A PCR célja és a módszer elve. Polimeráz láncreakció (PCR) és alkalmazása

SEI HPE "Krasznojarszk Állami Orvosi Akadémia

Yaszenetsky Szövetségi Egészségügyi és Szociális Fejlesztési Ügynökségről nevezték el »

Orvosi Genetikai és Klinikai Neurofiziológiai Osztály, IPO

A MÓDSZER FŐ ALAPELVEI

POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ

Módszertani kézikönyv 3-4 szakos hallgatók számára

általános orvosi szakokon (060101) ill

Krasznojarszk - 2007

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. A polimeráz láncreakciós módszer alapelvei. Módszertani kézikönyv általános orvosi (060101) és gyermekgyógyászati ​​(060103) szakon 3-4 szakos hallgatók tanórán kívüli munkájához. - Krasznojarszk: GOU VPO KrasGMA kiadó, 2007. - 42p.

A módszertani kézikönyv teljes mértékben megfelel az állami szabvány (2000) követelményeinek, és tükrözi az örökletes emberi betegségek diagnosztizálásának modern módszerének fő szempontjait - a polimeráz láncreakciós módszert, az oktatási anyagokat az oktatási technológiákhoz igazítják, figyelembe véve a sajátosságokat. képzés 3-4 szakon az orvosi és gyermekorvosi karokon.

Ellenőrzők:Állami Szakmai Felsőoktatási Intézmény Orvosi Genetikai Tanszékének vezetője

"Szövetségi Egészségügyi és Szociális Fejlesztési Ügynökség Novoszibirszk Állami Orvostudományi Egyeteme", az orvostudományok doktora, professzor;

DNS replikáció

Ennek a módszernek a vizsgálati tárgya a dezoxiribonukleinsav (DNS). A DNS a genetikai információ univerzális hordozója a Földön létező összes élőlényben (az RNS-tartalmú mikroorganizmusok kivételével). A DNS egy spirálba csavart kettős szál. Mindegyik szál sorba kapcsolt nukleotidokból áll. A DNS-szálak ellenkező irányúak: az egyik szál 5'-vége megfelel a második szál 3'-végének. A DNS egyedülálló tulajdonsága, hogy képes önmagát megkettőzni. Ezt a folyamatot ún replikáció. A DNS-molekula replikációja az interfázis szintetikus periódusában történik. A "szülő" molekula mind a két lánca sablonként szolgál a "lánya" számára. A replikáció után az újonnan szintetizált DNS-molekula egy „anyai” szálat tartalmaz, a második pedig egy „lány”, újonnan szintetizált (félig konzervatív módszer). Egy új DNS-molekula templátszintéziséhez szükséges, hogy a régi molekulát despiralizálják és megnyújtsák. A replikáció a DNS-molekula több pontján kezdődik. A DNS-molekula azon szakaszát, amely az egyik replikáció kezdetétől egy másik replikáció kezdetéig terjed, ún replikon.

A replikáció indítása aktiválva van alapozók(magok), 100-200 bázispárból áll. A DNS-helikáz enzim feltekercselődik és két szálra választja szét a szülő DNS-hélixet, amelyeken a komplementaritás elve szerint a DNS-polimeráz enzim közreműködésével „leány” DNS-szálak állnak össze. Ahhoz, hogy az enzim elkezdhesse munkáját, kiindulási blokk jelenléte szükséges - egy kis kezdeti kétszálú fragmentum. A kiindulási blokk akkor jön létre, amikor a primer kölcsönhatásba lép a kiindulási DNS megfelelő szálának komplementer régiójával. Minden replikonban a DNS-polimeráz csak egy irányba tud mozogni az "anya" szál mentén (5`=>3`).

A vezető szálon, ahogy a replikon letekerődik, egy „leány” szál fokozatosan növekszik folyamatosan. A lemaradó szálon a leányszál is szintetizál (5`=>3`), de külön töredékekben, ahogy a replikon letekerődik.

Így a "leány" szálak komplementer nukleotidjainak kapcsolódása ellentétes irányú (antiparallel). A replikáció az összes replikonban egyidejűleg történik. A különböző replikonokban szintetizált "leány" szálak töredékeit és részeit ligáz enzim ligáz egyetlen szálba ligálja. A replikációt a félig konzerváltság, az anti-parallelizmus és a megszakadás jellemzi. Egy sejt teljes genomja egy mitotikus ciklusnak megfelelő időtartamonként egyszer replikálódik. A replikációs folyamat eredményeként egy DNS-molekulából két DNS-molekula keletkezik, amelyekben az egyik szál a szülő-DNS-molekulából, a második, a leány-molekula pedig újonnan szintetizálódik (1. ábra).

Rizs. egy. A DNS-molekula replikációjának diagramja.

Így a DNS-replikációs ciklus magában foglalja három fő szakasz:

1. a DNS hélix feltekercselése és a szálak divergenciája (denaturáció);

2. alapozók rögzítése;

3. a gyermekszál láncának befejezése.

A PCR módszer elve

A DNS replikációja képezte a PCR alapját. A PCR során a fent felsorolt ​​folyamatokat kémcsőben, ciklikus üzemmódban hajtják végre. A reakció egyik szakaszából a másikba való átmenetet az inkubációs keverék hőmérsékletének változtatásával érjük el. Amikor az oldatot 93-95 °C-ra melegítjük, a DNS denaturálódik. A következő lépéshez - a primerek hozzáadásához vagy "illesztéséhez" - az inkubációs keveréket 50-65 °C-ra hűtjük. Ezután a keveréket 70-72 °C-ra melegítjük - ez a taq-DNS polimeráz optimális működése - ebben a szakaszban egy új DNS-szál elkészül. Ezután a ciklus újra megismétlődik. Más szavakkal A PCR módszer a másolatok számának többszörös növelése (erősítés) a DNS egy specifikus szakasza, amelyet a DNS-polimeráz enzim katalizál.

A leány-DNS-szálak kiterjesztésének egyszerre kell megtörténnie az anyai DNS mindkét szálán, így a második szál replikációjához is saját primerre van szükség. Így két láncindítót viszünk be a reakcióelegybe: az egyiket a "+"-lánchoz, a másodikat a "-"-lánchoz. Miután a DNS-molekula ellentétes szálaihoz csatlakoztak, a primerek a DNS-molekula azon részére korlátozódnak, amely a későbbiekben ismételten megkétszereződik vagy amplifikálódik. Egy ilyen fragmentum, amelyet amplikonnak neveznek, általában több száz nukleotid hosszúságú.

PCR lépések

Minden egyes amplifikációs ciklus 3 szakaszból áll, amelyek különböző hőmérsékleti feltételek mellett fordulnak elő (2. ábra).

· 1. szakasz: DNS denaturáció . 93-95°-on folyik 30-40 másodpercig.

· 2. szakasz: primer lágyítás . A primer kapcsolódása komplementeren megy végbe az ellentétes DNS-szálak megfelelő szekvenciáival egy adott régió határain. Minden alapozópárnak megvan a maga lágyítási hőmérséklete, melynek értéke 50-65°C között van. Izzítási idő 20-60 mp.

· 3. szakasz: A DNS-láncok komplementer meghosszabbítása a lánc 5"-es végétől a 3"-os végéig, ellentétes irányban történik, a primer kapcsolódási helyeitől kezdve. Az új DNS-szálak szintézisének anyaga az oldathoz adott dezoxiribonukleozid-trifoszfátok. A szintézis folyamatát a taq-polimeráz enzim katalizálja, és 70-72°C hőmérsékleten megy végbe. Szintézis idő - 20-40 mp.

Az első amplifikációs ciklusban képződött új DNS-szálak templátként szolgálnak a második amplifikációs ciklushoz, amelyben egy specifikus amplikon DNS-fragmens képződik (3. ábra). A következő amplifikációs ciklusokban az amplikonok sablonként szolgálnak az új láncok szintéziséhez.

Így az amplikonok a 2" képlet szerint halmozódnak fel az oldatban, ahol n az amplifikációs ciklusok száma. Ezért, még ha kezdetben csak egy kétszálú DNS-molekula volt is a kiindulási oldatban, körülbelül 108 amplikon molekula halmozódik fel az oldatban 30-40 ciklus Ez a mennyiség elegendő a fragmentum megbízható vizuális detektálásához agaróz gélelektroforézissel.

Az erősítési folyamat egy speciális programozható termosztátban történik ( kerékpáros), amely egy adott program szerint automatikusan változtatja a hőmérsékletet az erősítési ciklusok számának megfelelően.

Az erősítéshez a következő összetevőkre van szükség:

· DNS-sablon(DNS vagy annak a kívánt specifikus fragmenst tartalmazó része);

· Alapozók(szintetikus oligonukleotidok (20-30 nukleotidpár), amelyek komplementerek a DNS-szekvenciákkal a meghatározandó specifikus fragmentum határain). Az amplifikáció specifitásában nagy szerepe van a specifikus fragmens megválasztásának és a primerek kiválasztásának, ami befolyásolja az analízis minőségét.

· Dezoxinukleotid-trifoszfátok (dNTP-k) keveréke(négy dNTP keveréke, amelyek új, komplementer DNS-szálak szintézisének anyagai 200-500 mikronos egyenértékű koncentrációban)

· EnzimTaq-polimeráz(hőstabil DNS polimeráz, a primer láncok meghosszabbítását katalizálja nukleotid bázisok szekvenciális hozzáadásával a szintetizált DNS növekvő láncához, 2-3 mm).

· pufferelési megoldás(az enzimaktivitás fenntartásához szükséges Mg2+ ionokat tartalmazó reakcióközeg, PH 6,8-7,8).

Az RNS-vírusok genomjának specifikus régióinak meghatározásához először egy DNS-másolatot nyernek egy RNS-templátból egy reverz transzkripciós (RT) reakció segítségével, amelyet a reverz transzkriptáz (reverz transzkriptáz) enzim katalizál.

Rizs. 2. Erősítés (1. ciklus).

Rizs. 3. Erősítés (2. ciklus).

A PCR fő alkalmazásai

klinikai gyógyszer:

o fertőzések diagnosztizálása,

o mutációk kimutatása, beleértve az örökletes betegségek diagnosztizálását,

o genotipizálás, beleértve a HLA genotipizálást,

o sejtes technológiák

ökológia (a környezeti tárgyak és élelmiszerek állapotának és minőségének nyomon követésének módja)

a transzgenikus szervezetek (GMO-k) meghatározása

Személyazonosítás, apaság, kriminalisztika

általános és speciális biológia,

Alapelvek

diagnosztikai laboratóriumok szervezése

A PCR-laboratóriumban végzett munka az egészségügyi ellátórendszer egészségügyi és járványügyi intézményeinek laboratóriumaiban (osztályaiban, osztályaiban) végzett munka során a "tervezési, biztonsági, ipari higiéniai, járványellenes rendszerre és személyi higiéniára vonatkozó szabályokkal összhangban történik.

DNS-minták szennyeződése

A PCR diagnosztika elvégzése a módszer nagy érzékenysége által okozott problémával - a lehetőséggel szennyeződés. Ha nyomokban pozitív DNS kerül a reakciócsőbe (specifikus DNS-amplifikációs termékek - amplikonok; pozitív kontrollként használt DNS-standard; klinikai minta pozitív DNS-e), a PCR során egy specifikus DNS-fragmens amplifikációjához vezet, és ennek eredményeként hamis pozitív eredmények megjelenése.

Munka közben találkozhattok kétféle szennyeződés:

1. keresztszennyeződés mintáról mintára (a klinikai minták feldolgozása során vagy a reakcióelegy kiásásakor), ami szórványos téves pozitív eredmények megjelenéséhez vezet;

2. amplifikációs termék szennyeződés(amplikonok), aminek a legnagyobb jelentősége van, mivel a PCR folyamat során az amplikonok hatalmas mennyiségben halmozódnak fel és ideális termékei a reamplifikációnak.

Az üvegedények, automata pipetták és laboratóriumi berendezések, a laboratóriumi asztalok felületének vagy akár a laboratóriumi dolgozók bőrfelületének nyomokban előforduló amplikonokkal való szennyeződése szisztematikus téves pozitív eredményekhez vezet. A szennyeződés forrásának meghatározása nagyon nehéz lehet, és jelentős idő- és pénzbefektetést igényel. A diagnosztikai PCR-módszert alkalmazó laboratóriumok eddigi munkájában felhalmozott tapasztalatok lehetővé teszik, hogy megfogalmazzuk az ilyen laboratóriumok megszervezésére és magukra az elemzések lefolytatására vonatkozó alapvető követelményeket. Ezen követelmények betartása kizárja a fertőzés lehetőségét és a hamis pozitív eredmények elérését.

A PCR elemzés szakaszai

Földrajzilag elkülönítve, külön helyiségekben elhelyezve (4.5. ábra):

· PCR előtti szoba, ahol klinikai mintákat dolgoznak fel, izolálják a DNS-t, elkészítik a reakcióelegyet a PCR-hez, és felállítják a PCR-t (ha adottak a feltételek, az utolsó két lépést is javasolt egy további külön helyiségben elvégezni). Ezekben a helyiségekben tilos minden más jellegű munkát végezni a vizsgált szerekkel, amelyek PCR diagnosztikáját ebben a laboratóriumban végzik.

· PCR utáni szoba, ahol az amplifikációs termékek kimutatását végzik. Ebben a helyiségben más észlelési módszerek is használhatók. Kívánatos, hogy az amplifikációs termékek kimutatására szolgáló helyiséget a lehető legtávolabb helyezzük el a PCR előtti helyiségektől.

A munkatermek ultraibolya lámpákkal vannak felszerelve, amelyek maximális sugárzása 260 nm (DB-60 típus), 2,5 W/1 m3 sebességgel. A lámpák úgy helyezkednek el, hogy a munkaasztalok, berendezések és anyagok felületei, amelyekkel a kezelő a PCR elemzés során érintkezésbe kerül, közvetlen sugárzásnak vannak kitéve. A besugárzást a munka megkezdése előtt 1 órán belül és a munka befejezését követő 1 órán belül kell elvégezni.

A laboratóriumi orvosok speciális laboratóriumi ruhában dolgoznak, amelyet egyik helyiségből a másikba költöztetnek, és eldobható kesztyűben. A különböző helyiségekből származó ruhák feldolgozása külön történik. A különböző alkalmazottak a PCR elemzés különböző szakaszaiban dolgoznak.

A munkához külön adagolókészleteket, műanyag- és üvegárukat, laboratóriumi felszereléseket, köpenyeket és kesztyűket használnak, amelyeket az elemzés különböző szakaszaira terveztek, és nem hordozhatók egyik helyiségből a másikba. Az egyes helyiségekben található felszerelések, anyagok és készletek ennek megfelelően vannak felcímkézve.

A munka minden szakaszában csak eldobható fogyóeszközöket használnak: automata pipetták hegyei, kémcsövek, kesztyűk stb. A mintáról a mintára való váltáskor feltétlenül cserélje ki a hegyeket. Aeroszolos zárószűrővel ellátott hegyeket kell használni, hogy megakadályozzuk az oldat mikrocseppek bejutását a pipettába. A használt kémcsöveket és hegyeket speciális edényekbe vagy fertőtlenítő oldatot tartalmazó tartályokba kell dobni. A klinikai mintákat a reagensektől elkülönítve tárolják.

A munkahelyi feldolgozáshoz, tisztításhoz minden helyiségben vatta-géz törlőkendők (szalvéták), csipeszek, fertőtlenítő és inaktiváló oldatok találhatók.

A PCR diagnosztikai laboratóriumban az ebben a laboratóriumban diagnosztizált kórokozók DNS-szekvenciáját vagy génfragmenseit tartalmazó rekombináns plazmidok előállításával (klónozásával) és izolálásával kapcsolatos munka kizárt.

Klinikai anyagok gyűjteménye

A PCR-hez vizsgált anyag lehet hámsejtek, vér, plazma, szérum, pleurális és agy-gerincvelői folyadék, vizelet, köpet, nyálka és egyéb biológiai váladék, biopsziás minták.

Az anyagmintavétel a megfelelő profilú kezelőhelyiség körülményei között történik. A mintavételt követően a mintákat a lehető leghamarabb a PCR diagnosztikai laboratóriumba kell vinni.

A mintavételt steril, lehetőleg eldobható eszközökkel, csak eldobható steril műanyag csövekben vagy üvegcsövekben kell végezni, egy órán át krómkeverékkel előkezelve, desztillált vízzel alaposan kimosva és kemencében 150 °C-on kalcinálva. 1 órán keresztül.

Érzékelési zóna (egy másik emelet vagy másik épület).

Rizs. négy. PCR laboratóriumi készülék elektroforézissel történő kimutatással.

Érzékelési zóna (különböző emelet vagy épület)

Rizs. 5. PCR laboratóriumi készülék fluoreszcens detektálással (kvantitatív elemzés).

Rizs. 6. DNS izolációs szoba. Az ábrán egy asztali doboz látható baktericid lámpával.

Rizs. 7. erősítő szoba.

Rizs. nyolc. Detektáló szoba.

Rizs. 9. Vérminták örökletes betegségek DNS-diagnosztikájához.

A minták tárolása és szállítása

Az örökletes betegségek diagnosztizálásához a vérmintákat speciális papírformákon vagy epindorfokban (műanyag kémcsövekben) tárolják hosszú ideig fagyasztva (9. ábra).

A fertőző betegségek diagnosztizálásához a mintákat legfeljebb 2 órán át szobahőmérsékleten tartják. Ha hosszabb tárolásra van szükség, a minták 2-8°C-os hűtőszekrénybe helyezhetők, legfeljebb 24 órán át. Hosszabb tárolási idő (akár 2 hét) elfogadható, ha fagyasztóban lefagyasztjuk, mínusz 20°C-on. A minták ismételt fagyasztása-felolvasztása nem megengedett.

Ha a PCR diagnosztikai laboratórium és a mintavételi eljárási helyiség földrajzilag el van választva, akkor a mintákat a minták tárolására és a fertőző anyagok szállítására vonatkozó szabályok betartásával termoszokban vagy termikus tartályokban kell szállítani.

DNS kinyerése a mintákból

Széles körben elterjedt a szilárd fázisú szorpció módszere, amely guanidin oldatot tartalmazó lizálószer hozzáadását, a DNS szorbensre történő szorpcióját, ismételt mosását és a DNS pufferoldattal történő reszorpcióját foglalja magában. Szérum, plazma vagy teljes vér feldolgozása esetén általában a fenolos extrakciós módszert alkalmazzák. A módszer magában foglalja a fehérjementesítést fenol/kloroformmal, majd a DNS (vagy RNS) etanollal vagy izopropanollal történő kicsapását. A feldolgozást 1,5 ml térfogatú Eppendor P típusú mikrocentrifuga kémcsövekben végezzük. A feldolgozási idő 1,5-2 óra (10. ábra).

Rizs. tíz. A DNS izolálása.

PCR lefolytatása

A feldolgozott klinikai mintából egy bizonyos mennyiségű mintát egy speciális, 0,2 vagy 0,5 ml térfogatú Eppendorf típusú mikrocentrifuga csőbe visszük át, majd vízből, PCR pufferből, dNTP oldatból, primer oldatból és oldatból álló amplifikációs keveréket adunk hozzá. ugyanabba a csőbe. Taq-polimeráz (utoljára adjuk a keverékhez. A reakcióelegy térfogata jellemzően 25 µl. Ezután minden csőbe egy csepp ásványolajat csepegtetünk, hogy megakadályozzuk a reakcióelegy elpárolgását az amplifikáció során. A csöveket egy programozható termosztátba (erősítőbe) helyezzük át, ahol az erősítés egy adott program szerint automatikus üzemmódban történik (11. ábra).

Rizs. tizenegy. Erősítő" Thermocycler ».

A reakcióidő az adott programtól függően 2-3 óra. A kísérleti mintákkal párhuzamosan kontrollminták kerülnek elhelyezésre: a pozitív kontroll a reakció összes komponensét tartalmazza, de a klinikai minta anyaga helyett a vizsgált gén kontroll DNS-preparátumát vezetik be. A negatív kontroll a reakció összes komponensét tartalmazza, de a klinikai anyag vagy a DNS-készítmény helyett megfelelő mennyiségű ionmentesített vizet vagy olyan kivonatot adunk hozzá, amely nem tartalmazza a vizsgált DNS-t. Negatív kontrollra van szükség annak ellenőrzésére, hogy a reakció komponensei nem tartalmaznak-e DNS-t szennyeződés miatt, és kizárják a hamis pozitív eredményeket.

Az eredmények nyilvántartása

Az amplifikált specifikus DNS-fragmenst agarózgél-elektroforézissel detektáljuk etidium-bromid jelenlétében. Az etidium-bromid DNS-fragmensekkel stabil intersticiális vegyületet képez, amely világító sávként jelenik meg, amikor a gélt 290-330 nm hullámhosszú UV-sugárzással sugározzák be. A kapott PCR-amplikonok méretétől függően 1,5-2,5% agarózt tartalmazó gélt használunk. Agaróz gél készítéséhez agaróz, puffer és víz keverékét mikrohullámú sütőben vagy vízfürdőben megolvasztják, és etidium-bromid oldatot adnak hozzá. Az 50-60°C-ra hűtött keveréket 4-6 mm vastag rétegű formába öntik, és speciális fésűk segítségével zsebeket készítenek a gélben a minta felviteléhez. A fésűket úgy állítjuk be, hogy a lyukak alja és a gél alapja között 0,5-1 mm-es agarózréteg maradjon. Miután a gél megszilárdult, 5-15 µl mennyiségben amplifikátumot viszünk fel a zsebekre. Javasoljuk, hogy a DNS-fragmentumhossz-markerek keverékének elektroforézisét a kontroll és a kísérleti mintákkal párhuzamosan végezzük. Egy ilyen keverék jellemzően tíz, 100, 200, 300 stb. hosszúságú bázispár hosszúságú DNS-fragmenst tartalmaz.

Egy ilyen minta beállítása lehetővé teszi az amplikonok hosszának ellenőrzését a kontroll és a kísérleti mintákban. A gélt a felvitt mintával egy pufferrel töltött elektroforézis kamrába visszük, a kamrát áramforráshoz csatlakoztatjuk, és az amplifikációs termékek elektroforetikus szétválasztását 30-45 percig végezzük 10-15 elektromos térerő mellett. V/cm. Ebben az esetben a reakcióelegy részét képező festék elülső részének legalább 3 cm-t kell áthaladnia.

Az elektroforézis befejezése után a gélt átvisszük a transzilluminátor üvegére, és ultraibolya fényben nézzük. A dokumentációhoz a gélt Mikrat 300 filmre fényképezzük, vagy számítógéphez csatlakoztatott videorendszerrel rögzítjük.

Először a kontroll mintákat értékelik ki. A pozitív kontrollnak megfelelő elektroforetikus sávban egy narancssárga világító sávnak kell jelen lennie. Elektroforetikus mobilitása meg kell, hogy feleljen az amplikon utasításban megadott hosszának.

A negatív kontrollnak megfelelő elektroforetikus sávban ilyen sávnak hiányoznia kell. Egy ilyen sáv jelenléte a negatív kontrollban szennyeződést jelez – a használt reagensek szennyeződését a vizsgált DNS-sel vagy amplikonnal. A vizsgálati mintákat úgy értékelik, hogy a megfelelő sávban egy olyan sáv található, amely ugyanazon a szinten helyezkedik el, mint a pozitív kontrollmintában lévő sáv. A sáv fényének intenzitása megfelel a mintában lévő vizsgált DNS mennyiségének, ami lehetővé teszi a PCR félkvantitatív értékelését. Általában a pozitív eredményeket négyfokú skálán értékelik. Ha a kísérleti mintában a sáv fénye nagyon gyenge, akkor az ilyen mintát át kell rendezni (12. ábra).

Rizs. 12. Elektroforézis agaróz gélben.

PCR alkalmazások számárapontmutációk és génpolimorfizmusok diagnosztikája

A PCR egyik vezető alkalmazási területe a gyakorlati egészségügyben a pontmutációk és génpolimorfizmusok diagnosztikája. . A DNS-diagnosztikának vannak közvetlen és közvetett módszerei. Azokban a helyzetekben, ahol ismert egy gén, amelynek károsodása örökletes betegség kialakulásához vezet, ez a károsodás molekuláris genetikai módszerekkel kimutatható. Az ilyen módszereket közvetlennek nevezzük. Közvetlen módszerekkel detektálják a DNS elsődleges nukleotidszekvenciájának zavarait (mutációkat és típusaikat). A direkt módszereket a közel 100%-os pontosság jellemzi.

A gyakorlatban azonban ezek a módszerek bizonyos feltételek mellett alkalmazhatók.:

az örökletes betegség kialakulásáért felelős gén ismert citogenetikai lokalizációjával;

A betegség génjét klónozni kell, és nukleotidszekvenciáját ismerni kell.

A közvetlen DNS-diagnosztika célja a mutáns allélek azonosítása.

Így azokban a helyzetekben, ahol ismert, hogy milyen DNS-károsodás vezet örökletes betegséghez, közvetlenül a károsodást tartalmazó DNS-fragmenst vizsgálják, azaz a DNS-diagnosztika direkt módszerét alkalmazzák.

A mai napig azonban számos betegség génje nem került feltérképezésre, exon-intron szerveződésük ismeretlen, számos örökletes betegségre jellemző a kifejezett genetikai heterogenitás, ami nem teszi lehetővé a direkt DNS-diagnosztikai módszerek teljes körű alkalmazását. Ezért azokban az esetekben, amikor a károsodás lokalizációja nem ismert, más megközelítést alkalmaznak a génbetegségért felelős gén környezetének vizsgálatához, családanalízissel kombinálva, vagyis a molekuláris genetikai diagnózis közvetett módszereivel. örökletes betegségeket alkalmaznak.

A pontmutációk, kis deléciók kimutatására többféle módszer használható, de ezek mindegyike a PCR módszer alkalmazásán alapul. Ez a reakció lehetővé teszi a DNS nukleotidszekvenciájának ismételt megsokszorozását, majd mutációk keresését. A mutációkat hordozó DNS-fragmensek keresésének módszerei a mutáns és normál DNS-nukleotidszekvenciák összehasonlító elemzésén alapulnak.

PCR termékek elemzése

a közvetlen DNS-diagnosztika folyamatában

Ez magában foglalja a gén amplifikált régiójának sajátos jellemzőinek tanulmányozását. Így a trinukleotid ismétlődések expanziója által okozott betegségekben az amplifikációs termékek hosszukban (különböző számú hármast tükröznek a vizsgált génrégióban) és ennek következtében a gélben való mozgási sebességükben különböznek. Ennek köszönhetően a normál és a mutáns allélok egyértelmű elektroforetikus szétválasztása és a kórosan megnyúlt fragmentum pontos meghatározása, azaz a betegség DNS-diagnosztikája érhető el (13. ábra).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Rizs. tizennégy. A törlés diagnózisa GAG a génben DYT 1 dopa-független dystóniában szenvedő betegeknél (poliakrilamid gélelektroforézis). 2,3,6 pályák - beteg; sávok 1,4,5 - ellenőrzés. A vékony nyíl a normál allélt jelöli, a vastag nyíl a mutáns rövidebb allélt (három nukleotid törlése).

Ha a vizsgált DNS-régió teljes egészében beletartozik egy kiterjesztett delécióba, akkor ebből a deletált allélból származó DNS PCR-amplifikációját nem hajtják végre a primer hibridizációs helyek hiánya miatt. Ebben az esetben a homozigóta deléciót a reakció PCR-termékének teljes hiánya alapján diagnosztizálják (a DNS-szintézis a gén mindkét kópiájából lehetetlen). Heterozigóta delécióval lehetséges a normál (biztonságos) allélból szintetizált PCR-termék kimutatása, azonban egy ilyen mutáció megbízható diagnosztizálásához kifinomultabb DNS-vizualizációs módszereket kell alkalmazni, amelyek lehetővé teszik a végső dózis becslését. PCR termék.

Pontmutációk (leggyakrabban nukleotidszubsztitúciók) kimutatására bizonyos helyeken a PCR-módszert más molekuláris genetikai elemzési módszerekkel kombinálva alkalmazzák. Ha a javasolt pontmutáció helye és természete pontosan ismert, akkor egy ilyen mutáció célirányos kimutatásához restrikciós endonukleázok (korlátozza) speciális sejtenzimek, amelyeket különféle baktériumtörzsekből izolálnak.

Ezek az enzimek négy-tíz nukleotid hosszúságú specifikus nukleotidszekvenciákat ismernek fel. Ezután ezeknek a szekvenciáknak a restrikcióját (lat. (vágás)) hajtják végre egy kettős szálú DNS molekula részeként. Minden restrikciós enzim felismer és rögzített helyen vág egy szigorúan meghatározott, specifikus nukleotid szekvenciát - restrikciós hely (felismerési hely).

Azokban az esetekben, amikor egy pontmutáció megváltoztatja egy adott restrikciós enzim természetes felismerési helyét, az enzim nem lesz képes hasítani a mutáns PCR-amplifikált fragmenst. Egyes esetekben a mutáció egy adott restrikciós enzim új felismerési helyének megjelenéséhez vezet, amely a normában hiányzik.

Mindkét esetben a kiválasztott restrikciós enzimmel kezelt mutáns és normál PCR-termékek különböző hosszúságú restrikciós fragmentumokat adnak, amelyek elektroforézissel könnyen kimutathatók (15. ábra).

Így, ha szükség van egy adott pontmutáció gyors kimutatására, a feladat a megfelelő restrikciós enzim megkeresésére csökken, amelynek felismerési helye a megzavart nukleotidszekvencia helyén található. A PCR-termékek kezelése ezzel a restrikciós enzimmel lehetővé teszi a normál és mutáns allélek könnyű megkülönböztetését. A restrikciós elemzés nagymértékben leegyszerűsíti az ismert pontmutációk kimutatását, és jelenleg széles körben használják örökletes betegségek közvetlen DNS-diagnosztikájára.

végső szakasz mutációk molekuláris genetikai elemzése a vizsgált DNS-fragmens nukleotidszekvenciájának meghatározása (szekvenálás), amelyet összehasonlítanak a normával és felállítják a végső genetikai diagnózist. A molekuláris genetika fejlődésének köszönhetően mára több mint 400 örökletes betegségre fejlesztettek ki DNS-diagnosztikai módszereket.

Rizs. tizenöt. Pontmutáció kimutatása restrikciós elemzéssel: A - restrikciós helyet tartalmazó gén amplifikálható régiójaAGCTrestrikciós endonukleázhozAlu én. MutációG→ Amegváltoztatja ezt a nukleotidszekvenciát, ami restrikciós enzimet eredményezAluizárolt; B - restrikciós termékek elektroferogramja: 1. sáv - homozigóta a normál allélra; 2. sáv, a mutáció homozigótasága; 3. sáv - heterozigóta állapot (normál allél + mutáció).

A betegek, családtagjaik vagy feltételezett kóros mutáció heterozigóta hordozói mutáns allélek közvetlen vizsgálatán alapuló örökletes betegségek diagnosztizálása alkalmas pre-tünet- és prenatális diagnosztikára, amely a magzati fejlődés legkorábbi szakaszában, a magzati fejlődés megjelenése előtt alkalmazható. bármilyen klinikai vagy biokémiai tünet, betegség.

A mutációdetektálás módszerétől függetlenül az egyes mutációk pontos molekuláris jellemzése csak közvetlen szekvenálással érhető el. Ennek a folyamatnak az automatizálására az elmúlt években széles körben alkalmaztak speciális eszközöket - szekvenátorokat, amelyek lehetővé teszik a DNS-információk leolvasási folyamatának jelentős felgyorsítását.

A molekuláris biológiai kutatások klinikai diagnosztikai laboratóriumokban való szélesebb körű alkalmazásának utat nyitja meg az analitikai folyamat felgyorsítása az összes eljárás egy kontinuumban, mintaátvitel nélkül történő végrehajtásával, megteremtve a feltételeket a szennyeződés megelőzésére számos analit párhuzamos vizsgálata során és objektív regisztrációval. az egyes ciklusok eredményeiről.

A PCR módszer főbb módosításai

Ismert génmutációk gyors szkennelésére és keresésére használják.

Multiplex (multiprimer) PCR

Ez a módszer a vizsgált gén több exonjának egyidejű amplifikációján alapul egy reakcióban. Ez lehetővé teszi a leggyakoribb mutációk gazdaságos gyors szűrését. Például progresszív Duchenne/Becker izomdisztrófiában szenvedő betegeknél a disztrofin gén delécióinak hordozásának gyors diagnosztizálására ennek a génnek a leggyakrabban mutáló exonjainak egyidejű amplifikációját végezzük. Mivel ezek a betegségek X-hez kötött recesszív típusban öröklődnek, és fiúknál az egyetlen X-kromoszóma károsodásával járnak, kiterjesztett deléció esetén a reakciótermékek elektroforézise feltárja egy vagy több DNS-fragmens (exon) hiányát. ), amely a diagnózis molekuláris megerősítéseként szolgálhat. Ezen túlmenően, a PCR-amplifikációhoz specifikus génrégiók kiválasztásával a deléció és a géntöréspontok teljes hosszának (az exonig) meglehetősen pontos értékelése lehetséges.

Több multiplex reakció együttes alkalmazása lehetővé teszi a progresszív Duchenne/Becker izomdisztrófiában szenvedő betegeknél előforduló összes deléció akár 98%-ának diagnosztizálását. Ez a dystrophin gén összes ismert mutációjának körülbelül 60%-a, és ez a szűrési módszer nagyon magas hatékonyságát jelzi a dystrophinopathia DNS-diagnosztikájában (16. ábra).

Rizs. 16. Duchenne-izomdystrophia közvetlen DNS-diagnosztikája multiplex PCR-rel (agaróz gélelektroforézis). A vizsgált egyedek mindegyikében a disztrofin gén négy exonja amplifikálódott egyidejűleg (17., 19., 44. és 45. exon; a nyilak a megfelelő amplifikációs termékeket jelölik). 1. sáv - kontroll, 2-5. sáv - Duchenne-izomdystrophiában szenvedő betegek a disztrofin gén különböző delécióival (2. és 5. sáv - 45. exon deléciója, 3. sáv - 44. exon deléciója, 4. sáv - 17. és 19. exon deléciója ).

Allélspecifikus amplifikáció

A módszer két független primerpár használatán alapul a gén egy meghatározott régiójához: mindkét párban egy primer gyakori, a második primer pedig mindegyik párban eltérő szerkezettel rendelkezik, és komplementer akár normál, akár mutáns DNS-szekvenciákkal. . Az oldatban történő ilyen reakció eredményeként kétféle PCR-termék egyidejűleg szintetizálható - normál és mutáns. Ezenkívül az alkalmazott primerek kialakítása lehetővé teszi a normál és a mutáns amplifikációs termékek világos megkülönböztetését molekulaméretük alapján. Ez a módszer nagyon világos, és lehetővé teszi a mutáns allél homo- és heterozigóta hordozásának ellenőrzését.

Az amplifikált DNS helyspecifikus módosításának módszere

A módszer a PCR-ben az úgynevezett mismatch primer (a templáttal nem teljesen komplementer) alkalmazásán alapul, amely egy nukleotidban különbözik a templát DNS-szekvenciától. A meghatározott primernek a mutáns PCR-termék összetételébe való beépítése következtében az egyik restrikciós endonukleáz számára mesterségesen létrehozott restrikciós hely képződik benne, amely lehetővé teszi egy bizonyos ismert mutáció közvetlen DNS-diagnózisát restrikciós elemzés segítségével. Ilyen mesterséges restrikciós hely létrehozására akkor lehet szükség, ha a keresés nem tárt fel olyan ismert és hozzáférhető enzim létezését, amelynek „természetes” restrikciós helyét befolyásolja a vizsgált mutáció DNS-molekulában való megjelenése. .

Reverz transzkriptáz PCR módszer (RT- PCR)

Ezt a módszert olyan esetekben alkalmazzák, amikor kényelmesebb nem genomikus DNS-t használni vizsgálati tárgyként, hanem kompaktabb és információban gazdagabb cDNS-t, amelyet szövetminták, például biopsziás anyag vagy limfociták, fibroblasztok sejtvonalai megfelelő feldolgozása után nyernek. stb. Fontos, hogy a feltétel itt a kívánt gén (legalább minimális) expressziója a vizsgált szövetben.

Az első szakaszban az mRNS reverz transzkripcióját hajtják végre, és a kapott cDNS-molekulák templátként szolgálnak a PCR-hez. Ezt követően a megfelelő mennyiségben amplifikált kritikus cDNS-régiót szekvenálásnak és egyéb mutációs szűrési módszernek, közvetlen elektroforetikus vizsgálatnak (deléciók, inszerciók kimutatása stb.) vagy expressziós rendszerbe történő integrációnak vetik alá fehérjetermék előállítása és annak közvetlen elemzése. .

Ez a módszer különösen hatékony a "csonkított" fehérje szintéziséhez vezető mutációk (nonszensz mutációk, splicing mutációk, nagy deléciók) kimutatására - az úgynevezett PTT analízis (Protein Truncation Test). A PTT analízist gyakran használják kiterjesztett, több exonból álló gének, például a Duchenne/Becker izomdisztrófia, ataxia-telangiectasia vagy 1-es típusú neurofibromatózis génjének vizsgálatakor.

valós idejű PCR(Valós idejű PCR)

A gyakorlati egészségügyben évről évre egyre népszerűbb diagnosztikai módszerré válik a valós idejű PCR. Alapvető jellemzője a polimeráz láncreakció termékeinek felhalmozódásának monitorozása és kvantitatív elemzése, valamint az eredmények automatikus regisztrálása és értelmezése. Ez a módszer nem igényel elektroforézis lépést, ami csökkenti a PCR laboratórium követelményeit. A termelési helymegtakarításnak, a létszámcsökkenésnek és a DNS/RNS számszerűsítés iránti igénynek köszönhetően ezt a módszert az elmúlt években sikeresen alkalmazzák a világ fejlett országainak legnagyobb egészségügyi járványügyi, diagnosztikai és kutatóközpontjaiban, a PCR jelenlegi ("klasszikus") formátumának felváltása.

A valós idejű PCR fluoreszcensen jelölt oligonukleotid próbákat használ a DNS kimutatására az amplifikáció során. A valós idejű PCR lehetővé teszi a minta teljes elemzését 20-60 percen belül, és elméletileg akár egyetlen DNS- vagy RNS-molekulát is képes kimutatni a mintában.

Rizs. 17. PCR valós időben.

A valós idejű PCR a TaqMan rendszert használja a PCR kinetika közvetlen szabályozására az amplifikáció során, rezonáns fluoreszcencia kioltással. A kimutatáshoz egy fluorofort és az amplifikált fragmens középső részével komplementer kioltót hordozó próbát használunk. Amikor a fluorofor és a kioltó az oligonukleotid próbához kötődik, csak kis mennyiségű fluoreszcens emisszió figyelhető meg. Az amplifikációs folyamat során a Taq polimeráz 5'-exonukleáz aktivitása miatt a fluoreszcens jelölés oldatba kerül, kiszabadul a kioltó környezetéből, és fluoreszcens jelet hoz létre, amely valós időben növekszik az akkumulációval arányosan. felerősítjük (17. ábra).

A PCR-Real-Time fő előnyei a gélelektroforézissel végzett PCR-rel szemben:

Az egész módszer egy kémcsőben történik;

· A módszer 1 órát vesz igénybe;

Elég 1-2 dolgozószoba;

Az eredmény kvalitatív értékelése mellett lehetővé válik annak számszerűsítése is (például AIDS vagy vírusos hepatitis vírusellenes terápiájának felírásakor ismerni kell a vírusterhelést, azaz az 1 egységre jutó vírus mennyiségét, ami valós -idő PCR);

· Drámaian csökkenti a szennyeződés kockázatát.

Következtetés

A PCR módszer a molekuláris biológiai kutatások egyik legelterjedtebb módszere. Ezt a módszert a klinikusoknak értelmesen kell alkalmazniuk, és annak az orvosnak, aki úgy dönt, hogy munkájában PCR-t alkalmaz, bizonyos ismeretekkel kell rendelkeznie ennek a módszernek a jellemzőiről és képességeiről. Másodszor, szoros visszacsatolásnak kell lennie a klinikus és a PCR-laboratórium között, amely szükséges az összetett esetek elemzéséhez és a helyes diagnosztikai stratégia kialakításához. Harmadszor, a PCR-elemzés nem csodaszer a diagnózisban (elsősorban a fertőző betegségek esetében), és nem helyettesíti a meglévő kutatási módszereket, hanem csak kiegészíti azokat. És ami a legfontosabb, a PCR nem helyettesítheti azt az intuíciót és analitikus gondolkodást, amellyel egy orvosnak, aki sikert vár, rendelkeznie kell.

P . S . Molekuláris-biológiai kutatások - a diagnosztika és kezelés referenciapontjainak változása. A molekuláris biológiai módszerek alkalmazása a laboratóriumi diagnosztika radikális hangsúlyváltozásának kilátásba helyezésével jár. Nem csak az időszerű tájékoztatásról beszélhetünk, hanem annak előzetes beérkezéséről is. Ha ma már a legtöbb esetben már előrehaladott betegség esetén végeznek laboratóriumi vizsgálatokat, és megkezdik a kezelést, akkor a molekuláris biológiai laboratóriumi információk várhatóan lehetővé teszik az egyén bizonyos típusú patológiákra való hajlamának és bizonyos gyógyszerekkel szembeni érzékenységének megállapítását. lehetővé teszi a jövő orvostudományának prediktív, megelőző és személyre szabott jellegének igazolását.

A DIAGNOSZTIKA ÉS A KEZELÉS FÓKUSZÁNAK VÁLTOZTATÁSA

ÖRÖKLETES BETEGSÉGEK

Ma A jövőben

Diagnózis Genetikai útlevél

8. Hány munkaszoba szükséges egy fluoreszcencia-detektáló (kvantitatív elemzés, Real-Time PCR) PCR laboratóriumhoz?

9. Mi az észlelés?

10. Milyen DNS-diagnosztikai módszereket különböztetünk meg?

11. Melyik enzim működik PCR alapján?

12. Miért kell az érzékelési zónát elválasztani a többi munkazónától?

13. Mi az a korlátozási oldal?

14. Mi a különbség a DNS-diagnosztika direkt módszere és az indirekt módszer között?

15. Mi a szekvenálás?

16. Mi az a multiplex PCR?

17. Milyen típusú mutációkat határoz meg a PCR?

18. Mi a szennyeződés?

19. Mi az allélspecifikus amplifikációs módszer lényege?

20. A PCR-anyag tárolási feltételei?

21. Milyen eszközt használnak az erősítéshez?

22. Mi a reverz transzkriptáz PCR (RT-PCR) módszere?

23. Mi a PCR diagnosztika anyaga?

24. Sorolja fel a szennyeződés típusait?

Tesztek az önálló tanuláshoz

1. Restrikciós endonukleázok:

a) olyan enzimek, amelyek szigorúan meghatározott helyeken „bontják” a DNS-t;

b) enzimek, amelyek töréseket varrnak a DNS-molekulában;

c) DNS-javítást végző vegyületeket biztosító enzimek.

2. Gén amplifikáció:

3. A molekuláris genetikai módszerek közül melyiket használják ismert szekvenciájú mutáns gén által okozott betegségek diagnosztizálására?

a) meghatározott korlátozás alkalmazása;

b) közvetlen kimutatás specifikus molekuláris próbák segítségével;

c) a normál restrikciós fragmentumhosszúságú polimorfizmus eloszlásának családanalízise.

4. DNS szekvenálás:

a) a DNS-bázis szekvencia azonosítása;

b) bármely DNS-szakasz ismételt ismétlődése;

c) a vizsgált gént tartalmazó DNS-fragmens izolálása.

5. segítségével DNS-mintákat nyerhetünk :

b) chorionbolyhok;

c) magzatvíz;

d) magzatvíz sejtek;

e) bőr-, izom-, májbiopszia,

e) minden helyes, kivéve a "c" pontot,

g) minden helyes, kivéve a "d" pontot,

h) A fentiek mindegyike igaz.

6. Mely mutációkat diagnosztizálják a PCR?

a) genomiális;

b) kromoszómális;

c) gén (pont).

7. Az alapozó a következő:

a) a DNS egy komplementer szakasza;

b) szintetikus oligonukleotiddal jelölt (radioaktívan vagy fluoreszcensen) szekvencia, amely komplementer mutáns vagy normál génnel;

c) oligonukleotid, amely "magként" működik, és elindítja egy polinukleotid lánc szintézisét egy DNS- vagy RNS-templáton.

8. Ki dolgozta ki a PCR módszer elvét?

b) K. Mullis

9. Használják-e a PCR módszert a trinukleotid ismétlődések (dinamikus típusú mutációk) kiterjedésének diagnosztizálására?

10. Milyen területeken alkalmazzák a PCR-t?

a) klinikai orvoslás;

b) a transzgenikus szervezetek (GMO-k) meghatározása

c) személyazonosítás, apaság megállapítása, kriminalisztika

d) a fentiek mindegyike

d) a fentiek egyike sem.

Válaszminta: 1-a; 2-b; 3-b; 4 - a; 5 - e; 6 - be; 7 - be; 8-b; 9 – a, 10 – d.

Fő

1. Bochkov genetika. Moszkva. GEOTAR, 2002.

További

1., Bakharev és a veleszületett és örökletes betegségek kezelése gyermekeknél. - Moszkva, 2004.

2. DNS-diagnosztika és orvosgenetikai tanácsadás. - Moszkva, 2004.

3. Gintergenetika. - Moszkva, 2003.

4. Gorbunov orvosi genetika alapjai. - Szentpétervár: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekuláris klinikai diagnosztika. – Világ, 1999.

6. Mensikov - biológiai kutatások a klinikai laboratóriumi diagnosztikában: a probléma lehetőségei (előadások). Klinikai laboratóriumi diagnosztika, 2006. 3. sz.

7. Kornyienko a PCR laboratórium munkájáról a biológiai anyagok in-line elemzése során. Klinikai laboratóriumi diagnosztika, 2006. 10. sz.

8. A PCR laboratórium munkájának megszervezése. Módszertani utasítások. MU 1.3.1794-03. Az Orosz Föderáció egészségügyi főorvosa, 2003.

9. Erlich H. A. PCR technológia. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Valós idejű kvantitatív PCR. Genome Res. - 1996. 6. sz.

A MÓDSZER FŐ ALAPELVEI

POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ

Módszertani kézikönyv általános orvosi (060101) és gyermekgyógyászati ​​(060103) szakon 3-4 szakos hallgatók tanórán kívüli munkájához.

SEI HPE "Szövetségi Egészségügyi és Szociális Fejlesztési Ügynökség Krasznojarszk Állami Orvosi Akadémiája"

Oroszország, Krasznojarszk,

Szövetségi Oktatási Ügynökség

Állami oktatási intézmény

Felsőfokú szakmai végzettség

"Karél Állami Pedagógiai Akadémia"

Tanfolyam a témában:

Polimeráz láncreakció (PCR) és alkalmazása

Készítette: Koryagina Valeria Alexandrovna diák

Ellenőrizte: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodszk 2013

Bevezetés

1. fejezet Irodalmi áttekintés

1.5.4 Fennsík hatás

1.5.6 Erősítés

Következtetés

Bevezetés

Az elmúlt húsz év a molekuláris genetikai módszerek széles körű bevezetése volt a biológiai, orvosi és mezőgazdasági tudományokba.

Az 1970-es évek elejére úgy tűnt, hogy a molekuláris biológia elért a tökéletesség bizonyos fokát. Ebben az időszakban a mikroorganizmusok voltak a molekuláris genetikai kutatások fő tárgya. Az eukariótákra való átállás teljesen új problémák elé állította a kutatókat, amelyeket az akkoriban létező genetikai elemzési módszerekkel nem lehetett megoldani. A molekuláris genetika fejlődésében az áttörést egy új kísérleti eszköz - a restrikciós endonukleázok - megjelenése tette lehetővé. A következő években a minőségileg eltérő megközelítéseken alapuló közvetlen DNS-elemzési módszerek száma rohamosan növekedni kezdett.

A modern technológiák sok esetben lehetővé tették a különböző élőlények nukleáris és extranukleáris genomjainak finom szerkezeti és funkcionális szerveződésének mélyebb szintű tanulmányozását. Ez különösen fontos volt a különféle betegségek diagnosztizálására és kezelésére szolgáló új módszerek kidolgozása szempontjából. Nem kevésbé fontos volt a molekuláris genetika populációbiológiai és nemesítési eredményeinek felhasználása a populációk, fajták és törzsek genetikai variabilitásának azonosítására, elemzésére, gazdaságilag értékes egyedek azonosítására és minősítésére, génmódosított szervezetek létrehozására és egyéb kérdések megoldására.

Mindegyik módszernek megvannak a maga előnyei és hátrányai. Nincs olyan univerzális módszer, amely minden felmerülő problémát megoldana. Ezért a folyamatban lévő kutatás konkrét módszerének megválasztása minden tudományos munka egyik legfontosabb állomása.

1. fejezet Irodalmi áttekintés

1.1 A polimeráz láncreakció (PCR) felfedezésének története

1983-ban K.B. Mullis és munkatársai publikálták és szabadalmaztatták a polimeráz láncreakció (PCR) módszert, amely a nukleinsavak kutatásának és alkalmazásának minden területére kiterjedt hatással volt. Ennek a módszernek a jelentősége a molekuláris biológia és a genetika szempontjából olyan nagynak és nyilvánvalónak bizonyult, hogy hét évvel később a szerző megkapta a kémiai Nobel-díjat.

A módszer alkalmazásának kezdetén, minden melegítési-hűtési ciklus után DNS-polimerázt kellett a reakcióelegyhez adni, mivel az a DNS-hélix szálainak elválasztásához szükséges magas hőmérsékleten inaktiválódott. A reakcióeljárás viszonylag nem volt hatékony, sok időt és enzimet igényelt. 1986-ban a polimeráz láncreakciós módszert jelentősen továbbfejlesztették. Termofil baktériumokból származó DNS-polimerázok alkalmazását javasolták. Ezek az enzimek hőstabilnak bizonyultak, és számos reakcióciklust képesek voltak ellenállni. Használatuk lehetővé tette a PCR egyszerűsítését és automatizálását. Az egyik első hőstabil DNS-polimerázt baktériumokból izolálták Thermus aquaticusés megnevezett Taq-polimeráz.

A PCR-t a rövid DNS-fragmensek molekuláris klónozásának alternatív módszerévé teszi az a lehetőség, hogy bármely ismert nukleotidszekvenciájú DNS-szakaszt amplifikáljunk, majd PCR után homogén formában és preparatív mennyiségben kapjuk meg. Ebben az esetben nincs szükség olyan összetett módszertani technikák alkalmazására, amelyeket a génsebészetben használnak a hagyományos klónozás során. A PCR-módszer fejlődése nagymértékben kibővítette a molekuláris genetika, azon belül is a géntechnológia módszertani lehetőségeit, olyannyira, hogy számos területén gyökeresen megváltoztatta és megerősítette a tudományos potenciált.

1.2 A polimeráz láncreakció (PCR) változatai

· Beágyazott PCR- a reakció melléktermékeinek számának csökkentésére szolgál. Használjon két pár primert, és hajtson végre két egymást követő reakciót. A második primerpár amplifikálja az első reakció termékén belüli DNS-régiót.

· Fordított PCR- akkor használatos, ha a kívánt sorozaton belül csak egy kis terület ismert. Ez a módszer különösen akkor hasznos, ha a szomszédos szekvenciák meghatározására van szükség a DNS-nek a genomba történő beillesztése után. Az invertált PCR végrehajtásához DNS-vágások sorozatát hajtják végre restrikciós enzimekkel<#"justify">polimeráz láncreakciós primer

· Csoportspecifikus PCR- PCR rokonoknak<#"center">1.3 Polimeráz láncreakció

Az 1980-as évek közepén felfedezett polimeráz láncreakció (PCR) néhány órán belül milliószorosára növelheti az eredeti minta másolatainak számát. A reakció minden ciklusa során két másolat keletkezik az eredeti molekulából. A szintetizált DNS-kópiák mindegyike templátként szolgálhat új DNS-kópiák szintéziséhez a következő ciklusban. Így a ciklusok ismételt ismétlése a másolatok számának exponenciális növekedéséhez vezet. A számításokból az következik, hogy ha 30 ciklusról van szó, az eredeti molekula másolatainak száma több mint 1 milliárd lesz. Még ha figyelembe vesszük is, hogy nem minden amplikon duplikálódik minden ciklus során, a másolatok teljes száma ennek ellenére meglehetősen nagy szám.

A polimeráz láncreakció (PCR) minden ciklusa a következő lépésekből áll:

· Denaturáció – A hőmérséklet emelkedése egy kétszálú DNS-molekulát feltekercselődik, és két egyszálúra hasad;

· Lágyítás – A hőmérséklet csökkentése lehetővé teszi, hogy a primerek a DNS-molekula komplementer régióihoz kapcsolódjanak;

· Megnyúlás – A DNS-polimeráz enzim kiegészíti a komplementer szálat.

A kiválasztott fragmentum amplifikálásához két oligonukleotid primert (magot) használunk, amelyek egy bizonyos DNS-régiót szegélyeznek. Alapozók orientált 3 - egymás felé és az erősítésre szoruló sorozat irányába végződik. A DNS-polimeráz kölcsönösen komplementer DNS-láncok szintézisét (befejezését) végzi, a primerekkel kezdve. A DNS-szintézis során a primerek fizikailag beépülnek az újonnan szintetizált DNS-molekulák láncába. A primerek egyikével kialakított DNS-molekula mindegyik szála templátként szolgálhat egy komplementer DNS-szál szintéziséhez a másik primer használatával.

1.4 Polimeráz láncreakció (PCR) lefolytatása

A polimeráz láncreakciót speciális vékony falú polipropilén kémcsövekben hajtják végre, amelyek méretében kompatibilisek a használt hőciklussal (erősítővel) - egy olyan eszközzel, amely szabályozza a polimeráz láncreakció (PCR) szakaszainak hőmérsékletét és időbeli jellemzőit. .

1.5 A polimeráz láncreakciós módszer elve

A polimeráz láncreakció (PCR) egy olyan in vitro DNS-amplifikációs módszer, amely néhány órán belül több milliárdszor képes izolálni és megsokszorozni egy bizonyos DNS-szekvenciát. A genom egy szigorúan meghatározott régiójának hatalmas számú másolatának beszerzése nagyban leegyszerűsíti a meglévő DNS-minta vizsgálatát.

A polimeráz láncreakció végrehajtásához számos feltételnek kell teljesülnie:

1.5.1 Számos komponens jelenléte a reakcióelegyben

A reakcióelegy (PCR) fő komponensei: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, nukleotid trifoszfátok (ATP, GTP, CTP, TTP), primerek (oligonukleotidok), elemzett DNS preparátum, hőstabil DNS polimeráz keveréke. A reakcióelegy minden komponense közvetlenül részt vesz a polimeráz láncreakcióban (PCR), és a reagensek koncentrációja közvetlenül befolyásolja az amplifikáció lefolyását.

· Tris-HCl - meghatározza a reakcióelegy pH-ját, pufferkapacitást hoz létre. A DNS polimeráz aktivitása a közeg pH-jától függ, így a pH értéke közvetlenül befolyásolja a polimeráz láncreakció lefolyását. Általában a pH-érték 8-9,5 tartományban van. A magas pH annak köszönhető, hogy a hőmérséklet emelkedésével a Tril-HCl puffer pH-ja csökken.

· KCl - a kálium-klorid 50 mm-ig terjedő koncentrációja befolyásolja a denaturációs és lágyulási folyamatokat, az 50 mm feletti koncentráció gátolja a DNS polimerázt.

· MgCl 2- mert a DNS polimeráz Mg 2+- függő enzim, akkor a magnéziumionok koncentrációja befolyásolja az enzim aktivitását (Mg 2+komplexeket képez az NTP-vel - ezek a komplexek a polimeráz szubsztrátja). A magas koncentráció a nem specifikus amplifikáció növekedéséhez, az alacsony pedig a reakció gátlásához vezet, az optimum (különböző polimerázok esetén) 0,5-5 mM tartományban van. Ezenkívül a magnéziumsók koncentrációja befolyásolja a denaturációs és lágyítási folyamatokat - a Mg koncentrációjának növekedését 2+a DNS olvadási hőmérsékletének növekedését okozza (azaz az a hőmérséklet, amelyen a kétszálú DNS-szálak 50%-a egyszálú szálakra bomlik).

· Az NTP - nukleotid-trifoszfátok a nukleinsavak közvetlen monomerei. A láncvégződés megakadályozása érdekében mind a négy nukleotid-trifoszfát egyenlő aránya javasolt. Ezen komponensek alacsony koncentrációja a reakcióelegyben növeli a hibák valószínűségét a komplementer DNS-szál felépítésében.

· Alapozók - A legoptimálisabb olyan alapozók használata, amelyek olvadáspont-különbsége legfeljebb 2-4 o C. Néha hosszú távú tárolás során 4 °C hőmérsékleten o A primerek nagyszámú fagyasztás - felengedés után vagy után másodlagos struktúrákat - dimereket képeznek, csökkentve a PCR hatékonyságát. Ennek a problémának a kiküszöbölése a vízfürdőben történő inkubációra redukálódik (T=95 o C) 3 percig, majd gyors hűtés 0°-ra TÓL TŐL.

· DNS-preparátumok - a DNS-preparátum (mátrix) mennyisége és minősége közvetlenül befolyásolja a polimeráz láncreakció lefolyását és paramétereit. A felesleges DNS minta gátolja a polimeráz láncreakciót (PCR). A DNS-készítményben lévő különféle anyagok szennyeződései is csökkenthetik a polimeráz láncreakció (PCR) hatékonyságát: nátrium-acetát, nátrium-klorid, izopropanol, etanol, heparin, fenol, karbamid, hemoglobin stb.

· DNS-polimeráz - kis mennyiségű DNS-polimeráz használatakor a végtermék szintézisének csökkenése figyelhető meg a fragmensek méretével egyenes arányban. A polimeráz 2-4-szeres feleslege diffúz spektrumok, 4-16-szoros alacsony molekulatömegű nem specifikus spektrumok megjelenéséhez vezet. Az alkalmazott koncentrációtartomány 0,5-1,5 egységnyi aktivitási egység 25 µl PCR-elegyre vonatkoztatva.

A PCR keverék fő összetevői mellett számos további anyagot használnak, amelyek javítják a PCR minőségi és mennyiségi mutatóit: acetamid (5%) - a fő komponensek oldhatóságának növekedése; betain (nátriumsó) - a DNS polimeráz stabilizálása, a DNS olvadáspontjának csökkentése, az olvadáspont kiegyenlítése; szarvasmarha albumin (10-100 μg / ml) - a DNS polimeráz stabilizálása; dimetil-szulfoxid (1-10%) - a fő komponensek oldhatóságának növelése; formamid (2-10%) - a lágyítás specifitásának növekedése; glicerin (15-20%) - az enzim termikus stabilitásának növekedése, a DNS-minta denaturációs hőmérsékletének csökkenése; ammónium-szulfát - csökkenti a denaturáció és az izzítás hőmérsékletét.

1.5.2 Ciklus és hőmérséklet

A polimeráz láncreakció (PCR) program általános nézete a következő:

színpad. A DNS-preparátum elhúzódó elsődleges denaturációja.1 ciklus

színpad. A DNS-készítmény gyors denaturálása. Primer lágyítás. Megnyúlás.30 - 45 ciklus.

színpad. Elhúzódó megnyúlás. A reakcióelegy hűtése 1 ciklus.

A színpad minden eleme - denaturáció, lágyítás, nyúlás - egyedi hőmérsékleti és időbeli jellemzőkkel rendelkezik. Az egyes elemek hőmérsékleti és áramlási idő paramétereit empirikusan választjuk ki, az amplifikációs termékek minőségi és mennyiségi mutatóinak megfelelően.

Denaturáció. A polimeráz láncreakció ezen eleme során egy kétszálú DNS-molekula két egyszálúra hasad. A denaturáció hőmérsékleti paraméterei 90-95 tartományban vannak o C-on, de magas guanin és citozin tartalmú DNS-minta esetén a hőmérsékletet 98 fokra kell emelni. o C. A denaturálás hőmérsékletének elegendőnek kell lennie a teljes denaturációhoz - a DNS-szálak hasítása és a "hirtelen lehűlés" vagy a gyors annealing elkerülése, azonban a hőstabil DNS-polimeráz kevésbé stabil magas hőmérsékleten. Így a primer/minta arány (DNS-előállítás) optimális denaturációs hőmérsékleti paramétereinek kiválasztása az amplifikáció fontos feltétele. Ha az első lépésben a denaturációs hőmérséklet 95 fok felett van o C, javasolt a DNS polimeráz hozzáadása a reakcióelegyhez az elsődleges denaturálás után. A szakasz ezen elemének időtartamának a polimeráz láncreakció (PCR) során elegendőnek kell lennie a teljes DNS-denaturációhoz, ugyanakkor nem befolyásolja jelentősen a DNS-polimeráz aktivitását egy adott hőmérsékleten.

Lágyítás. Izzítási hőmérséklet (T a ) a polimeráz láncreakció egyik legfontosabb paramétere. A lágyítási hőmérsékletet minden egyes alapozóhoz egyedileg választják ki. Ez a primer hosszától és nukleotid összetételétől függ. Általában 2-4-gyel alacsonyabb o Az olvadáspont értékéből (T m ) alapozó. Ha a rendszer lágyítási hőmérséklete az optimum alatt van, akkor a nem specifikus amplifikált fragmentumok száma nő, és fordítva, a magasabb hőmérséklet csökkenti az amplifikált termékek számát. Ebben az esetben a specifikus amplikonok koncentrációja meredeken csökkenhet, egészen a polimeráz láncreakció (PCR) gátlásáig. A lágyítási idő növelése a nem specifikus amplikonok számának növekedéséhez is vezet.

Megnyúlás. Jellemzően a hőstabil DNS-polimeráz minden típusának egyéni hőmérséklet-optimuma van. A komplementer DNS-szál enzim általi szintézisének sebessége is az egyes polimerázokra jellemző érték (átlagosan 30-60 nukleotid/másodperc, vagy 1-2 ezer bázis/perc), így az elongációs időt aszerint választjuk ki. a DNS polimeráz típusától és az amplifikált régió hosszától.

1.5.3 A primer kiválasztásának alapelvei

A PCR tesztrendszer létrehozásakor az egyik fő feladat a primerek helyes kiválasztása, amelyeknek számos kritériumnak kell megfelelniük:

Az alapozóknak specifikusnak kell lenniük. Különös figyelmet fordítanak a 3 - a primerek végei, mivel ezektől kezdi el a Taq polimeráz befejezni a komplementer DNS-láncot. Ha nem megfelelő a specifitásuk, akkor valószínű, hogy a reakcióelegy kémcsőjében nemkívánatos folyamatok mennek végbe, nevezetesen a nem specifikus DNS (rövid vagy hosszú fragmentumok) szintézise. Elektroforézis során nehéz vagy könnyű kiegészítő sávok formájában látható. Ez megnehezíti a reakció eredményeinek értékelését, mivel könnyen összetéveszthető egy adott amplifikációs termék a szintetizált idegen DNS-sel. A primerek és a dNTP-k egy részét nem specifikus DNS szintéziséhez használják fel, ami az érzékenység jelentős csökkenéséhez vezet.

A primerek nem képezhetnek dimereket és hurkokat, pl. nem szabad stabil kettős szálakat kialakítani a primerek önmagukhoz vagy egymáshoz való illesztésével.

1.5.4 Fennsík hatás

Meg kell jegyezni, hogy a specifikus amplifikációs termékek exponenciális felhalmozódási folyamata csak korlátozott ideig tart, majd hatékonysága kritikusan csökken. Ez az úgynevezett "fennsík" hatásnak köszönhető.

kifejezés hatása fennsík a PCR-termékek felhalmozódási folyamatának leírására szolgál az utolsó amplifikációs ciklusokban.

Az amplifikációs reakció körülményeitől és ciklusainak számától függően a hatás elérésének időpontjában fennsík a szubsztrátok (dNTP-k és primerek) felhasználása, a reaktánsok (dNTP-k és enzimek) stabilitása, az inhibitorok száma, beleértve a pirofoszfátokat és a DNS-duplexeket, a reaktánsokért való versengés nem specifikus termékekkel vagy primer-dimerekkel, egy adott termék koncentrációja , és az amplifikációs termékek nagy koncentrációinál a nem teljes denaturáció befolyásolja.

Minél alacsonyabb a cél DNS kezdeti koncentrációja, annál nagyobb a reakció kockázata plató". Ez a pont azelőtt jelentkezhet, hogy a specifikus amplifikációs termékek száma elegendő lenne az elemzéshez. Ezt csak jól optimalizált tesztrendszerek tudják elkerülni.

1.5.5 Biológiai anyag mintaelőkészítése

A DNS-kivonáshoz a feladatoktól függően különböző technikákat alkalmaznak. Lényegük a DNS extrakciójában (extrakciójában) rejlik egy biológiai termékből, valamint az idegen szennyeződések eltávolításában vagy semlegesítésében, hogy PCR-re alkalmas tisztaságú DNS-készítményt kapjanak.

A tiszta DNS-készítmény előállításának Marmur által leírt módszere standardnak számít, és már klasszikussá vált. Ez magában foglalja az enzimatikus proteolízist, amelyet fehérjementesítés és a DNS alkohollal történő újrakicsapása követ. Ez a módszer lehetővé teszi tiszta DNS-készítmény előállítását. Ez azonban meglehetősen munkaigényes, és olyan agresszív és csípős anyagokkal dolgozik, mint a fenol és a kloroform.

Az egyik jelenleg népszerű módszer a Boom és munkatársai által javasolt DNS-kivonási módszer. Ez a módszer egy erős kaotróp ágens, a guanidin-tiocianát (GuSCN) felhasználásán alapul a sejtlízishez, majd ezt követően egy hordozón (üveggyöngyökön, kovaföldön, üvegtejjel stb.) történő DNS-szorpcióra. Mosások után a DNS a hordozón adszorbeált mintában marad, ahonnan elúciós puffer segítségével könnyen eltávolítható. A módszer kényelmes, technológiailag fejlett és alkalmas amplifikációs minta-előkészítésre. Azonban DNS-vesztések lehetségesek a hordozón történő visszafordíthatatlan szorpció miatt, valamint számos mosás során. Ez különösen fontos, ha kis mennyiségű DNS-sel dolgozunk a mintában. Ezenkívül a GuSCN nyomokban is gátolhatja a PCR-t. Ezért ennek a módszernek a használatakor nagyon fontos a szorbens helyes megválasztása és a technológiai árnyalatok gondos betartása.

A minta-előkészítési módszerek másik csoportja a Chilex típusú ioncserélők alkalmazásán alapul, amelyek az üveggel ellentétben nem DNS-t szorbeálnak, hanem éppen ellenkezőleg, a reakciót zavaró szennyeződéseket. Ez a technológia általában két szakaszból áll: a minta felforralását és a szennyeződések adszorpcióját egy ioncserélőn. A módszer rendkívül vonzó a kivitelezés egyszerűsége miatt. A legtöbb esetben alkalmas klinikai anyagokkal való munkavégzésre. Sajnos néha előfordulnak olyan szennyeződéseket tartalmazó minták, amelyeket nem lehet ioncserélővel eltávolítani. Ezenkívül egyes mikroorganizmusokat nem lehet elpusztítani egyszerű forralással. Ezekben az esetekben a mintafeldolgozás további szakaszait kell bevezetni.

Így a minta-előkészítési módszer megválasztását a tervezett elemzések céljának megértésével kell kezelni.

1.5.6 Erősítés

Az amplifikációs reakció végrehajtásához el kell készíteni a reakcióelegyet, és hozzá kell adni az elemzett DNS-mintát. Ebben az esetben fontos figyelembe venni a primer lágyítás néhány jellemzőjét. A tény az, hogy a vizsgált biológiai mintában általában különböző DNS-molekulák találhatók, amelyekkel a reakcióban használt primerek részleges, esetenként jelentős homológiát mutatnak. Ezenkívül a primerek egymáshoz kapcsolódhatnak primer-dimerek kialakítása céljából. Mindkettő jelentős primer-felhasználáshoz vezet az oldalsó (nem specifikus) reakciótermékek szintéziséhez, és ennek eredményeként jelentősen csökkenti a rendszer érzékenységét. Ez megnehezíti vagy lehetetlenné teszi a reakció eredményeinek leolvasását az elektroforézis során.

1.6 A standard PCR reakcióelegy összetétele

x PCR puffer (100 mM Tris-HCl oldat, pH 9,0, 500 mM KCl oldat, 25 mM MgCl2 oldat ) …….2,5 µl

Víz (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Nukleotid-trifoszfátok (dNTP-k) keveréke

mindegyik mM oldata………………………………………….……….0,5 µl

Primer 1 (10 mM oldat) …………………………………………….….1 µl

Primer 2 (10 mM oldat) …………………………………………….….1 µl

DNS polimeráz (5 egység / µl) ……………………………………………… 0,2 µl

DNS-minta (20 ng/µl) ………………………………………………..1 µl

1.7 A reakció eredményeinek értékelése

A PCR eredményeinek helyes értékelése érdekében fontos megérteni, hogy ez a módszer nem kvantitatív. Elméletileg az egyedi cél-DNS-molekulák amplifikációs termékei elektroforézissel már 30-35 ciklus után kimutathatók. A gyakorlatban azonban ez csak olyan esetekben valósul meg, amikor a reakció az ideálishoz közeli körülmények között megy végbe, ami az életben nem gyakran fordul elő. A DNS-készítmény tisztasági foka különösen nagy hatással van az amplifikáció hatékonyságára; bizonyos inhibitorok jelenléte a reakcióelegyben, amelyektől bizonyos esetekben rendkívül nehéz megszabadulni. Előfordul, hogy jelenlétük miatt még több tízezer cél-DNS-molekulát sem lehet amplifikálni. Így gyakran nincs közvetlen kapcsolat a cél DNS kezdeti mennyisége és az amplifikációs termékek végső mennyisége között.

2. fejezet: A polimeráz láncreakció alkalmazásai

A PCR-t számos területen használják elemzésre és tudományos kísérletekben.

Kriminalistika

A PCR-t az úgynevezett „genetikai ujjlenyomatok” összehasonlítására használják. Szükségünk van egy mintára a tetthelyről származó genetikai anyagból - vér, nyál, sperma, haj stb. Összehasonlítják a gyanúsított genetikai anyagával. Nagyon kis mennyiségű DNS elég, elméletileg - egy példány. A DNS-t fragmensekre vágjuk, majd PCR-rel amplifikáljuk. A fragmentumokat DNS-elektroforézissel választjuk el. A DNS-sávok elhelyezkedéséről kapott képet genetikai ujjlenyomatnak nevezzük.

Az apaság megállapítása

A PCR-rel amplifikált DNS-fragmensek elektroforézisének eredményei. Apa. Gyermek. Anya. A gyermek mindkét szülő genetikai lenyomatának néhány jellemzőjét örökölte, ami új, egyedi lenyomatot adott.

Bár a "genetikai ujjlenyomatok" egyediek, családi kötelékek még mindig létrehozhatók több ilyen ujjlenyomat készítésével. Ugyanez a módszer, kis módosításokkal, alkalmazható az élőlények közötti evolúciós kapcsolatok megállapítására.

Orvosi diagnosztika

A PCR lehetővé teszi az örökletes és vírusos betegségek diagnosztizálásának jelentős felgyorsítását és megkönnyítését. A kérdéses gént PCR-rel amplifikáljuk megfelelő primerek alkalmazásával, majd szekvenáljuk a mutációk meghatározására. A vírusfertőzések közvetlenül a fertőzés után, hetekkel vagy hónapokkal a betegség tüneteinek megjelenése előtt észlelhetők.

Személyre szabott orvoslás

Néha a gyógyszerek mérgezőek vagy allergén hatásúak egyes betegek számára. Ennek oka részben a gyógyszerek és származékaik érzékenységének és metabolizmusának egyéni különbségei. Ezeket a különbségeket genetikai szinten határozzák meg. Például egy betegnél egy bizonyos citokróm aktívabb lehet, egy másikban kevésbé. Annak meghatározására, hogy egy adott beteg milyen citokrómban szenved, javasoljuk, hogy a gyógyszer alkalmazása előtt végezzen PCR-elemzést. Ezt az elemzést előzetes genotipizálásnak nevezik.

Gén klónozás

A génklónozás a gének izolálásának és a géntechnológiai manipulációk eredményeként az adott gén termékének nagy mennyiségének kinyerésének folyamata. A PCR-t egy gén amplifikálására használják, amelyet azután egy vektorba, egy olyan DNS-darabba inszertálnak, amely az idegen gént ugyanabba a szervezetbe szállítja, vagy egy másik, könnyen termeszthető szervezetbe. Vektorként például plazmidokat vagy virális DNS-t használunk. A gének idegen szervezetbe történő beillesztését általában e gén termékének - RNS-nek vagy leggyakrabban fehérjének - előállítására használják. Ily módon számos fehérjét nyernek ipari mennyiségben, hogy felhasználják a mezőgazdaságban, az orvostudományban stb.

DNS szekvenálás

A fluoreszcens vagy radioaktívan jelölt didezoxinukleotidok felhasználásával végzett szekvenálási módszerben a PCR szerves részét képezi, mivel a polimerizáció során a fluoreszcens vagy radioaktív jelzéssel jelölt nukleotidszármazékok beépülnek a DNS-láncba. Ez leállítja a reakciót, lehetővé téve a specifikus nukleotidok helyzetének meghatározását a szintetizált szálak elválasztása után a gélben.

Mutagenezis

Jelenleg a PCR a mutagenezis fő módszere. A PCR alkalmazása lehetővé tette a mutagenezis eljárás egyszerűsítését, felgyorsítását, valamint megbízhatóbbá és reprodukálhatóbbá tételét.

A PCR-módszer lehetővé tette a humán papillomavírus szekvenciák jelenlétének elemzését paraffinba ágyazott humán nyaki neoplazmák biopsziás metszeteiben 40 évvel a vizsgálat előtt. Sőt, a PCR segítségével az emberi agy 7 ezer éves fosszilis maradványaiból lehetett mitokondriális DNS fragmentumokat amplifikálni és klónozni!

Egyedi humán spermiumok lizátumain kimutatták, hogy képesek egyidejűleg elemezni két különböző nem homológ kromoszómán található lókuszt. Ez a megközelítés egyedülálló lehetőséget biztosít finom genetikai elemzésre, valamint kromoszóma-rekombináció, DNS-polimorfizmus stb. vizsgálatára. Az egyes spermiumok elemzésének módszere azonnal gyakorlati alkalmazásra talált a törvényszéki orvostudományban, mivel a haploid sejtek HLA-tipizálása lehetővé teszi az apaság meghatározását vagy azonosítását. bűnöző (a HLA-komplex az emberi fő hisztokompatibilitási komplex génkészlete; a HLA-komplex lókuszai a legpolimorfabbak a magasabb rendű gerincesekben ismert összes közül: egy fajon belül, minden lókusznál szokatlanul nagy számban találhatók különböző allélok – ugyanazon gén alternatív formái).

A PCR segítségével azonosítható az idegen genetikai struktúrák integrációjának helyessége a vizsgált sejtek genomjának egy előre meghatározott régiójában. A teljes sejt-DNS-t két oligonukleotid primerrel kapcsoljuk össze, amelyek közül az egyik komplementer a gazda-DNS helyével az inszerciós pont közelében, a másik pedig az antiparallel DNS-szálban lévő integrált fragmentum szekvenciájával. A polimeráz láncreakció változatlan kromoszómális DNS-szerkezet esetén a javasolt inszerciós helyen meghatározatlan méretű egyszálú DNS-fragmensek, tervezett inszerció esetén pedig ismert kétszálú DNS-fragmensek képződéséhez vezet. méret, amelyet a két primer összekapcsolódási helyei közötti távolság határozza meg. Ezenkívül a genom elemzett régiójának amplifikációs foka az első esetben lineárisan függ a ciklusok számától, a másodikban pedig exponenciálisan. Egy előre meghatározott méretű amplifikált fragmens exponenciális felhalmozódása a PCR során lehetővé teszi annak vizuális megfigyelését a DNS-készítmény elektroforetikus frakcionálása után, és egyértelmű következtetést vonhatunk le egy idegen szekvencia beépüléséről a kromoszómális DNS adott régiójába.

Következtetés

A PCR módszer jelenleg a legszélesebb körben alkalmazott módszer különféle fertőző betegségek diagnosztizálására. A PCR lehetővé teszi a fertőzés etiológiájának azonosítását, még akkor is, ha az elemzésre vett minta csak néhány kórokozó DNS-molekulát tartalmaz. A PCR-t széles körben használják HIV-fertőzések, vírusos hepatitis stb. korai diagnosztizálására. A mai napig szinte nincs olyan fertőző ágens, amelyet ne lehetne PCR-rel kimutatni.

Felhasznált irodalom jegyzéke

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Molekuláris-genetikai analízis módszerei. - Minszk: Unipol, 2007. - 176 p.

2.PCR "valós időben" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. satöbbi.; szerk. e. b. n. D.V. Rebrikov; Előszó L.A. Osterman és akad. RAS és RAAS E.D. Sverdlov; 2. kiadás, rev. és további - M.: BINOM. Tudáslaboratórium, 2009. - 223 p.

.Patrushev L.I. Mesterséges genetikai rendszerek. - M.: Nauka, 2005. - 2 tonnában

.B. Glick, J. Pasternak Molekuláris biotechnológia. Alapelvek és alkalmazás 589 oldal, 2002

5.Shchelkunov S.N. génmanipuláció. - Novoszibirszk: Sib. univ. kiadó, 2004. - 496 p.

Szerkesztette: A.A. Vorbjeva "Polimeráz láncreakció és alkalmazása diagnosztikában a dermatovenereológiában"; Orvosi Hírügynökség - 72 oldal

http://ru. wikipedia.org

Http://tudós. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - orvosi folyóirat

Korrepetálás

Segítségre van szüksége egy téma megtanulásához?

Szakértőink tanácsot adnak vagy oktatói szolgáltatásokat nyújtanak az Önt érdeklő témákban.
Jelentkezés benyújtása a téma azonnali megjelölésével, hogy tájékozódjon a konzultáció lehetőségéről.

Ez az ötlet azonban akkoriban nem érvényesült. A polimeráz láncreakciót 1983-ban fedezte fel újra Kary Mullis. Célja egy olyan módszer létrehozása volt, amely lehetővé teszi a DNS-amplifikációt az eredeti DNS-molekula többszöri, egymást követő megkettőzésekor a DNS-polimeráz enzim segítségével. 7 évvel az ötlet megjelenése után, 1993-ban Mullis Nobel-díjat kapott érte.

A módszer alkalmazásának kezdetén, minden melegítési-hűtési ciklus után DNS-polimerázt kellett a reakcióelegyhez adni, mivel az gyorsan inaktiválódott a DNS-spirál szálainak elválasztásához szükséges magas hőmérsékleten. Az eljárás nagyon hatástalan volt, sok időt és enzimet igényelt. 1986-ban jelentősen javították. Termofil baktériumokból származó DNS-polimerázok alkalmazását javasolták. Ezek az enzimek hőstabilnak bizonyultak, és számos reakcióciklust képesek voltak ellenállni. Használatuk lehetővé tette a PCR egyszerűsítését és automatizálását. Az egyik első hőstabil DNS-polimerázt baktériumokból izolálták Thermus aquaticusés megnevezett Taq-polimeráz. Ennek a polimeráznak az a hátránya, hogy meglehetősen nagy a valószínűsége egy hibás nukleotid bejutásának, mivel ez az enzim nem rendelkezik hibajavító mechanizmusokkal (3" → 5" exonukleáz aktivitás). Polimerázok pfués Pwo az archaeából izolált, ilyen mechanizmussal rendelkeznek, használatuk jelentősen csökkenti a mutációk számát a DNS-ben, de munkájuk sebessége (proceszivitása) kisebb, mint a Taq. Jelenleg keverékeket használnak Taqés pfu nagy polimerizációs sebesség és nagy másolási pontosság elérése érdekében.

A módszer feltalálása idején Mullis a Cetus (en: Cetus Corporation) cégnél dolgozott, amely szabadalmaztatta a PCR módszert. 1992-ben a Cetus eladta a módszer jogait és a használati szabadalmat Taq-polimeráz cég Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) 300 millió dollárért. Az azonban kiderült Taq-polimerázt Alekszej Kaledin orosz biokémikus jellemezte 1980-ban, amivel kapcsolatban a Promega (Promega) cég megpróbálta bíróságon rákényszeríteni a Roche-t, hogy adja fel ennek az enzimnek a kizárólagos jogait. A PCR-módszer amerikai szabadalma 2005 márciusában járt le.

PCR lefolytatása

A módszer egy bizonyos DNS-régió többszöri szelektív másolásán alapul enzimek segítségével mesterséges körülmények között ( in vitro). Ebben az esetben csak az a terület kerül másolásra, amely megfelel a meghatározott feltételeknek, és csak akkor, ha az jelen van a vizsgált mintában. Ellentétben az élő szervezetekben végzett DNS-amplifikációval (replikáció), a DNS viszonylag rövid szakaszait amplifikálják PCR segítségével. Egy hagyományos PCR eljárásban a replikált DNS-régiók hossza nem haladja meg a 3000 bázispárt (3 kbp). Különböző polimerázok keverékének segítségével, adalékok használatával és bizonyos feltételek mellett a PCR fragmentum hossza elérheti a 20-40 ezer bázispárt is. Ez még mindig sokkal kevesebb, mint egy eukarióta sejt kromoszómális DNS-ének hossza. Például az emberi genom körülbelül 3 milliárd bázispár hosszú.

Reakció komponensek

A PCR-hez a legegyszerűbb esetben a következő összetevőkre van szükség:

• DNS-sablon, amely tartalmazza a DNS amplifikációra szoruló szakaszát.
• Két alapozó, amely komplementer a kívánt DNS-fragmens különböző szálainak ellentétes végeivel.
• hőálló DNS polimeráz egy enzim, amely a DNS polimerizációját katalizálja. A PCR-ben használt polimeráznak magas hőmérsékleten hosszú ideig aktívnak kell maradnia, ezért termofilekből izolált enzimeket használnak - Thermus aquaticus(Taq polimeráz), Pyrococcus furiosus(Pfu polimeráz), Pyrococcus woesei(Pwo-polimeráz) és mások.
• Dezoxinukleozid-trifoszfátok(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• A polimeráz működéséhez szükséges Mg 2+ ionok.
• pufferelési megoldás, biztosítva a szükséges reakciókörülményeket - pH, az oldat ionerőssége. Sókat, marhaszérum albumint tartalmaz.

A reakcióelegy elpárolgásának elkerülése érdekében magas forráspontú olajat, például vazelint adunk a kémcsőbe. Ha fűtött fedős ciklust használ, erre nincs szükség.

Pirofoszfatáz hozzáadása növelheti a PCR reakció hozamát. Ez az enzim katalizálja a pirofoszfát hidrolízisét, amely a nukleotid-trifoszfátok növekvő DNS-szálhoz való hozzáadásának mellékterméke, az ortofoszfáttá. A pirofoszfát gátolhatja a PCR reakciót.

Alapozók

A PCR specifitása a templát és a primerek, rövid, 18-30 bázis hosszú szintetikus oligonukleotidok közötti komplementer komplexek képződésén alapul. A primerek mindegyike komplementer a kétszálú templát egyik láncához, és korlátozza az amplifikált régió kezdetét és végét.

A templátnak a primerrel való hibridizálása (annealing) után az utóbbi primerként szolgál a DNS-polimeráz számára a templát komplementer szálának szintézisében (lásd).

A primerek legfontosabb jellemzője a primer-mátrix komplex olvadáspontja (Tm). T m az a hőmérséklet, amelyen a templát DNS fele komplexet képez az oligonukleotid primerrel. Az olvadáspont megközelítőleg a következő képlettel határozható meg, ahol n X a primerben lévő X nukleotidok száma. Ha a primer hosszát és nukleotid összetételét vagy az annealing hőmérsékletét nem megfelelően választják meg, akkor a templát DNS más régióival részlegesen komplementer komplexek képződhetnek, amelyek nem specifikus termékek megjelenéséhez vezethetnek. Az olvadási hőmérséklet felső határát a polimeráz optimális működési hőmérséklete korlátozza, amelynek aktivitása 80 °C feletti hőmérsékleten leesik.

Az alapozók kiválasztásakor kívánatos betartani a következő kritériumokat:

erősítő

Rizs. egy: PCR ciklus

A PCR-t egy erősítőben hajtják végre - olyan eszközben, amely a kémcsövek időszakos hűtését és melegítését biztosítja, általában legalább 0,1 ° C-os pontossággal. A modern ciklusok lehetővé teszik összetett programok beállítását, beleértve a "hot start", a Touchdown PCR (lásd alább) lehetőségét és az amplifikált molekulák ezt követő tárolását 4 °C-on. A valós idejű PCR-hez fluoreszcens detektorral felszerelt eszközöket gyártanak. A műszerek automata fedéllel és mikrolemez rekesszel is kaphatók, így automatizált rendszerekbe integrálhatók.

A reakció előrehaladása

Fénykép egy gélről, amely marker DNS-t (1) és PCR reakciótermékeket (2, 3) tartalmaz. A számok a DNS-fragmensek hosszát mutatják nukleotidpárokban.

A PCR végrehajtása során jellemzően 20-35 ciklust hajtanak végre, amelyek mindegyike három szakaszból áll (2. ábra).

Denaturáció

A kettős szálú DNS-templátot 94-96 °C-ra (vagy 98 °C-ra, ha különösen hőstabil polimerázt használunk) 0,5-2 percig melegítjük, hogy lehetővé tegyük a DNS-szálak szétválását. Ezt a szakaszt az ún denaturáció mert a két DNS-szál közötti hidrogénkötések megszakadnak. Néha az első ciklus előtt (a polimeráz hozzáadása előtt) a reakcióelegyet 2-5 percig előmelegítik. a templát és a primerek teljes denaturálásához. Az ilyen megközelítést ún melegindítás, lehetővé teszi a nem specifikus reakciótermékek mennyiségének csökkentését.

Lágyítás

Amikor a szálakat szétválasztjuk, a hőmérsékletet lecsökkentjük, hogy lehetővé tegyük a primerek kötődését az egyszálú sablonhoz. Ezt a szakaszt az ún izzítás. A lágyítási hőmérséklet a primerek összetételétől függ, és általában 4-5 °C-kal az olvadáspontjuk alatt van kiválasztva. Színpadi idő - 0,5-2 perc. Az illesztési hőmérséklet helytelen megválasztása vagy a primerek gyengén kötődik a templáthoz (emelt hőmérsékleten), vagy rossz helyen kötődik, és nem specifikus termékek jelennek meg (alacsony hőmérsékleten).

Megnyúlás

A PCR fajtái

• "Nested" PCR (Nested PCR (eng.)) - a reakció melléktermékeinek számának csökkentésére szolgál. Használjon két pár primert, és hajtson végre két egymást követő reakciót. A második primerpár amplifikálja az első reakció termékén belüli DNS-régiót.
• "Invertált" PCR (inverz PCR (eng.)) - akkor használatos, ha a kívánt szekvencián belül csak egy kis terület ismert. Ez a módszer különösen akkor hasznos, ha a szomszédos szekvenciák meghatározására van szükség a DNS-nek a genomba történő beillesztése után. Az invertált PCR megvalósításához restrikciós enzimekkel végzett DNS-vágások sorozatát hajtják végre, majd a fragmentumok összekapcsolását (ligálását) követik. Ennek eredményeként az ismert fragmensek az ismeretlen régió mindkét végén vannak, ami után a PCR a szokásos módon elvégezhető.
• A reverz transzkripciós PCR (RT-PCR) egy ismert szekvencia RNS-könyvtárból történő amplifikálására, izolálására vagy azonosítására szolgál. A hagyományos PCR előtt egyszálú DNS-molekulát szintetizálnak az mRNS-templáton reverzáz segítségével, és egy egyszálú cDNS-t kapnak, amelyet templátként használnak a PCR-hez. Ez a módszer gyakran meghatározza, hogy ezek a gének hol és mikor fejeződnek ki.
• aszimmetrikus PCR. Aszimmetrikus PCR) - akkor hajtják végre, ha az eredeti DNS főként az egyik láncát kell amplifikálni. Egyes szekvenálási és hibridizációs elemzési technikákban használatos. A PCR-t a szokásos módon hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy az egyik primert nagy feleslegben vettük fel.
• A kvantitatív PCR (Q-PCR) segítségével gyorsan mérhető a mintában lévő specifikus DNS, cDNS vagy RNS mennyisége.
• Kvantitatív valós idejű PCR - ez a módszer fluoreszcensen jelzett reagenseket használ a reakciótermék mennyiségének pontos mérésére a felhalmozódás során.
• Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR(angol)) - ezzel a módszerrel a primerek nem specifikus kötődésének hatása a termék képződésére csökken. Az első ciklusokat a lágyítási hőmérséklet feletti hőmérsékleten hajtják végre, majd néhány ciklusonként a hőmérsékletet csökkentik. Egy bizonyos hőmérsékleten a rendszer áthalad a DNS számára optimális primerspecifitás sávján.
• Molekuláris kolónia módszer (PCR gélben) Polony-PCR kolónia) - az akrilamid gélt polimerizálják az összes PCR komponenssel a felületen, és PCR-t hajtanak végre. Az elemzett DNS-t tartalmazó pontokon az amplifikáció molekuláris kolóniák képződésével történik.
• PCR a cDNS végek gyors amplifikációjával A cDNS végek gyors amplifikációja, RACE-PCR )
• Hosszú fragmensek PCR-je Hosszú távú PCR) - a PCR módosítása kiterjesztett DNS-szegmensek (10 ezer bázis vagy több) amplifikálására. Két polimerázt használnak, amelyek közül az egyik egy nagy processzivitással rendelkező Taq polimeráz (azaz egy lépésben képes egy hosszú DNS-láncot szintetizálni), a másik pedig egy 3'-5' endonukleáz aktivitással rendelkező DNS polimeráz. A második polimerázra azért van szükség, hogy kijavítsuk az első által okozott hibákat.
• RAPD-PCR Polimorf DNS PCR véletlenszerű amplifikációja , PCR a polimorf DNS véletlenszerű amplifikációjával - akkor használatos, ha különbséget kell tenni a genetikai szekvenciában közel álló organizmusok, például a kultúrnövények különböző fajtái, kutyafajták vagy közeli rokon mikroorganizmusok között. Ez a módszer általában egyetlen kis alapozót (20-25 bp) használ. Ez a primer részben komplementer lesz a vizsgált organizmusok véletlenszerű DNS-régióival. A feltételek megválasztásával (primer hossza, primer összetétele, hőmérséklet stb.) két organizmus PCR mintázatában kielégítő különbséget lehet elérni.

Ha a templát nukleotidszekvenciája részben ismert vagy egyáltalán nem ismert, akkor használható degenerált primerek, amelynek sorozata degenerált pozíciókat tartalmaz, amelyek bármilyen bázist tartalmazhatnak. Például a primer szekvencia a következő lehet: ...ATH... ahol H jelentése A, T vagy C.

A PCR alkalmazása

A PCR-t számos területen használják elemzésre és tudományos kísérletekben.

Kriminalistika

A PCR-t az úgynevezett „genetikai ujjlenyomatok” összehasonlítására használják. A tetthelyről származó genetikai anyag mintája szükséges – vér, nyál, sperma, haj stb. Ezt összehasonlítják a gyanúsított genetikai anyagával. Nagyon kis mennyiségű DNS elég, elméletileg - egy példány. A DNS-t fragmensekre vágjuk, majd PCR-rel amplifikáljuk. A fragmenseket DNS-elektroforézissel választjuk el. A kapott képet a DNS-sávok elrendezéséről ún genetikai ujjlenyomat(Angol) genetikai ujjlenyomat).

Az apaság megállapítása

Rizs. 3: PCR-rel amplifikált DNS-fragmensek elektroforézisének eredményei. (1) Apa. (2) Gyermek. (3) Anya. A gyermek mindkét szülő genetikai lenyomatának néhány jellemzőjét örökölte, ami új, egyedi lenyomatot adott.

Bár a „genetikai ujjlenyomatok” egyediek (kivéve az egypetéjű ikrek esetét), mégis több ilyen ujjlenyomat készítésével családi kötelékek hozhatók létre (3. ábra). Ugyanez a módszer, kis módosításokkal, alkalmazható az élőlények közötti evolúciós kapcsolatok megállapítására.

Orvosi diagnosztika

A PCR lehetővé teszi az örökletes és vírusos betegségek diagnosztizálásának jelentős felgyorsítását és megkönnyítését. A kívánt gént PCR-rel amplifikáljuk megfelelő primerek alkalmazásával, majd szekvenáljuk a mutációk meghatározására. A vírusfertőzések közvetlenül a fertőzés után, hetekkel vagy hónapokkal a betegség tüneteinek megjelenése előtt észlelhetők.

Személyre szabott orvoslás

Ismeretes, hogy a legtöbb gyógyszer nem hat minden olyan betegre, akinek szánták, hanem csak a számuk 30-70%-án. Ezenkívül sok gyógyszer mérgező vagy allergén egyes betegek számára. Ennek oka részben a gyógyszerek és származékaik érzékenységének és metabolizmusának egyéni különbségei. Ezeket a különbségeket genetikai szinten határozzák meg. Például az egyik betegnél egy bizonyos citokróm (az idegen anyagok metabolizmusáért felelős májfehérje) aktívabb lehet, egy másikban - kevésbé. Annak meghatározására, hogy egy adott beteg milyen citokrómban szenved, javasoljuk, hogy a gyógyszer alkalmazása előtt végezzen PCR-elemzést. Ezt az elemzést előzetes genotipizálásnak nevezik. prospektív genotipizálás).

Gén klónozás

A génklónozás (nem tévesztendő össze az organizmusok klónozásával) a gének izolálásának folyamata, és géntechnológiai manipulációk eredményeként egy adott gén termékének nagy mennyiségben való kinyerése. PCR-t használnak a gén amplifikálására, amelyet azután inszertálnak vektor- olyan DNS-fragmens, amely egy idegen gént visz át ugyanabba vagy egy másik, termesztésre alkalmas szervezetbe. Vektorként például plazmidokat vagy virális DNS-t használunk. A gének idegen szervezetbe történő beillesztését általában e gén termékének - RNS-nek vagy leggyakrabban fehérjének - előállítására használják. Ily módon számos fehérjét nyernek ipari mennyiségben, hogy felhasználják a mezőgazdaságban, az orvostudományban stb.

Rizs. négy: Gén klónozás plazmid segítségével. .
(1) Az A szervezet kromoszómális DNS-e. (2) PCR. (3) Az A szervezet génjének több másolata. (4) A gén beépítése egy plazmidba. (5) Plazmid az A szervezet génjével. (6) A plazmid bevitele a B szervezetbe. (7) Az A szervezet génje másolatainak számának megsokszorozása a B szervezetben.

DNS szekvenálás

A fluoreszcens vagy radioaktívan jelölt didezoxinukleotidok felhasználásával végzett szekvenálási módszerben a PCR szerves részét képezi, mivel a polimerizáció során a fluoreszcens vagy radioaktív jelzéssel jelölt nukleotidszármazékok beépülnek a DNS-láncba. Ez leállítja a reakciót, lehetővé téve a specifikus nukleotidok helyzetének meghatározását a szintetizált szálak elválasztása után a gélben.

Mutagenezis

Jelenleg a PCR a mutagenezis fő módszere. A PCR alkalmazása lehetővé tette a mutagenezis eljárás egyszerűsítését, felgyorsítását, valamint megbízhatóbbá és reprodukálhatóbbá tételét.

Bakteriális genetika. Információk a második leckéhez.

polimeráz láncreakció

A polimeráz láncreakció olyan módszer, amely lehetővé teszi bizonyos DNS-molekulák számának többszörös növelését (amplifikációját) az elemzett mintában (beleértve a biológiai anyagot vagy a tiszta tenyészetet is).

A PCR, mint mikrobiológiai diagnosztikai módszer fő előnye a nagyon magas érzékenység, amely lehetővé teszi a kórokozók rendkívül alacsony koncentrációjának kimutatását a mintákban, valamint az állítható specificitás, amely lehetővé teszi a kórokozók kimutatását vagy azonosítását a generikus fajoknál. , vagy alfaj szinten. A PCR fő hátránya a rendkívül nagy érzékenységéből adódik – a képek nagyon könnyen szennyezhetik a pozitív kontrollból, másik mintából vagy PCR-termékből származó DNS-t, ami hamis pozitív reakcióhoz vezet. Ez szigorú korlátozásokat ír elő a PCR-nek a kész PCR-termékekkel való keverésének és feldolgozásának körülményeire vonatkozóan.

PCR lefolytatása. A következő komponenseket tartalmazó reakcióelegyet készítünk:

izolált DNS a vizsgálati mintából,

pufferelési megoldás,

Mg2+ ionok (az enzim működéséhez szükségesek),

Két primer egyszálú rövid DNS-molekula (leggyakrabban 18-24 nukleotid hosszúságú), amelyek komplementerek a kimutatandó DNS-szekvencia különböző szálainak végeihez.

Dezoxinukleotid-trifoszfátok keveréke.

Hőálló DNS-polimeráz (a leggyakrabban használt Taq polimeráz, egy polimeráz, amelyből izolált Thermus aquaticus).

Ezután ezt a reakcióelegyet a ciklusba helyezzük, ami valójában egy programozható termosztát. A ciklusban 30-40 hőmérséklet-változási ciklust hajtanak végre. Ezen ciklusok mindegyike három szakaszból áll (lásd 1. ábra):

Denaturáció (hőmérséklet 94 ° C) - a hidrogénláncok megszakadnak, és a DNS-láncok eltérnek.

Primer annealing (hőmérséklet általában 50-60 o C körül van) - primerek kapcsolódnak a DNS láncok végéhez. Általánosságban elmondható, hogy a hőmérséklet csökkentésével a vizsgált mintából az eredeti DNS-szálak újraegyesítése (renaturáció) energetikailag kedvezőbb, azonban a primerek koncentrációja a reakcióelegyben sok nagyságrenddel magasabb, mint a DNS koncentrációja. a mintából (legalábbis a kezdeti PCR ciklusokban), így a primer annealing reakció gyorsabban megy végbe, mint a renaturáció.DNS. A lágyítási hőmérsékletet a primerek olvadási (denaturációs) hőmérsékletétől függően választjuk meg.

Megnyúlás (a hőmérséklet általában 72 ° C) - a DNS-polimeráz kiegészíti a primereket a hosszú DNS-láncok templátja mentén. A hőmérséklet megfelel az alkalmazott DNS-polimeráz optimális működési hőmérsékletének.

Az eredmények kimutatása a különböző PCR-készítményekben eltérő, és a „PCR-változatok” című részben ismertetjük.

A PCR dinamikája

A korai PCR-ciklusokban a kettős szálú DNS-molekulák száma, amelyek méretét a primer helyek közötti távolság határozza meg, minden ciklussal megduplázódik. Kis számú hosszabb DNS-molekula is keletkezik, ami elhanyagolható (lásd 2. ábra).

Így a korai ciklusokban a PCR termék mennyiségét az m*2 n képlet írja le, ahol m a kívánt DNS kezdeti mennyisége a mintában, n a ciklusok száma. Ezután a reakció elér egy platót. Ennek oka a reakciótermék felhalmozódása, a primerek és a dezoxinukleotid-trifoszfátok koncentrációjának csökkenése, valamint a pirofoszfát koncentrációjának növekedése (lásd 3. ábra).

A PCR fajtái

Hagyományos PCR

A PCR beállításnak ebben a változatában a reakció előre meghatározott számú cikluson keresztül (30-40) folytatódik, majd megvizsgálják, hogy a reakcióelegyben megtörtént-e a kétszálú DNS-molekulák felhalmozódása.

A PCR ezen változata, ha diagnosztikai módszerként alkalmazzák, kvalitatív módszer. A pozitív reakció azt jelzi, hogy a mintában legalább nyomokban jelen van a kívánt DNS-molekula. A negatív reakció hiányukat jelzi. A mintában lévő kiindulási DNS-molekulák tartalmának kvantitatív értékelése lehetetlen, mivel a reakció egy platót ér el.

A termék jelenlétének kimutatásának fő módszere az elektroforézis agarózban vagy poliakrilamid gélben. A PCR-termékeket a gélben elektromos tér hatására molekulatömegük szerint választják el. A gélhez interkaláló festéket adnak (a kétszálú DNS-hez kapcsolódó állapotban fluoreszkál - leggyakrabban etidium-bromid). Így ultraibolya fénynek kitéve látható lesz a kívánt molekulatömegű DNS-nek megfelelő csík jelenléte vagy hiánya. Diagnosztikai célú PCR végzésekor mindig pozitív és negatív reakciókontrollokat helyezünk el, amelyekkel összehasonlítjuk a mintákat (lásd 4. ábra).

valós idejű PCR

A PCR elrendezés ezen változatában a reakció során folyamatosan rögzítjük a reakcióelegyben lévő PCR-termék mennyiségét. Ez lehetővé teszi egy reakciógörbe felépítését (lásd 3. ábra), és ennek alapján kiszámítja a kívánt DNS-molekulák számát a mintákban.

A valós idejű PCR egyik típusa egy interkaláló festéket használ, amelyet közvetlenül adnak a reakcióelegyhez (a SYBRGreen a leggyakrabban). Egy másik típus a fluoreszcens próbák egyik típusa, amely a PCR-terméken belüli helyhez kötődik, ami lehetővé teszi a detektálás specifitásának növelését (lásd 5. ábra) A fluoreszcens detektálás közvetlenül a készülékben történik a reakció során.

A kvantitatív kimutatás lehetőségén túl a valós idejű PCR-nek további előnyei is vannak a hagyományos PCR-hez képest. Ez a PCR-változat egyszerűbb, gyorsabb, és nem igényli a csöveket PCR-termékekkel, ami csökkenti más minták szennyeződésének lehetőségét. A fő hátrány a beépített fluoreszcencia-detektáló képességgel rendelkező erősítő magasabb költsége a hagyományoshoz képest.

Digitális kvantitatív PCR

A PCR egy új, drága és még mindig nem elterjedt változata, amely lehetővé teszi a DNS mennyiségének pontosabb meghatározását egy mintában, ebben a változatban a fluoreszcens festéket tartalmazó reakcióelegyet hatalmas számú mikroszkopikus térfogatra osztják (pl. , cseppek emulzióban). A PCR után elemzik, hogy a cseppek hányadában bizonyult pozitívnak a reakció, és ennek megfelelően figyelhető meg a fluoreszcencia. Ez az arány arányos lesz a mintában lévő érdekes DNS-molekulák számával.

reverz transzkripciós PCR

Ebben az esetben egy vagy másik PCR-változat előtt reverz transzkripciós reakciót (RNS-t DNS-vé) hajtanak végre a reverz enzim segítségével. Így ez a módszer lehetővé teszi az RNS-molekulák kvalitatív vagy kvantitatív kimutatását. Ez felhasználható RNS-tartalmú vírusok kimutatására, vagy egy adott gén transzkripciójának (mRNS mennyiségének) meghatározására.

1. kép PCR lépések. Az alapozók pirossal vannak jelölve.

2. ábra. Primer-limitált kétszálú DNS-molekulák felhalmozódása a PCR során.

3. ábra A PCR reakció dinamikája a kívánt DNS-molekulák különböző kezdeti koncentrációinál a mintában. (a) - a legmagasabb koncentráció (b) - közepes koncentráció (c) - a legalacsonyabb koncentráció

4. ábra PCR termékek agaróz elektroforézise. K+ - pozitív kontroll (nyilvánvalóan jelen van a szükséges DNS). 1-7 - vizsgálati minták (ebből 1-2 pozitív, 3-7 negatív). K- -negatív kontroll (határozottan hiányzik a kívánt DNS). Sok esetben a célterméken kívül könnyebb, nem specifikus reakciótermékek (primer-dimerek) is láthatók.

5. ábra Kimutatási módszerek valós idejű PCR segítségével. (a) - interkaláló festék - fluoreszkál, amikor kettős szálú DNS-hez kötődik (b) - Taqman próba - fluoreszcencia akkor következik be, amikor a próbát 5'-3' endonukleáz aktivitású DNS polimeráz hasítja a fluorofor és a kioltó elválasztása miatt. (c) MolecularBeacon próba - fluoreszcencia akkor következik be, amikor a próba hibridizál a célfragmenssel a fluorofor és a kioltó térbeli elválasztása miatt (d) - LightCycler próbák - akceptor fluoreszcencia akkor következik be, amikor a szondák (akceptort és donort tartalmaznak) hibridizálnak a célponttal fragmentum a rezonáns fluoreszcens energiatranszfer (FRET) következtében.

1. Polimeráz láncreakció (PCR)

2. A polimeráz láncreakciós módszer elve

2.1 Számos komponens jelenléte a reakcióelegyben

2.2 Hőmérséklet-ciklus

2.3 A primer kiválasztásának alapelvei

2.4 Fennsík hatás

3. A PCR beállítás szakaszai

3.2 Erősítés

3.4.1 Pozitív vezérlők

3.4.2 Belső ellenőrzések

4.1 Kvalitatív elemzés

4.1.2 RNS-molekulák kimutatása

3.1 Biológiai anyag minta előkészítése

A DNS-kivonáshoz a feladatoktól függően különböző technikákat alkalmaznak. Lényegük a DNS extrakciójában (extrakciójában) rejlik egy biológiai termékből, valamint az idegen szennyeződések eltávolításában vagy semlegesítésében, hogy PCR-re alkalmas tisztaságú DNS-készítményt kapjanak.

A tiszta DNS-készítmény előállításának Marmur által leírt módszere standardnak számít, és már klasszikussá vált. Ez magában foglalja az enzimatikus proteolízist, amelyet fehérjementesítés és a DNS alkohollal történő újrakicsapása követ. Ez a módszer lehetővé teszi tiszta DNS-készítmény előállítását. Ez azonban meglehetősen munkaigényes, és olyan agresszív és csípős anyagokkal dolgozik, mint a fenol és a kloroform.

Az egyik jelenleg népszerű módszer a Boom és munkatársai által javasolt DNS-kivonási módszer. Ez a módszer egy erős kaotróp ágens, a guanidin-tiocianát (GuSCN) felhasználásán alapul a sejtlízishez, majd ezt követően egy hordozón (üveggyöngyökön, kovaföldön, üvegtejjel stb.) történő DNS-szorpcióra. Mosások után a DNS a hordozón adszorbeált mintában marad, ahonnan elúciós puffer segítségével könnyen eltávolítható. A módszer kényelmes, technológiailag fejlett és alkalmas amplifikációs minta-előkészítésre. Azonban DNS-vesztések lehetségesek a hordozón történő visszafordíthatatlan szorpció miatt, valamint számos mosás során. Ez különösen fontos, ha kis mennyiségű DNS-sel dolgozunk a mintában. Ezenkívül a GuSCN nyomokban is gátolhatja a PCR-t. Ezért ennek a módszernek a használatakor nagyon fontos a szorbens helyes megválasztása és a technológiai árnyalatok gondos betartása.

A minta-előkészítési módszerek másik csoportja a Chilex típusú ioncserélők alkalmazásán alapul, amelyek az üveggel ellentétben nem DNS-t szorbeálnak, hanem éppen ellenkezőleg, a reakciót zavaró szennyeződéseket. Ez a technológia általában két szakaszból áll: a minta felforralását és a szennyeződések adszorpcióját egy ioncserélőn. A módszer rendkívül vonzó a kivitelezés egyszerűsége miatt. A legtöbb esetben alkalmas klinikai anyagokkal való munkavégzésre. Sajnos néha előfordulnak olyan szennyeződéseket tartalmazó minták, amelyeket nem lehet ioncserélővel eltávolítani. Ezenkívül egyes mikroorganizmusokat nem lehet elpusztítani egyszerű forralással. Ezekben az esetekben a mintafeldolgozás további szakaszait kell bevezetni.

Így a minta-előkészítési módszer megválasztását a tervezett elemzések céljának megértésével kell kezelni.

3.2 Erősítés

Az amplifikációs reakció végrehajtásához el kell készíteni a reakcióelegyet, és hozzá kell adni az elemzett DNS-mintát. Ebben az esetben fontos figyelembe venni a primer lágyítás néhány jellemzőjét. A tény az, hogy a vizsgált biológiai mintában általában különböző DNS-molekulák találhatók, amelyekkel a reakcióban használt primerek részleges, esetenként jelentős homológiát mutatnak. Ezenkívül a primerek egymáshoz kapcsolódhatnak primer-dimerek kialakítása céljából. Mindkettő jelentős primer-felhasználáshoz vezet az oldalsó (nem specifikus) reakciótermékek szintéziséhez, és ennek eredményeként jelentősen csökkenti a rendszer érzékenységét. Ez megnehezíti vagy lehetetlenné teszi a reakció eredményeinek leolvasását az elektroforézis során.

3.3 A reakció eredményeinek értékelése

A PCR eredményeinek helyes értékelése érdekében fontos megérteni, hogy ez a módszer nem kvantitatív. Elméletileg az egyedi cél-DNS-molekulák amplifikációs termékei elektroforézissel már 30-35 ciklus után kimutathatók. A gyakorlatban azonban ez csak olyan esetekben valósul meg, amikor a reakció az ideálishoz közeli körülmények között megy végbe, ami az életben nem gyakran fordul elő. A DNS-készítmény tisztasági foka különösen nagy hatással van az amplifikáció hatékonyságára; bizonyos inhibitorok jelenléte a reakcióelegyben, amelyektől bizonyos esetekben rendkívül nehéz megszabadulni. Előfordul, hogy jelenlétük miatt még több tízezer cél-DNS-molekulát sem lehet amplifikálni. Így gyakran nincs közvetlen kapcsolat a cél DNS kezdeti mennyisége és az amplifikációs termékek végső mennyisége között.

3.3.1 Vízszintes elektroforézis módszer

Az amplifikáció eredményeinek megjelenítésére különféle módszereket alkalmaznak. Ma a legelterjedtebb az elektroforézis módszere, amely a DNS-molekulák méret szerinti szétválasztásán alapul. Ehhez egy lemezt agaróz gélt készítünk, amelyet elektroforézis pufferben történő megolvadás után 1,5-2,5% koncentrációban lefagyasztanak egy speciális DNS-festék, például etidium-bromid hozzáadásával. A fagyasztott agaróz térhálót képez. Fésűk segítségével történő öntéskor a gélben speciális lyukak képződnek, amelyekbe ezt követően amplifikációs termékeket adnak. A géllemezt vízszintes gélelektroforézis készülékbe helyezzük, és állandó feszültségű forrást csatlakoztatunk. A negatív töltésű DNS mínuszból pluszba kezd mozogni a gélben. Ugyanakkor a rövidebb DNS-molekulák gyorsabban mozognak, mint a hosszúak. A DNS mozgásának sebességét a gélben befolyásolja az agaróz koncentrációja, az elektromos térerősség, a hőmérséklet, az elektroforézis puffer összetétele, és kisebb mértékben a DNS GC összetétele. Minden azonos méretű molekula azonos sebességgel mozog. A festék síkbeli csoportokban DNS-molekulákba ágyazódik (interkalálódik). A 10 perctől 1 óráig tartó elektroforézis befejezése után a gélt egy ultraibolya tartományban (254-310 nm) fényt kibocsátó transzilluminátor szűrőjére helyezzük. A DNS által 260 nm-en elnyelt UV-energia átkerül a festékre, ami a látható spektrum narancsvörös tartományában (590 nm) fluoreszkál.

Az erősítő termékek sávjainak fényereje eltérő lehet. Ez azonban nem hozható összefüggésbe a mintában lévő cél DNS kezdeti mennyiségével.

3.3.2 Függőleges elektroforézis módszer

A vertikális elektroforézis módszere alapvetően hasonló a horizontális elektroforézishez. Különbségük abban rejlik, hogy ebben az esetben agaróz helyett poliakrilamid géleket használnak. Ezt egy speciális kamrában végzik függőleges elektroforézishez. A poliakrilamid gélelektroforézis nagyobb felbontású, mint az agaróz elektroforézis, és lehetővé teszi a különböző méretű DNS-molekulák megkülönböztetését egy nukleotid pontossággal. A poliakrilamid gél elkészítése valamivel bonyolultabb, mint az agaróz. Ezenkívül az akrilamid mérgező anyag. Mivel ritkán merül fel az amplifikációs termék méretének 1 nukleotid pontosságú meghatározásának szükségessége, a rutinmunka során a horizontális elektroforézis módszert alkalmazzák.

3.4 Az amplifikációs reakció előrehaladásának nyomon követése

3.4.1 Pozitív vezérlők

"Pozitív kontrollként" használja a kívánt mikroorganizmus DNS-preparátumát. A nem specifikus amplikonok méretükben különböznek a kontroll DNS-preparátummal végzett amplifikációval előállított amplikonoktól. A nem specifikus termékek mérete lehet nagyobb vagy kisebb, mint a pozitív kontrollé. A legrosszabb esetben ezek a méretek egybeeshetnek, és az elektroforézisben pozitívnak olvashatók.

A kapott amplifikációs termék specifitásának szabályozására enzimjelölésekkel vagy radioaktív izotópokkal jelölt hibridizációs próbák (az amplifikálható szekvencián belül elhelyezkedő DNS-régiók) használhatók, amelyek kölcsönhatásba lépnek a DNS-sel a primerekkel azonos elvek szerint. Ez nagymértékben megnehezíti és meghosszabbítja az elemzést, és jelentősen megnő a költsége.

3.4.2 Belső ellenőrzések

A reakciókeverékkel minden csőben ellenőrizni kell az amplifikáció előrehaladását. Erre a célra egy további, úgynevezett "belső ellenőrzést" használnak. Ez bármely olyan DNS-készítmény, amely nem hasonlít a kívánt mikroorganizmus DNS-éhez. Ha a reakcióelegyhez belső kontrollt adunk, akkor az ugyanazon célpont lesz a primer összekapcsolódásnál, mint a kívánt fertőző ágens kromoszómális DNS-e. A belső kontroll amplifikációs termék méretét úgy választjuk meg, hogy az 2-szer vagy többször nagyobb legyen, mint a mikroorganizmus cél DNS-ének amplifikációjából származó amplikonok. Ennek eredményeként, ha belső kontroll DNS-t adunk a reakcióelegyhez a vizsgált mintával együtt, akkor függetlenül attól, hogy mikroorganizmus van-e a biológiai mintában, a belső kontroll specifikus amplikonok képződését okozza, de sokkal hosszabb ideig (nehezebb) mint a mikroorganizmus amplikonja. A nehéz amplikonok jelenléte a reakcióelegyben az amplifikációs reakció normális lefolyását és az inhibitorok hiányát jelzi. Ha nem jöttek létre a kívánt méretű amplikonok, de a belső kontroll amplikonok sem, akkor megállapítható, hogy a vizsgált mintában vannak nemkívánatos szennyeződések, amelyeket el kell távolítani, de nem a kívánt DNS hiányáról.

Sajnos ennek a megközelítésnek minden vonzereje ellenére van egy jelentős hibája. Ha a szükséges DNS jelen van a reakcióelegyben, akkor amplifikációjának hatékonysága meredeken csökken a primerek belső kontrolljával való versengés miatt. Ez különösen fontos a vizsgálati mintában lévő alacsony DNS-koncentráció esetén, ami hamis negatív eredményekhez vezethet.

Mindazonáltal, feltéve, hogy a primerekért való versengés problémáját megoldják, az amplifikáció hatékonyságának szabályozására szolgáló módszer minden bizonnyal nagyon hasznos lesz.

4. A polimeráz láncreakción alapuló módszerek

4.1 Kvalitatív elemzés

A PCR felállításának klasszikus módszerét, melynek alapelveit fentebb vázoltuk, néhány olyan módosítással fejlesztették ki, amelyek célja a PCR korlátainak leküzdése és a reakció hatékonyságának növelése volt.

4.1.1 A PCR beállítása „hot start” használatával

Az amplifikációs reakció nem specifikus termékei képződésének kockázatának csökkentése érdekében a „hot-start”-nak nevezett megközelítést alkalmazzák, melynek lényege, hogy megakadályozzák a reakció beindításának lehetőségét mindaddig, amíg a csőben a primerek specifikus hőkezelését biztosító körülmények be nem alakulnak. elérte.

A tény az, hogy a HC összetételétől és méretétől függően a primerek bizonyos olvadásponttal (Tm) rendelkeznek. Ha a rendszer hőmérséklete meghaladja a Tm értéket, a primer nem tud a DNS-szálhoz tapadni és denaturálódik. Optimális körülmények között, pl. Az olvadásponthoz közeli lágyítási hőmérsékleten a primer csak akkor képez kétszálú molekulát, ha teljesen komplementer és így biztosítja a reakció specifitását.

A "hot start" megvalósításának többféle lehetősége van:

Taq polimeráz bevitele a reakcióelegybe az első ciklus során, miután a csövet denaturációs hőmérsékletre melegítettük.

A reakcióelegy összetevőinek szétválasztása paraffinos réteggel rétegekre (alsó részen primerek, felsőben Taq polimeráz és cél DNS), amelyek a paraffin megolvadásakor (~65-75 0 С) összekeverednek.

Taq polimeráz elleni monoklonális antitestek alkalmazása. A monoklonális antitestek által megkötött enzim csak az első denaturációs lépés után válik aktívvá, amikor a monoklonális antitestek irreverzibilisen denaturálják és felszabadítják a Taq polimeráz aktív helyeit.

Mindezekben az esetekben, még ha a hőciklus kezdete előtt meg is történt a nem specifikus annealing, megnyúlás nem következik be, és a primer-DNS komplexek denaturálódnak a melegítés során, így nem képződnek nem specifikus termékek. Ezt követően a csőben a hőmérséklet nem esik az olvadáspont alá, ami biztosítja egy specifikus amplifikációs termék képződését.

4.1.2 RNS-molekulák kimutatása

Az RNS-nek a PCR célpontjaként való felhasználásának lehetősége jelentősen kibővíti ennek a módszernek az alkalmazási körét. Például számos vírus (hepatitis C, influenza vírus, picornavírusok stb.) genomját RNS képviseli. Ugyanakkor az életciklusukban nincs köztes fázis a DNS-vé való átalakulásnak. Az RNS kimutatásához először DNS formájúvá kell alakítani. Ehhez reverz transzkriptázt használnak, amelyet két különböző vírusból izolálnak: madár myeloblastosis vírusból és Moloney rágcsáló leukémia vírusból. Ezen enzimek használata bizonyos nehézségekkel jár. Először is, hőlabilisak, ezért legfeljebb 42 °C-on használhatók. Mivel ezen a hőmérsékleten az RNS-molekulák könnyen másodlagos struktúrákat alkotnak, a reakció hatékonysága jelentősen csökken, és különböző becslések szerint körülbelül 5%. Ezt a hátrányt próbálják megkerülni a Thermus Thermophilus termofil mikroorganizmusból nyert hőstabil polimeráz alkalmazásával, amely Mn 2+ jelenlétében transzkriptáz aktivitást mutat reverz transzkriptázként. Ez az egyetlen ismert enzim, amely polimeráz és transzkriptáz aktivitást egyaránt képes mutatni.

A reverz transzkripciós reakció végrehajtásához a reakcióelegynek, csakúgy, mint a PCR-ben, magként primereket és építőanyagként 4 dNTP keverékét kell tartalmaznia.

A reverz transzkripciós reakció után a kapott cDNS-molekulák a PCR célpontjaként szolgálhatnak.

5. A PCR beállításának technológiai folyamatának megszervezése

A polimeráz láncreakció potenciálisan nagy érzékenysége feltétlenül szükségessé teszi a PCR laboratórium különösen gondos tervezését. Ez a módszer legégetőbb problémájának – a szennyeződésnek – köszönhető.

Szennyezés - a külső környezetből olyan specifikus DNS-molekulák bejutása a reakcióelegybe, amelyek célpontként szolgálhatnak az amplifikációs reakcióban és hamis pozitív eredményeket adnak.

Számos módja van ennek a kellemetlen jelenségnek a kezelésére. Az egyik az N-uracil glikoziláz (UG) enzim alkalmazása. Ez a módszer az UG azon képességén alapul, hogy beágyazott uracillal DNS-molekulákat hasít. Az amplifikációs reakciót dNTP-k keverékével hajtják végre, amelyben a dTTP-t uracil helyettesíti, és hőciklus után a csőben keletkező összes amplikon uracilt tartalmaz. Ha HC-t adunk a reakcióelegyhez az amplifikáció előtt, akkor a reakcióelegybe belépő amplikonok elpusztulnak, míg a natív DNS érintetlen marad, és ezt követően az amplifikáció célpontjaként szolgál.

Így ez a módszer csak bizonyos mértékig szünteti meg a szennyeződés forrását, és nem garantálja a hamis pozitív eredményeket.

A szennyeződés következményeinek kezelésének másik módja a reakcióciklusok számának jelentős csökkentése (akár 25-30 ciklus). De még ezzel a megközelítéssel is nagy a hamis pozitív eredmény elérésének kockázata, mert ebben az esetben inhibitorok hiányában könnyen lehet amplifikációs terméket kapni a szennyeződés miatt.

Így a hamis pozitív eredményt okozó DNS-molekulák inaktiválását célzó előamplifikációs intézkedések előnyei ellenére a legradikálisabb orvosság egy jól átgondolt laboratóriumi szervezet.

Következtetés

A PCR módszer jelenleg a legszélesebb körben alkalmazott módszer különféle fertőző betegségek diagnosztizálására. A PCR lehetővé teszi a fertőzés etiológiájának azonosítását, még akkor is, ha az elemzésre vett minta csak néhány kórokozó DNS-molekulát tartalmaz. A PCR-t széles körben használják HIV-fertőzések, vírusos hepatitis stb. korai diagnosztizálására. A mai napig szinte nincs olyan fertőző ágens, amelyet ne lehetne PCR-rel kimutatni.