni, ami az amplifikációs keverék agarózgélben történő elektroforetikus elválasztása után világító sávként rögzíthető. Az erősítő termékek sávjainak fényereje eltérő lehet. Ezért a PCR laboratóriumokban gyakran szokás az eredményt három-, négy- vagy ötpontos rendszer szerint értékelni. Ez azonban nem hozható összefüggésbe a mintában lévő cél DNS kezdeti mennyiségével. Gyakran a sávok fényerejének csökkenése az amplifikáció hatékonyságának csökkenésével jár, inhibitorok vagy más tényezők hatására.

4. ábra Az amplifikációs termékek kimutatása horizontális elektroforézissel

). Függőleges elektroforézis módszer

A vertikális elektroforézis módszere alapvetően hasonló a horizontális elektroforézishez. Különbségük abban rejlik, hogy ebben az esetben agaróz helyett poliakrilamidot használnak. Ezt egy speciális kamrában végzik függőleges elektroforézishez. A poliakrilamid gélelektroforézis nagyobb felbontású, mint az agaróz elektroforézis, és lehetővé teszi a különböző méretű DNS-molekulák megkülönböztetését egy nukleotid pontossággal. A poliakrilamid gél elkészítése valamivel bonyolultabb, mint az agaróz. Ezenkívül az akrilamid mérgező anyag. Mivel az amplifikációs termék méretének 1 nukleotid pontosságú meghatározásának igénye ritkán merül fel, ezt a módszert a rutinmunkában nem alkalmazzák.

3). Hibridizációs szonda módszer

Az elektroforetikus kimutatási módszer alternatívájaként, amelynek van néhány hátránya: szubjektivitás az eredmények leolvasásában, a különböző mikroorganizmusok DNS-ének egy reakcióban történő meghatározásának korlátai, hibridizációs kimutatási sémák javasolhatók. Ezekben a sémákban az amplifikációból származó DNS-fragmens hibridizál (2-szálú komplexeket - "hibrideket" képez) egy specifikus oligonukleotid próbával. Az ilyen komplexek regisztrálása történhet kolorimetriásan vagy fluorimetriásan.

3. VALÓS idejű PCR MÓDSZER

A Real-Time PCR módszer lehetővé teszi az amplifikációs termékek kimutatását a reakció során, valamint az amplikon felhalmozódás kinetikájának nyomon követését. A PCR-termék kimutatására fluoreszcens festékeket használnak, amelyek a PCR-termék - riporter fluoreszcencia - mennyiségével egyenesen arányos fluoreszcenciát biztosítanak. Előállítási mechanizmusai a valós idejű PCR adott típusától függően eltérőek.

A „Reporter fluoreszcencia szintje – amplifikációs ciklus” koordinátákban lévő kinetikai görbe S alakú.

Három szakaszra osztható:

1.Az iniciációs szakasz (amikor a PCR-termékeket a fluoreszcens jelölés még nem észleli).

2.Exponenciális szakasz (amelyben a fluoreszcencia mennyisége exponenciálisan függ a PCR ciklustól).

.Plateau (telítettségi szakasz).

5. ábra A fluoreszcencia kinetikai görbéjének grafikonja valós idejű PCR-rel

A fluoreszcens jel regisztrálása az erősítési folyamat során történik egy speciális eszközön - egy erősítőn a valós idejű PCR-hez. A fluoreszcens jel intenzitásának növelésével az erősítőhöz mellékelt szoftver segítségével kiszámítjuk a kezdeti DNS-templát koncentrációját.

A valós idejű PCR előnyei

n az amplifikációs termékek felhalmozódásának közvetlen kimutatásának lehetősége az amplifikáció során;

n a fő előny az amplikonok felhalmozódásának a cső felnyitása nélkül történő detektálása, ami minimálisra csökkenti annak a kockázatát, hogy a minták és a reagensek amplifikációs termékekkel való szennyeződése miatt hamis pozitív eredményeket kapjanak;

n a vizsgálati mintával végzett manipulációk számának jelentős csökkenése csökkenti az időt, leegyszerűsíti az elemzést és csökkenti a hibák valószínűségét;

n ez a megközelítés lehetővé teszi az elektroforézis szakaszának elhagyását, ami a vizsgált minták amplifikációs termékekkel való szennyeződésének valószínűségének éles csökkenéséhez vezet;

n a PCR-laboratóriumokkal szemben támasztott követelmények csökkentése;

n a PCR-vizsgálat eredményei értelmezésének objektivitásának növelése, mivel a feldolgozás az eszköz szoftverével történik;

n jelentősen, majdnem kétszeresére csökken a vizsgálat teljes ideje, ami lehetővé teszi, hogy a klinikai anyag laboratóriumi kézhezvétele után 1,5-2 órán belül megkapja az eredményt;

n ez a módszer először teszi lehetővé a mikroorganizmus DNS-tartalmának mennyiségi meghatározását egy klinikai mintában;

n a hibridizációs próbák és a primerek alkalmazása növeli az analízis specificitását;

n a több hibridizációs DNS-próbából származó fluoreszcens jel független egyidejű regisztrálásának lehetősége lehetővé teszi egy vagy különböző DNS-célpontok több különböző régiójának kimutatását egy vizsgálat során.

. A PCR MÓDSZER ELŐNYEI

n A fertőző betegségek kórokozóinak közvetlen kimutatása

A PCR-módszer közvetlenül jelzi a kórokozó egy specifikus DNS-fragmensének jelenlétét a betegtől vett anyagban.

n A PCR magas specificitása

A PCR-módszerrel csak egy meghatározott kórokozóban – baktériumban vagy vírusban – rejlő DNS-fragmenst izolálnak a vizsgálati anyagból. Ez a DNS-szakasz egyedülálló, és nem jellemző egyetlen földi fertőzésre sem. A specifitást a primerek nukleotid szekvenciája határozza meg, ami kiküszöböli a hamis eredmények elérésének lehetőségét, ellentétben az enzim immunoassay módszerrel, ahol a keresztreakcióba lépő antigének miatt nem ritkák a hibák.

n Nagy érzékenységű PCR

A PCR módszer lehetővé teszi akár egyetlen baktérium- vagy vírussejt kimutatását is. A PCR-diagnosztika olyan esetekben észleli a fertőző betegségek kórokozóinak jelenlétét, amikor ez más módszerrel (immunológiai, bakteriológiai, mikroszkópos) nem lehetséges. A PCR analízis érzékenysége mintánként 10-1000 sejt (az immunológiai és mikroszkópos tesztek érzékenysége 103-105 sejt).

n A PCR sokoldalúsága

Mivel a kórokozó bármilyen biológiai váladékban és szövetben megtalálható, gyakorlatilag bármilyen anyag felhasználható a PCR-kutatáshoz, beleértve a nyálkahártyát, vizeletet, vért, szérumot, köpetet, ejakulátumot, hámsejt-kaparékot, amelyek más módszerekkel nem kutathatók.

n A PCR-analízis eredményének nagy sebessége

A PCR-elemzés nem igényli a kórokozótenyészet izolálását és tenyésztését, ami sok időt vesz igénybe. A bioanyag feldolgozásának és a reakciótermékek kimutatásának egységes módszere, valamint az amplifikációs folyamat automatizálása lehetővé teszi a teljes elemzés elvégzését 4-4,5 óra alatt.

n Képes bármilyen típusú fertőzés diagnosztizálására

A PCR módszer nagy érzékenysége nemcsak a betegség akut stádiumában teszi lehetővé a fertőzés diagnosztizálását, hanem a krónikus fertőzések, sőt akár egyetlen baktérium vagy vírus jelenlétét is.

Jelenleg a PCR-elemzés előnye a mikroorganizmusok kimutatására szolgáló tenyésztési módszerrel szemben a következő:

A mikroba detektálási gyakorisága magasabb, a tenyésztési módszer alkalmazásakor ugyanezt a mutatót meghaladja, 6-7%-kal. Ezeket a különbségeket a mikroba esetleges elpusztulása magyarázza a tárolás és szállítás során, míg a PCR képes kimutatni a mikroorganizmus nem életképes formáit is.

A kórokozó tenyésztési módszerrel történő kimutatásának időigénye körülbelül 4 nap, míg a PCR alkalmazása 4-5 óra alatt teszi lehetővé a mikroba kimutatását.

A PCR technológia alkalmazása lehetővé teszi a kórokozók, például a chlamydia kimutatását nem invazív mintákban, például vizeletmintákban.

A PCR módszer különösen hatékony a rejtett és krónikus fertőzésekben gyakran előforduló mikroorganizmusok nehezen tenyészthető, nem tenyészthető és perzisztens formáinak diagnosztizálására, mivel ezzel a módszerrel elkerülhetők az ilyen mikroorganizmusok laboratóriumi tenyésztésével járó nehézségek.

n Tartási lehetőség a terápia hatékonyságának nyomon követése és értékelése, különösen vírusos betegségek esetén.

n Felismerési lehetőség vírusok és baktériumok egyes altípusai és törzsei.

n Meghatározási képesség többféle kórokozó (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonasvaginalis, Ureaplasmaurealyticum) egy csőből biológiai anyaggal.

Ez a módszer munkaintenzitás tekintetében összehasonlítható a klasszikus módszerekkel (enzimatikus immunoassay, immunofluoreszcencia stb.), de megbízhatóbb diagnosztikai információt nyújt, lehetővé téve a fertőző ágens DNS-ének vagy RNS-ének közvetlen kimutatását a klinikai anyagokban. Ezért a PCR módszert a kulturális módszerrel együtt a fertőző betegségek diagnosztizálásának "arany standardjaként" ismerik el.

5. A PCR-MÓDSZER KORLÁTAI

· A reakció során mind az élő, mind az elhalt mikroorganizmus DNS-e felszaporodik.

· Keresztreakció lehetősége

A primerek kiválasztása az adott és hasonló mikroorganizmusok genomjára vonatkozó meglévő ismereteken alapul. Elméletileg fennáll annak a lehetősége, hogy ugyanaz a fragmentum más mikroorganizmusokban is jelen legyen, amelyek genomja jelenleg nincs dekódolva, és amelyeket nem vizsgáltak a keresztreaktivitás lehetőségére. Az ilyen mikroorganizmusok jelenléte a mintában hamis pozitív teszteredményhez vezethet.

· A mikroorganizmusok változékonysága

Bár egy tesztrendszer tervezésekor az amplifikációhoz használt genomfragmenst egy erősen konzervált régióból választják ki, a mikroorganizmusok variabilitása oda vezethet, hogy a vizsgált kórokozó egyes genotípusai vagy törzsei mutációkat szerezhetnek az amplifikálandó genomrégióban, és így megfoghatatlanná válnak ehhez a teszthez.

Az utolsó két pont a PCR diagnosztika fejlesztői számára fontos. Mostanra olyan szabványokat dolgoztak ki, amelyek szabályozzák a vizsgálatok körét (beleértve a keresztreaktivitás vizsgálatát, valamint a kimutatható kórokozó ismert törzseinek tesztelését), amelyeken a tesztrendszernek át kell mennie, mielőtt piacra kerül.

6. A PCR-MÓDSZER ALKALMAZÁSA

polimeráz diagnózis fertőző betegség

A PCR-t számos területen használják elemzésre és tudományos kísérletekre:

1. kriminalisztika

A PCR-t az úgynevezett „genetikai ujjlenyomatok” összehasonlítására használják. A tetthelyről származó genetikai anyag mintája szükséges – vér, nyál, sperma, haj stb. Ezt összehasonlítják a gyanúsított genetikai anyagával. Nagyon kis mennyiségű DNS elég, elméletileg - egy példány. A DNS-t fragmensekre vágjuk, majd PCR-rel amplifikáljuk. A fragmentumokat DNS-elektroforézissel választjuk el. A DNS-sávok elhelyezkedéséről kapott képet genetikai ujjlenyomatnak nevezzük.

2. az apaság megállapítása

Az apa-gyermek-anya PCR-rel amplifikált DNS-fragmensek elektroforézisének eredményeit elemezve kiderül, hogy a gyermek mindkét szülő genetikai lenyomatának bizonyos jellemzőit örökli, ami egyedi lenyomatot ad. Bár a „genetikai ujjlenyomatok” egyediek (kivéve az egypetéjű ikrek esetét), mégis több ilyen ujjlenyomat készítésével családi kötelékek hozhatók létre. Ugyanez a módszer, kis módosításokkal, alkalmazható az élőlények közötti evolúciós kapcsolatok megállapítására.

3. orvosi diagnosztika

A PCR lehetővé teszi az örökletes és vírusos betegségek diagnosztizálásának jelentős felgyorsítását és megkönnyítését. A kérdéses gént PCR-rel amplifikáljuk megfelelő primerek alkalmazásával, majd szekvenáljuk a mutációk meghatározására. A vírusfertőzések közvetlenül a fertőzés után, hetekkel vagy hónapokkal a betegség tüneteinek megjelenése előtt észlelhetők.

4. génklónozás

A génklónozás a gének izolálásának és a géntechnológiai manipulációk eredményeként az adott gén termékének nagy mennyiségének kinyerésének folyamata. A PCR-t egy gén amplifikálására használják, amelyet azután egy vektorba, egy olyan DNS-darabba inszertálnak, amely az idegen gént ugyanabba a szervezetbe szállítja, vagy egy másik, könnyen termeszthető szervezetbe. Vektorként például plazmidokat vagy virális DNS-t használunk. A gének idegen szervezetbe történő beillesztését általában e gén termékének - RNS-nek vagy leggyakrabban fehérjének - előállítására használják. Ily módon számos fehérjét nyernek ipari mennyiségben, hogy felhasználják a mezőgazdaságban, az orvostudományban stb.

5. DNS szekvenálás

A fluoreszcens vagy radioaktívan jelölt didezoxinukleotidokat alkalmazó szekvenálási eljárásban a PCR szerves részét képezi, mivel a polimerizáció során a fluoreszcens vagy radioaktív jelzéssel jelölt nukleotidszármazékok beépülnek a DNS-láncba. Ez leállítja a reakciót, lehetővé téve a specifikus nukleotidok helyzetének meghatározását a szintetizált szálak elválasztása után a gélben.

6. mutagenezis

Jelenleg a PCR a mutagenezis (a DNS nukleotidszekvenciájának megváltoztatása) végrehajtásának fő módszere. A PCR alkalmazása lehetővé tette a mutagenezis eljárás egyszerűsítését, felgyorsítását, valamint megbízhatóbbá és reprodukálhatóbbá tételét.

7. fertőző betegségek diagnosztizálása

A PCR módszer alkalmazása mind bakteriális, mind vírusos természetű fertőző betegségek diagnosztizálására számos mikrobiológiai és epidemiológiai probléma megoldásában nagy jelentőséggel bír. A módszer alkalmazása hozzájárul a krónikus és kevéssé kutatott fertőző betegségek területén végzett alapkutatások fejlesztéséhez is.

8. vírusos betegségek diagnosztizálása

A PCR legátfogóbb előnyei a vírusos betegségek diagnosztizálásában a hepatitis C vírus (HCV) által okozott fertőzési folyamat vizsgálatával mutathatók ki. A PCR különösen diagnosztikus értékű e vírus kimutatására a következő okok miatt:

) a HCV tenyésztésére szolgáló módszer hiánya; 2) nem léteznek antigéndiagnosztikai készletek; 3) a HCV elleni antitestek képződésének reakciója olyan lassú, hogy a fertőzés akut fázisában általában nem lehet diagnózist felállítani.

Ezért a PCR technológia alkalmazása a HCV-vel összefüggő morbiditás diagnosztizálására, a kezelés minőségének ellenőrzésére és epidemiológiai elemzésére ma már általánosan elismertté válik.

Ugyanakkor csak a PCR technológia teszi lehetővé a következő feladatok megoldását: 1) akut fertőzés diagnosztizálása a HCV elleni antitestek késői kimutatásával; 2) elvégzi a krónikus hepatitis C etiológiai diagnózisát immunszupprimált betegeknél; 3) értékelje az antivirális terápia hatékonyságát; 4) kimutatja a virémiát normál aminotranszferázszintű véradóknál; 5) meghatározza a vérkészítmények lehetséges szennyeződését; 6) értékelje a HCV eloszlásának szélességét.

9. A PCR alkalmazása a pulmonológiában és ftiziológiában

Az atípusos tüdőgyulladás, a visszatérő krónikus bronchitis gyakori oka a mikoplazmák és a chlamydia. Ezeknek a kórokozóknak a hagyományos mikroszkópos és tenyésztési módszerekkel történő diagnosztizálása nem hatékony. A PCR nemcsak a chlamydia és a mycoplasmosis diagnosztizálását teszi lehetővé, hanem a kórokozó fajok azonosítását is (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). A PCR módszer alkalmazása jelentősen javíthatja a tuberkulózis korai diagnózisát. Jelenleg PCR készleteket fejlesztettek ki és jelentek meg a piacon a mikobaktériumok antibiotikumokkal szembeni rezisztenciájának meghatározására.

10. A PCR alkalmazása a vérszolgálati gyakorlatban

A donor vér hepatitis, szifilisz, HIV szerológiai módszerekkel történő vizsgálata nem zárja ki a fertőzött vér felhasználásának veszélyét egy bizonyos szeronegatív periódus jelenléte miatt ezekben a betegségekben, amely a kórokozó megjelenésétől számítva több hétig is eltarthat. vér. A vérvizsgálat leghatékonyabb módszere ezen kórokozók jelenlétére a PCR módszer.

11. A PCR alkalmazása a neonatológiában

Terhesség alatt számos mikroorganizmus megfertőzheti a magzatot. Ezek a citomegalovírus, a toxoplazma, a herpeszvírus, a rubeola vírus, a mikoplazma, a chlamydia stb. A szerológiai tesztek alkalmazása ezen fertőzések újszülötteknél történő meghatározására nem hatékony, mivel a gyermek immunrendszerének kialakulása több hónapon belül megtörténik, és a jelenléte egy fertőző ágens nem kísérheti specifikus antitestek termelődését. Másrészt az anyai IgG antitestek, amelyek átjuthatnak a placenta gáton, hosszú ideig jelen lehetnek az újszülött vérében. Így a specifikus IgG jelenléte egy gyermekben az élet első hónapjaiban nem jelzi a kórokozó jelenlétét. A PCR analízis alkalmazása jelentősen növeli az újszülöttkori fertőzések diagnosztizálásának lehetőségét, beleértve a prenatális stádiumban lévő fertőzéseket is.

12. A PCR alkalmazása az urogynekológiai gyakorlatban

Az urogenitális traktust érintő fertőző ágensek közül az utóbbi időben nagy figyelmet fordítanak a látens és krónikus fertőzések kórokozóira - chlamydia, mycoplasma. Az ezen kórokozók által okozott betegségekre a klinikai tünetek elmosódása, krónikus lefolyás jellemző, ami gyakran a szaporodási funkciók károsodásához – vetéléshez, meddőséghez – vezet. A Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum kimutatására alkalmazott PCR-módszerrel kapcsolatos számos tanulmány, amelyet különböző országok nagy klinikáin végeztek, kimutatta ennek a módszernek a nagy hatékonyságát. Felismerték, hogy az érzékenység és a hatékonyság tekintetében a PCR felülmúlja az "arany standardként" elfogadott kultúrmódszert.

KÖVETKEZTETÉS

Így a PCR technológia olyan hatékony eszköz, amely lehetőséget ad a krónikus fertőző folyamatok, a fertőző betegségek kórokozóinak ökológiájának tanulmányozására és diagnosztizálására. A PCR diagnosztikai módszer kiegészíti a már meglévő mikrobiológiai diagnosztikai módszereket, minőségileg megváltoztatja az orvosi mikrobiológia és epidemiológia alkalmazott problémáinak megoldásának módszertanát.

A fentiek figyelembe vételével megfogalmazzuk azokat a kutatási területeket a fertőző patológiában, amelyek megoldásában a PCR kezd vezető szerepet játszani.

Baktériumok vagy vírusok perzisztenciája által okozott krónikus fertőző állapotok diagnosztizálása. Ez a PCR legkézenfekvőbb alkalmazása diagnosztikai célokra.

A PCR a leghatékonyabb módszer azon kórokozók azonosítására és tanulmányozására, amelyek „nem tenyésztett” állapotban képesek ott fennmaradni, túlélve a kedvezőtlen külső körülményeket.

A PCR lehetővé teszi a lassan növekvő és nehezen tenyészthető baktériumok antibiotikum-rezisztenciájának meghatározását.

A PCR-diagnosztika gyakorlati felhasználásának ígéretes területei a következők:

onkológiai betegségek diagnosztikája;

Leukémia és limfómák diagnosztizálása;

Az emlőrák diagnózisa

egyéb rosszindulatú betegségek diagnosztizálása;

A jó- és rosszindulatú daganatok DNS-diagnosztikáját korlátozza a csekély, de egyre növekvő mennyiségű információ az e betegségekhez kapcsolódó génekről;

Genetikai betegségek diagnosztizálása.

A genetikai betegségek diagnózisa csak az emberi genom kiterjedt tudományos kutatása után alakulhat ki. Az orvostársadalom azonban már felismerte a betegségek genetikai alapjainak tanulmányozásának fontosságát, valamint a betegség diagnosztizálásának és kezelésének megkezdésének lehetőségét a tünetek megjelenése előtt;

Személyazonosítás: igazságügyi orvostan, törvényszéki orvostan; szervek és szövetek átültetése; az apaság meghatározása. A szakértők úgy becsülik, hogy ez a tendencia a DNS-diagnosztika piacán az egyik legnagyobb és leggyorsabban növekvő;

Polimeráz láncreakció (PCR)

A PCR módszer lényege. DNS polimeráz

A polimeráz láncreakció a molekuláris biológia kísérleti módszere, amely lehetővé teszi bizonyos nukleinsavfragmensek kis koncentrációjának jelentős növekedését a biológiai anyagokban. A DNS másolatok számának növelésének ezt a folyamatát ún erősítés. A PCR során a DNS-másolást egy speciális enzim végzi - polimeráz. A DNS polimeráz (3. ábra) a DNS replikációjában (élő szervezetekben a DNS amplifikációjában) részt vevő enzim. Az ebbe az osztályba tartozó enzimek katalizálják a dezoxiribonukleotidok polimerizációját a DNS-nukleotid lánc mentén, amelyet az enzim "beolvas" és templátként használ. Az új nukleotid típusát az a templáttal való komplementaritás elve határozza meg, amelyből a leolvasás történik.

A DNS-polimeráz szabad nukleotidokat ad az összeállított lánc 3 "végéhez. Ez a lánc 5"-3 irányú megnyúlásához vezet. Az ismert DNS-polimerázok egyike sem képes "a semmiből" láncot létrehozni: csak a már meglévő 3"-hidroxilcsoporthoz képes nukleotidokat adni. Emiatt a DNS-polimeráznak szüksége van alapozó- egy rövid nukleotidszekvencia (általában 20-25), amely komplementer a vizsgált gén végszakaszaival - amelyhez hozzáadhatta az első nukleotidot. A primerek mindig DNS- és RNS-bázisokból állnak, az első két bázis mindig RNS-bázis. A primereket egy másik enzim szintetizálja - prímás. Egy másik enzim az helicase- szükséges a DNS kettős hélix feltekercseléséhez egyszálú szerkezet kialakításával, amely biztosítja mindkét szál replikációját a DNS-replikáció félkonzervatív modelljének megfelelően.

Egyes DNS-polimerázok arra is képesek, hogy kijavítsák az újonnan összeállított DNS-szál hibáit. Ha nem megfelelő nukleotidpárt észlelünk, a DNS-polimeráz egy lépést visszagördít, eltávolítja a rossz nukleotidot a láncból, majd beilleszti a megfelelő nukleotidot a helyére, majd a replikáció a szokásos módon folytatódik.

PCR lefolytatása

A polimeráz láncreakció (PCR) egy olyan DNS-amplifikációs módszer, amely néhány órán belül több milliárdszor képes izolálni és megsokszorozni egy bizonyos DNS-szekvenciát. A genom egy szigorúan meghatározott régiójának hatalmas számú másolatának beszerzése nagyban leegyszerűsíti a meglévő DNS-minta vizsgálatát.

A polimeráz láncreakció lejátszódásához számos feltételnek kell teljesülnie. A PCR-hez a legegyszerűbb esetben a következő összetevőkre van szükség:

Az amplifikálandó DNS szakaszt tartalmazó DNS-templát.

Két primer komplementer a kívánt fragmens végeihez. (Egy mesterségesen szintetizált oligonukleotid pár, általában 15-30 bp méretű, azonos a cél DNS megfelelő régióival. Ezek kulcsszerepet játszanak az amplifikációs reakciótermékek képződésében. A megfelelően kiválasztott primerek biztosítják a teszt specificitását és szenzitivitását rendszer.)

Hőstabil DNS polimeráz. A PCR-ben használt polimeráznak magas hőmérsékleten hosszú ideig aktívnak kell maradnia, ezért termofilekből izolált enzimeket - Thermus aquaticus (Taq polimeráz) és másokat - használnak.

Dezoxinukleotid-trifoszfátok (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

A polimeráz működéséhez szükséges Mg 2+ ionok.

Pufferoldat, amely biztosítja a szükséges reakciókörülményeket - pH, az oldat ionerőssége. Sókat, szérumalbumint tartalmaz.

A reakcióelegy elpárolgásának elkerülése érdekében magas forráspontú olajat, például vazelint adunk a kémcsőbe. Ha fűtött tetővel ellátott készüléket használ, ez nem szükséges.

Pirofoszfatáz hozzáadása növelheti a PCR reakció hozamát. Ez az enzim katalizálja a pirofoszfát hidrolízisét, amely a nukleotid-trifoszfátok növekvő DNS-szálhoz való hozzáadásának mellékterméke, az ortofoszfáttá. A pirofoszfát gátolhatja a PCR-reakciót.

Az eredeti DNS másolatainak számának megsokszorozásához ciklikus reakcióra van szükség. Általános szabály, hogy a szekvenciálisan ismételt PCR-ciklusok mindegyike három szakaszból áll:

1. A DNS denaturációja vagy „olvadása”. A kettős szálú DNS-templátot 94-96 °C-ra (vagy 98 °C-ra, ha különösen hőstabil polimerázt használunk) 0,5-2 percig melegítjük, hogy lehetővé tegyük a DNS-szálak elválását. Ezt a lépést denaturációnak nevezik, mivel a DNS két szála közötti hidrogénkötések megszakadnak. Néha az első ciklus előtt (a polimeráz hozzáadása előtt) a reakcióelegyet 2-5 percig előmelegítik, hogy a templát és a primerek teljesen denaturálódjanak. Ezt a megközelítést ún melegindítás, lehetővé teszi a nem specifikus reakciótermékek mennyiségének csökkentését.

2. Annealing – primerek kötődése templát DNS-hez. Miután a szálak elváltak, a hőmérsékletet lassan csökkentjük, hogy lehetővé tegyük a primerek megkötődését az egyszálú sablonhoz. A lágyítási hőmérséklet az alapozó összetételétől függ, és általában 50-65 °C-ra választják. Színpadi idő - 20-60 másodperc. Az illesztési hőmérséklet helytelen megválasztása vagy a primerek gyengén kötődik a templáthoz (emelt hőmérsékleten), vagy rossz helyen kötődik, és nem specifikus termékek jelennek meg (alacsony hőmérsékleten).

3. Szintézis (lánc megnyúlás). A DNS-polimeráz replikálja a templátszálat, a primert "magként" használva. A polimeráz a primer 3"-os végétől kezdi meg a második szál szintézisét, amely a templáthoz kötődött és a templát mentén mozog. Az elongációs hőmérséklet a polimeráztól függ. Az általánosan használt Taq és Pfu polimerázok 72 °C-on a legaktívabbak °C az amplifikálandó fragmentum hossza Tipikusan az elongációs időt minden ezer bázispáronként egy percnek tekintik. Az összes ciklus befejezése után gyakran egy további lépést is végrehajtanak. végső nyúlás hogy elkészüljön az összes egyszálú töredék. Ez a szakasz 7-10 percig tart.

Ezt követően a denaturáció, a lágyítás és a megnyújtás szakaszai sokszor (30 vagy több alkalommal) megismétlődnek. Minden ciklusban megduplázódik a DNS-fragmens szintetizált másolatainak száma.

Minden reakciót termosztátba merített kémcsövekben hajtanak végre. A hőmérsékleti rendszer megváltoztatása és karbantartása automatikusan megtörténik.

Ahhoz, hogy pontosan megértsük, hogyan megy végbe egy bizonyos DNS-szegmens amplifikációja a PCR során, világosan meg kell értenünk az összes primer és azok komplementer szekvenciáinak helyzetét az amplifikálható láncokban minden körben. Az első körben az újonnan szintetizált láncok mindegyike sokkal hosszabb, mint a távolság a primer 3"-hidroxilcsoportjától a második primerrel komplementer szekvencia terminális nukleotidjáig. Az ilyen láncokat "hosszú templátoknak" nevezik. rajtuk megy végbe a további szintézis.

A második körben a hasonló és újonnan szintetizált (hosszú templát) szálakból álló kettős szálú DNS-t ismét denaturálják, majd primerekkel összekapcsolják. A szintézis során ebben a körben ismét "hosszú templátok" szintetizálódnak, valamint számos olyan szál, amelyek egyik végén egy primer, a másik végén pedig a második primerrel komplementer szekvencia ("rövid templátok"). A harmadik körben az összes korábban kialakult heteroduplex egyidejűleg denaturálódik és primerekkel lágyul, majd replikálódik. A következő körökben egyre több a "rövid mátrix", és a 30. fordulóra számuk már 10 6-szor nagyobb, mint a kezdeti láncok vagy "hosszú mátrixok".

A specifikus reakciótermék mennyisége (amelyet a primerek korlátoznak) elméletileg arányosan növekszik 2 n -re, ahol n a reakcióciklusok száma. Valójában az egyes ciklusok hatékonysága 100% alatti lehet, tehát a valóságban:

ahol P a termék mennyisége, E a ciklus átlagos hatékonysága.

A "hosszú" DNS-másolatok száma is nő, de lineárisan, így a reakciótermékekben egy specifikus fragmentum dominál. A szükséges termék növekedését exponenciálisan korlátozza a reagensek mennyisége, az inhibitorok jelenléte és a melléktermékek képződése.

A PCR rendkívül érzékeny módszer, ezért ha a vizsgált mintában csak jelentéktelen mennyiségű DNS van, amely véletlenül egyik reakcióelegyből a másikba került, téves pozitív eredményt kaphatunk. Ez szükségessé teszi a PCR-hez használt összes oldat és eszköz gondos ellenőrzését.

Az alapozó kiválasztásának alapelvei.

A PCR tesztrendszer létrehozásakor az egyik fő feladat a primerek helyes kiválasztása, amelyeknek számos kritériumnak kell megfelelniük:

1. Az alapozóknak specifikusnak kell lenniük. Különös figyelmet kell fordítani a primerek 3" végére, mivel ezektől kezdi meg a Taq polimeráz befejezni a komplementer DNS-láncot. Ha ezek specificitása nem megfelelő, akkor nagy valószínűséggel nemkívánatos folyamatok mennek végbe a kémcsőben a reakciókeverékkel együtt. , nevezetesen a nem specifikus DNS (rövid vagy hosszú fragmentumok) szintézise. Elektroforézis során nehéz vagy könnyű további sávok formájában látható. Ez megnehezíti a reakció eredményeinek értékelését, mert könnyen összetéveszthető egy specifikus amplifikációs termék szintetizált idegen DNS-sel. Egyes primereket és dNTP-ket a nem specifikus DNS szintéziséhez használnak fel, ami az érzékelés jelentős elvesztéséhez vezet.

2. A primerek nem képezhetnek dimereket és hurkokat, pl. nem szabad stabil kettős szálakat kialakítani a primerek önmagukhoz vagy egymáshoz való illesztésével.

A közelmúltban egy megbízható, rendkívül érzékeny és gyors módszert fejlesztettek ki különféle humán fertőző betegségek diagnosztizálására. Ezt a módszert "PCR-analízisnek" nevezik. Mi ez, mi a lényege, milyen mikroorganizmusokat tárhat fel és hogyan kell helyesen bevenni, cikkünkben elmondjuk.

A felfedezés története


A PCR-módszereket a rák diagnosztizálására is használják.

A módszer előnyei

A PCR diagnosztikának számos előnye van:

  1. Magas érzékenység. Még csak néhány mikroorganizmus-DNS molekula jelenlétében is a PCR-elemzés meghatározza a fertőzés jelenlétét. A módszer segít a krónikus és lappangó betegségekben. Gyakran ilyen esetekben a mikroorganizmus egyébként tenyésztetlen.
  2. Bármilyen anyag alkalmas kutatásra, például nyál, vér, nemi szervek váladéka, haj, hámsejtek. A leggyakoribb a vérvizsgálat és az urogenitális kenet a PCR-hez.

  3. A növények hosszú távú termesztése nem szükséges. Az automatizált diagnosztikai folyamat lehetővé teszi, hogy 4-5 óra elteltével megkapja a vizsgálat eredményeit.
  4. A módszer majdnem 100%-ban megbízható. Csak elszigetelt eseteket jegyeztek fel hamis negatív eredményekkel.
  5. Egy anyagmintából többféle kórokozó azonosításának lehetősége. Ez nemcsak felgyorsítja a betegség diagnosztizálásának folyamatát, hanem jelentősen csökkenti az anyagköltségeket is. Gyakran az orvos átfogó PCR-elemzést ír elő. A hat kórokozó meghatározásából álló vizsgálat ára körülbelül 1500 rubel.

    6. Annak érdekében, hogy az eredmények megbízhatóak legyenek a PCR-vizsgálat során, át kell adni az elemzést, követve a diagnózis előzetes előkészítésére vonatkozó ajánlásokat:

    1. A nyáladás előtt 4 órával az anyag bevétele előtt tartózkodnia kell az evéstől és a gyógyszerszedéstől. Közvetlenül az eljárás előtt öblítse ki a száját forralt vízzel.
    2. A fenti szabályokat az arc belső felületéről történő mintavétel során is be kell tartani. Öblítés után ajánlatos enyhe bőrmasszázst végezni, hogy kiemeljük a mirigy titkát.
    3. A vizeletet általában otthon gyűjtik. Ehhez alaposan meg kell mosni a nemi szerveket. Gyűjtsön össze 50-60 ml vizeletet egy steril műanyag edénybe. Az anyag tisztaságának biztosítása érdekében a nőknek javasolt tampont behelyezni a hüvelybe, férfiaknak pedig a bőrredőt amennyire csak lehet húzni. Nem veheti be az anyagot a menstruáció alatt.
    4. A sperma adományozásához az anyag begyűjtése előtt 3 napig tartózkodnia kell a nemi érintkezéstől. Az orvosok nem tanácsolják a szauna látogatását és a forró fürdőt, az alkoholt és a fűszeres ételeket. 3 órával az elemzés előtt tartózkodnia kell a vizeléstől.
    5. Szülésnél például, ha PCR-tesztet végeznek chlamydia miatt, nőknek és férfiaknak egyaránt ajánlott 3 napos szexuális pihenés. Az elemzés előtt 2 héttel nem szabad antibakteriális gyógyszereket bevenni. Egy hétig abba kell hagynia az intim gélek, kenőcsök, hüvelykúpok, öblítés használatát. 3 órával a vizsgálat előtt tartózkodnia kell a vizeléstől. Menstruáció alatt az anyagmintavétel nem történik, csak a vérfolyás megszűnése után 3 nappal lehet urogenitális kenetet venni.

    PCR terhesség alatt

    A babavárás során számos szexuális úton terjedő fertőzés rendkívül veszélyes a magzat normális fejlődésére. Az STD-k méhen belüli növekedési retardációt, vetélést vagy koraszülést, a gyermek veleszületett fejlődési rendellenességeit okozhatják. Ezért rendkívül fontos a PCR vizsgálat elvégzése a terhesség korai szakaszában. A regisztráció során át kell adni az elemzést - legfeljebb 12 hétig.

    Az anyagot a nyaki csatornából speciális kefével veszik ki. Az eljárás fájdalommentes és nem jelent veszélyt a babára. Általában a terhesség alatt a chlamydia elemzését PCR-módszerrel, valamint ureaplasmosisra, mycoplasmosisra, citomegalovírusra, herpeszre, papillomavírusra vonatkozóan végzik. Az ilyen vizsgálati komplexumot PCR-6-nak nevezik.

    PCR a HIV diagnózisához

    Tekintettel arra, hogy a módszer nagyon érzékeny a szervezetben bekövetkezett változásokra és a diagnózis körülményeire, számos tényező befolyásolhatja az eredményt. Ezért a HIV-fertőzés PCR-analízise nem megbízható módszer, hatékonysága 96-98%. Az esetek fennmaradó 2-4%-ában a teszt hamis pozitív eredményt ad.

    De bizonyos helyzetekben nem nélkülözheti a HIV PCR-diagnosztikáját. Általában azoknak adják, akiknek álnegatív ELISA-eredménye van. Az ilyen mutatók azt jelzik, hogy egy személyben még nem alakultak ki antitestek a vírus ellen, és nem mutathatók ki a szám többszörös növekedése nélkül. Pontosan ez érhető el a PCR módszerrel végzett vérvizsgálattal.

    Az ilyen diagnosztikára HIV-pozitív anyától született első életévben is szükség van. Ez a módszer az egyetlen módja annak, hogy megbízhatóan meghatározzuk a gyermek állapotát.

    PCR a hepatitis diagnosztizálására

    A polimeráz láncreakciós módszer lehetővé teszi a hepatitis A, B, C vírus DNS-ének kimutatását jóval a fertőzés elleni antitestek képződése vagy a betegség tüneteinek megjelenése előtt. A hepatitis C PCR elemzése különösen hatékony, mivel az esetek 85% -ában ez a betegség tünetmentes, és időben történő kezelés nélkül krónikus stádiumba kerül.

    A kórokozó időben történő felismerése segít elkerülni a szövődményeket és a hosszú távú kezelést.

    Átfogó PCR vizsgálat

    Átfogó PCR analízis: polimer láncreakciós módszerrel végzett vizsgálat, mely magában foglalja többféle fertőzés egyidejű meghatározását: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, citomegalovírus, 1. és 2. típusú herpesz, gonorrhoea, papillomavírus. Az ilyen diagnosztika ára 2000 és 3500 rubel között mozog. a klinikától, a felhasznált anyagoktól és berendezésektől, valamint az elemzés típusától függően: kvalitatív vagy kvantitatív. Mi szükséges az Ön esetében - az orvos dönti el. Egyes esetekben elegendő a kórokozó jelenlétének meghatározása, másokban, például HIV-fertőzés esetén, a kvantitatív titer fontos szerepet játszik. A fenti kórokozók mindegyikének diagnosztizálása során a vizsgálatot "PCR-12 elemzésnek" nevezik.

    Az elemzés eredményeinek megfejtése

    A PCR elemzés megfejtése nem nehéz. A mutatónak csak 2 skálája van - "pozitív eredmény" és "negatív eredmény". Ha kórokozót észlelnek, az orvosok 99%-os biztonsággal megerősíthetik a betegség jelenlétét, és megkezdhetik a beteg kezelését. A fertőzés meghatározására szolgáló kvantitatív módszerrel a megfelelő oszlop jelzi a kimutatott baktériumok számszerű mutatóját. Csak az orvos tudja meghatározni a betegség mértékét és előírni a szükséges kezelést.

    Egyes esetekben, például a HIV-fertőzés PCR-rel történő meghatározásakor, negatív eredménnyel, további vizsgálatokat kell végezni a kapott mutatók megerősítésére.

    Hol kell elvégezni az elemzést?

    Hol kell PCR-elemzést végezni: állami klinikán vagy magánlaboratóriumban? Sajnos az önkormányzati egészségügyi intézményekben a felszerelések és módszerek gyakran elavultak. Ezért jobb, ha előnyben részesítjük a modern berendezésekkel és magasan képzett személyzettel rendelkező magánlaboratóriumokat. Ezenkívül egy magánklinikán sokkal gyorsabban érheti el az eredményeket.

    Moszkvában számos magánlaboratórium kínál PCR-elemzést különféle fertőzésekre. Például az olyan klinikákon, mint a Vita, a Complex Clinic, a Happy Family, az Uro-Pro, PCR-elemzést végeznek. A vizsgálat ára 200 rubeltől kezdődik. egyetlen kórokozó azonosítására.

    Megállapítható, hogy a fertőző betegségek diagnosztizálása PCR-rel a legtöbb esetben gyors és megbízható módszer a kórokozó kimutatására a szervezetben a fertőzés korai szakaszában. Ennek ellenére bizonyos esetekben érdemes más diagnosztikai módszereket választani. Egy ilyen vizsgálat szükségességét csak szakember tudja megállapítani. A PCR elemzés megfejtése is professzionális megközelítést igényel. Kövesse orvosa utasításait, és ne végezzen olyan vizsgálatokat, amelyekre nincs szüksége.