Rekombinantni tkivni aktivator plazminogena. Aktivatori plazminogena izolovani iz tkiva i bioloških tečnosti

Aktivatori plazminogena (AP) su visoko specifične serinske proteaze regulatornog tipa. Postoji mnogo poznatih AP izoliranih iz krvi i drugih bioloških tekućina i ljudskih tkiva. Dijele se na fiziološke aktivatore, koji, ovisno o izvoru proizvodnje, mogu biti tkivni (organski), vaskularni (tkivni aktivator plazminogena), plazma, krv, urinarni (urokinaza) itd. i izolovani iz mikroorganizama (streptokinaza). Gotovo svi AP se formiraju u obliku proenzima (proaktivatora plazminogena).

Aktivacija plazminogena može biti:

vanjski - pod djelovanjem aktivatora tkiva, krvi, vaskularnog zida, koji se oslobađaju u krv pod utjecajem različitih faktora;

interni - uz sudjelovanje proteina plazme - faktor Hageman, prekalikrein, kininogen visoke molekularne težine;

egzogeni - nakon unošenja u organizam aktivatora plazminogena (streptokinaze i lijekova stvorenih na njegovoj osnovi, urokinaze, kompleksa streptokinaze-lys-plasminogena; aktivatora tkivnog plazminogena dobivenog genetskim inženjeringom i drugih lijekova) u terapijske svrhe.

Intrinzični aktivacijski put za fibrinolizu(Hagemanovu zavisnu fibrinolizu) pokreće Hageman faktor (XP faktor) krvne plazme. Nakon fiksacije faktora XII i kompleksa kininogen-prekalikrein visoke molekulske težine na stranoj ili izmijenjenoj površini (kolagen ili drugi), aktivni kalikrein nastaje ograničenom proteolizom, koja katalizira konverziju faktora XII u njegov aktivni oblik, faktor XIIa. . Potonji potiče pretvaranje plazminogena u plazmin. Slobodni kalikrein je također direktni aktivator plazminogena.

Fibrinoliza ovisna o Hagemanu aktivira se istovremeno s uključivanjem kaskade reakcija za stvaranje protrombinaze unutarnjim mehanizmom i njena glavna svrha je čišćenje vaskularnog korita od fibrinskih ugrušaka koji nastaju tijekom intravaskularne koagulacije krvi. U aktivaciji Hageman-ovisne fibrinolize može učestvovati APH sadržan u krvnim stanicama.

Eksterni put aktivacije plazminogena- vodeći put u oštećenju tkiva, stimulisan različitim aktivatorima tkivnog plazminogena. Najvažniji od njih je tkivni aktivator plazminogena (tPA) , koju sintetišu endotelne ćelije krvnih sudova i po potrebi se troši na aktivaciju fibrinolize (slika 13.15).

13.15 Šema strukture slavine

Njegova molitva. mase 70 kDa, ima jedan domen, strukturno sličan EGF-u, 2 kringla i domen u obliku prsta, koji podsjeća na strukturu plazmina. Izlučivanje tPA od strane endoteliocita nastaje ne samo tokom vaskularne tromboze, već i pri kompresiji manžetne, pri fizičkom naporu, pod uticajem vazoaktivnih supstanci (adrenalina, norepinefrina) i određenih lekova. Ovaj aktivator i njegovi inhibitori obezbeđuju kontinuiranu regulaciju fibrinolitičke aktivnosti. tPA čini 85% vanjske fibrinolitičke aktivnosti krvi.

U pogledu strukture i mehanizma djelovanja, tPA je sličan drugim aktivatorima fibrinolize sadržanim u različitim tkivima, koji ulaze u krv kada su tkiva oštećena (trauma, destrukcija tkiva, opstetrička patologija itd.). Posebno mjesto među tkivnim (organskim) faktorima fibrinolize zauzima fibrinoliza koju proizvodi bubrežno tkivo i epitel urinarnog trakta. urokinaza, od kojih se većina izlučuje urinom. Urokinaza osigurava oko 10-15% vanjske fibrinolitičke aktivnosti krvi. U stanju je da prodre u tromb i tamo katalizuje pretvaranje plazminogena u plazmin, uništavajući tako tromb ne samo izvana, već i iznutra.

Aktivatori krvnog plazminogena sadržane u krvnim ćelijama (eritrociti, trombociti i leukociti) i oslobađaju se kada su aktivirane i uništene, kao i tokom tromboze, posebno izazvane endotoksinom.

Od egzogenih aktivatora, najviše proučavan streptokinaza - neenzimski protein (mol. masa 47 kDa), proizveden od β-hemolitičkog streptokoka i odsutan u krvi u normalnim uslovima. Streptokinaza, poput dekaze, celiaze, avelizina i drugih, nemaju nezavisnu enzimsku aktivnost u odnosu na plazmin, ali u kombinaciji sa plazminogenom formiraju kompleks koji inicira konverziju plazminogena u plazmin. Dakle, streptokinaza aktivira plazminogen vezan za fibrinski ugrušak, kao i plazminogen u rastvorljivoj fazi, što je praćeno stvaranjem slobodnog plazmina. Kod streptokokne infekcije moguće je stvaranje streptokinaze u velikim količinama, što može dovesti do pojačane fibrinolize (fibrinogenolize) i razvoja hemoragijske dijateze. Na površini ovih ugrušaka dolazi do transformacije plazminogena u plazmin, kao i procesa lize fibrinskih ugrušaka. Ugrušci fibrina selektivno adsorbuju i zadržavaju plazminogen. Mjesta bogata lizinom (LN) koja se nalaze u središnjem dijelu molekule fibrin(ogen)a vezuju se za plazminogen kringle domene, pri čemu se jedan molekul plazminogena vezuje za nekoliko molekula fibrin(ogen)a, što omogućava molekuli plazmina da djeluje na nove netaknute molekuli fibrina, ostaju povezani sa supstratom i izbjegavaju prijelaz u otopinu i inaktivaciju pri kontaktu sa a2-antiplazminom. Zajedno s plazminogenom, fibrinski ugrušak specifično veže aktivatore plazminogena. Aktivatori tkivnog plazminogena imaju nisku katalitičku aktivnost u odsustvu fibrina i aktiviraju se nakon vezivanja za njega. Aktivatori tkivnog tipa, sa izuzetkom urokinaze, imaju veći afinitet za fibrin od fibrinogena, što objašnjava dominantnu fibrinolizu i, u vrlo niskom stepenu, fibrinogenolizu. Istovremeno prisustvo plazminogena i njegovih aktivatora na površini fibrina osigurava prirodno stvaranje plazmina, a fibrin se cijepa u topljive fragmente tzv. produkti razgradnje fibrina(PDF).

Različiti PDP-i pokazuju antikoagulantna, antipolimerizacija, antiagregacija i druga svojstva. Određivanje ranih i kasnih PDFs provodi se radi rane dijagnoze promjena fibrinolitičke aktivnosti, stadijuma DIC-a, diferencijacije primarne i sekundarne fibrinolize. Ni plazmin ni aktivator plazminogena se ne vezuju za PDP i, kako se ugrušak rastvara, ulaze u plazmu, gdje se inaktiviraju prirodnim inhibitorima.

Pronalazak se odnosi na novi poboljšani tkivno aktivni plazminogen (poboljšani TAP) koji ima produženo poluvrijeme u tijelu i povećanu stabilnost na toplinu i kiseline, koji se može koristiti za suzbijanje upale oko područja formiranja tromba. Pronalazak se takođe odnosi na metodu za proizvodnju navedenog tkivnog aktivatora plazminogena korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK i sredstva koja se koriste za njegovu implementaciju. Poznato je da aktivator plazminogena ljudskog tkiva (TPA) ima blagotvorno fibrinolitičko djelovanje i izuzetno je efikasan protiv plazminogena vezanog za fibrin, dok ne aktivira plazminogen u fazi slobodne cirkulacije u tijelu tako efikasno kao konvencionalni trombolitici, streptokinaza (SK) i urokinaza (UK). Poznate su aminokiselinske sekvence humanog TSA i nukleotidne sekvence cDNK koja kodira humani TSA (Pennica. D., et al., Nature, 301, 214-221, 1983). Također je poznato da ljudski TSA otapa venske i arterijske krvne ugruške. U velikim kliničkim ispitivanjima, intravenska zamka kod ljudi pokazala se efikasnom u reperfuziji okludirane koronarne arterije kod pacijenata sa akutnim infarktom miokarda. Međutim, nedostatak upotrebe ovog lijeka u liječenju bolesti povezanih s trombozom je izuzetno kratko poluvrijeme njegove enzimske aktivnosti u krvi (Rijken, D.C., et al., Thromb. Heamost. 54 (1), 61 , 1985, Hubert, E.F., et al., Blood, 65, 539, 1985). Kada se koristi za liječenje, ljudska zamka se mora primijeniti kao kontinuirana intravenska injekcija u visokoj dozi. Poznato je da prirodni ljudski t-PA ima strukturu domena, počevši od N-kraja molekule, nakon čega slijedi domena prsta, domena EGF (epidermalnog faktora rasta), dva kringle 1 i kringle 2 domena i serin protease domer. Rijken et al., primijetili su (Rijken D.C., et al., Thromb. Heamost., 54 (1), 61, 1985) da kratki biološki poluživot ljudskog TSA može biti povezan sa svim domenima humanog TSA, osim za serinski domen -proteaze. Zonneveld et al. (Zonneveld, A.J.V., et al, Proc. Natl. Acad. USA., 83, 4670, 1986) takođe je primećeno da domen prsta, domen EDF i domen kringle 2 mogu biti važni za aktivnost vezivanja fibrina prirodnog ljudskog t-PA, kao i za održavanje fibrin zavisne aktivacije APT. Međutim, još nisu razvijene posebne mjere za održavanje aktivnosti vezivanja fibrina koju ima prirodni ljudski t-PA i njegove aktivnosti zavisne od fibrina, kao i za produžavanje biološkog poluživota. Japanska objavljena otvorena patentna prijava br. 48378/1987 opisuje TPB dobijen brisanjem 87-175 aminokiselina prirodnog ljudskog TPB-a u kojem je "kringle 1" izbrisan. Ovu zamku odlikuje dodatna indukovana tačkasta mutacija u regiji epidermalnog faktora rasta. Japanska patentna prijava otkriva da modifikovani t-PA ima sposobnost da se veže za fibrin, ali je interakcija sa tkivnim inhibitorom aktivatora plazminogena slaba. Evropski patent br. 241208 opisuje TSA dobijen brisanjem 92-179 aminokiselina prirodnog ljudskog TSA koji takođe ima izbrisan "kringle 1". U ovom radu se spominje da ovaj t-PA ima fibrinolitičku aktivnost. Pored toga, evropski patent N 231624 otkriva modifikovani TAP sa produženim poluživotom. Modificiranoj zamci, koja ima sekvencu F-EGFK2-A, nedostaje domen kringle 1, međutim, nije prikazan specifičan put za njegovu pripremu. U svetlu gore navedenog, jasno je da se modifikovani TSA prema pronalasku mora razlikovati od prirodnog TSA po sekvenci aminokiselina u regionu unutrašnjih domena. Kao rezultat opsežnog istraživanja, podnosilac prijave je dobio poboljšani TSA koji sadrži domen prstiju, domen EDF, domen kringle 2 i domen serinske proteaze, ali je prva "kringle 1" domena izbrisana na određenom mjestu, i na mjestu vezanja domene "kringle 2" i serinska proteaza su mutirani što rezultira poboljšanim t-PA koji pokazuje odličnu otpornost na toplinu i kiseline, ima značajno produžen biološki poluživot i snažno protuupalno djelovanje, dok zadržava poželjna svojstva prirodnog ljudskog t-PA. Pronalazak se odnosi na poboljšani APT. TSA prema pronalasku značajno se razlikuje po svojoj hemijskoj strukturi od prirodnog ljudskog TSA i pokazuje bolja svojstva. Poboljšani TSA prema pronalasku je polipeptid koji ima sekvencu aminokiselina predstavljenu opštom formulom prikazanom na Sl. 28-29, gdje je R direktna veza, Y je A-Ile-B (A je Arg ili Glu i B je lys ili Ile), poželjno Glu-Jle-Lys. H 2 N je amino terminus, a -COOH je karboksi kraj). U pronalasku, izraz "poboljšani TSA" se koristi za označavanje analoga TSA gdje su A i B aminokiseline opisane u nastavku, redom:

Poboljšani APT (II): Arg, Lys;

Poboljšani APT (V): Arg, Ile;

Poboljšani APT (VI): Glu, Lys;

Poboljšani APT (VIII): Glu, Ile. Pronalazak je također usmjeren na ekspresiju predloženog analoga TSA primjenom tehnika rekombinantne DNK. S tim su povezani novi DNK koji kodira poboljšane tPA i rekombinantne ekspresijske vektore DNK. Slika 1, 2 prikazuje sekvencu od 16 oligodeoksinukleotida korištenih za konstruiranje sintetičkog genskog fragmenta koji kodira poboljšanu zamku (II); slika 3 - 4 - fragment sintetičkog gena za konstruisanje poboljšanog takta (II) pronalaska, koji sadrži krajeve restrikcijskih enzima Bge 11 i Eco R1, koji je konstruisan korišćenjem 16 oligodeoksinukleotida prikazanih na slikama 1 - 2; slika 5 - tehnika za konstruisanje poboljšane zamke (II) (na slici, crno područje, zasjenjeno područje i nepopunjeno područje označavaju regiju koja kodira zreli protein takta, regiju koja kodira propropeptid i neprevedenu regiju, respektivno; slika 6 - metoda za provjeru sintetičkog genskog fragmenta blok IV određivanjem bazne sekvence DNK dideoksi metodom i 7-DEAZA metodom; slika 7 prikazuje metodu za konstruisanje pVY1 ekspresijskog vektora u životinjskim ćelijama i integraciju poboljšane DNK zamke u pVY1; slika 8 - 13 DNK sekvence koje kodiraju poboljšani takt (II) i poboljšani TPA (V), slika 14 - 19 - sekvence aminokiselina izvedene iz DNK sekvenci koje kodiraju poboljšani APT (II) i poboljšani APT (V ), Slika 20 - restrikcijski enzimi i funkcionalna mapa plazmida pTPA 2 koji ima Eco R1-Xho fragment (oko 1000 parova baza) prirodnog APT gena integriranog u pBR322 vektor na mjestima cijepanja Eco R1 i Bam H1; slika 21 - mp9 (poboljšana zamka (II), koji ima fragment BgL11-Xho 11 (oko 1500 parova baza) gena, poboljšani takt (II) integriran u dvolančanu DNK M13 mp9 na mjestu cijepanja BamH1; slika 22 - zavisnost "doza-efekat" za aktivnost poboljšanog TSA (VI) i prirodnog TSA metodom S-2251 u prisustvu (+Fb) i odsustvu (-Fb) fibrinskog supstituenta; Slika 23 pokazuje promjenu u aktivnosti poboljšanog TSA (VI) i nativnog Slika 24 prikazuje promjenu rezidualne aktivnosti poboljšanog TSA (VI) nakon termičke obrade, Slika 25 prikazuje inhibiciju faktora aktiviranja limfocita (LAF) poboljšanim TSA (VI), slika 26 prikazuje aktivaciju upotrebom denaturiranog proteina, poboljšanog takta (VI), na sl. 27 - degradacija denaturisanog proteina pod dejstvom poboljšanog TSA (VI). Metoda za dobijanje rekombinantne DNK i transformisanih ćelija je detaljno opisana u nastavku. Metoda za dobijanje poboljšanog APT-a. Gen koji kodira prirodnu zamku, na osnovu koje se dobija takt ovog pronalaska, izolovan je iz cDNK banke napravljene od Bowesovih ćelija ljudskog melanoma. Poli A + RNK je izolovan iz ćelija Bowesovog humanog melanoma i frakcionisan centrifugiranjem sa gradijentom gustine saharoze. Zatim se uzima mala količina frakcionisanog poli(A) + RNK, a frakcija mRNA koja kodira TP gen se identifikuje hibridizacijom tačke pomoću oligonukleotidne sonde sposobne da prepozna specifičnu sekvencu TP mRNA. Koristeći ovu frakciju bogatu TP mRNA kao polazni materijal, pripremljena je cDNK banka i pregledana TP mRNA identifikacionom sondom opisanom gore. Pošto nije izolovan niti jedan klon koji ima kompletnu sekvencu APT gena, nedostajuća bazna sekvenca se sintetiše pomoću DNK sintetizatora kako bi se dobio željeni gen. Željeni gen se zatim konstruiše indukcijom mutacije specifične za lokaciju. Eco R1-Xho 11 fragment se prirodno javlja u AT genu (oko 1000 parova baza), čiji je dio obrisan na N = kraju, uveden je u pBR332 vektor na mjestima cijepanja Eco R1 i BamH1 i dobijen je pTPA2 . Soj (E. coli HB 101/pTPA2) dobijen transformacijom E. coli ovim plazmidom deponovan je kod Instituta za istraživanje fermentacije Japanske agencije za industrijsku nauku i tehnologiju pod pristupnim brojem P-9649 (FERM BP-2107). Restrikcija i funkcionalna mapa plazmida pTPA2 su prikazane na Sl.20. Poboljšani tPA gen je umetnut u pVY1 plazmid. Plazmid pVY1 je pripremljen ligiranjem BamH1-Kpn1 fragmenta (oko 2900 bp) plazmida pRSV10 (proizvođača Fine Chemical Pharmacy) sa fragmentom iz Eco R1 digestije plazmida pAdD26SV (A) N 3 (N) (dobijenog od Dr. Hiroshi Handa sa Univerziteta u Tokiju (nakon dobijanja na oba tupa kraja. Prema tome, ovaj vektor sadrži cDNK gena mišje dihidrofolat reduktaze pod kontrolom transkripcije glavnog adenovirusnog kasnog promotora (Ad2), SV 40 ranog promotora uzvodno od poboljšane zamke mesto insercije gena i intron, i sekvenca poliadenilacije nizvodno od gena ovog pronalaska mogu se ugraditi u druge pogodne ekspresione vektore. Ekspresijski vektor se dalje uvodi u odgovarajuću ćeliju domaćina da bi se dobili transformanti. Kao ćelije domaćini mogu se koristiti prokariotske ćelije kao što su E. coli, Bacillus subtilis, itd., eukariotski mikroorganizmi kao što su kvasac itd., kao i ćelije viših životinja. Kao predstavnik E. coli najčešće se koriste soj JM109, soj W3110, soj Q itd. koji pripada soju K12, a kao predstavnik Bacillus subtilis koriste se soj BD170, soj BR151 itd. Za kvasac se može koristiti soj RH218, soj SHY1 itd. kvasac Saccharomyces cerevisiae. Za ekspresiju se obično koristi vektor plazmida ili vektor faga, koji sadrži replikon izveden iz vrste kompatibilne sa ćelijama domaćina i regulatornu sekvencu. Primjeri vektora za E. coli su, na primjer, plazmidi pBR322, pUC18, pUC19, itd., fag, kao što je qt, Charon 4A, itd., fag M13, itd. Kao vektor za Bacillus subtilis, pUB110 može biti korišteni , pSA2100, itd., a YRp7, YEp61 itd. mogu se koristiti kao vektor kvasca. Vektor mora nositi promotor sposoban da izrazi protein od interesa. Kao promotor gena E. coli ili gena faga, na primjer, mogu se koristiti Lae, trp, tac, trc, pL, itd. Kao domaćin, kultivisane životinjske ćelije kao što su ćelije bubrega rezus majmuna, ćelije larve komaraca, ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna, fetalni fibroblast miša, ćelije jajnika kineskog hrčka, ćelije bubrega ljudskog fetusa, ćelije tkiva jajeta leptira, ćelije nalik epitelu grlića materice mogu ćelije, ćelije humanog mijeloma, mišji fibroblasti i tako dalje. SV40 rani promotor, SV40 kasni promotor, SV40 koji nosi promotor iz eukariotskog gena (npr. gen za ptičji ovalbumin induciran estrogenom, gen za interferon, gen tirozin aminotransferaze induciran glukokortikoidima, gen timidin kinaze, gen adenovirus) mogu se koristiti kao rani i kao rani vektor., gen fosfoglicerat kinaze, gen faktora, itd.), goveđi papiloma virus ili vektori izvedeni iz njih. Osim toga, poznato je da TP-ovi koje luče i proizvode stanice imaju različite N-terminale ovisno o razlici u mjestima cijepanja. U slučaju sekrecije i proizvodnje TP koristeći ćelije kulture kao domaćina, metoda cijepanja signalne peptidaze ili proteaze varira u zavisnosti od tipa ćelije, tako da se mogu dobiti TP vrste koje imaju različite N-terminale. Ovaj fenomen nije prikladan samo za slučaj izlučivanja i proizvodnje kultiviranih ćelija, jer se vjeruje da se sličan fenomen može pojaviti i u proizvodnji TSA od strane E. coli, Bacillus sublitis, kvasca i drugih posebno modificiranih stanica. Metoda Hanahana, Hanahana, D.J. Mol. može se koristiti za transformaciju domaćina korištenjem ekspresijskog vektora s integriranim poboljšanim genom za takt u slučaju E. coli. Biol., 166, 557, 1983), u slučaju manipulacije životinjskim ćelijama, može se koristiti metoda kalcijum fosfata (Vander Eb, A.J. i Graham, F.L., Method in Enrymoloqy, 65, 826, 1980, Academic Press) i tako on. Kao što je gore opisano, poboljšani ART je koristan u liječenju različitih stečenih bolesti, uključujući vaskularnu koagulaciju (čak i duboke vene), plućnu emboliju, perifernu arterijsku trombozu, srčanu ili perifernu arterijsku emboliju, akutni infarkt miokarda i trombotički napad. Kao i prirodni PTCA kod ljudi, poboljšani PTCA je posebno koristan u liječenju akutnog infarkta miokarda. ART kod ljudi se nedavno pokazao efikasnim u rastvaranju tromba koji začepljuje koronarne arterije, regeneraciji perfuzije miokarda i obnavljanju većine dijelova u ishemijskom sloju miokarda kada se primjenjuje intravenozno u dozi od 30 do 70 mg tokom 1 do 3 sata. Poboljšana zamka ima produženi biološki poluživot u krvi i stoga je efikasna u istim slučajevima kao i prirodni ljudski takt. Očekuje se da poboljšana zamka može dati klinički učinak sličan prirodnom ljudskom taktu u dozi od oko 10% doze preporučene kada se koristi prirodni ljudski takt, čak i sa jednom dozom. Pored toga, poboljšana zamka ovog pronalaska pokazuje sljedeća vrijedna svojstva, koja još nisu poznata u vezi sa prirodnim ljudskim taktom i modificiranim taktom. a) Protuupalno djelovanje. Na mjestu tromba detektuje se ne samo stvaranje samog tromba, već i stvaranje produkata razgradnje fibrina ili kinina u tragovima. Poznato je da ove supstance imaju aktivnost izazivanja upale i na taj način izazivaju upalu u području tromba. Iz tog razloga, poželjno je da sredstvo koje se koristi za liječenje tromboze ima ne samo trombolitičku aktivnost, već i protuupalno djelovanje. Kao rezultat sprovedenih studija, podnosilac zahteva je uspeo da poboljšanom TAP-u dodeli antiinflamatornu aktivnost na osnovu dve funkcije. Jedna od njih je da poboljšani trap inhibira biološku aktivnost interleukina 1 (IL-1), koji je jedan od medijatora upalnog odgovora. Vjeruje se da IL-1 proizveden od makrofaga sudjeluje u inflamatornom odgovoru kroz hipertermiju, ubrzanje rasta fibroblasta, proizvodnju kolagenaze u sinovijalnoj ćelijskoj membrani i tako dalje, ili ubrzavanjem sinteze prostaciklina u vaskularnim endotelnim stanicama. Poznato je i da IL-1 djeluje na ćelije jetre ubrzavajući proizvodnju proteina (serumski amiloidni protein, fibrinogen, itd.) u akutnoj fazi, koja se povećava s upalom. Podnosilac prijave je otkrio da poboljšana zamka inhibira aktivnost (aktivnost LAF) povećanja mitogene reaktivnosti timocita miša, što je jedna od bioloških aktivnosti IL-1. Druga funkcija je da poboljšana zamka ima afinitet za denaturirani protein (denaturirani imunoglobulin G, denaturirani albumin, itd.) koji je rezultat upale na mjestu tromba, a dodatno ima svojstvo da se aktivira ovim denaturiranim proteinom. Zbog ove aktivnosti, poboljšana zamka samo degradira denaturirani protein u području upale, a upala se može privremeno smanjiti. Podnosilac zahtjeva je potvrdio elektroforezom natrijum dodecil sulfata u gelu da poboljšani TSA samo razgrađuje denaturirani protein. Kao što je prikazano na Sl. 26, vidljiva je aktivacija i selektivnost poboljšane zamke denaturiranim proteinom. Kod imunoglobulina G tretiranog HCl, i to u nekoliko puta nižoj koncentraciji, pokazana je ista aktivnost kao i kod fibrinogena tretiranog BrCN. S druge strane, normalan imunoglobulin C ne pokazuje aktivacijski učinak na poboljšani trap čak i pri koncentraciji od 500 µg/ml. Prevencija ponovne okluzije nakon ponovne perfuzije začepljenog krvnog suda. Poznato je da se u liječenju tromboze prirodnim protuupalnim lijekovima, nakon obnavljanja krvotoka začepljene krvne žile, često opaža ponovna okluzija. Iz tog razloga se provodi kombinirana terapija inhibitorom koagulacije trombocita ili antikoagulansom. Međutim, kombinovana terapija uključuje probleme interakcije lijekova, kontrole doze, sličnih efekata itd. Poželjno je da sam TSA dodatno ima aktivnost prevencije ponovne okluzije. Poboljšani APT ovog pronalaska ima sposobnost da spriječi ponovnu okluziju zbog dvije vrste aktivnosti. Prvi tip je prevencija naglog smanjenja koncentracije t-PA nakon uvođenja poboljšanog t-PA zbog produženog trajanja djelovanja, što dovodi do eliminacije Stuart-Holmesovog simptoma i na taj način sprječava nastanak ponovne okluzije. Drugi tip je da se sprječavanjem oštećenja vaskularnih endotelnih stanica uzrokovanih IL-1 indirektno inhibira koagulacija trombocita, što sprječava ponovnu okluziju. c) Povećana stabilnost. Proteinski preparati su uglavnom nestabilni, pa je poželjno čuvati preparate u smrznutom suvom stanju ili na niskim temperaturama u obliku rastvora. Prilikom davanja aktivatora plazminogena pacijentu sa akutnim infarktom miokarda, potrebno je izvršiti proceduru u roku od nekoliko sati od početka napada kako bi se smanjila stopa mortaliteta. U tom slučaju su poželjni stabilni preparati koji se mogu čuvati na sobnoj temperaturi. Osim toga, povećana stabilnost omogućava termičku obradu, kiselinsku obradu i slično. tokom pripreme lekova. Posebno, s obzirom na poboljšani TSA ovog izuma, koji se proizvodi u ćelijskim kulturama, postaje moguće ukloniti retrovirus ćelijskog porijekla, za koji se zna da je nestabilan na toplinu. U nastavku pronalazak je detaljnije opisan sa referencom na primjere, ali nije ograničen na njih. Osim ako nije drugačije navedeno, rekombinantna DNK se proizvodi prema laboratorijskim smjernicama. Maniatis T et al., Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1982). Primjer 1. Kloniranje u tAT DNK. Bowesove ćelije humanog melanoma (kupljene od Dr. Roblin, R., Nacionalni institut za istraživanje raka, SAD) uzgajane su prema metodi Opdenakker et al. (Opdenakker, G., et al., Eur. J. Biochem, 131, 481-487 (1983)). Da bi se inducirala tRNA mRNA, TFA (12-O-tetradekanoilforbol-13-acetat) se dodaje u mješavinu kulture u konačnoj koncentraciji od 100 ng/ml, nakon čega slijedi kultura 16 sati. Ukupna ćelijska RNK se zatim ekstrahuje iz kultiviranih ćelija prema modifikovanoj metodi od strane Freeman et al. ((Okayama) Berqa DNK priručnik, str. 3, 1985, Fine Chemicals Pharmacy). Koristeći kolonu oligo-dT celuloze (proizvođača Pharmacia Fine Chemicals), poli(A) + RNK se odvaja od sve ćelijske RNK. Kao rezultat, oko 400 μg poli(A) + RNK dobije se iz približno 10 o ćelija. Ovaj poli(A) + RNK se frakcioniše centrifugiranjem sa gradijentom gustine saharoze na konvencionalni način. Uzima se dio frakcioniranog poli(A) + RNA i izvodi se dot-blot hibridizacija (Perbal, B., Apractical Gube to Molecular Cloninq, 410, 1984, John Wiley and Sons, Inc) korištenjem oligonukleotidne sonde specifične za tBA mRNA. Sonda (sonda Y) koja se ovdje koristi ima baznu sekvencu 5'-GCNNGGCAAAGATGGCA-3', koja je komplementarna mRNA regiji koja kodira aminokiselinske ostatke +291 do +297 u TPA sekvenci koju je opisao Pennicaetal, a sintetizirao je α-cijanofosfamidatna metoda koristeći DNK sintisajzer Model 380A (proizvođač Applied Biosystems). Sinteza DNK oligomera, odvajanje zaštitne grupe, odvajanje od smole i prečišćavanje se vrši u skladu sa uputstvima za upotrebu DNK sintisajzera, Model 380A. Radioaktivno označavanje Y sonde na 5' kraju je izvedeno prema laboratorijskom priručniku korištenjem T4 polinukleotid kinaze (proizvođača Taka-Ra Shuzo Co., Ltd.) sa t i -(32 P) ATP-om. Y sonda je hibridizirana snažno, uglavnom sa 20-30S poli(A) + RNA (ova frakcija se naziva frakcija M) Koristeći šablon, pripremi se 10 μg poli(A) + RNA iz frakcije M, 3 μg dvolančane cDNK sintetizirana upotrebom reverzne transkriptaze (proizvođa Biochemical Industry Co., Ltd) prema metodi Gubler-Hoffman (Gubler, U. i Hoffman, B.J., Gene 25, 263, 1983), i dodana u dvolančanu cDNK na 3' kraj deoksi C lanca prema metodi Denq-Wu (Denq, G. R. i Wu, R., Nucleic Acids Res., 9, 4173, 1981). Dvolančana cDNK produžena deoksi C lancem se zatim podvrgava gel filtraciji na Sepharose CL 4B (proizvođač Fine Chemicals Pharmacy) kako bi se uklonile nukleinske kiseline niske molekularne težine koje imaju manje od 500 baznih parova. Nakon toga, cDNK je žarena sa pBR322 (proizvođača Bethesda Research) koji sadrži deoksi G lanac na P st 1 mjestu korištenjem konvencionalne tehnike. Smjesa dobivena nakon žarenja transformirana je u E. coli HB101 kompetentne ćelije (proizvođač Takara Shuzo Co. , doo). Rezultat je cDNK banka koja se sastoji od približno 4000 nezavisnih transformanata. Ova cDNK je podvrgnuta hibridizaciji kolonije korištenjem Y sonde opisane gore prema Woods metodi (Woods, D., Focus, 6 (3), 1, 1984, proizveden od strane Bethesda Research Lab.) da bi se dobili klonovi koji djeluju na Y sondu. Među klonovima je identificiran pTPA1 klon koji sadrži najdužu TPA cDNK. Zatim je izvedena dideoksi metoda (Carlson, J., et al., J. Biotechnoloqy, 1, 253, 1984) koristeći M13 fag vektor i 7-DEAZA metodu (Mizusawa S., et al., Nucleis Acids Res ., 14, 1319, 1986). Kao rezultat toga, pronađeno je da plazmid pTPA1 sadrži baznu sekvencu od T y+441 do A y+2544 za TPA gen koji je opisao Pennicaetal. Primjer 2. Dizajniranje poboljšanog APT-a (II). U plazmidu pTPA1 prikazanom u Primeru 1, N-terminalni region je nedovoljan da se konstruiše poboljšani TPA (II) kojem nedostaje kringle 1 domen. Stoga je deficitarni DNK segment sintetiziran kao što je gore opisano korištenjem 380A DNK sintisajzera (proizvođača Applied Biosystems). Bazna sekvenca sintetizovanog oligomera i kompletna sintetizovana sekvenca su prikazane na Sl. 1-4. Specifične tehnike za konstruisanje poboljšanog TSA (II) korišćenjem ovih oligomera prikazane su na Sl. 5-6. 2-1). Konstrukcija bloka IV (fragment Bql II-Eco R1, oko 480 bp). Fragment bloka IV na sl. 5 se dobija na sledeći način. Prvo, prema laboratorijskim smjernicama, 40 pmol svakog od sintetičkih oligonukleotida 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 i 15 prikazanih na Sl. 1-2 su fosforilirani sa 10 jedinica T4 polinukleotid kinaze (proizvođač Takara Shuzo Co., Ltd.) na 37°C tokom jednog sata u 50 µl reakcionog rastvora za svaku od njih. Reakciona otopina se tretira fenolom. Nakon taloženja etanolom, precipitati se osuše pod sniženim pritiskom i rastvore u sterilnoj destilovanoj vodi. Nakon taloženja 40 pmol svakog oligomera u 150 µl rastvora koji sadrži 6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM NaCl, 7 mM MgCl 2 i 0,1 mM EDTA, na temperaturi od 80 o C 5 minuta, na temperaturi na 60 o C 5 minuta i na sobnoj temperaturi jedan sat, u odgovarajućim blokovima bloka I (oligomeri 1, 2, 3 i 4), bloka II (oligomeri 5, 6, 7, 8, 9 i 10) i blok III (oligomeri 11, 12, 13, 14, 15 i 16) vrši precipitaciju etanolom i sušenje pod sniženim pritiskom. Ostatak se otopi u 40 µl sterilne destilovane vode. Reakcija je izvedena u 400 µl reakcionog rastvora na 4°C tokom 15 sati korišćenjem kompleta za ligaciju DNK (proizvođač Takara Shuzo Co., Ltd.). Nakon taloženja etanolom i sušenja pod sniženim pritiskom, talog se rastvara u sterilnoj destilovanoj vodi: u slučaju bloka I (1), gel elektroforeza se izvodi u 5% poliakrilamidu (lab. priručnik), separira i prečišćava na tradicionalan način. (laboratorijski priručnik), fragment od oko 100 parova baza, a u slučaju bloka II (2) i bloka III (3), gel elektroforeza se provodi u 3% agaroznom gelu (LMP agaroza, proizvođača BRL) ( laboratorijski priručnik) i fragmenti od oko 190 parova se izoluju i prečiste elektroelucijom (laboratorijski priručnik). Zatim, 0,1 μg, 0,2 μg i 0,2 μg fragmenata bloka I, bloka II i bloka III, respektivno, se ligiraju pomoću gornjeg kompleta za ligaciju DNK. Izvršite gel elektroforezu u koncentraciji od 1,5% agaroze da biste izolovali Bgl II-Eco R1 fragment (blok IV) od oko 480 parova baza. DNK se zatim izoluje iz agaroznog gela elektroelucijom. Ova DNK se zatim fosforilira u 100 µl reakcionog rastvora na 37°C tokom jednog sata koristeći 10 jedinica gornje T4 polinukleotid kinaze, nakon čega se tretira fenolom, istaloži etanolom i osuši pod sniženim pritiskom. Ovaj sintetički genski fragment i blok IV bazna sekvenca potvrđeni su baznim sekvenciranjem prema dideoksi metodi korištenjem vektora faga M13. Specifične tehnike su prikazane na Sl. 6. Nakon ligiranja gornjeg Bgl II-Eco R1 blok IV fragmenta sa M13 mp18 DNK (proizvođač Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) digestiran restrikcijskim enzimima BamH1 (proizvođač Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) i Eco R1 (proizvođač Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) njegova osnovna sekvenca je određena korištenjem kompleta za sekvenciranje M13 (proizvođača Taraka Shuzo K., Ltd.) i 7-DEAZA kompleta za sekvenciranje (proizvođača Takara Shuzo Co. , doo). Mjesto cijepanja restrikcionog enzima Bgl11 i mjesto cijepanja restrikcijskog enzima BamH1 su vezani u izošizomernom rasporedu kroz (BamH1 - Bgl11 kraj cijepanja - mjesto cijepanja), a vezani fragment se može cijepati s Xho 11 restrikcijskim enzimom, što rezultira prirodnim i Bgl1 Bamh1 cijepanje završava, respektivno. Za preciznije sekvenciranje baza, M 13mp18 fag (koji sadrži fragment bloka IV) je inficiran sa E. cjli JM109 prema metodi Messing/Messing J., Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983)), nakon čega se dobija dvolančana DNK (replikacijski tip). Nakon što je ova DNK (50 μg) digestirana restrikcijskim enzimima Xho 11 (proizvođača Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co) i Eco R1, gel elektroforeza je izvedena na 1,5% agaroznom gelu da bi se izolirao fragment (blok IV) od oko 480 parova baza. . Ova DNK se ekstrahuje elektroelucijom. Nakon ligiranja ekstrahirane DNK sa M13mp19 DNK (proizvođač Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd) cijepanom restrikcijskim enzimima Eco R1 i BamH1 na isti način kao što je gore opisano, korištenjem kompleta za ligaciju DNK, određena je bazna sekvenca. Kao što je gore opisano, ova sekvenca se može preciznije provjeriti sekvenciranjem oba DNK pomoću M13mP18 i M13mp19. Dodatno, opisanom metodom dobijena je dvolančana replikativna DNK M13mp19 (sa blokom IV). Nakon digestije ove DNK (50 μg) restrikcijskim enzimima Eco R1 i Xho 11, vrši se gel elektroforeza u 1,5% agarozi, uz izolaciju fragmenta (blok IV) od oko 480 parova baza. 2-2). Blok V izolacija (Eco R1-Bal1 fragment, oko 1250 bp). Iz pTRA1 klona dobijenog u Primjeru 1, plazmidna DNK je izolirana u velikim količinama prema metodi opisanoj u laboratorijskom priručniku, kao što je prikazano na Sl. 5. Nakon digestije 70 μg ove DNK restrikcijskim enzimima Bal1 (proizvođač Takara Shuzo Co., Ltd.) i Nar1 (proizvođač Nirro Gen Co., Ltd.), izvršena je elektroforeza u 0,8% agaroznom gelu da bi se izolirao Nar1- Fragment Bal1 (oko 1540 parova baza). DNK se izoluje elektroelucijom. Nakon daljnje parcijalne digestije ove DNK restrikcijskim enzimom Eco R1, elektroforeza se provodi na 0,7% agaroznom gelu, naglašavajući Eco R1-Bal1 fragment (oko 1250 parova baza). DNK se izoluje elektroelucijom. 2-3). Konstrukcija poboljšanog tAM(II) gena iz bloka IV i bloka V. Kao što je prikazano na Sl. 5, poboljšani tPA gen se dobija na sledeći način. Nakon dopinga blok IV (fragment Bgl11-Eco R1, oko 480 bp) dobijen u primjeru 2-1 sa blokom V (fragment Eco R1-Bal1, oko 1250 bp) dobijenim u primjeru 2-2, koristeći opisani komplet za doping DNK gore, dopirani proizvod je podvrgnut taloženju etanolom. Nakon sušenja pod sniženim pritiskom, talog je digestiran sa restrikcijskim enzimom Xho 11 na uobičajeni način. Zatim se izvodi elektroforeza u 0,8% agaroznom gelu da bi se izolovao Bgl 11-Xho 11 fragment (oko 1500 parova baza, sadrži poboljšani tPA gen). DNK se zatim izoluje elektroelucijom. Kompletna bazna sekvenca tako dobijenog poboljšanog tPA(II) gena prikazana je na Sl. 8-13. Izvedena aminokiselinska sekvenca je takođe prikazana na Sl. 14-19. Primjer 3 Konstrukcija poboljšanog taktnog V, VI i VIII gena. Konstrukcija poboljšanog gena za takt V, VI ili VIII zasnovana je na poboljšanom genu za takt (II) uz pozivanje na sljedeće publikacije. Genetska konverzija se provodi metodom indukcije mutacije specifične za mjesto. Publikacije: Zoller M.J. i Smith.M., Metoda u fermentologiji, 100, str. 468-500 (1983), Zoller M.J. and Smith. M. DNK, 3, str. 479-488 (1984), Morinaga, Y. i dr. Biotehnologija, str. 636-630 (juli 1984), Adelman J. P. i dr., DNK, 2, str. 183-193 ( 1983), 6. M13 Sequencing Manual (puC) izdao Jean Sayens Room Co., Ltd.). 3-1). Konstrukcija poboljšanog trap gena (V). A) Generisanje M13mp19 (apt/p/) za mutaciju. Poboljšani fragment taktnog gena (II) koji je detaljno opisan u Primjeru 2, 2-3) je vezan za M13mp9 dvolančanu DNK tretiranu BamH1 restrikcijskim enzimom i alkalnom fosfatazom (proizvođač Takara Shuzo Co., Ltd.). Proizvod ligacije je transficiran u kompetentne ćelije E. cjli JM109 (proizvođač Takara Shuzo Co., Ltd.). Svaki klon koji proizvodi bezbojnu sterilnu mrlju je korišten za izazivanje E. coli JM109. Jednolančana DNK se izoluje iz supernatanta kulture, a dvolančana (replikativna) DNK se izoluje iz ćelija E. cjli prema Messing metodi (Messing, J., Methods in Enzymology, 101, str. 20-78, 1983. ). Karakterizacija ovih dvolančanih DNK nakon digestije sa restrikcijskim enzimom Pst1 elektroforezom u agaroznom gelu daje mp9 klon (poboljšani TPA(II) u kojem je gen TPA(II) umetnut u mp9 DNK u željenom smjeru kao što je prikazano na Sl. 21. Nakon cijepanja dijela ovih DNK sa Pst restrikcijskim enzimom, izvršena je elektroforeza u 0,8% agaroznom gelu, gdje je klon mp9 (poboljšani TAP(II) pokazao jednostavnu traku na poziciji 7300 bp, 840 bp, 430 bp i 80 bp Jednolančana DNK ovog klona je korištena u naknadnom eksperimentu indukcije mutacije specifičnih za mjesto. B) Sinteza prajmera sposobnog da izazove mutaciju specifičnu za mesto. Sintetički oligonukleotid koji se koristi za indukciju mutacije specifične za mjesto u poboljšanom tPA(II) genu sintetiziran je β-cijanoetilfosfoamidatnom metodom korištenjem DNK sintisajzera modela 380 A (proizvođača Applied Biosystems). Sinteza DNK oligomera, uklanjanje zaštitne grupe, odvajanje od smole i prečišćavanje vrše se u skladu sa uputstvima za upotrebu DNK sintisajzera 380 A. Za izazivanje mutacije na određenom mestu, prajmer (1) sposoban da indukujući mutaciju specifičnu za mesto i pripremaju se prajmer (2) za dideoksi sekvenciranje korišćenjem vektora faga M13 (Carlson, J. et al., Journal of Biotechnology, 1, str. 253, 1984). Date su aminokiselinske i nukleotidne sekvence za poboljšani TSA (II). Prajmer (1) koji može da izazove mutaciju razlikuje se po podvučenoj bazi od sekvence gena poboljšane zamke (II) (videti tabelu 1). C) Indukcija mutacije specifične za mjesto. Sledi metoda za stvaranje klona koji sadrži baznu sekvencu prajmera (1) sposobnu da izazove mutaciju, odnosno gen poboljšanog tPA (IV). Nakon žarenja (renaturacije) jednolančane DNK opisane u Primjeru 3,3-1), A) klon mp9 (poboljšani TPA (II) i prajmer (1), proizvod renaturacije je pretvoren u dvolančanu DNK, koja je zatim se transformiše u E. coli JM109. Zatim, koristeći prajmer za sekvenciranje, sekvence DNK se skriniraju kako bi se izolovao klon faga koji nosi mutirani poboljšani tAM(II) gen, tj. poboljšani TAT(V) gen. 5'- krajnja fosforilacija sintetičkog oligomera. DNK prajmer (1) za indukciju mutacije specifične za mjesto fosforilira se metodom opisanom u primjeru 2,2-1). se zagrijavaju u 30 µg otopine koja sadrži 2 pmol fosforiliranog prajmera (1) 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA i 50 mM NaCl, na 90° C. (2 min), 50° C. ( 5 min), 37°C (5 min) i na sobnoj temperaturi (10 min). U otopinu se dodaje 36 μl otopine 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) koja sadrži 4 jedinice Klenow enzima, 7 jedinica T4 DNK ligaze, 0,1 mM EDTA, 12 mM MgCl 2 , 10 mM ditiota 07. , 0,07 dATP i 0,2 mM svaki od dGTP, dTTP i dCTP, kako bi se stimuliralo izduživanje prajmera. Smjesa je podvrgnuta interakciji na temperaturi od 20 o C tokom 2 sata i na temperaturi od 4 o C tokom 15 sati. Transformacija je sprovedena korišćenjem rastvora opisanog iznad i kompetentnih ćelija E. coli JM109 (proizvođača Takara Shuzo Co., Ltd.) sve dok se ne formiraju mrlje lize. Nakon odvajanja bezbojne mrlje, fag je inficiran sa E. coli JN109 da bi se razmnožio. Zatim se iz supernatanta kulture za svaki klon dobije šablonska jednolančana DNK. Ove jednolančane DNK podvrgnute su samo "T" reakciji (reakcija "A" i "T" u Primjeru 3-2) dideoksi metode korištenjem prajmera za sekvenciranje (2), nakon čega je uslijedila elektroforeza na poliakrilamidnom gelu. Nakon sušenja, gel je analiziran autoradiografijom. Na osnovu rezultata identifikuje se klon koji ima željenu mutantnu sekvencu. Supernatant kulture klona je korišćen za inficiranje ćelija E. coli JM109 i ponovo inokulisan na ploču tako da je izolovana jedna tačka. Iz dobijene pojedinačne boje, jednolančana DNK se izoluje prema gore navedenoj metodi. Koristeći ove DNK, prvo je bazna sekvenca DNK određena dideoksi metodom upotrebom prajmera za sekvenciranje (2) da bi se dobio klon mutiran u željenu baznu sekvencu. Nakon infekcije ovog klona faga sa ćelijama E. coli JM-109 upotrebom metode messing opisane u Primeru 2, dobija se dvolančana DNK. Ova dvolančana DNK je digestirana restrikcijskim enzimom Xho 11, elektroforeza je provedena u 0,8% agaroznom gelu kako bi se izolirao fragment (poboljšani takt gen (V) od oko 1500 parova baza koji sadrže poboljšani gen za takt. Zatim je DNK ekstrahirana elektroelucijom.Osim toga, dideoksi metodom se utvrđuje kompletna bazna sekvenca tako dobijene DNK, pri čemu se utvrđuje da je DNK poboljšani tAM(V) gen. Kompletna bazna sekvenca tako dobijenog poboljšanog tAT(V) gen (iako sadrži signalni peptid od -35 do -1) prikazan je na slikama 11 - 13. Aminokiselinska sekvenca izvedena iz njega je također prikazana na slikama 17 - 19. 3-2) Konstrukcija poboljšanih TPA (VI) i (VIII). Tehnike su slične onima opisanim u primjeru 3, 3-1). Prvo se konstruiše M13mp3 (poboljšani TAP(II)), nakon čega se sintetišu prajmeri da bi izazvali mutaciju specifičnu za mesto. Bazna sekvenca ovih prajmera je gore opisana, međutim, 5'-fosforilirani prajmer (3) i 5'-fosforilirani prajmer (5) se koriste za konstruisanje poboljšanog tAM gena (VI) i poboljšanog gena za takt (VIII) , odnosno (vidi Sl. tab. 2). Nakon indukcije mutacije specifične za mjesto, kompletna bazna sekvenca se određuje dideoksi metodom. Potvrđeno je da imaju željene bazne sekvence. Tako se dobijaju geni za poboljšani takt (VI) i poboljšan takt (VIII). Ovi geni se zatim integrišu u pVY1 vektor prema proceduri opisanoj u Primerima 4 i 5. Primer 4 Integracija poboljšanog tPA(II) gena u pVY1 vektor. 4-1) Konstrukcija pVY1 vektora. Vektor pVY1 se generiše kao što je prikazano na Sl. 7. A) Konstrukcija pAdD26SV (A) N3 (N) i zatupljivanje Eco R1 mjesta cijepanja. Prvo, DNK pAdD26SV(A) N3 (kupljena od dr. Hiroshi Handa sa Univerziteta u Tokiju, poznata iz sažetaka u Mo1, Ce 11. Biol, 2 (11, (1982)) nije spregnuta sa restrikcijskim enzimom Bgl11 (proizvođača Boehringer). Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) na tradicionalan način. DNK se zatim tupi kraj na tradicionalan način koristeći Klenow enzim (proizvođač Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) Nakon tretmana fenolom, taloženje etanolom, i sušenjem pod sniženim pritiskom, precipitati se rastvore u sterilnoj destilovanoj vodi.Posle daljeg ligiranja transformisan je reakcionom smešom u kompetentne ćelije E. coli HB101 (proizvođač Takra Shuzo, Co. Ltd.) Plazmidne DNK su pripremljene od transformanata otpornih na tetraciklin na uobičajeni način Nakon što je dio ovih DNK digestiran restrikcijskim enzimom BgL 1, izvršena je elektroforeza na 0,7% Kao rezultat, dobije se klon koji nosi DNK koji nije cijepan restrikcijskim enzimom BgL 11, kao što je gore opisano. Nakon tretmana fenolom, taloženja etanolom i sušenja pod sniženim pritiskom, precipitati se rastvaraju u destilovanoj sterilnoj vodi. B) Izolacija fragmenta Kpn 1-BamH1 (oko 2900 bp) iz pKSV10 i formiranje tupih krajeva. Nakon što je pKSV10 DNK (proizveden od Fine Chemicals Pharmacy) digestirana restrikcijskim enzimima Kpn1 i BamH1 na konvencionalan način, DNK je tupim krajevima koristeći T4 DNK polimerazu (laboratorijski priručnik, str. 114-121). Zatim izvršite elektroforezu u gelu od 0,7% agaroze uz izdvajanje fragmenta od oko 2900 baznih parova. Fragment se zatim elektrolitira kako bi se izdvojila DNK.

C) Konstrukcija pVY1. Nakon ligiranja DNK fragmenta dobijenog u A) i DNK fragmenta dobijenog u B), kompetentne ćelije E. coli HB101 (gore opisane) se transformišu. Od transformanata koji pokazuju otpornost na tetraciklin, plazmidna DNK se dobija na tradicionalan način. Nakon cijepanja dijela ovih plazmidnih DNK sa Pst1 restrikcijskim enzimom (proizvođača Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd), provedena je elektroforeza u 1,0% agaroznom gelu. Rezultat je klon (plazmid pVY1) koji karakteriziraju trake od oko 3400 parova baza, oko 3200 parova baza i oko 1400 parova baza. Ovaj klon E/coli HB101 (pVY1 je deponovan kod Naučnog instituta za istraživanje fermentacije Agencije za industrijsku nauku i tehnologiju Japana pod registarskim brojem P-9625 (FEPM BP 2106). 4-2) Integracija poboljšanog tPA (II) gen u pVY1 vektor. Nakon cijepanja DNK plazmida pVY1 dobijenog u Primjeru 4-1) sa restrikcijskim enzimom BgL 11 na konvencionalan način, defosforilacija je izvedena korištenjem alkalne fosfataze (proizvođač Takara Shuzo. Co. Ltd.). Zatim tri puta provesti tretman fenolom. A nakon taloženja etanolom i sušenja pod sniženim pritiskom, talog se rastvara u sterilnoj destilovanoj vodi. Nakon što je ova DNK ligirana na fragment BgL 11-Xho 11 (oko 1500 bp) dobijen u primjerima 3, 3-1) i kompetentne ćelije E. coli HB101 su transformirane produktom ligacije prema gore opisanoj metodi. Od transporanti koji imaju otpornost na tetraciklin, primite na tradicionalan način plazmidnu DNK. Nakon cijepanja ovih DNK restrikcijskim enzimima (BqL 11, Pst 1), odabire se klon koji ima poboljšani tPA(II) gen u pVY1 vektoru integriran u željenom smjeru, a selekcija se vrši na osnovu analize agaroznog gela uzorak elektroforeze. Prvo, dio ovih DNK se probavlja restrikcijskim enzimom BqL 11, nakon čega slijedi elektroforeza u 0,8% agaroznom gelu kako bi se dobio klon koji ima traku fragmenata od oko 1500 parova baza kada se fragment BqL 11-Xho 11 veže na BqL fragment 11 plazmida pVY1, vezani dio Xho 11 i BqL 11 može biti odrezan restrikcijskim enzimom BqL 11. Dio plazmidne DNK ovih klonova se dalje razgrađuje sa restrikcijskim enzimom Pst1, a DNK se podvrgava elektroforezi u 0,8% agarozni gel da se dobije klon koji ima jednu traku veličine oko 3400 bp, dvije trake od oko 2300 bp, jednu traku od oko 1400 bp i jednu traku od oko 80 bp. Koristeći ovaj klon (plazmidi pVY1-TPA (II) prema laboratorijskom priručniku, dobijene su plazmidne DNK. u primjeru 4-1), restrikcijski enzim BqL 11 je konvencionalno defosforiliran korištenjem alkalne fosfataze (proizvođa Takara Shuzo, Co., Ltd. ), nakon čega slijedi tretman (3 puta) fenolom, taloženje etanolima i sušenje pod sniženim tlakom. Talog se zatim rastvori u sterilnoj destilovanoj vodi. Nakon ligacije ove DNK sa BqLII-Xho 11 fragmentom od oko 1500 parova baza, dobijenim u primjerima 2, 2-3), proizvod ligacije je transformiran u gore navedene kompetentne ćelije E. coli HB101. Plazmidna DNK se dobija od transformanata koji pokazuju otpornost na tetraciklin, u skladu sa tradicionalnom metodom. Nakon digestije ovih DNK restrikcijskim enzimima BqL11 i Pstl, izvodi se elektroforeza u agaroznom gelu. Analizom obrasca razdvajanja u agaroznom gelu, odabiru se klonovi u kojima se poboljšani tPA (V) gen ubacuje u pVYI vektor u željenom smjeru. Prvo, nakon cijepanja dijela ovih DNK restrikcijskim enzimom BqL11, izvedena je elektroforeza u 0,8% agaroznom gelu kako bi se dobili klonovi i dobivena je traka od oko 1500 parova baza. Kada je BqL11-Xholl fragment povezan sa BqL11 fragmentom pVYI vektora, dio Xholl i BqL11 može se odcijepiti sa BqL11 restrikcijskim enzimom zbog gore spomenute konfiguracije izošizomera. Nakon daljeg varenja dijela DNK plazme ovih klonova restrikcijskim enzimom Pstl, izvedena je elektroforeza pri koncentraciji agaroznog gela od 0,8% kako bi se dobio klon koji je dao traku od oko 3400 bp, traku od oko 2300 bp, dvije trake od oko 1400 bp, jedan opseg od oko 800 bp i jedan opseg od oko 80 bp. Koristeći klon (plazmidi pVYI-TAP(V)) plazmidna DNK se dobija u velikim količinama, na osnovu laboratorijskog priručnika. Na sličan način, geni za poboljšane tPAs (VI) i (VIII) su integrisani u pVYI vektor. Primjer 6 Ekspresija poboljšanog tPA u CHO ćelijama. Plazmid pVYI - poboljšani t-PA(VI), t-PA(II), t-PA(V) ili t-PA-(VIII) se transficira u CHO ćelije sa nedostatkom DHFR (Urlaub, et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 77(7), 4216-4224, 1980) metodom kalcijum fosfata (Graham, et al. , Viroloqy, 52, 456, 1973). Utvrđeno je da transformirani klon proizveden na selektivnoj podlozi (MEM A LPHA (-), GIBCO) u prisustvu metotreksata (MTX) pokazuje aktivnost TAP na nivou od 50 do 100 jedinica/mL (vrijednost određena fibrin/agaroznom pločom metoda opisana u nastavku). Ovaj klon se koristi za dalja istraživanja. Kao proizvodni medij korišten je GIT medij (proizvođa Waco Pue Chemical Industry Co., Ltd.) obogaćen sa 20 međunarodnih jedinica/ml (SIGMA) aprotinina. Primjer 7. Prečišćavanje poboljšanog TSA iz supernatanta kulture CHO ćelija. Supernatant kulture dobijen u Primeru 6 je delimično prečišćen na afinitetnoj koloni anti-TGA monoklonskih antitela. Na tradicionalan način dobijena su hibridna monoklonska antitela za t-PA koja potiču iz ćelija humanog melanoma. Hibrid koji proizvodi antitijela je inokuliran u miševe, a monoklonsko antitijelo (podklasa: IgGM1) razvijeno u ascitesu je ekstrahirano i pročišćeno korištenjem celulofinskog proteina A (proizvođača Biochemical Industry Co., Ltd.) i MAPS puferskog sistema za pročišćavanje monoklonskog antitijela proizvođača Biorad Laboratories. Antitijelo je spojeno sa CN3r aktiviranom sefarozom (proizvođač Pharmacia Fine Chemicals) brzinom od 4 mg po ml gela na konvencionalni način. Gel antitijela (24 ml) se pomiješa sa četiri litre supernatanta kulture. Nakon laganog mućkanja preko noći na 4°C, gel se stavlja na kolonu (prečnika 1,5 cm x 20 cm). Gel se zatim uzastopno ispere sa 125 ml svakog od sledećih rastvora (1) Tris-HCl pufer pH 7,4 (pufer A) koji sadrži 25 IU/ml aprotinina (proizvođač SIGMA) i 0,01% (w/v) Tween 80 , (2) Pufer A koji sadrži 0,5 M NaCl, (3) Pufer A koji sadrži 4 M uree, i (4) Pufer A. Poboljšani gel vezan TSA je eluiran sa 0,2 M glicin-HCl puferom pH 2, 5 koji sadrži 25 međunarodnih jedinica/ml aprotinina i 0,01% (w/v) Tween 80. Aktivne frakcije se sakupljaju i skupljaju. Nakon dijalize protiv 10 mM Tris-HCl pufera, pH 7,4, koji sadrži 25 internacionalnih jedinica/ml aprotinina i 0,01% (w/v) Tween 80, dijalizat je koncentriran 20-30 puta preko noći sa vakuum centrifugalnim koncentratom (Speed ​​VAC, proizveden od SAVANT Inc.). Koncentrat se ponovo dijalizira protiv 10 mM Tris-HCl pufera, pH 7,4, koji sadrži 0,15 M NaCl, 25 IU/ml aprotinina i 0,01% (w/v) Tween 80, preko noći, te se koristi za naknadne in vitro i in vivo procjene . Konačno, specifična aktivnost se povećava za 3700-5000 puta, a prinos je od 36 do 42% aktivnosti TAP (određene metodom fibrin/agarozne čašice). Ova aktivna frakcija se analizira elektroforezom natrijum dodecil sulfata i bojenjem srebrom. U uslovima redukcije, primećena je veoma jaka traka na 54 kilodaltona, zajedno sa nekoliko drugih opsega. Gel za elektroforezu je zatim tretiran sa 2,5% (w/v) Triton X-100 i stavljen na fibrin/agaroznu ploču da bi se autografirao fibrin na 37°C, pri čemu se otopljena traka detektuje na oko 50 kilodaltona. Na istoj čaši, prirodni TPA se pojavljuje na oko 60 kilodaltona. Rezultati pokazuju da TAP apsorbovan na koloni afiniteta antitela i eluiran ovom metodom odgovara poboljšanom TPT koji ima molekulsku težinu koja je oko 10.000 manja od one prirodnog tipa. Primjer 8. Mjerenje specifične aktivnosti poboljšanog takta. Količina proteina u djelimično prečišćenom poboljšanom TSA određuje se mjerenjem ukupnog proteina prema Bradford metodi (Bradford, Anal. Bochem., 72, 248 (1976)), koristeći albumin goveđeg seruma kao referentni protein. Količina antigena TAP se mjeri enzimskim imunološkim testom (ELISA). Fibrinolitička aktivnost se određuje metodom fibrin/agarozne ploče i metodom 125 filma rastvaranja 1-obilježenog fibrina. Fibrin/agarozna ploča se priprema dodavanjem agara u 95% koaguliranog fibrinogena. Metoda rastvaranja filma 125 1-obilježenog fibrina izvedena je u skladu s opisom Hoyraeertsa et al. (J. Biol. Chem. 257, 2912, 1982) koristeći TBA ćelije humanog melanoma proizvođača Bioscott Inc. kao referencu. i standardizovan prema međunarodnom APT standardu (Gaffuey i Curtis, Thromb. Haemostas, 53, 34, 1985). Vrijednost specifične aktivnosti izračunata iz vrijednosti aktivnosti određene 125 filmskom metodom rastvaranja 1-fibrina i količine antigena određene enzimskim imunološkim testom (ELISA) kretala se u rasponu od 300.000 do 420.000 jedinica/mg antigena. Primjer 9 Afinitet fibrina i aktivacija fibrina poboljšanog TAP-a

U skladu sa radom Verheijen, et al./EMBOJ, 5, 3525, 1986) istražiti afinitet poboljšanog TSA za fibrin. Pojačani ili prirodni TAP (1000 jedinica/ml) se dodaje fibrinogenu u različitim koncentracijama, nakon čega slijedi jedna jedinica trombona, nakon čega slijedi reakcija na sobnoj temperaturi u trajanju od 3 minute. Formirani fibrinski ugrušak se precipitira centrifugiranjem na 16.000 o/min u trajanju od 8 minuta, a količina TSA koja nije vezana za fibrin se određuje mjerenjem aktivnosti fibrin/agaroze metodom fibrin/agarozne ploče. Kao rezultat toga, utvrđeno je da poboljšani TAP (VI) pokazuje isti afinitet prema fibrinu kao i prirodni oblik. Da bi se ispitao stepen aktivacije plazminogena poboljšanom zamkom u prisustvu ili odsustvu fibrina, sproveden je sledeći eksperiment. Koristeći ploču za titraciju, prirodni ili poboljšani TSA se dodaje u 0,1 M Tris-HCl pufer, pH 7,5, koji sadrži 0,3 mM sintetičkog supstrata p-niroanilid tripeptida S-2251 (H-D-Val-leulys-pNA HCl, proizvođača Kabi Inc. ), 0,13 μM plazminogena bez plazmina, 120 μg/ml DESAFIB TM (proizvođač American Diagnostics Inc.) i 0,1% Tween 80 da bi se dobila ukupna zapremina od 200 μl. Sistem se održava na 37° C. Nakon određenog vremenskog perioda, apsorbancija (optička gustina) se meri na 405 nm korišćenjem Titertech Multiscan 310 modela. Kriva doza-odgovor za amidolitičku aktivnost poboljšane zamke (VI) i prirodnog takta prikazana je na Sl. 22. Pomak krivulje doza-odgovor zbog dodavanja DESAFIB TM za prirodni t-PA odgovara vrijednosti od 158 puta, dok za poboljšani t-PA dostiže 100 puta. To je zbog činjenice da je aktivnost poboljšanog TSA (VI) u odsustvu DESAFIB TM niža, za približno 1/20, od aktivnosti prirodnog TSA. Primjer 10. Analiza poboljšane zamke za fibrinolitičku aktivnost u krvotoku zeca. Farmakinetika poređenjem aktivnosti prirodnog t-PA (n-t-PA) i poboljšanog t-PA ovog pronalaska kod kunića. Kao što se vidi sa Sl. 23, poboljšani trap pokazuje značajno produženje biološkog poluživota u aktivnom stanju (prirodni takt pokazuje poluživot od 1-2 minute, dok je poboljšani takt biološki aktivan 8-15 minuta). Osim toga, jasno je da vrijednost aktivnosti od 5% (vrijednost nakon 30 sekundi nakon primjene je 100%) i dalje ostaje u poboljšanom TAP-u čak i 60 minuta nakon njegove primjene (prirodni TAP nakon 60 minuta pokazuje aktivnost od 0,1% početni). Ovaj eksperiment se izvodi na sljedeći način

Za test je odabran japanski bijeli zec težine 2,4 kg. Pod anestezijom pentobarbitalom, ART se primjenjuje kroz perifernu venu uha. Doza je 15400 jedinica (0,8 ml) poboljšane zamke po zecu i 5400 jedinica (0,8 ml) n-trac po zecu (vrijednosti određene metodom fibrinske ploče). Zatim se 2,5 ml krvi uzima iz femoralne arterije pomoću katetera u različitim vremenskim intervalima (od 0,5 do 60 minuta) i dodaje se u 1/9 zapremine natrijum citrata (3,8%). Unutar 30 minuta nakon uzimanja krvi, centrifugiranje se provodi malom brzinom, odvajajući plazmu. Koristeći odvojenu plazmu izmjerite aktivnost t-PA u krvi. (1) Mjerenje aktivnosti APT-a. Nakon razrjeđivanja 0,2 ml plazme sa 3 mM glacijalne octene kiseline 16 puta, razrijeđeni proizvod se centrifugira na maloj brzini kako bi se dobio precipitat. Precipitati se rastvore u 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, sa 140 mM NaCl u zapremini koja je ekvivalentna onoj u plazmi da bi se dobila frakcija euglobulina. Aktivnost tPA se određuje dodavanjem ove frakcije euglobulina u fibrin/agaroznu posudu. Nakon inkubacije ploče na temperaturi od 37 o C tokom 16 sati, uočava se aktivnost t-PA u obliku plaka. Standardna kriva za metodu fibrin/agarozne ploče priprema se razblaživanjem TSA koji se koristi za davanje životinji na 0,1-10,000 jedinica/ml. Ovako određena aktivnost krvne zamke izražava se u procentima koristeći taktnu aktivnost dobijenu prikupljanjem krvi 30 s nakon primjene, uzetu kao 100%. Primer 11. Otpornost poboljšanog TAP (VI) na toplotu i kiseline. Da bi se odredila tolerancija na toplotu, poboljšana zamka (VI) i prirodna zamka se razblaže sa 50 mM Tris pufera koji sadrži 100 mM NaCl i 0,01% Tween 80, pH 7,4, do koncentracije od 100 μg/ml, respektivno. Svaki rastvor se drži u kipućoj vodi (temperatura 98 o C) 2-60 minuta. Nakon hlađenja, rezidualna aktivnost se određuje metodom fibrinske čašice. Kao što je prikazano na Sl. 24, smanjenje aktivnosti poboljšane zamke (VI) je beznačajno u poređenju sa smanjenjem aktivnosti prirodnog takta. Na primjer, nakon termičke obrade u trajanju od 2 minute, aktivnost prirodnog takta se smanjuje na 25%, dok poboljšani takt (VI) i dalje zadržava aktivnost od 71%. Da bi se proučavala otpornost na kiselinu, poboljšani TAP (VI) i prirodni TAP su rastvoreni u 0,5N. Rastvor HCl u koncentraciji od 100 µg/ml, nakon čega slijedi taloženje na sobnoj temperaturi 30 minuta. Nakon neutralizacije, aktivnost se određuje metodom fibrin-cup. Poboljšani TP ne otkriva nikakvu promjenu aktivnosti, dok je aktivnost prirodnog TP smanjena za 50%. Primjer 12 Inhibicija aktivnog limfocitnog stimulirajućeg faktora poboljšanim TSA (VI)

Poboljšani TSA (VI) i prirodni TPA su na odgovarajući način razrijeđeni u mediju za kulturu tkiva PPM1 1640 koji sadrži 7% fetalnog telećeg seruma i 58 μM 2-merkaptoetanola. 100 µl razblaženja se stavlja u ploču za kulturu tkiva sa 96 jažica, a zatim se dodaje 50 µl ćelijske suspenzije koja sadrži timocite (210 7 ćelija/ml) od 4 do 6 nedelja starih C3H/He J mužjaka miševa, konkanavalin A ( 1,2 μg/ml), kao i 50 μl IL-1 (4 jedinice/ml, Aenzyme Inc), nakon čega slijedi kultivacija 48 sati u inkubatoru na temperaturi od 37 o C koji sadrži 5% ugljičnog dioksida. Zatim dodajte H 3 -timidin u koncentraciji od 0,5 mikrona. kocka inča /20 µl/jažici. Nakon kultivacije u trajanju od 18 sati, ćelije su sakupljene na filteru od staklenih vlakana, a količina 3 H-timidina ubrizganog u ćelije je izmjerena tečnim scintilacijskim brojačem kako bi se odredila aktivnost faktora koji stimulira limfocite. Kao što je prikazano na slici 25, prirodna zamka ne inhibira aktivnost faktora stimulacije limfocita, dok je poboljšani takt značajno potiskuje. Kada je testirano samo sa rastvaračem, nije zabeležen nikakav efekat. Primjer 13 Protuupalna aktivnost zasnovana na djelovanju na denaturirani protein. 1) Dobivanje denaturiranog proteina. Nakon inkubacije otopine proteina (5 mg/ml) u 0,1 N. rastvor HCl ili 0,1 N. Rastvor NaOH na temperaturi od 37 o C tokom 2-3 sata, rastvor proteina se neutrališe sa istom količinom NaOH ili HCl. 2) Afinitet poboljšane zamke (VI) za denaturirani protein. Metoda: Prema dolje navedenoj proceduri, denaturirani protein je "vezan" za nitrocelulozni film. Zatim se mjeri količina poboljšanog TSA povezanog s tretmanom proteina i nitroceluloznog filma, čime se procjenjuje afinitet poboljšanog TSA za denaturirani protein. Komad nitroceluloznog filma uronjen je u 20 mM puferski rastvor Tris-HCl, pH 7,5, koji sadrži 140 mM NaCl. Sušenje. Denaturirani protein (50 µg/10 µl) se kap po kap ukapa na komad nitroceluloznog filma. Sušenje. Blokiranje sa 3% rastvorom želatine. Ispiranje. Komad nitroceluloznog filma uronjen je u rastvor poboljšanog TSA /1mcg/ml/. Ispiranje. Dodati plazminogen i sintetički supstrat S-2251, nakon čega sledi inkubacija na temperaturi od 37 o C (kvantitativna analiza apsorbovanog poboljšanog TBA). Mjerenje apsorpcije na 405 nm. Rezultati: Kao što je prikazano u Tabeli 3, poboljšani tPA pokazuje afinitet za IgG tretiran sa HCl, albumin tretiran sa HCl, albumin tretiran sa NaOH. S druge strane, poboljšana zamka ne pokazuje afinitet za intaktni imunoglobulin G i albumin. 3) Aktivacija poboljšanog APT (VI) denaturiranim proteinom. Metoda: Plazminogen (0,0078 jedinica u 10 µl), 100 µl 3 mM sintetičkog supstrata S-2251 i različite količine TBS pufera se dodaju u reakcionu otopinu naprednog TBA aktivatora (denaturirani protein, BrCN-tretirani fibrinogen, itd. ) pri različitim koncentracijama da bi se dobilo 0,275 ml reakcione otopine. Poboljšani TSA (2,5 n/g u 25 µl) se dodaje u reakcionu otopinu da se inicira reakcija. Nakon reagiranja određenog vremenskog perioda, 2% natrijum dodecil sulfata (ekvimolarna količina) je dodan u reakcijsku otopinu kako bi se zaustavila reakcija. Mjerenjem optičke gustoće (OD 405) odredite aktivnost poboljšanog takta. Rezultati: Kao što je prikazano na Slici 26, albumin tretiran NaOH i imunoglobulin G tretiran HCl pokazuju izražen aktivirajući efekat poboljšane zamke. Konkretno, kod IgG tretiranih HCl, aktivacija je jaka, a aktivnost IgG tretiranog HCl je približno jednaka onoj kod BrCN tretiranog fibrinogena, i to u koncentraciji koja je nekoliko puta niža. Intaktni albumin i imunoglobulin G ne pokazuju aktivaciju. 4) Degradacija denaturisanog proteina pod dejstvom poboljšane zamke (VI). Metoda: nakon reakcije denaturiranog proteina sa poboljšanim TSA pod istim uvjetima kao u metodi opisanoj u prethodnom podstavu, osim što se u reakcioni sistem ne dodaje sintetički supstrat S-2251, a količina denaturiranog proteina je 133 µg /ml, izvršiti elektroforezu u poliakrilamidnom gelu sa natrijum dodecil sulfatom u prisustvu α-merkaptoetanola. Rezultati: Kao što je prikazano na slici 27, protein denaturiran tretmanom NaOH ili HCL tretmanom rezultirao je nestankom traka ef-proteina u obrascu i formiranjem proizvoda razgradnje, što ukazuje na njegovu degradaciju. S druge strane, kada se koristi intaktni albumin, nije pronađena promjena u ef-obrasci nakon interakcije s poboljšanom zamkom, pa stoga nije pronađena degradacija denaturiranog proteina.

TVRDITI

1. Rekombinantni tkivni aktivator plazminogena koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu na str. gdje je Y Glu-Ile-Lys;

H 2 N - amino;

COOH - karboksi kraj;

R je direktna veza ili sekvenca slična njoj koja sadrži supstitucije i/ili delecije i/ili insercije koje nisu povezane s promjenama aktivnosti,

I ima sljedeća svojstva: fibrinolitička aktivnost, određena metodom rastvaranja filma 1 2 5 I-fibrina, sposobnost da se aktivira fibrinom i aktivnost poboljšanog tpA u odsustvu fibrina, koja je niža od aktivnosti fibrina. prirodni tpA, povećan, u poređenju sa prirodnim oblikom, poluživot, povećan, u poređenju sa prirodnim tpA, otpornost na kiseline i toplotu, sposobnost inhibicije faktora aktiviranja limfocita, sposobnost da se aktivira denaturisanim proteinom. 2. Metoda za proizvodnju rekombinantnog tkivnog aktivatora plazminogena, uključujući kultivaciju ćelija domaćina transformiranih rekombinantnom DNK koja sadrži sekvencu koja kodira analog tpA, i naknadno pročišćavanje ciljnog produkta, naznačeno time da se ćelije domaćina kultiviraju transformirane sa rekombinantnim vektorom koji sadrži DNK sekvenca koja kodira tpA na stavku 1.

I važna je komponenta sistema fibrinolize. Aktivator plazminogena je jedan od najčešće uključenih enzima u uništavanju bazalne membrane, ekstracelularnog matriksa i invaziji ćelija. Proizvodi ga endotel i lokaliziran je u zidu krvnih žila [Loscalso, ea 1988]. Tkivni faktor je fosfolipoprotein. Apoprotein ovog kompleksa je integralni membranski glikoprotein sa molekulima. težine oko 46 kDa, što je snažno povezano sa fosfolipidima membrana endotela, glatkih mišićnih ćelija, monocita. TPA se sintetizira in vivo kao jednolančani polipeptid (molekulske težine 72 kDa) koji se proteolizom pretvara u dvolančani oblik pomoću različitih proteinaza, uključujući plazmin, tkivni kalikrein i aktivirani faktor X. Dvolančani oblik tPA je aktivniji od jednolančanog prekursora. pH-optimum djelovanja enzima tokom konverzije angiotenzinogena u Ang II je u kiseloj regiji. Vidite tPA kao enzim koji formira ang II. tPA iz krvi je endotelni aktivator koji se oslobađa u krvotok kao odgovor na različite podražaje. Koncentracija tPA u krvi je 6,6+/-2,9 ng/ml.

Tkivni faktor, transmembranski glikoprotein, član porodice citokinskih receptora klase II, može inducirati ćelijsku aktivaciju pomoću dva mehanizma.

Tkivni faktor, pokretač aktivacije vanjskog mehanizma zgrušavanja krvi, lokaliziran u endotelnim i glatkim mišićnim stanicama, kada su oštećene, dolazi u kontakt s krvlju, što u konačnici doprinosi stvaranju trombina i pokretanju krvi. mehanizam koagulacije. Ima visok afinitet prema F.VII koji cirkuliše u krvi. U prisustvu Ca++ jona, apoprotein T.f. formira stehiometrijski kompleks sa f.VII, uzrokujući njegove konformacijske promjene i pretvarajući potonju u serin proteinazu f.VIIa cijepanjem Arg-152-Ile peptidne veze. Reakcija je stimulisana količinama proteinaza u tragovima koje cirkulišu u krvi (f.Xa, trombin, f.VIIa, f.IXa). Rezultirajući kompleks (f.VIIa-T.f.) pretvara f.X u serin proteinazu f.Xa. Kompleks tkivni faktor-faktor VII je u stanju da aktivira i faktor X i faktor IX, što na kraju doprinosi stvaranju trombina a [Boyle, E.M., Verrier, E.D., ea., (1996)].

U strukturi proteina T.f. Postoje tri domene: glavni, koji se nalazi na površini ćelijske membrane, transmembranski i citoplazmatski. Receptorske funkcije imaju površinski domen koji sadrži 219 aminokiselinskih ostataka Ser-1-Glu-219. Nakon 23-člane transmembranske domene slijedi citoplazmatski "rep" kroz koji je protein usidren za membranu. Ovdje se ostvaruje mogućnost da jedan Cys ostatak ovog domena formira tioetersku vezu sa membranskim lipidima (palmitat ili stearat). Određena uloga pripisuje se ostacima alifatičnih aminokiselina, uz pomoć kojih se protein ugrađuje u unutrašnji sloj membrane, čime se pojačava „sidrenje“ molekula tkivnog faktora. Površinski domen je glikoziliran na tri ostatka treonina (Thr-13, Thr-126, Thr-139). Sadrži 4 Cys ostatka koji formiraju dvije disulfidne veze, jednu na N-terminalnoj, a drugu na C-terminalnoj regiji domene. Ove veze stabilizuju dotične peptidne petlje. Pokazalo se da je disulfidna veza koja se nalazi u C-terminalnoj regiji funkcionalno značajna, njeno učešće je neophodno za ispoljavanje kofaktorskih funkcija tkivnog faktora u odnosu na faktore VII i VIIa. Na osnovu analize primarne strukture, lokacije disulfidnih veza i proučavanja funkcionalnih karakteristika, otkrivena je njena homologija sa interferonima Ifn-alphaR i Ifn-gammaR porodice citokinskih receptora klase II. U sistemu koagulacije krvi, interakcija faktora VII/VIIa sa receptorom – kofaktorom – tkivnim faktorom ubrzava aktivaciju vanjskog mehanizma hemokoagulacije za nekoliko hiljada puta. Ovo ubrzanje se postiže:

Prvo, proteolitički mehanizam iniciran formiranjem kompleksa tkivnog faktora sa faktorom VII/VIIa (VII aktivan) koagulacije krvi, u kojem tkivni faktor djeluje kao kofaktor i modulator faktora VII/VIIa. Vezivanje faktora VIIa za tkivni faktor uzrokuje povećanje unutarćelijske Ca2+ fosforilacije protein kinaza aktiviranih mitogenom (MAP kinaza) - Erk-1, Erk-2, p38, Jnk i dovodi do transkripcije gena Egr-1 (rani odgovor na rast) , obično izazvan citokinima i faktorima rasta.

Drugo, ne-proteolitičkim mehanizmom, u kojem je citoplazmatski domen samog tkivnog faktora uključen u intracelularnu signalizaciju, što dovodi do

Uključeno u lijekove

Uključeno na listu (Uredba Vlade Ruske Federacije br. 2782-r od 30. decembra 2014.):

VED

ATH:

B.01.A.D.02 Alteplase

farmakodinamika:

Aktivator plazminogena ljudskog tkiva (rekombinantni): aktivacija plazminogena, konverzija plazminogena u plazmin, uništavanje fibrina, fibrinogena, faktora koagulacije V i VIII.

Farmakološki efekti

Trombolitički.

Farmakokinetika:

Biotransformacija se dešava u jetri. T1/2 - 35 min. Eliminacija putem bubrega (80% - u obliku metabolita).

Indikacije:

Infarkt miokarda (u prvih 6-12 sati), akutna masivna plućna embolija, akutni ishemijski moždani udar,tromboza perifernih arterija donjih ekstremiteta

IX.I20-I25.I21 Akutni infarkt miokarda

IX.I26-I28.I26 Plućne embolije

Kontraindikacije:

Hemoragični vaskulitis, hemoragijska retinopatija, istovremena upotreba indirektnih antikoagulansa. Teška ili opasna krvarenja (tekuće ili nedavno), cerebrovaskularni akcident (intrakranijalno krvarenje, hemoragični moždani udar), uključujući u posljednjih 6 mjeseci. Neoplazme centralnog nervnog sistema i druge lokalizacije, praćene povećanim rizikom od krvarenja, aneurizme, intrakranijalnih operacija ili operacija kičme (anamneza za poslednja 2 meseca). Teška trauma (u posljednjih deset dana), traumatska masaža otvorenog srca (unutar posljednjih 10 dana). Akušerski porođaj (unutar posljednjih 10 dana). Operativne intervencije, punkcije krvnih žila s niskim tlakom: na primjer, subklavijske ili jugularne vene (unutar posljednjih 10 dana). Teška nekontrolisana hipertenzija. Bakterijski endokarditis, perikarditis. Peptički čir na želucu i dvanaestopalačnom crijevu (u roku od 3 mjeseca nakon pojave egzacerbacije), akutni pankreatitis.

Arterijske ili venske malformacije Zatajenje jetre, ciroza jetre, portalna hipertenzija, aktivni hepatitis. Proširene vene jednjaka. Pacijent je stariji od 70 godina.

Pažljivo:

Nedavne manje ozljede koje su rezultat biopsije, vaskularne punkcije, intramuskularne injekcije, masaže srca i drugih stanja koja su praćena rizikom od krvarenja.

Trudnoća i dojenje:

Trudnoća

Kategorija preporuka FDA nije određena. Kontrolisane studije na ljudima i životinjama nisu sprovedene. Smatra se da trombolitici koji se daju tokom prvih 18 nedelja trudnoće povećavaju rizik od preranog odvajanja placente jer se veže za matericu pretežno fibrinom.

Laktacija

Nema podataka o prodiranju u majčino mlijeko i komplikacijama. S obzirom na izlučivanje mnogih lijekova u mlijeko, trombolitičke lijekove treba davati s oprezom ženama u laktaciji.

Doziranje i primjena:

AMI U prvih 6 sati - intravenski bolus u dozi od 15 mg tokom 1-2 minute, nakon čega - primjena infuzije u dozi od 50 mg tijekom 30 minuta i 35 mg - 60 minuta prije postizanja maksimalne doze (100 mg ). Bolesnici tjelesne težine manje od 65 kg - intravenozno kao bolus u dozi od 15 mg i 0,75 mg/kg tijekom 30 minuta (maksimalno - 50 mg); zatim - infuzija od 0,5 mg / kg u trajanju od 60 minuta (maksimalno - 35 mg). 6-12 sati nakon pojave simptoma, lijek se primjenjuje intravenozno kao bolus u dozi od 10 mg i 50 mg infuzijom tokom prvog sata, a zatim u dozi od 10 mg tokom 30 minuta (do maksimalna doza od 100 mg tokom 3 sata). Za pacijente koji teže manje od 65 kg, lijek se propisuje u dozi koja ne prelazi 1,5 mg / kg.

Istovremeno se propisuje acetilsalicilna kiselina i. Acetilsalicilna kiselina - 160-300 mg / dan nakon pojave simptoma nekoliko mjeseci; - prije početka trombolitičke terapije, intravenozno kao bolus u dozi od 5 hiljada IU, zatim - 1 hiljada IU/h, uzimajući u obzir APTT (aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme), mjereno nekoliko puta (vrijednosti ​​trebalo bi biti 1,5-2,5 puta veći od originala).

Akutna masivna plućna embolija u kombinaciji sa nestabilnom hemodinamikom. Intravenski bolus u dozi od 10 mg tokom 1-2 minuta, zatim 90 mg intravenozno tokom 2 sata.Ukupna doza lijeka kod pacijenata tjelesne težine manje od 65 kg ne smije prelaziti 1,5 mg/kg. Ako PV premašuje početnu vrijednost za manje od 2 puta, tada se propisuje istovremeno (pod kontrolom APTT). Uz masivnu plućnu emboliju s nestabilnom hemodinamikom, lijek djeluje na isti način kao. Uvođenje alteplaze u ukupnoj dozi od 100 mg tokom 2 sata je uporedivo sa efektom reteplaze, streptokinaze u dozi od 1,5 miliona IU tokom 2 sata, urokinaze u dozi od 1 milion IU kao bolus 10 minuta (tada - 2 miliona IU intravenozno u trajanju od 2 h) i efikasnije od intravenske kapi natrijum heparina od 1750 IU/h. U potonjem slučaju, veća je vjerovatnoća da će se pojaviti nuspojave.

Akutni ishemijski moždani udar - tromboliza (uključujući alteplazu 0,9 mg/kg do 90 mg u 100 ml 0,9% natrijum hlorida. 10% doze kao bolus, ostatak - intravenozno 1 sat; alteplaza 0,85 mg/dan kg intravenski 60 minuta u prvih 90 minuta i 91-180 minuta nakon pojave bolesti); alteplaza (rekombinantni tkivni aktivator plazminogena) 1,1 mg/kg do 100 mg IV, 10% doze kao bolus, ostatak IV 1 sat;

Kada se primjenjuje lokalno u slučaju tromboze perifernih arterija donjih ekstremiteta, alteplaza je bolja od urokinaze. Kod tromboze cerebralne arterije, primjena 2 miliona U/dan alteplaze ima prednost u odnosu na intravensku primjenu od 60 hiljada U/dan urokinaze tokom 7 dana.

Upotreba kod dece

Efikasnost i sigurnost nisu proučavane.

Kod intravaskularne tromboze lijek se propisuje intravenozno mlazom (u sterilnoj vodi za injekcije dok se ne dobije otopina koncentracije od 1 mg/ml) ili kap po kap (u 0,9% otopini natrijevog klorida dok koncentracija ne dostigne 200 μg/ml) . Nemojte razrjeđivati ​​lijek s otopinom dekstroze. Za novorođenčad, lijek se daje 100-500 mcg / kg na sat tokom 3-6 sati; djeca od 1 mjeseca do 18 godina - 100-500 mcg / kg na sat tokom 3-6 sati (maksimalna dnevna doza - 100 mg). Prije propisivanja drugog kursa potrebno je ultrazvučno praćenje odgovora na prvi kurs.

U slučaju okluzije arteriovenskih šantova ili katetera kod djece od 1 mjeseca do 18 godina, lijek se ubrizgava direktno u kateter u dozi od najviše 2 ml (ovisno o vrsti katetera) otopine s koncentracijom 1 mg/ml; lizat se aspirira nakon 4 sata, nakon čega se kateter ispere sa 0,9% rastvorom natrijum hlorida. Nema podataka o upotrebi lijeka za trombozu arterija ili vena kod novorođenčadi.

Nuspojave:

Hematološki: krvarenje, fatalno intrakranijalno krvarenje (kada se koristi u akutnom periodu ishemijskog moždanog udara) Sa strane kardiovaskularnog sistema: bol u grudima, aritmije, hipotenzija koja nije povezana sa krvarenjem ili aritmijom. Preosjetljivost: alergijske reakcije Ostalo: groznica.

predoziranje:

Krvarenje. Liječenje: transfuzija svježe smrznute plazme, pune krvi, rastvori koji zamjenjuju plazmu, sintetički inhibitori fibrinolize.

interakcija:

Rizik od krvarenja se povećava uz istovremenu primjenu derivata kumarina, antiagregacijskih sredstava, heparina i drugih lijekova koji inhibiraju zgrušavanje krvi.

Specialne instrukcije:

Kod akutnog koronarnog sindroma preporučuje se tromboliza. Pomaže u smanjenju smrtnosti i isplativ je. Nije bilo razlike u preživljavanju nakon primjene tkivnog aktivatora plazminogena, streptokinaze i anizoliranog kompleksa plazminogen-streptokinaze; raspravlja se o trajanju i režimu trombolitičke terapije. Dodatni tretman antikoagulansima i antitrombocitnim agensima vjerovatno povećava efikasnost trombolitičke terapije.

Što se ranije izvrši tromboliza, to je efikasnija. Zato trombolizu treba uvesti u svakodnevnu praksu zdravstvenih ustanova. Treba uzeti u obzir rizik od potrebe za reanimacijom povezan sa trombolizom.

U ambulantnoj praksi urokinaza se smatra lijekom izbora (bolusna primjena tenekteplaze ili reteplaze), u stacionarnim stanjima - streptokinaza (osim kada su je pacijenti primili ranije). Noviji agensi (alteplaza) su skuplji i stoga ne mogu biti lijekovi prve linije. Približan trošak tretmana za jednog pacijenta koji koristi inhibitor tkivnog tromboplastin aktivatora je 2.900 dolara, sa streptokinazom - 400 dolara, izolovanim plazminogen-streptokinaznim kompleksom - 1.900 dolara i urokinazom - 775 dolara.

Rukovodioci i rukovodioci zdravstvene zaštite, kardiolozi bolnica treba da olakšaju provođenje trombolize od strane ljekara opšte prakse.

Praćenje koagulograma (APTT, fibrinogen, produkti razgradnje fibrina, trombinsko vrijeme), hematokrita, koncentracije hemoglobina, broja trombocita, elektrokardiograma (kod tromboze koronarne arterije); kod tromboze cerebralnih žila - kontrola mentalnog i neurološkog statusa (prije početka liječenja i periodično tijekom uzimanja lijeka). Jedan ili više kriterijuma se koriste za procenu lečenja tokom vremena; krvni pritisak, puls i disanje se redovno određuju.

Rizik od razvoja hemoragijskih komplikacija povećava se upotrebom doza lijeka većih od 100 mg.

Potencijalni rizik i korist od upotrebe alteplaze treba odmjeriti u odnosu na nedavne manje ozljede (biopsija, vaskularna punkcija, intramuskularne injekcije, masaža srca) i druga stanja povezana s rizikom od krvarenja tokom trudnoće, tokom prvih 10 dana postporođajnog perioda (povećana rizik od krvarenja) tokom dojenja, kod starijih osoba i dece.

Heparin natrij se poništava prije trombolitičke terapije; sljedeće uvođenje je moguće nakon trombolize i vraćanja trombinskog vremena i/ili APTT-a na dvostruko više od kontrolnih vrijednosti​​​ ili niže (obično nakon 2-4 sata).

Uputstvo Sadržaj teme "Eozinofili. Monociti. Trombociti. Hemostaza. Sistem zgrušavanja krvi. Antikoagulantni krvni sistem.":
1. Eozinofili. Funkcije eozinofila. Funkcije eozinofilnih leukocita. Eozinofilija.
2. Monociti. makrofagi. Funkcije monocita - makrofaga. Normalan broj monocita - makrofaga.
3. Regulacija granulocitopoeze i monocitopoeze. Faktori stimulacije kolonija granulocita. Keylons.
4. Trombociti. Struktura trombocita. Funkcije trombocita. Funkcije glikoproteina. Sol-gel zona hijaloplazme.
5. Trombocitopoeza. regulacija trombocitopoeze. Trombopoetin (trombocitopoetin). Megakariociti. trombocitopenija.
6. Hemostaza. Mehanizmi koagulacije krvi. Hemostaza trombocita. trombocitna reakcija. primarna hemostaza.
7. Sistem koagulacije krvi. Spoljašnji način aktivacije zgrušavanja krvi. faktori koagulacije.
8. Unutrašnji način aktivacije koagulacije krvi. Trombin.
9. Antikoagulantni krvni sistem. Antikoagulantni mehanizmi krvi. Antitrombin. Heparin. Proteini. Prostacyclin. Trombomodulin.
10. Tkivni aktivator plazminogena. Ektoenzimi. Uloga endotela u antikoagulansnom sistemu. tkivni faktor. Inhibitor aktivatora plazminogena. Willebrand faktor. Antikoagulansi.

Aktivator tkivnog plazminogena. Ektoenzimi. Uloga endotela u antikoagulansnom sistemu. tkivni faktor. Inhibitor aktivatora plazminogena. Willebrand faktor. Antikoagulansi.

Aktivator tkivnog plazminogena je protein koji se može reproducirati i stalno ga luči vaskularni endotel. Pruža direktnu lokalnu trombolitičku aktivnost protiv formiranog tromba. U krvi se održava konstantan nivo ovog faktora, što osigurava sistemsku trombolitičku aktivnost krvi.

Ektoenzimi- to su ADPaza, ATPaza i enzim koji konvertuje adenozin formiran od endotela. Endotelna ADPaza brzo cijepa proagregantni ADP koji luče aktivirani trombociti.

Vaskularne endotelne ćelije sintetizirati i protrombotički faktori: tkivni faktor, inhibitori aktivatora plazminogena, von Willebrand faktor.

Rice. 7.11. Uloga endotela krvnog suda u koagulaciji krvi. Ispod natpisa "Antikoagulansi" nalaze se endotelni faktori koji imaju antikoagulantni učinak zbog inhibicije agregacije trombocita, stvaranja fibrinskog ugruška i aktivacije fibrinolize. Pod nazivom "prokoagulansi" su endotelni faktori uključeni u formiranje trombocitnog tromba, fibrinskog ugruška i suzbijanje fibrinolize (

tkivni faktor je složen protein ćelijske membrane mase 46 kDa. Dio njegove molekule, kada je stanica oštećena, čvrsto se veže za faktor koagulacije Vila, održavajući svoju funkciju akceleratora u vanjskom putu koagulacije krvi.

Inhibitor aktivatora plazminogena-I je protein od 52 kDa koji se nalazi u cirkulirajućoj krvi. Blisko se vezujući za aktivator plazminogena, on ga inaktivira i tako učestvuje u regulaciji fibrinolize u tijelu.

Willebrand faktor je multidimenzionalni molekul težine 1-20 miliona Da, sintetiziran u endotelu i pohranjen u endotelnim sekretornim granulama. Oslobađajući se od njih, obavlja funkciju adhezivne molekule za trombocite, podržava njihovu agregaciju. Povećano oslobađanje von Willebrandovog faktora iz endotela inducira se trombin.

Zgrušavanje krvi u sudu glatka površina endotela takođe sprečava uključivanje unutrašnjeg puta za stvaranje aktivne protrombinaze. Monomolekularni proteinski sloj adsorbiran na površini endotela odbija faktore koagulacije i trombocite, a također sprječava zgrušavanje krvi.

Antikoagulansi koristi u kliničkoj praksi. Na primjer, za smanjenje povećanog zgrušavanja krvi kod pacijenata s koronarnom bolešću, za održavanje krvi u tekućem stanju pri korištenju srčano-plućnog aparata, uzrokujući traumu krvnih stanica, uslijed čega se aktivira unutarnji put zgrušavanja krvi.