Sa pozitivnim RSC u eksperimentu se opaža. Reakcija fiksacije komplementa

Reakcija fiksacije komplementa (RCC) zasniva se na činjenici da specifični kompleks antigen-antitijelo uvijek adsorbira (veže) komplement na sebe.

Ova reakcija se široko koristi u identifikaciji antigena i u serodijagnostici infekcija, posebno bolesti * uzrokovanih spirohetama (Wassermannova reakcija), rikecijama i virusima.

RSK je složena serološka reakcija. Uključuje komplement i dva sistema antigen-antitijelo. U suštini, to su dvije serološke reakcije.

Prvi sistem, glavni, sastoji se od antigena i antitela (jedno je poznato, drugo nije). Dodata mu je određena količina komplementa. Kada se antigen i antitijelo ovog sistema poklope, oni će se povezati i vezati komplement. Dobijeni kompleks je fino raspršen i nije vidljiv.

Formiranje ovog kompleksa poznato je uz pomoć drugog hemolitičkog ili indikatorskog sistema. Uključuje ovčje eritrocite (antigen) i njihov odgovarajući hemolitički serum (antitijela), odnosno gotov imuni kompleks. U ovom sistemu do lize eritrocita može doći samo u prisustvu komplementa. Ako je komplement vezan za prvi sistem (ako u njemu odgovaraju antigen i antitelo), onda neće biti hemolize u drugom sistemu - pošto nema slobodnog komplementa. Odsustvo hemolize (sadržaj epruvete je zamućen ili se na dnu epruvete nalazi sediment eritrocita) evidentira se kao pozitivan rezultat RSK.

Ako u prvom sistemu antigen ne odgovara antitelu, onda se imunološki kompleks ne formira i komplement će ostati slobodan! Ostajući slobodan, komplement učestvuje u drugom sistemu, izazivajući hemolizu - rezultat RSK je negativan (sadržaj epruveta je providan - „krv laka“).

Komponente reakcije fiksacije komplementa:

Antigen - obično lizat, ekstrakt, hapten; rjeđe spuštaj slušalicu.

1.Antitelo-serum sistema pacijenta
2. Komplement - serum zamorca

3. Antigen - eritrociti ovaca

4.Antitelo - hemolizin na ovnu eritrocite

5. Izotonični rastvor

S obzirom na to da je u RSC uključen veliki broj složenih komponenti, one se moraju prethodno titrirati i uvesti u reakciju u tačnim količinama iu jednakim količinama: 0,5 ili 0,25, rjeđe 0,2 ml. U skladu s tim, cijeli eksperiment se provodi u zapreminama od 2,5, 1,25 ili 1,0 ml (veći volumeni daju precizniji rezultat). Titracija komponenti reakcije se provodi u istoj zapremini kao i eksperiment, zamjenjujući nedostajuće sastojke izotoničnom otopinom.

Priprema sastojaka

Hemolitički serum (hemolizin). Serum je razrijeđen 3 puta manje od njegovog titra (vidi str. 211). Pripremite ukupno razrjeđenje seruma za cijeli eksperiment, čija se zapremina određuje množenjem volumena seruma u jednoj epruveti (na primjer, 0,5 ml) s brojem epruveta nešto većim od broja njih u eksperimentu.

2. Ovčiji eritrociti. Pripremite 3% suspenziju ispranih ovčijih eritrocita (vidi str. 211) za cijeli broj epruveta u eksperimentu. Za pripremu hemolitičkog sistema, 30 minuta prije uvođenja u eksperiment, pomiješaju se jednake količine razrijeđenog hemolizina i suspenzije eritrocita, dodajući serum eritrocitima, dobro promiješaju i inkubiraju 30 minuta na 37°C.

3. Komplement se obično razblaži 1:10. mora se titrirati prije svakog eksperimenta. Titar komplementa je njegova najmanja količina, kada se doda u hemolitički sistem, potpuna hemoliza se javlja u roku od 1 sata na 37°C. Šema titracije komplementa je predstavljena u tabeli 21.

Pažnja! Kompliment se titrira u istoj količini kao i glavni eksperiment, zamjenjujući nedostajuće sastojke izotoničnom otopinom.

Obračun rezultata. U kontrolama ne bi smjelo biti ni tragova hemolize, jer jednoj od njih nedostaje komplementa, a drugoj hemolizinu. Kontrole ukazuju na odsustvo reakcija hemotoksičnosti (sposobnost spontane lize eritrocita) u komponentama.

U tabeli. 21 na primjer, titar komplementa u razrjeđenju 1:10 je 0,15 ml. U eksperimentu se aktivnost komplementa može smanjiti zbog njegove nespecifične adsorpcije drugim komponentama reakcije, pa se za eksperiment povećava količina komplimenta: uzima se doza koja slijedi nakon titra. Ovo je radna doza. U datom primjeru, to je jednako 0,2 komplementa u razrjeđenju 1:10. Budući da se sve komponente uključene u CSC moraju uzeti u jednakim količinama (u našem primjeru to je 0:5 ml), potrebno je u radnu dozu komplementa (0,2 ml 1:10) dodati 0,3 ml izotonične otopine. Za cijeli eksperiment, volumen svakog od njih (komplementa i izotonične otopine.

Za cijeli eksperiment, volumen svakog od njih (komplementa i izotonične fiziološke otopine) se množi s brojem epruveta uključenih u CSC. Na primjer, da biste izvršili eksperiment u 50 epruveta, potrebno je uzeti 10 ml komplementa 1:10 (0,2 mlx50) i 15 ml izotonične otopine (0,3 mlx50).

4. Antigen se obično prima gotov sa naznakom njegovog titra, tj. količina koju bi, nakon razblaženja antigena, trebalo da sadrži 1 ml. na primjer, pri titru od 0,4 razrijeđen je u 0,96 ml izotonične fiziološke otopine. U eksperimentu uzimam količinu antigena jednaku polovini titra (0,5 ml). Ovo je njegova radna doza. Recimo ukupno razrjeđenje antigena za cijelo iskustvo, množenjem 0,5 ml s brojem epruveta u iskustvu.

5. Antitijelo - serum pacijenta. Svježi serum se inaktivira prije eksperimenta kako bi se uništio komplement prisutan u njemu. Da biste to učinili, zagrijava se 30 minuta na 56°C u vodenoj kupelji ili u inaktivatoru s termostatom. Posljednja metoda je poželjnija: eliminira mogućnost pregrijavanja seruma, odnosno njegove denaturacije. Denaturirani serumi nisu prikladni za testiranje. Pacijentov serum se obično koristi u razrjeđenju od 1:10 do 1:160.

Tabela br. 14

Sastojci, ml	epruvete
iskustvo	kontrolu
										Hemolitički sistem	eritrociti
Izotonični rastvor	1,45	1,4	1,35	1,3	1,25	1,2	1,15	1,1	1,05	1,0	1,5	1,5
Dopuna 1:10	0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3	0,35	0,4	0,45	0,5	―	0,5
Hemolitički sistem	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	―
3% suspenzija ovčijih eritrocita	―	―	―	―	―	―	―	―	―	―	―	0,5
Epruvete se dobro protresu i inkubiraju na 37°C 1 sat.
rezultat	Nema hemolize	Hemoliza	Nema hemolize

Imuni serumi se najčešće pripremaju u industrijskim uslovima i puštaju inaktivirani. Uzgajaju se 1:50 i više.

Sve komponente se pripremaju sa malim viškom.

Sastojci, ml	epruvete

Kontrola iskustva
	serum	antigen	Hemolitički sistem	Komplement u radnoj dozi
½
Faza 1 Izotonični fiziološki rastvor	―	0,5	0,5	1,5	1,25	1,0	0,5
Testirani serum razrijeđen 1:10	0,5	0,5	―	―	―	―	―
Antigen u radnoj dozi	0,5		0,5	―	―	―	―
Komplement 1:10 u radnoj dozi	0,5	0,5	0,5	―	0,25	0,5	1,0
Epruvete se dobro protresu i inkubiraju na 37°C 45 min 1 h ili 4°C 18 h
Faza 2 hemolitički sistem	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Epruvete se dobro protresu i inkubiraju na 37°C do potpune hemolize u 2, 3, 6 i 7 epruveta
Rezultat	Pozitivno ili negativan	―	―	++++	(+)	―	―

Tabela br. 15

Provođenje glavnog iskustva

Prilikom postavljanja eksperimenta, to je izuzetno; važan je redosled kojim se komponente dodaju. Eksperiment se izvodi u dvije faze.

Faza I. U epruvete se ulije potrebna količina izotonične otopine natrijum hlorida, zatim potrebna zapremina razrijeđenog seruma i radne doze antigena i komplementa u istoj zapremini. Iskustvo mora biti praćeno kontrolom svih sastojaka koji su u njemu uključeni: seruma, antigena, hemolitičkog sistema i komplementa.

Epruvete se dobro protresu i inkubiraju na 37°C 45 min-1 h ili na 4°C (“CSC na hladnom”) 18 h. Za to vreme, u prisustvu specifičnog kompleksa, dolazi do fiksacije komplementa. Provođenje reakcije "na hladno" značajno povećava njenu osjetljivost i specifičnost.

Faza II Na kraju inkubacije u sve epruvete se dodaje po 1 ml hemolitičkog sistema, koji se prethodno drži u termostatu 30 minuta (senzibilizovan). Cijevi se protresu i vrate u termostat.

Računovodstveni rezultat oko at. Epruvete se ostavljaju u termostatu do potpune hemolize u 2., 3., 6. i 7. epruveti (kontrola seruma, antigena i komplementa za jednu i dvije doze). Prije svega, hemoliza će nastupiti u 7. epruveti koja sadrži dvostruku količinu komplementa. Nakon što dođe do hemolize u ovoj epruveti i njen sadržaj postane potpuno providan, morate pažljivo pratiti ostale kontrole. Čim tečnost u 2., 3. i 6. epruveti postane providna, treba odmah ukloniti stalak sa epruvetama sa termostata. Na činjenicu da pokus nije držan u termostatu duže nego što je potrebno ukazuje i prisustvo blagog zamućenja (nepotpuna hemoliza) u 5. epruveti - sadrži samo polovinu radne doze komplementa i potpunu hemolizu uz pravilno podešavanje eksperiment ne može biti.

Hemoliza u serumu i kontrolama antigena (epruvete 2 i 3) ukazuje da su njihove doze pravilno odabrane i da se ni serum ni komplementarni antigen ne vezuju sami.

U kontroli hemolitičkog sistema (epruveta 4), ako radi kako treba, ne bi trebalo da bude ni tragova hemolize – nedostaje mu komplementa.

Nakon što se uvjerimo da su kontrole ispravno položene, iskustvo se može uzeti u obzir. Odsustvo hemolize u epruvetama iskustva se smatra pozitivnim rezultatom reakcije. To ukazuje da u serumu postoje antitijela koja su specifična za uzeti antigen. Kompleks koji su oni formirali vezivao je komplement i sprečavao njegovo učešće u reakciji hemolize. Ako dođe do hemolize u epruvetama, rezultat reakcije se ocjenjuje kao negativan. U ovom slučaju ne postoji korespondencija između antigena i antitijela, komplement nije vezan i učestvuje u reakciji hemolize.

Paralelno sa pacijentovim serumom radi se isti eksperiment sa poznatim pozitivnim serumom (odnosno sa serumom u kojem postoje antitijela na dati antigen) i poznatim negativnim, u kojem nema specifičnih antitijela. Uz ispravnu postavku eksperimenta, u prvom slučaju bi trebalo da dođe do kašnjenja hemolize, au drugom slučaju do hemolize.

Intenzitet reakcije se izražava na sljedeći način:

Potpuna odgoda hemolize. Eritrociti formiraju jednoliku zamućenost ili se talože na dno. U tom slučaju tečnost u epruveti postaje bezbojna;

Lizira oko 25% eritrocita. Talog je manji, tečnost iznad njega je blago ružičasta. Rezultat RSC-a je također ocijenjen kao oštro pozitivan;

Lizira oko 50% eritrocita. Talog je mali, tečnost je ružičasta. Pozitivan RSK rezultat;

Lizira oko 75% eritrocita. Beznačajan sediment, tečnost intenzivno obojene iznad njega. Sumnjiv rezultat RSK;

Svi eritrociti su lizirani. Tečnost je intenzivne boje i potpuno prozirna. Negativan RSK rezultat.

Laboratorijska dijagnostika gotovo svih infektivnih bolesti temelji se na otkrivanju antitijela u krvi pacijenta, koja se stvaraju protiv antigena uzročnika, metodama seroloških reakcija. U medicinsku praksu ušli su od kraja devetnaestog do početka dvadesetog vijeka.

Razvoj nauke pomogao je da se utvrdi antigena struktura mikroba i hemijske formule njihovih toksina. To je omogućilo stvaranje ne samo terapijskih, već i dijagnostičkih seruma. Dobivaju se primjenom atenuiranih patogena laboratorijskim životinjama. Nakon nekoliko dana izlaganja, od krvi zečeva ili miševa pripremaju se preparati koji serološkim testovima koriste za identifikaciju mikroba ili njihovih toksina.

Vanjska manifestacija takve reakcije ovisi o uvjetima njenog nastanka i o stanju antigena u krvi pacijenta. Ako su mikrobne čestice netopive, one se talože, liziraju, vežu ili imobiliziraju u serumu. Ako su antigeni topljivi, javlja se fenomen neutralizacije ili precipitacije.

Reakcija aglutinacije (RA)

Serološka reakcija aglutinacije je vrlo specifična. Jednostavan je za izvođenje i dovoljno vizualan da se brzo utvrdi prisustvo antigena u krvnom serumu pacijenta. Koristi se za stadijum Vidalove reakcije (dijagnoza trbušnog tifusa i paratifusa) i Weiglove (tifusne groznice).

Zasniva se na specifičnoj interakciji između ljudskih antitijela (ili aglutinina) i mikrobnih ćelija (aglutenogena). Nakon njihove interakcije nastaju čestice koje se talože. Ovo je pozitivan znak. Živi ili ubijeni mikrobni agensi, gljive, protozoe i somatske ćelije mogu se koristiti za uspostavljanje reakcije.

Hemijski, reakcija je podijeljena u dvije faze:

Specifična veza antitela (AT) sa antigenima (AG).
Nespecifično - precipitacija AG-AT konglomerata, odnosno stvaranje aglutinata.

Indirektna reakcija aglutinacije (IPHA)

Za njegovo postavljanje koriste se pročišćeni ovčiji eritrociti i ljudska crvena krvna zrnca, prethodno tretirana antitijelima ili antigenima (ovisi šta tačno laboratorijski asistent želi pronaći). U nekim slučajevima, ljudska crvena krvna zrnca se liječe imunoglobulinima. Smatra se da je došlo do seroloških reakcija eritrocita ako su se taložili na dnu epruvete. O pozitivnoj reakciji možemo govoriti kada su ćelije raspoređene u obliku obrnutog kišobrana, koji zauzima cijelo dno. Negativna reakcija se računa ako su se eritrociti smjestili u stupac ili u obliku dugmeta u sredini dna.

Reakcija precipitacije (RP)

Serološki testovi ovog tipa koriste se za otkrivanje ekstremno malih čestica antigena. To mogu biti, na primjer, proteini (ili njihovi dijelovi), spojevi proteina s lipidima ili ugljikohidratima, dijelovi bakterija, njihovi toksini.

Serumi za reakciju se dobivaju umjetnom infekcijom životinja, obično zečeva. Ovom metodom možete dobiti apsolutno bilo koji precipitirajući serum. Postavka seroloških reakcija precipitacije je po mehanizmu djelovanja slična reakcijama aglutinacije. Antitela sadržana u serumu kombinuju se sa antigenima i formiraju velike proteinske molekule koje se talože na dnu epruvete ili na supstratu (gelu). Ova metoda se smatra vrlo specifičnom i može otkriti čak i zanemarljive količine tvari.

Koristi se za dijagnostiku kuge, tularemije, antraksa, meningitisa i drugih bolesti. Osim toga, on je uključen u sudsko-medicinski pregled.

u gelu

Serološke reakcije se mogu izvesti ne samo u tečnom mediju, već iu agar gelu. Ovo se zove metoda difuzne precipitacije. Uz njegovu pomoć proučava se sastav složenih antigenskih mješavina. Ova metoda se zasniva na hemotaksiji antigena na antitijela i obrnuto. U gelu se kreću jedni prema drugima različitim brzinama i, susreću se, formiraju linije padavina. Svaka linija je jedan set AG-AT.

Reakcija neutralizacije egzotoksina sa antitoksinom (RN)

Antitoksični serumi su u stanju da neutraliziraju djelovanje egzotoksina koji proizvode mikroorganizmi. Ove serološke reakcije se temelje na tome. Mikrobiologija koristi ovu metodu za titriranje seruma, toksina i toksoida i određivanje njihove terapeutske aktivnosti. Snaga neutralizacije toksina određena je konvencionalnim jedinicama - AE.

Osim toga, zahvaljujući ovoj reakciji, moguće je odrediti vrstu ili vrstu egzotoksina. Koristi se za difteriju, botulizam. Studija se može izvesti i "na staklu" i u gelu.

Reakcija lize (RL)

Imuni serum koji ulazi u organizam pacijenta ima, pored svoje glavne funkcije pasivnog imuniteta, i svojstva lizanja. U stanju je da otopi mikrobne agense, ćelijske strane elemente i viruse koji ulaze u tijelo pacijenta. Ovisno o specifičnosti antitijela uključenih u serum, izdvajaju se bakteriolizini, citolizini, spirohetolizini, hemolizini i drugi.

Ova specifična antitijela se nazivaju "komplement". Nalazi se u gotovo svim ljudskim tjelesnim tekućinama, ima složenu proteinsku strukturu i izuzetno je osjetljiv na porast temperature, tresenje, djelovanje kiselina i direktnu sunčevu svjetlost. Ali u osušenom stanju, može zadržati svoja svojstva lizanja do šest mjeseci.

Postoje takve vrste seroloških reakcija ove vrste:

Bakterioliza;

Hemoliza.

Bakterioliza se provodi korištenjem krvnog seruma pacijenta i specifičnog imunološkog seruma sa živim mikrobima. Ako je u krvi prisutno dovoljno komplementa, tada će istraživač vidjeti kako se bakterija lizira, a reakcija će se smatrati pozitivnom.

Druga serološka reakcija krvi je da se suspenzija eritrocita pacijenta tretira serumom koji sadrži hemolizine, koji se aktiviraju samo u prisustvu određenog komplimenta. Ako postoji, tada laboratorijski asistent promatra otapanje crvenih krvnih stanica. Ova reakcija se široko koristi u modernoj medicini za određivanje titra komplementa (odnosno njegove najmanje količine koja izaziva lizu eritrocita) u krvnom serumu i za analizu za fiksaciju komplementa. Na taj način se provodi serološka reakcija na sifilis -

Reakcija fiksacije komplementa (CFR)

Ova reakcija se koristi za otkrivanje antitijela na infektivni agens u krvnom serumu pacijenta, kao i za identifikaciju patogena po njegovoj antigenskoj strukturi.

Do sada smo opisali jednostavne serološke reakcije. RSK se smatra složenom reakcijom, jer u njoj ne djeluju dva, već tri elementa: antitijelo, antigen i komplement. Njegova suština leži u činjenici da se interakcija između antitijela i antigena događa samo u prisustvu proteina komplementa, koji se adsorbiraju na površini formiranog AG-AT kompleksa.

Sami antigeni, nakon dodavanja komplementa, prolaze kroz značajne promjene, što pokazuje kvalitet reakcije. To može biti liza, hemoliza, imobilizacija, baktericidno ili bakteriostatsko djelovanje.

Sama reakcija se odvija u dvije faze:

Formiranje kompleksa antigen-antitijelo koje nije vizualno vidljivo ispitivaču.
Promjena antigena djelovanjem komplementa. Ova faza se najčešće može pratiti golim okom. Ako reakcija nije vizualno vidljiva, tada se koristi dodatni sistem indikatora za identifikaciju promjena.

sistem indikatora

Ova reakcija se zasniva na fiksaciji komplementa. Pročišćeni ovnski eritrociti i hemolitički serum bez komplementa dodaju se u epruvetu sat vremena nakon postavljanja RSC. Ako nevezani komplement ostane u epruveti, tada će se spojiti s AG-AT kompleksom formiranim između ovčijih krvnih stanica i hemolizina i uzrokovati njihovo rastvaranje. To će značiti da je RSK negativan. Ako su eritrociti ostali netaknuti, onda je, shodno tome, reakcija pozitivna.

Reakcija hemaglutinacije (RHA)

Postoje dvije fundamentalno različite reakcije hemaglutinacije. Jedan od njih je serološki, koristi se za određivanje krvnih grupa. U ovom slučaju, eritrociti stupaju u interakciju s antitijelima.

A druga reakcija se ne odnosi na serološke, jer crvena krvna zrnca reagiraju s hemaglutininima koje proizvode virusi. Budući da svaki patogen djeluje samo na specifične eritrocite (piletina, ovca, majmun), ova reakcija se može smatrati visoko specifičnom.

Možete reći da li je reakcija pozitivna ili negativna prema lokaciji krvnih stanica na dnu epruvete. Ako njihov uzorak podsjeća na obrnuti kišobran, tada je željeni virus prisutan u krvi pacijenta. A ako su se svi eritrociti formirali kao novčić, onda nema željenih patogena.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HITA)

Ovo je vrlo specifična reakcija koja vam omogućava da utvrdite vrstu, vrstu virusa ili prisutnost specifičnih antitijela u krvnom serumu pacijenta.

Njegova suština leži u činjenici da antitijela koja se dodaju u epruvetu sa materijalom za ispitivanje sprječavaju taloženje antigena na eritrocitima, čime se zaustavlja hemaglutinacija. Ovo je kvalitativni znak prisutnosti u krvi specifičnih antigena za specifični virus od interesa.

Imunofluorescentna reakcija (RIF)

Reakcija se zasniva na sposobnosti detekcije AG-AT kompleksa nakon njihovog tretmana fluorohromnim bojama. Ova metoda je laka za rukovanje, ne zahtijeva izolaciju čiste kulture i oduzima malo vremena. Neophodan je za brzu dijagnostiku zaraznih bolesti.

U praksi se ove serološke reakcije dijele na dvije vrste: direktne i indirektne.

Direktni RIF se pravi sa antigenom koji je prethodno tretiran fluorescentnim serumom. I indirektno, lijek se prvo tretira konvencionalnim dijagnostikumom koji sadrži antigene za antitijela od interesa, a zatim se ponovo primjenjuje luminiscentni serum, koji je specifičan za proteine AG-AT kompleksa, i mikrobne stanice postaju vidljive pod mikroskopom.

Reakcija fiksacije komplementa(RSK) je složena dvostepena serološka reakcija. Koristi pet sastojaka koji čine dva sistema: antigen, antitelo, komplement (prvi sistem); ovčji eritrociti senzibilizirani (tretirani) hemolitičkim serumom koji sadrži za njih specifična antitijela (drugi, ili indikatorski, hem sistem). U ovom slučaju, interakcija antitijela s antigenom u prvoj fazi reakcije dovodi do stvaranja imunog kompleksa koji adsorbira komplement, ali to se ne može vizualno otkriti. Kao indikator vezivanja komplementa na kompleks antigen-antitelo u drugoj fazi koristi se hem sistem, koji je, kao imuni kompleks, sposoban i da ga adsorbuje. Na kraju krajeva, postoje dva moguća ishoda reakcije. Ako antitelo i antigen odgovaraju jedno drugom i komplement se adsorbuje formiranim kompleksom, neće doći do lize eritrocita hem sistema. Ako se antitijelo ne poklapa s antigenom, i obrnuto, komplement će se, ostajući slobodan, pridružiti sistemu hema i uzrokovati hemolizu.

Kao i drugi serološki testovi, RSK se može koristiti za otkrivanje specifičnih antitela protiv poznatog antigena ili za detekciju antigena protiv poznatih antitela.

Opće karakteristike sastojaka RSC.

1. STUDIJA SERUM prije postavljanja se zagrijava u vodenom kupatilu 30 minuta da inaktivira vlastiti komplement i razrjeđuje se počevši od 1:5.

2. ANTIGENI mogu biti kulture bakterija, njihovi lizati, virusi i materijali koji sadrže viruse, ekstrakti patološki izmijenjenih organa i tkivni lipidi.

3. KOMPLEMENT - serum zamorca dobijen na dan eksperimenta. Trenutno se koristi industrijski suhi komplement.

4. HEMOLITIČKI SISTEM se sastoji od hemolitičkog seruma pomešanog u jednakim količinama i 3% suspenzije eritrocita ovaca u sedimentu. Za senzibilizaciju eritrocita hemolizinima, smjesa se drži u termostatu na temperaturi od 37°C 30 minuta.

Izjava glavnog eksperimenta RSC. U 1 epruvetu se dodaju SERUM, ANTIGEN I KOMPLEMENT, u treću epruvetu dodaju se serum, komplement i izotonični rastvor natrijum hlorida (KONTROLA SERUMA), antigen, komplement i isti rastvor natrijum hlorida (ANTIGEN CONTROL). Epruvete se stavljaju u termostat na temperaturu od 37°C na 1 sat. Istovremeno se priprema hemolitički sistem, koji se zatim dodaje u sve tri epruvete nakon uklanjanja stalka sa termostata. Nakon miješanja hem sistema sa sastojcima tri epruvete, ove se ponovo stavljaju u termostat na 1 sat, a nakon tog vremena se uzimaju u obzir rezultati RSC.

Kada se uzme u obzir RSC, intenzitet reakcije je označen plusovima: "++++" - oštro pozitivna reakcija s potpunim kašnjenjem hemolize, tekućina u epruveti je bezbojna, svi eritrociti su se složili na dno; "+++", "++" - pozitivna reakcija, koju karakterizira povećanje boje tekućine zbog hemolize i smanjenje broja eritrocita u sedimentu; "+" - slabo pozitivna reakcija, tečnost je intenzivno obojene, na dnu epruvete je mala količina crvenih krvnih zrnaca. Negativna reakcija je označena znakom "-", dok se uočava potpuna hemoliza, tečnost u epruveti ima intenzivnu ružičastu boju ("lak krv").

RSK je vrlo složena, ali vrlo osjetljiva specifična reakcija. Široko se koristi u dijagnostici sifilisa, kronične gonoreje, velikog kašlja, aktinomikoze, svih rikecioza i virusnih infekcija.

Vezani imunosorbentni test.

Metodu su ranih 70-ih nezavisno razvile tri grupe naučnika. Metoda liči na RIA, ali se zasniva na označavanju Ag ili Ab koji ulazi u reakciju sa enzimom. Vzd tragovi sa podlogom obično su praćeni promjenom boje podloge. Trenutno su stvorene brojne modifikacije ove metode, ali je najšire korištena heterogena ELISA na čvrstoj fazi (solid-phase). razlikovati:

1) DIREKTNA ELIZA NA ČVRSTE FAZE. U ovom slučaju:

1. Serum sa Ab se inkubira sa Ag fiksiranim na čvrstu podlogu (najčešće je to plastična mikroploča).

2. Ab koji nije vezan za Ag uklanja se ponovnim pranjem.

3. Serum označen enzimom se dodaje u Ab vezanu Ag.

4. Odredite broj enzima markera vezanih za At.

2) KONKURENCIJSKA ELIZA NA ČVRSTE FAZE.

1. Serum je dodan. Ako sadrži specifične Abs, onda se vežu za Ag fiksiran na čvrstoj podlozi. Ako ne postoje specifični Abs, onda Ag nije vezan.

2. Ako se dodaju antitijela specifična za fiksni Ag, u prvom slučaju neće imati s čim stupiti u interakciju (većina Ag-a je već vezana) Þ sadržaj markera je nizak. U drugom slučaju, specifični Abs će se vezati za Ag i neće se isprati tokom pranja Þ visok sadržaj markera.

Slično, možda. ANTITELA su fiksna, a razne kompanije proizvode upravo tablete sa već fiksiranim At.

U usporedbi s klasičnim metodama za otkrivanje antigena, ova metoda vam omogućava da direktno registrirate njihovu interakciju s antitijelima, a ne sekundarne manifestacije (aglutinacija, precipitacija ili hemoliza). Metoda je vrlo OSJETLJIVA (dovoljna je koncentracija od 1ng/ml).

Odredite: klamidija, klostridija, HIV, itd.

8. Fagocitozna reakcija.

Fagocitozu provode mikrofagi i makrofagi. Faze fagocitoze: približavanje, lijepljenje, uranjanje, probava.

Procjena funkcionalne aktivnosti fagocitnih stanica.

Količina fagocitna aktivnost granulocita i monocita se procjenjuje u punoj krvi, u suspenziji leukocita ili u obogaćenim frakcijama fagocitnih stanica. Kao standardni objekti fagocitoze koriste se monodisperzne čestice lateksa promjera 1,0-2,0 μm, suspenzija bakterija ubijenih toplinom ili gljivica sličnih kvascu.

Fagociti se miješaju sa fagocitiranim materijalom u omjeru 1:10 ili 1:100 i inkubiraju na 37°C 30 minuta uz stalno miješanje. Epruvete se zatim centrifugiraju i talog se resuspendira u kapi krvnog seruma kako bi se pripremio razmaz. U brisevima fiksiranim May-Chryunwald bojom i obojenim prema Romanovsky-Giemsa, izračunava se postotak fagocitnih ćelija (FP - fagocitni indeks) i broj apsorbovanih čestica po 1 ćeliji (PF - fagocitni broj).

Kod zdrave osobe FP=40-80%, FC=1-5.

9. Diagnosticums.

Dijagnostikumi su suspenzija određenih mikrobnih ćelija ubijenih zagrijavanjem ili formalinom s poznatim sadržajem stanica po jedinici volumena. Kao antigen se mogu koristiti i suspenzije živih bakterija. Fenomen reakcije se javlja preliminarno nakon dva sata (na 37 0 C), konačni rezultat se uzima u obzir na sobnoj temperaturi nakon 18-20 sati. Za dijagnostiku pozitivnu reakciju zanima samo određeni titar seruma, koji služi kao dijagnostika. Dakle, kod bruceloze je dijagnostički titar 1:200, a kod tularemije -1:100. Za otkrivanje antitijela mogu se provesti reakcije ekspresne aglutinacije (obračunsko vrijeme je nekoliko minuta). Na primjer: 1. Reakcija kapi krvi kod tularemije. Kap destilovane vode (za hemolizu) i kap tularemia diagnosticum stavljaju se na kap pune krvi pacijenta na posebnom staklu. Reakcija se javlja u roku od 1-2 minute, aglutinati su jasno vidljivi u obliku bjelkastih grudica. 2. Ekspresna reakcija aglutinacije prema Heddelsonu se provodi na staklu za brucelozu.

Ove reakcije ne dozvoljavaju da se odredi količina antitijela u serumu b) da se identifikuje čista kultura patogena zaraznih bolesti. U tu svrhu, imunodijagnostika

aglutinirajući serumi proizvedeni u institutima za vakcinu i serume imunizacijom životinja cijelim mikrobnim stanicama. Radi pouzdanosti, bolje je koristiti adsorbirane serume, tako da sadrže samo antitijela koja odgovaraju određenoj vrsti ili vrsti mikroorganizma.

Principi dobijanja imunoloških seruma.

Imuni serum (antiserum) je krvni serum koji sadrži antitijela na dati antigen. U većini slučajeva imuni (dijagnostički) serumi na mikrobne, tkivne i druge antigene dobijaju se eksperimentalno imunizacijom životinja odgovarajućim antigenima.

Među glavnim zahtjevima za antiserume su njihova visoka specifičnost i dovoljan sadržaj antitijela. Po specifičnosti razlikuju se polivalentni (polispecifični) i monovalentni (monospecifični) antiserumi. Polivalentni serumi sadrže antitela na mnoge antigene, monospecifična - na jedan određeni antigen. Monospecifične serume možete dobiti:

1) korištenje visoko pročišćenih antigena za imunizaciju životinja,

2) čišćenje nativnih seruma od antitela nepoželjne specifičnosti.

Za ovu upotrebu:

1) imunoafinitetna metoda, koja se zasniva na vezivanju antitela određene specifičnosti za odgovarajuće antigene imobilisane na nosaču čvrste faze, nakon čega sledi odvajanje nastalih AG-AT kompleksa i izolovanje antitela;

2) metoda adsorpcije po Castellaniju. U tu svrhu, mikroorganizmi koji sadrže sve grupne antigene se sekvencijalno dodaju u nativni imunološki serum koji sadrži grupno-specifična unakrsnu reakciju antitela, čime se adsorbuju homologni anti-

tijelo. Takvi adsorbirani monospecifični antiserumi sadrže antitijela na različite determinante molekule antigena, koja su heterogena u klasi (podklasi)

Test fiksacije komplementa (CFR) i reakcija dugotrajne fiksacije komplementa (RDSC)

REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA (RSK) I DUGOROČNA REAKCIJA VEZE KOMPLEMENTA (RDSK)

REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA, RSK, Bordet-Jangu reakcija [u ime bakteriologa J. Bordet i O. Zhangu (O. Gengou), 1901], visoko specifična i vrlo osjetljiva serološka. reakcija zasnovana na svojstvu kompleksa antigen-antitijelo da fiksira slobodni komplement.

Komplement (sistem komplementa) (od lat.complementum - dodatak), grupa globularnih proteina u krvnom serumu životinja i ljudi, koji su dio imunološkog sistema organizma. Kada bakterije ili virusi koji ga inficiraju uđu u tijelo, neki toksini ili pojava vlastitih transformiranih stanica, komplement se aktivira, uslijed čega se ciljne stanice liziraju (uništavaju), a toksini i virusi neutraliziraju. Stoga se sistem komplementa, zajedno sa makrofagima, smatra granicom imunološke odbrane organizma.

Ova reakcija se široko koristi u identifikaciji antigena i u serodijagnostici infekcija, posebno bolesti uzrokovanih spirohetama (Wassermannova reakcija), rikecijama i virusima.

RSK je složena serološka reakcija. Uključuje komplement i dva sistema antigen-antitijelo. U suštini, to su dvije serološke reakcije.

Prvi sistem - glavni - sastoji se od antigena i antitela (jedan je poznat, drugi nije). Dodata mu je određena količina komplementa. Kada se antigen i antitijelo ovog sistema poklope, oni će se povezati i vezati komplement. Dobijeni kompleks je fino raspršen i nije vidljiv.

reakcija fiksacije komplementa serodijagnostika

Formiranje ovog kompleksa poznato je uz pomoć drugog hemolitičkog ili indikatorskog sistema. Uključuje ovčije eritrocite (antigen) i njihov odgovarajući hemolitički serum (antitijela), tj. gotov imuni kompleks. U ovom sistemu do lize eritrocita može doći samo u prisustvu komplementa. Ako je komplement vezan za prvi sistem (ako u njemu odgovaraju antigen i antitelo), onda neće biti hemolize u drugom sistemu - pošto nema slobodnog komplementa. Odsustvo hemolize (sadržaj epruvete je zamućen ili se na dnu nalazi sediment eritrocita) evidentira se kao pozitivan rezultat RSK.

Ako se u prvom sistemu antigen ne poklapa sa antitijelom, tada se imunološki kompleks ne formira i komplement ostaje slobodan. Ostajući slobodan, komplement učestvuje u drugom sistemu, izazivajući hemolizu - rezultat RSC je negativan (sadržaj epruveta je providan - "krv laka").

Komponente reakcije fiksacije komplementa:

1. Antigen - obično lizat, ekstrakt, hapten; rjeđe suspenzija mikroorganizama

2. Antitijelo - serum pacijenta

3. Komplement - serum zamorca

4. Antigen - ovčiji eritrociti Hemolitički sistem

5. Antitelo - hemolizin na eritrocite ovaca

6. Izotonični rastvor

Priprema sastojaka

1. Serum je razrijeđen 3 puta manje od njegovog titra. Pripremite ukupno razrjeđenje seruma za cijeli eksperiment, čija se zapremina određuje množenjem volumena seruma u jednoj epruveti (na primjer, 0,5 ml) s brojem epruveta nešto većim od broja njih u eksperimentu. Višak tečnosti je neophodan u pripremi svih komponenti reakcije: deo ostaje na zidovima epruveta, tikvica, pipeta. Zapremine razrijeđenog hemolizina i suspenzije eritrocita, dodavanjem seruma eritrocitima, dobro promiješati i inkubirati 30 min na 37°C (senzibilizirati).

2. Ovčiji eritrociti. Za ceo broj epruveta u eksperimentu priprema se 3% suspenzija ispranih ovčijih eritrocita. Za pripremu hemolitičkog sistema, 30 minuta prije uvođenja u eksperiment, pomiješaju se jednake količine ovnujskih eritrocita sa antitijelom na njih.

3. Komplement se obično razblaži 1:10. Mora se titrirati prije svakog eksperimenta. Titar komplementa je njegova najmanja količina, kada se doda u hemolitički sistem, potpuna hemoliza se javlja u roku od 1 sata na 37°C.

4. Antigen se obično prima gotov sa naznakom njegovog titra, tj. količina koju bi, nakon razblaženja antigena, trebalo da sadrži 1 ml. Na primjer, pri titru od 0,4, razrijeđen je u 0,96 ml izotonične otopine. U iskustvu uzmite količinu antigena, jednaku polovini titra (0,5 ml). Ovo je njegova radna doza. Pripremite ukupno razrjeđenje antigena za cijeli eksperiment množenjem 0,5 ml s brojem epruveta u eksperimentu.

Izjava o reakciji fiksacije komplementa (RSC).

Reakcija se stavlja u zapreminu od 1 cu. cm (0,2 kubna cm svake komponente).

Test serumi se ispituju u razblaženju 1:5 i 1:10 (doza seruma je 0,04 cc i 0,02 cc sa specifičnim antigenom, u razblaženju 1:5 sa kontrolnim antigenom (za specifičnost) i bez antigen (za antikomplementarnost). ).

Test i kontrolni serumi se inaktiviraju na dan reakcije u razrijeđenom obliku na 56-65°C (ovisno o vrsti životinje) u trajanju od 30 minuta. (takođe u RDSC).

Oba stupnja reakcije se izvode u vodenom kupatilu na 37-38°C, bakteriolitički sistem se drži 60 minuta, druga faza reakcije (sa hemolitičkim sistemom) je 20 minuta.

Kontrole glavnog iskustva RSK:

pozitivan serum razrijeđen 1:5 bez antigena i sa kontrolnim antigenom; u razrjeđenjima od 1:5 do njegovog titra sa specifičnim antigenom;

negativan serum u razrjeđenjima 1:5 i 1:10 sa specifičnim antigenom, u razrjeđenju 1:5 sa kontrolnim antigenom i bez antigena - specifični i kontrolni antigeni u dvostrukoj dozi - za antikomplementarnost (komplement +) i za hemotoksičnost (komplement );

hemolitički sistem za hemotoksičnost (komplement).

Obračun rezultata. U kontrolama ne bi trebalo biti ni tragova hemolize, jer jedna nema komplementa, dok druga ne sadrži hemolizin. Kontrole ukazuju na odsustvo reakcija hemotoksičnosti (sposobnost spontane lize eritrocita) u komponentama.

U eksperimentu se aktivnost komplementa može smanjiti zbog njegove nespecifične adsorpcije drugim komponentama reakcije, pa se za eksperiment povećava količina komplementa: uzima se doza koja slijedi nakon titra. Ovo je radna doza.

Postoje različite opcije za postavljanje RSC-a: klasična. metoda postavljanja u obliku makro- i mikrovarijanti, reakcija dugotrajne fiksacije komplementa (RDSC) na hladnoći, metoda količina. RSC 50% hemolizom senzibiliziranih eritrocita itd. Za dijagnostiku niza bolesti koristi se osjetljivija metoda - RDSC.

Izjava o reakciji dugotrajne fiksacije komplementa (RDSC).

Prva faza reakcije se izvodi u frižideru na 2-6°C 16-18 sati, druga faza u vodenom kupatilu 20 minuta na 37-38°C.

Komplement se koristi u radnom razblaženju 1:25 ili 1:30 (prilikom određivanja njegovog radnog razblaženja).

Prvog dana serumi i antigen se flaširaju za glavni eksperiment. Reakcija se stavlja u zapreminu od 1 cu. cm (0,2 kubna cm svake komponente). Kontrole RDSC-a su iste kao i kod podešavanja RSC-a.

Zatim, komplement od 0,2 cu. cm, u zavisnosti od njegovog radnog razblaženja, epruvete se promućkaju i stavljaju u frižider na 16-18 sati. na 2-6°C.

Sledećeg dana, rešetke sa prvom fazom se vade iz frižidera i nakon držanja 20-30 minuta. na sobnoj temperaturi, hemolitički sistem se sipa u sve epruvete u dozi (u datom primeru 0,6 kubnih cm). Police se protresu i stave u vodeno kupatilo 20 min. na 37-38°C.

Šema glavnog eksperimenta RDSC prikazana je u tabeli 3.

Računajući rezultate RSC, RDSC se provodi dva puta: prvi put - odmah nakon vodenog kupatila, drugi put - nakon što se eritrociti slegnu na dno epruvete (3-4 sata nakon vodenog kupatila) ili sljedeći dan kada se čuva u frižideru od 2° do 6°C.

Da bi se objektivno odredili rezultati reakcije, preporučuje se procijeniti postotak hemolize. Da bi se to postiglo, 5 epruveta sa potpunom (100%) hemolizom se odabire iz reakcije i tečnost iz njih se sipa u jednu epruvetu. Od njega se pripremaju razblaženja sa nižim procentom hemolize, takozvana "Standard" skala.

Stepen hemolize u epruvetama sa test serumima određuje se poređenjem sa stepenom hemolize u "standardnim" epruvetama, a procenat hemolize se izražava ukrštanjem.

Stepen kašnjenja je obrnuto proporcionalan procentu hemolize eritrocita:

++++ (4 krsta) - nema hemolize, supernatantna tečnost prozirna, bezbojna;

+++ (3 ukrštanja) - hemoliza 25% eritrocita;

++ (2 ukrštanja) - hemoliza 50% eritrocita;

+ (1 križ) - hemoliza 75% eritrocita;

(minus) - potpuna hemoliza eritrocita, nema sedimenta, tečnost je intenzivno obojena hemoglobinom.

Evaluacija rezultata RSK, RDSK.

Procijenite test serume u razrjeđenjima 1:5 i 1:10 (0,04 cc, 0,02 cc) sa potpunom hemolizom eritrocita u kontrolnom serumu bez antigena i sa kontrolnim antigenom.

Pozitivna reakcija se procjenjuje kada se hemoliza eritrocita odgodi za 3-4 križanja u razrjeđenju 1:10.

Sumnjivo - s kašnjenjem hemolize eritrocita za 1 križanje u razrjeđenju seruma 1: 10 i od 2 do 4 križanja u razrjeđenju 1: 5.

Negativno - s potpunom hemolizom eritrocita u razrjeđenjima seruma 1: 5 i 1: 10.

Posebna prednost CSC-a je u tome što priroda antigena uključenog u njega (korpuskularnog ili rastvorljivog) nije bitna, budući da se komplement vezuje za Fc fragment bilo kojeg antitela povezanog sa IgG i IgM, bez obzira na njegovu specifičnost antitela. Osim toga, CSC je vrlo osjetljiv: omogućava otkrivanje količine antitijela 10 puta manju nego, na primjer, u reakciji precipitacije. RSC su 1901. predložili J. Bordet i O. Zhang. Zasnovan je na dva svojstva komplementa:

1) sposobnost vezivanja za kompleks "antigen + antitelo";

2) liza eritrocita koji se koriste za dobijanje hemolitičkog seruma.

RSK se postavlja u dvije faze, a u njemu učestvuju dva sistema - eksperimentalni, odnosno dijagnostički i indikatorski. Dijagnostički sistem se sastoji od testnog (ili dijagnostičkog) seruma koji se zagrijava na 56°C 30 minuta prije nego što se reakcija podesi da inaktivira komplement koji je prisutan u njemu i antigen.

Ovom sistemu je dodan standardni dodatak. Njegov izvor je svježa ili sušena surutka zamorca. Smjesa je inkubirana na 37°C jedan sat. Ako su antitijela prisutna u test serumu, ona će stupiti u interakciju s dodanim antigenom, a rezultirajući kompleksi antigen + antitijelo će vezati dodani komplement. Ako u serumu nema antitijela, neće doći do stvaranja kompleksa antigen + antitijelo, a komplement će ostati slobodan.

U ovoj fazi reakcije obično nema vidljivih manifestacija fiksacije komplementa. Stoga, da bi se razjasnilo pitanje da li je došlo do fiksacije komplementa ili ne, dodaje se drugi indikatorski sistem (inaktivirani hemolitički serum + eritrociti ovna) i mješavina svih CSC komponenti se ponovo inkubira na 37°C 30-60 minuta. , nakon čega se evaluiraju rezultati reakcije. Pomoću pametnog telefona (na primjer, takvog) možete izračunati tačno vrijeme reakcije. Ako je komplement vezan u prvoj fazi, u dijagnostičkom sistemu, odnosno postoje antitela u serumu pacijenta, a komplement je vezan kompleksom „antitelo + antigen“, neće doći do lize eritrocita - RSC je pozitivan: tečnost je bezbojna, sediment je na dnu epruvete eritrocita.

Ako u serumu nema specifičnih antitela i ne dođe do vezivanja komplementa u dijagnostičkom sistemu, tj. RSK je negativan, onda se komplement koji nije utrošen u dijagnostičkom sistemu vezuje za kompleks „eritrociti + antitela“ indikatorskog sistema i dolazi do hemolize. : u epruveti “lakirana krv”, nema sedimenta eritrocita. Intenzitet CSC se procjenjuje po sistemu četiri križa, u zavisnosti od stepena kašnjenja hemolize i prisustva sedimenta eritrocita. Reakcija je praćena odgovarajućim kontrolama: kontrola seruma (bez antigena) i kontrola antigena (bez seruma), jer neki serumi i neki antigeni imaju antikomplementarno djelovanje. Prije postavljanja RSK-a, sve komponente koje su uključene u njega, s izuzetkom seruma ili antigena koji se proučava, pažljivo se titriraju.

Posebno je važno u reakciju uvesti tačnu dozu komplementa, jer njegov nedostatak ili višak može dovesti do lažnih rezultata. Titar komplementa je minimalna količina koja, u prisustvu radne doze hemolitičkog seruma, osigurava potpuno otapanje eritrocita. Za postavljanje glavnog eksperimenta uzima se doza komplementa, povećana za 20-25% u odnosu na utvrđeni titar. Titar hemolitičkog seruma je njegovo maksimalno razrjeđenje, koje, kada se pomiješa s jednakom zapreminom 10% otopine komplementa, potpuno hemolizira odgovarajuću dozu eritrocita u roku od 1 sata na temperaturi od 37 °C.

Reakcija indirektne hemolize koristi se kao ubrzana metoda za detekciju specifičnih antitijela. Eritrociti se koriste kao nosioci antigena. U prisustvu specifičnih antitijela u serumu pacijenta, senzibilizirani eritrociti se liziraju u prisustvu komplementa.

Niste pronašli prave informacije? Nema problema! Koristite pretragu sajta u gornjem desnom uglu.