Етапи на метода на флуоресцентна in situ хибридизация. FISH тест: бърза диагностика на рак

Методът на флуоресцентна in situ хибридизация (FISF - fluorescence in situ hybridization) включва използването на уникални нуклеотидни ДНК последователности като сонда за търсене на желаните ДНК последователности в материала, получен от пациента. Локус-специфичната или ген-специфичната ДНК проба е белязана със специфичен маркер (напр. флуорохром), за да може да бъде открита чрез флуоресцентна микроскопия. Изследваната ДНК е препарат от хромозоми за микроскопско изследване, съдържащ нишки в метафазното ядро в интерфазата (в неразделящо се състояние). ДНК сондата и тестовата ДНК се денатурират, което води до образуването на едноверижна ДНК. ДНК сондата се добавя към хромозомния препарат и се инкубира за период от време, достатъчен за хибридизация на ДНК сондата и комплементарните ДНК последователности на пациента, ако пациентът има ДНК област, комплементарен на ДНК сондата. Хибридизацията възниква само върху комплементарни ДНК региони и не засяга фрагменти с други ДНК последователности от други части на генома. Наличието или отсъствието на белязана с флуорохром проба в ДНК след хибридизация се определя чрез изследване на хромозоми с помощта на флуоресцентна микроскопия. Резултатът, като правило, не предизвиква съмнение (фиг. 28.1).

Предимствата на FISH включват бърз анализ на голям брой клетки, висока чувствителност и специфичност и възможност за изследване на некултивируеми и неделящи се клетки. С помощта на този метод е възможно да се изследват клетките, съдържащи се в парафиновите срезове. Недостатъците на метода са, че е невъзможно да се получи информация за физическото състояние на изследваната ДНК или хромозомна област. FISH изисква познаване на локуса, участващ в хромозомната аберация, както и избор на подходяща ДНК сонда, която може да открие тази аберация. FISH не се използва като метод за скрининг. Методът се използва, за да се получи отговор на конкретен въпрос (определяне на липсата или наличието на предполагаема специфична мутация). По правило той допълва класическите методи за оцветяване на хромозоми и също така е основният начин за идентифициране на хромозоми в метафаза или интерфаза и специфични ДНК нуклеотидни последователности, лежащи в основата на определено заболяване (фенотип).

FISH се използва при пренатална диагностика и за характеризиране на тумори; в педиатричната практика се използва, като правило, за идентифициране на субмикроскопични делеции, свързани със специфични малформации. Синдромите, базирани на микроделеции, преди това се считаха за заболявания с неизвестна етиология, тъй като хромозомните делеции и пренареждания, които причиняват развитието на тези заболявания, обикновено не се визуализират с традиционните методи за хромозомен анализ. Такива малки делеции в специфични области на хромозомите могат да бъдат открити с голяма точност от FISH. Болестите, причинени от субмикроскопични делеции, включват

За лечение на онкологични патологии учените все още не са разработили перфектни методи за лечение, които насърчават възстановяването. Анализът на рибите при рак на гърдата дава надежда за ранна диагностика на заболяването. Методът ще позволи на жените да започнат лечение в най-ранните етапи, което ще увеличи шансовете за излекуване.

Какво е?

Изследването на риби при рак на гърдата е едно от прогресивните и подходящи средства за ранна диагностика. В превод от английски това означава тест за вътреклетъчна флуоресцентна хибридизация. С този генен тест онколозите анализират произхода на туморите. Анализът също така показва положителен или отрицателен ефект на гена, участващ в патогенезата и прогресията на агресивен тип рак - HER2.

Постоянното развитие на научните изследвания влияе върху намаляването на цената на теста FISH и го прави достъпен за все повече жени.

Увеличените лимфни възли в подмишниците могат да сигнализират за развитието на заболяването.

подути лимфни възли в подмишниците;
уплътнения в областта на гърдите;
болка при натискане на зърното;
асиметрия на млечните жлези;
дискомфорт и болка в една от гърдите;
изпускане от зърната;
набръчкана кожа на млечната жлеза;
обърнато зърно.

Изготвяне и предаване на анализ

Не е необходима специална подготовка за преминаване на рибния тест. Можете не само да пиете алкохол, както и преди да вземете тестове и да ядете мазни, месни и тежки храни. Храната трябва да е лека, по-добре е зеленчукови ястия и сокове. Фиш тестът за рак на гърдата е безвредна и безопасна процедура, която протича на два етапа:

Хистологични. При локална анестезия се извършва биопсия на биоматериал от гърдата. Полученият материал се обработва със специална боя с флуоресцентни маркери. Според техните химични свойства тези маркери се свързват изключително с определените хромозоми и техните набори в клетките. В резултат на изследването се виждат най-оцветените с маркера хромозомни набори, което показва степента на промени в генома по онкологична принадлежност.
Анализ на риба. Във вената се влива ДНК компонент - дезоксирибонуклеинова киселина, оцветена със специфични маркери. Маркерните етикети са интегрирани в геномите на клетъчно ниво. Изследването се провежда в присъствието на пациента, а резултатите от анализа се предоставят незабавно.

Какво показват резултатите?

Хистологията на гърдата позволява да се установи вида на тумора и причините за неговото възникване.

Анализът на рибата за рак на гърдата показва следните резултати:

Хистологично изследване. Резултатите се определят според наситеността на маркерите в областите на хромозомните комплекти. Число 1 или по-малко означава, че няма опасност. Числото показва гранично състояние, изискващо допълнителни изследвания. Числото 3 означава развитието на онкологичния процес.
Реакция на риба при рак на гърдата. Отрицателният резултат от реакцията означава, че молекулите на дезоксирибонуклеиновата киселина не участват в патогенезата на атипичните клетки. С развитието на злокачествена формация генът HER2 не засяга раковата клетка. При положителна реакция скоростта на делене на гените, участващи в патогенезата на онкологичните молекули, се удвоява.

метод на хибридизация на място* (на място, лат.) се основава на способността на ДНК или РНК да образуват стабилни хибридни молекули с ДНК / РНК сонди директно върху препарати от фиксирани хромозоми и интерфазни ядра. Използвайки този метод, можете да определите точното местоположение на почти всяка ДНК или РНК последователност директно в клетката, клетъчното ядро или хромозомите.

За хибридизация. на мястоподходящи цитологични или хистологични препарати от клетки от всякакви тъкани или органи, приготвени съгласно стандартните методи. В клинична цитогенетична лаборатория се използват препарати от култивирани лимфоцити от периферна кръв, хорионепителни цитотрофобластни клетки, култивирани и некултивирани клетки от амниотична течност, различни тъкани от абортен материал, както и намазки от букален епител и кръвни клетки.

метод на хибридизация на място е от особено значение за практическата цитогенетика поради разработването на неизотопен вариант, базиран на използването на проби, маркирани с нерадиоактивни модифицирани нуклеотиди. Неизотопните варианти на хибридизация върху препарати (особено флуоресцентни) имат редица предимства в сравнение с изотопните: висока разделителна способност, която е равна на разделителната способност на микроскоп (0,1 - 0,2 μm), няма нужда от статистическа обработка на резултатите, скорост и безопасност за здравните изследователи

В допълнение, комбинация от различно модифицирани проби, открити с помощта на различни системи за откриване, позволява едновременно определяне на местоположението на две или повече ДНК последователности в една клетка или на една метафазна плака. А използването на повтарящи се последователности, маркирани с флуорохроми като ДНК сонди, намалява времето на процедурата до 7-9 часа (класическата безизотопна хибридизация отнема два дни, изотопните варианти от седмица до месец), което е особено важно за пренаталната диагностика. Използване FISH методв цитогенетичната диагностика позволява да се идентифицират структурни хромозомни пренареждания, да се установи естеството на маркерните хромозоми и да се анализират числените нарушения на хромозомния набор, както върху метафазните хромозоми, така и в интерфазните ядра.

Принцип на метода FISH

В основата FISH методлежи реакцията на хибридизация между изкуствено създадена ДНК проба и нейната комплементарна нуклеотидна последователност от ядрена ДНК. Молекулата на ДНК се състои от две спирално свързани нуклеотидни вериги и хибридизацията е възможна само ако веригите се разделят. За да се разединят нуклеотидните вериги на ДНК, се използва денатурация (за последваща хибридизация, както ДНК в ядрата на изследваната проба, така и самата ДНК сонда трябва да бъдат денатурирани). След денатуриране, ДНК сондата се хибридизира към своята комплементарна нуклеотидна последователност и може да бъде открита с помощта на флуоресцентен микроскоп.

По този начин общата форма на протокола за настройка РИБАможе да се представи в следната форма:

1. Изготвяне на хистологичен или цитологичен препарат.
Приготвянето на хистологичен препарат се извършва по стандартната схема: изрязване, маркиране, окабеляване, изливане, микротомия, поставяне на разреза върху предметно стъкло и депарафинизация. При приготвянето на цитологичен препарат се използват специални утаителни разтвори и центрофугиране, което позволява да се получи концентрирана клетъчна суспензия.

2. Предварителна обработка (при необходимост).
Препаратът се обработва от протеази, за да се елиминира наличието на протеини, които пречат на хибридизацията.

3. Поставяне на ДНК сонда върху препарата и последваща денатурация.
За да се денатурират сондата и пробата ДНК, те се третират с формамид и се нагряват до температура около 85-90°C.

4. Хибридизация.
След денатуриране препаратът се охлажда до определена температура (37°C в случай на клинични изследвания) и се инкубира във влажна камера за няколко часа (продължителността на инкубацията е посочена във всеки конкретен протокол). Понастоящем се използват автоматични хибридизатори за денатурация и хибридизация.

5. Измиване.
След като хибридизацията приключи, несвързаните проби трябва да бъдат отмити, което иначе би създало фон, който затруднява оценката на резултатите от FISH. За промиване обикновено се използва разтвор, съдържащ цитрат и натриев хлорид (SSC).

6. Контраоцветяване.
С помощта на флуоресцентни багрила (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; пропидиев йодид) се оцветява цялата ядрена ДНК.

7. Анализ на резултатите с помощта на флуоресцентен микроскоп. Рутинните операции (депарафинизиране, предварителна обработка, измиване) могат да бъдат автоматизирани.

* - Материалът е изготвен въз основа на информация от открити източници.

Методът за оцветяване FISH (флуоресцентна in situ хибридизация) е разработен в Ливърморската национална лаборатория (САЩ) през 1986 г. Това е принципно нов метод за изследване на хромозомите - методът за флуоресцентно откриване на ДНК чрез in situ хибридизация със специфични молекулярни сонди. Методът се основава на способността на хромозомната ДНК да се свързва при определени условия с ДНК фрагменти (ДНК проби), които включват нуклеотидни последователности, комплементарни на хромозомната ДНК. ДНК сондите са предварително маркирани със специални вещества (например биотин или дигоксигенин). Маркираните ДНК проби се прилагат към цитогенетични препарати на метафазни хромозоми, подготвени за хибридизация. След като е настъпила хибридизация, препаратите се третират със специални флуоресцентни багрила, конюгирани с вещества, които могат селективно да се свързват с биотин или дигоксигенин. Всяка хромозома има определен цвят. Хибридизацията може също да се извърши с радиоактивно маркирани сонди. Цитогенетичният анализ се извършва под флуоресцентен микроскоп в ултравиолетова светлина.

Методът FISH се използва за откриване на малки делеции и транслокации. Хромозомните обмени (транслокации и дицентрики) между различно оцветени хромозоми лесно се идентифицират като многоцветни структури.

Край на работата -

Тази тема принадлежи на:

Учебен модул. клетъчна биология

Висше професионално образование.. Башкирски държавен медицински университет.. Министерство на здравеопазването и социалното развитие..

Ако имате нужда от допълнителен материал по тази тема или не сте намерили това, което търсите, препоръчваме да използвате търсенето в нашата база данни с произведения:

Какво ще правим с получения материал:

Ако този материал се оказа полезен за вас, можете да го запазите на страницата си в социалните мрежи:

Всички теми в този раздел:

Учебен модул. Основи на общата и медицинска генетика
(насоки за студенти) Учебна дисциплина Биология За посоката на подготовка Обща медицина Ко.

Правила за регистриране на лабораторната работа
Необходим елемент от микроскопското изследване на обект е неговата скица в албум. Целта на скицата е по-доброто разбиране и фиксиране в паметта на структурата на обекта, формата на отделните структури.

Практическа работа
1. Приготвяне на временен препарат "Клетки от филм от лук" За да приготвите временен препарат с филм от лук, отстранете

Структурата на цитоплазмените мембрани. Транспортна функция на мембраните
2. Цели на обучението: Да познава: - структурата на универсалната биологична мембрана - моделите на пасивен транспорт на вещества през мембраните

Структурата на еукариотните клетки. Цитоплазма и нейните компоненти
2. Цели на обучението: Да познава: - особености на организацията на еукариотните клетки - структурата и функцията на цитоплазмените органели.

Органели, участващи в синтеза на вещества
Във всяка клетка се извършва синтеза на характерни за нея вещества, които са или строителни материали за новообразувани структури вместо износени, или ензими, участващи в биохимични реакции.

Органели със защитна и храносмилателна функция
Лизозоми Тези органели са известни от 50-те години на миналия век, когато белгийският биохимик дьо Дюве открива в чернодробните клетки малки гранули, съдържащи хидролитични

Органели, участващи в енергийното снабдяване на клетката
По-голямата част от клетъчните функции включват разход на енергия. Живата клетка го образува в резултат на постоянно протичащи редокс процеси, съставляващи

Органели, участващи в клетъчното делене и движение
Те включват клетъчния център и неговите производни - реснички и флагели. Клетъчен център Клетъчният център се намира в животински клетки и в някои

Практическа работа №1
Фиг. 1. Микроскопски анализ на перманентния препарат "Комплекс на Голджи в гръбначномозъчните ганглийни клетки" На препарата нервните клетки на име

Рибозоми
Те се откриват чрез електронна микроскопия в клетките на всички организми на про- и еукариоти, техният размер е 8-35 nm, те са в съседство с външната мембрана на ендоплазмения ретикулум. Осъществява се върху рибозоми

Гранулиран ендоплазмен ретикулум
Разгледайте субмикроскопската структура на грапавия ендоплазмен ретикулум в електронна микрография. Разкриват се три области от ацинарни клетки на панкреаса на гладуващ прилеп. Преди

Цитоплазмени микротубули
Цитоплазмените тубули се намират в клетките на всички животински и растителни организми. Това са цилиндрични, нишковидни образувания с дължина 20-30 микрона, 1

Митотична активност в тъканите и клетките
Понастоящем са изследвани митотичните цикли и режимът на митотична активност на много животински и растителни тъкани. Оказа се, че всяка тъкан има определено ниво на митотична активност. Около м

Митоза (непряко делене) в клетките на корена на лука
С малко увеличение на микроскопа намерете зоната на размножаване на върха на лука, поставете в центъра на зрителното поле област с ясно видими активно делящи се клетки. След това задайте лекарството на голямо увеличение

Амитоза (директно делене) в миши чернодробни клетки
Разгледайте чернодробните клетки на мишка при голямо увеличение на микроскопа. На препарата клетките имат многостранна форма. В неделящите се клетки ядрото е заоблено с ядро. В делящи се клетки, които са започнали да

Синкарион на яйцеклетката на Ascaris
С малко увеличение на микроскопа намерете част от матката на аскаридата, пълна с фоликули с яйца. Вижте образеца при голямо увеличение. Цитоплазмата в яйцето се свива и се отлепва

Структура и функции на ДНК и РНК. Структура на гените и регулация на генната експресия при про- и еукариоти. Етапи на биосинтеза на протеини
2. Цели на обучението: Да познава: - химичния състав и особеностите на организацията на нуклеиновите киселини; - разлики между ДНК и РНК;

Модели на унаследяване на белези при монохибридно кръстосване. Видове взаимодействие на алелни гени
2. Цели на обучението: Да познава: - закономерностите на монохибридното кръстосване; - I и II закон на Мендел; - видове взаимодействие

Законът за независимото наследяване на белези. Видове взаимодействие на неалелни гени
2. Цели на обучението: Да познава: - закономерностите на ди- и полихибридно кръстосване; - III закон на Мендел; - видове взаимодействие

Променливостта като свойство на живото, неговата форма. Фенотипна (модификация или ненаследствена) променливост. Генотипна изменчивост
2. Цели на обучението: Да познава: - основните форми на изменчивост; - получавате идеи за проникването и изразителността на разпознаването

Самостоятелна работа на учениците под ръководството на учител
Практическа работа Определяне на степента на изменчивост на признака и коефициента на вариация в зависимост от условията на средата.

Анализ на родословието
Не всички методи на генетиката са приложими за анализа на унаследяването на определени черти при хората. Въпреки това, чрез изучаване на фенотипа на няколко поколения роднини, е възможно да се установи естеството на наследството

Двоен метод за изследване на човешката генетика
Методът на близнаците оценява относителната роля на генетичните фактори и факторите на околната среда в развитието на определена черта или заболяване. Близнаците са еднояйчни (еднояйчни) и дизиготни (пъти

Дерматоглифен метод за изследване на човешката генетика
Дерматоглифният анализ е изследване на папиларните модели на пръстите, дланите и краката. В тези области на кожата има големи дермални папили, а епидермисът, който ги покрива, образува г

Цитогенетичен метод в изследването на генетиката на човека
Сред многото методи за изследване на наследствената патология на човека цитогенетичният метод заема важно място. С помощта на цитогенетичния метод е възможно да се анализират материалните основи на наследствеността

Изследване на хромозомния набор
Може да се извърши по два начина: 1) чрез директен метод - изследване на метафазни хромозоми в делящи се клетки, например костен мозък (използван

Практическа работа
1. Разглеждане на демонстрационния препарат "Човешки кариотип" в цитогенетична лаборатория.С X90 увеличение се виждат левкоцити в зрителното поле

Анализ на кариотипа при пациенти с хромозомни заболявания (от снимки)
№ 1. тризомия на хромозома 13 (синдром на Патау). Кариотип 47, +13. № 2. тризомия на хромозома 18 (синдром на Едуардс). Кариотип 47, +18. № 3. тризомия на хромозома 21 (болест на Даун).

Извършване на анализ на пръстови отпечатъци
За да направите свои собствени пръстови отпечатъци, имате нужда от следното оборудване: фотографски валяк, стъкло 20x20 cm2, парче гума от порест материал, печатарско мастило (или др.

Цитогенетичен анализ на кариотипа (на базата на микроснимки на метафазни плаки)
1. Скицирайте метафазната плоча. 2. Пребройте общия брой хромозоми. 3. Идентифицирайте хромозомите от групи A (3 двойки големи метацентрични хромозоми), B (две двойки големи

Експресен метод за изследване на X-sex хроматин в ядрата на епитела на устната лигавица
Преди да вземете остъргване, пациентът е помолен да захапе лигавицата на бузата със зъби и да избърше вътрешната повърхност на бузата с марлева салфетка. Тази процедура е необходима за отстраняване на разрушените клетки, напр

Популационно-статистически метод
Популацията е набор от индивиди от един и същи вид, които обитават една и съща територия за дълго време, относително изолирани от други групи индивиди от този вид, свободно кръстосващи се помежду си и давайки

Биохимичен метод
Биохимичните методи се основават на изследване на активността на ензимните системи (или чрез активността на самия ензим, или чрез количеството крайни продукти от реакцията, катализирана от този ензим). Биохимикали

Молекулярно-генетичен метод
Всички молекулярно-генетични методи се основават на изследване на структурата на ДНК. Етапи на ДНК анализ: 1. Изолиране на ДНК от клетки, съдържащи ядра (кръв

Полимеразна верижна реакция на синтеза на ДНК
Полимеразната верижна реакция (PCR) е in vitro метод за усилване (размножаване) на ДНК, който може да се използва за идентифициране и умножаване на представляващ интерес ДНК фрагмент от 80

No Пълно име Генотип Иванов АА Петров Аа

Наблюдаван генотип и алелни честоти
Генотипове, алели Брой случаи Честота (в дялове) АА 1/5 = 0,2 Аа

Наблюдавани и очаквани честоти на генотипове и алели
Наблюдаван брой случаи Наблюдавана честота Очаквана честота на AA (p2)

Наблюдаван генотип и алелни честоти
№ p / p Възможност за навиване на езика в тръба Генотипове Мога (да) A_

Кратък отговор: Методът на флуоресцентна in situ хибридизация (FISH - fluorescence in situ hybridization) включва използването на уникални ДНК нуклеотидни последователности като сонда за търсене на желаните ДНК последователности в материала, получен от пациента. Методът се основава на комплементарното свързване на ДНК сонда с ДНК на метафазни хромозоми или интерфазни клетки. ДНК сондата и тестовата ДНК се денатурират, за да образуват едноверижна ДНК. ДНК сондата се добавя към хромозомния препарат и се инкубира за определено време. Наличието или отсъствието на белязана с флуорохром проба в ДНК след хибридизация се определя чрез изследване на хромозоми с помощта на флуоресцентна микроскопия.

Подробен отговор: Метод на флуоресцентна хибридизация на мястови позволява да идентифицирате отделни хромозоми или техните индивидуални региони върху препарати от метафазни хромозоми или интерфазни ядра въз основа на комплементарното взаимодействие на ДНК сонда, конюгирана с флуоресцентен етикет и желания регион на хромозомата. За визуализиране на пептидно-нуклеинови съединения върху хромозомата се използват PNA сонди на базата на протеинов продукт.
Методът се основава на комплементарното свързване на ДНК сонда с ДНК на метафазни хромозоми или интерфазни клетки и включва следните стъпки:
1. Денатурациядвойноверижна сонда ДНК и прицелна ДНК към едноверижна под въздействието на висока температура или химически агенти.
2. ХибридизацияДНК сонда с ДНК мишена според принципа на комплементарност с образуването на двойноверижна хибридна молекула
3. Измиване след хибридизацияза отстраняване на нехибридизирана ДНК сонда
4. Анализхибридизационни сигнали с флуоресцентен микроскоп

ПредимстваМолекулярно-генетичните диагностични методи FISH включват бърз анализ на голям брой клетки, висока чувствителност и специфичност и възможност за изследване на некултивирани и неделящи се клетки.
недостатъциМетодът е невъзможността да се получи информация за физическото състояние на изследваната ДНК или хромозомния сегмент.
FISH се използва при пренатална молекулярно-генетична диагностика и за характеризиране на тумори; в педиатричната практика се използва, като правило, за идентифициране на субмикроскопични делеции, свързани със специфични малформации. Синдромите, базирани на микроделеции, преди това се считаха за заболявания с неизвестна етиология, тъй като хромозомните делеции и пренареждания, които причиняват развитието на тези заболявания, обикновено не се визуализират с традиционните методи за хромозомен анализ. Такива малки делеции в специфични области на хромозомите могат да бъдат открити с голяма точност от FISH. Болестите, причинени от субмикроскопични делеции, включват Синдроми на Prader-Willi, Angelman, Williams, Miller-Dieker, Smith-Magenis и велокардиофациален синдром. FISH улеснява диагностицирането на тези синдроми в нетипични случаи, особено в ранна детска възраст, когато все още липсват много диагностично значими признаци на заболяването. Използването на този метод за молекулярно-генетична диагностика е препоръчително и в юношеска и зряла възраст, когато типичните клинични признаци на заболяването, характерни за детството, претърпяват промени.

121. ДНК сонди. Използването им при определяне на наследствени заболявания.

Кратък преглед

ДНК сондата екъс фрагмент от ДНК, конюгиран с флуоресцеин, ензим или радиоактивен изотоп, който се използва за хибридизиране към комплементарния регион на целевата ДНК молекула.

Главна част

ДНК диагностични системи

Информация за цялото разнообразие от свойства на един организъм се съдържа в неговия генетичен материал. По този начин патогенността на бактериите се определя от наличието на определен ген или набор от гени в тях, а наследственото генетично заболяване възниква в резултат на увреждане на определен ген. Сегментът на ДНК, който определя този биологичен признак, има строго определена нуклеотидна последователност и може да служи като диагностичен маркер.

Много бързи и надеждни диагностични методи се основават на хибридизация на нуклеинова киселина - сдвояване на два комплементарни сегмента от различни ДНК молекули. Процедурата в общи линии е следната.

1. Фиксиране на едноверижна ДНК мишена върху мембранен филтър.

2. Прилагане на белязана едноверижна ДНК сонда, която при определени условия (температура и йонна сила) се сдвоява с таргетната ДНК.

3. Измиване на филтъра за отстраняване на излишната несвързана белязана ДНК сонда.

4. Откриване на хибридни молекули сонда/мишена.

В диагностичните тестове, базирани на хибридизация на нуклеинова киселина, три компонента са ключови: ДНК сонда, ДНК мишена и метод за откриване на хибридизиращ сигнал. Системата за откриване трябва да бъде много специфична и силно чувствителна.

* Флуоресцеин (диоксифлуоран, уранин А) е органично съединение, флуоресцентно багрило. В аналитичната химия флуоресцеинът се използва като луминисцентен киселинно-алкален индикатор. В биохимията и молекулярната биология, изотиоцианатни производни на флуоресцеин като биологични багрила за определяне на антигени и антитела.

* Детекция е откриване, идентифициране, намиране на нещо.

*conjugation=спрежение

*Ако смес от ДНК, например човешка и миша, се разтопи и закали в една "епруветка", тогава някои участъци от миши ДНК вериги ще се комбинират отново с комплементарни участъци от човешки ДНК вериги, за да образуват хибриди. Броят на тези обекти зависи от степента на родство на видовете. Колкото по-близо са видовете един до друг, толкова повече региони на взаимно допълване на ДНК вериги. Това явление се нарича ДНК-ДНК хибридизация.

122. Методи и условия за използване на директна ДНК диагностика.

Кратък преглед:

Чрез директни методи се откриват нарушения в първичната нуклеотидна последователност на ДНК (мутации и техните видове). Директните методи се характеризират с точност, достигаща почти 100%.

Целта на директната диагностика е да се идентифицират мутантни алели (аномалии в първичната нуклеотидна последователност на ДНК, мутации и техните видове).

Недостатъкът на директната ДНК диагностика е необходимостта да се знае точното местоположение на гена и спектъра на неговите мутации. Методите за директна ДНК диагностика са показани при заболявания като фенилкетонурия (мутация R408W), кистозна фиброза - (най-честата мутация delF508), хорея на Хънтингтън (разширяване на тринуклеотидни повтори-CTG повтори) и др.

Пълен отговор:

1) известна цитогенетична локализация на гена, отговорен за развитието на наследствено заболяване,

2) генът на заболяването трябва да бъде клониран и неговата нуклеотидна последователност да е известна.

Целта на директната диагностика е да се идентифицират мутантни алели (аномалии в първичната нуклеотидна последователност на ДНК, мутации и техните видове). Високата точност на метода за директна ДНК диагностика в повечето случаи не изисква ДНК анализ на всички членове на семейството, тъй като откриването на мутация в съответния ген позволява да се потвърди диагнозата с почти 100% точност и да се определи генотипът на всички членове на семейството на болно дете, включително хетерозиготни носители.

Недостатъкът на директната ДНК диагностика е необходимостта да се знае точното местоположение на гена и спектъра на неговите мутации.

Методите за директна ДНК диагностика са показани при заболявания като фенилкетонурия (мутация R408W), кистозна фиброза - (най-честата мутация delF508), хорея на Хънтингтън (разширяване на тринуклеотидни повтори-CTG повтори) и др.

Към днешна дата обаче гените на много заболявания не са картографирани, тяхната екзон-интронна организация е неизвестна и много наследствени заболявания се характеризират с изразена генетична хетерогенност, което не позволява пълното използване на директни методи за ДНК диагностика. Следователно информационното съдържание на метода за директна ДНК диагностика варира в широки граници. Така че, при диагностицирането на хорея на Хънтингтън, ахондроплазия, тя е 100%, с фенилкетонурия, кистозна ацидоза, адреногенитален синдром - от 70 до 80%, а с болест на Уилсън-Коновалов и миопатия на Дюшен / Бекер - 45-60%. В тази връзка се използват индиректни методи за молекулярно-генетична диагностика на наследствени заболявания.