Citokinų terapija. Citokinai ir uždegimas Pasireiškia citokinų funkcinis aktyvumas

Citokinai yra apie 100 sudėtingų baltymų, dalyvaujančių daugelyje imuninių ir uždegiminių procesų žmogaus organizme. Jie nesikaupia juos gaminančiose ląstelėse ir greitai sintetinami bei išskiriami.

Tinkamai veikiantys citokinai užtikrina, kad imuninė sistema veiktų sklandžiai ir efektyviai. Jų būdingas bruožas yra veiksmų universalumas. Daugeliu atvejų jie turi kaskadinį efektą, kuris pagrįstas abipuse nepriklausoma kitų citokinų sinteze. Besivystantį uždegiminį procesą kontroliuoja tarpusavyje susiję priešuždegiminiai citokinai.

Kas yra citokinai

Citokinai – tai didelė grupė reguliuojančių baltymų, kurių molekulinė masė svyruoja nuo 15 iki 25 kDa (kilodaltonas yra atominės masės vienetas). Jie veikia kaip tarpląstelinio signalo tarpininkai. Jų būdingas bruožas yra informacijos perdavimas tarp ląstelių nedideliais atstumais. Jie dalyvauja pagrindinių organizmo gyvybinių procesų valdyme. Jie yra atsakingi už pradžią platinimas, t.y. ląstelių dauginimosi procesas, po kurio vyksta jų diferenciacija, augimas, aktyvumas ir apoptozė. Citokinai nustato imuninio atsako humoralinę ir ląstelinę fazę.

Citokinai gali būti laikomi tam tikra imuninės sistemos hormonai. Be kitų šių baltymų savybių, visų pirma išskiriamas gebėjimas paveikti organizmo energijos balansą keičiantis apetitui ir medžiagų apykaitai, įtaka nuotaikai, širdies ir kraujagyslių sistemos funkcijoms ir struktūroms, padidėjęs mieguistumas.

Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas priešuždegiminiai ir priešuždegiminiai citokinai. Pirmųjų vyravimas sukelia uždegiminę reakciją su karščiavimu, pagreitėjusiu kvėpavimo dažniu ir leukocitoze. Kiti turi pranašumą, nes sukelia priešuždegiminį atsaką.

Citokinų savybės

Pagrindinės citokinų savybės:

  • perteklius- galimybė sukurti tą patį efektą
  • pliotropija- gebėjimas paveikti įvairių tipų ląsteles ir sukelti jose skirtingus veiksmus
  • sinergija- sąveika
  • indukcija teigiamo ir neigiamo grįžtamojo ryšio etapai
  • antagonizmas– Abipusis veiksmo efektų blokavimas

Citokinai ir jų poveikis kitoms ląstelėms

Citokinai ypač veikia:

  • B limfocitai – tai imuninės sistemos ląstelės, atsakingos už humoralinį imuninį atsaką, t.y. antikūnų gamyba;
  • T-limfocitai – imuninės sistemos ląstelės, atsakingos už ląstelinį imuninį atsaką; jie gamina ypač Th1 ir Th2 limfocitus, tarp kurių stebimas antagonizmas; Th1 palaiko ląstelių atsaką ir Th2 humoralinį atsaką; Th1 citokinai neigiamai veikia Th2 vystymąsi ir atvirkščiai;
  • NK ląstelės – imuninės sistemos ląstelių grupė, atsakinga už natūralaus citotoksiškumo reiškinius (toksinį poveikį citokinams, kuriems nereikia stimuliuoti specifinių mechanizmų antikūnų pavidalu);
  • Monocitai yra morfologiniai kraujo elementai, jie vadinami baltaisiais kraujo kūneliais;
  • Makrofagai yra imuninės sistemos ląstelių populiacija, gaunama iš kraujo monocitų pirmtakų; jie veikia tiek įgimto imuniteto procesuose, tiek įgytuose (adaptyviai);
  • Granulocitai yra baltųjų kraujo kūnelių tipas, pasižymintis fagocitų savybėmis, kurios turėtų būti suprantamos kaip gebėjimas absorbuoti ir sunaikinti bakterijas, negyvas ląsteles ir kai kuriuos virusus.

Priešuždegiminiai citokinai

Priešuždegiminiai citokinai dalyvauja reguliuojant imuninį atsaką ir hematopoezę (morfozinių kraujo elementų gamybos ir diferenciacijos procesą) ir inicijuoja uždegiminės reakcijos vystymąsi. Jie dažnai vadinami imunotransmiteriais.

Pagrindiniai priešuždegiminiai citokinai yra šie:

  • TNF arba naviko nekrozės faktorius, anksčiau vadintas kektsin. Šiuo pavadinimu yra baltymų grupė, kuri lemia limfocitų aktyvumą. Jie gali sukelti apoptozę, natūralų užprogramuotą vėžio ląstelių mirties procesą. Išskirti TNF-α ir TNF-β.
  • IL-1, t.y. interleukinas 1. Tai vienas iš pagrindinių uždegiminio imuninio atsako reguliatorių. Ypač aktyviai dalyvauja uždegiminėse žarnyno reakcijose. Tarp 10 jo veislių išskiriami IL-1α, IL-1β, IL-1γ. Šiuo metu jis apibūdinamas kaip interleukinas 18.
  • IL-6, t.y. interleukinas 6, kuris turi pleiotropinį arba daugiakryptį poveikį. Jo koncentracija padidėja opiniu kolitu sergančių pacientų serume. Jis stimuliuoja hematopoezę, parodydamas sinergiją su interleukinu 3. Stimuliuoja B-limfocitų diferenciaciją į plazmines ląsteles.

Priešuždegiminiai citokinai

Priešuždegiminiai citokinai mažina uždegiminį atsaką, slopindami monocitų ir makrofagų, ypač IL-1, IL-6, IL-8, gamybą priešuždegiminių citokinų.

Tarp pagrindinių priešuždegiminių citokinų visų pirma minimas IL-10, t. y. interleukinas 10 (faktorius, slopinantis citokinų sintezę), IL 13, IL 4, kurie dėl citokinų sekrecijos indukcijos. kurie veikia kraujodarą, teigiamai veikia kraujo ląstelių gamybą.


Uždegimo zonos ląstelių aktyvacija pasireiškia tuo, kad ląstelės pradeda sintetinti ir išskirti daug citokinų, kurie veikia šalia esančias ir tolimų organų ląsteles. Tarp visų šių citokinų yra skatinančių (uždegiminių) ir neleidžiančių vystytis uždegiminiam procesui (priešuždegiminių). Citokinai sukelia poveikį, panašų į ūminių ir lėtinių infekcinių ligų pasireiškimus.

Priešuždegiminiai citokinai


90% limfocitų (leukocitų rūšis), 60% audinių makrofagų (ląstelių, galinčių sugauti ir suvirškinti bakterijas) gali išskirti priešuždegiminius citokinus. Infekcijos sukėlėjai ir patys citokinai (arba kiti uždegiminiai veiksniai) yra citokinų gamybos stimuliatoriai.

Vietinis priešuždegiminių citokinų išsiskyrimas sukelia uždegiminio židinio susidarymą. Konkrečių receptorių pagalba uždegimą skatinantys citokinai jungiasi ir į procesą įtraukia kitų tipų ląsteles: odą, jungiamąjį audinį, vidinę kraujagyslių sienelę, epitelio ląsteles. Visos šios ląstelės taip pat pradeda gaminti priešuždegiminius citokinus.

Svarbiausi priešuždegiminiai citokinai yra IL-1 (interleukinas-1) ir TNF-alfa (auglio nekrozės faktorius-alfa). Jie sukelia sukibimo (prilipimo) židinių susidarymą ant vidinio kraujagyslės sienelės apvalkalo: pirmiausia leukocitai prilimpa prie endotelio, o tada prasiskverbia pro kraujagyslių sienelę.

Šie priešuždegiminiai citokinai skatina leukocitų ir endotelio ląstelių kitų priešuždegiminių citokinų (IL-8 ir kitų) sintezę ir sekreciją ir taip suaktyvina ląsteles gaminti uždegimo mediatorius (leukotrienus, histaminą, prostaglandinus, azoto oksidą ir kt.).

Kai infekcija patenka į organizmą, mikroorganizmo patekimo vietoje (gleivinės, odos, regioninės limfos ląstelėse) prasideda IL-1, IL-8, IL-6, TNF-alfa gamyba ir išsiskyrimas. mazgai) - tai yra, citokinai aktyvina vietines gynybines reakcijas.

Tiek TNF-alfa, tiek IL-1, be vietinio veikimo, turi ir sisteminį poveikį: aktyvina imuninę, endokrininę, nervų ir kraujodaros sistemas. Priešuždegiminiai citokinai gali sukelti apie 50 skirtingų biologinių poveikių. Beveik visi audiniai ir organai gali būti jų taikiniai.

Pavyzdžiui, anemija sergant ūminėmis ir lėtinėmis infekcinėmis ligomis atsiranda dėl uždegimą skatinančių citokinų (interleukino-1, interferono-beta, interferono-gama, TNF, neopterino) poveikio organizmui. Jie slopina eritroidinio gemalo augimą, geležies išsiskyrimą iš makrofagų ląstelių ir slopina eritropoetino gamybą inkstuose. Citokinai veikia labai efektyviai ir greitai.

Priešuždegiminiai citokinai


Priešuždegiminių citokinų veikimą kontroliuoja priešuždegiminiai citokinai, įskaitant IL-4, IL-13, IL-10, TGF-beta. Jie gali ne tik slopinti uždegimą skatinančių citokinų sintezę, bet ir skatinti interleukino receptorių antagonistų (RAIL arba RAIL) sintezę.

Priešuždegiminių ir priešuždegiminių citokinų santykis yra svarbus uždegiminio proceso pradžios ir vystymosi reguliavimo taškas. Nuo šios pusiausvyros priklauso ir ligos eiga, ir jos baigtis. Būtent citokinai skatina kraujo krešėjimo faktorių gamybą kraujagyslių endotelio ląstelėse, chondrolitinių fermentų gamybą, prisideda prie randinio audinio susidarymo.

Citokinai ir imuninis atsakas


Visos imuninės sistemos ląstelės atlieka tam tikras skirtingas funkcijas. Jų koordinuotą sąveiką vykdo citokinai – imuninio atsako reguliatoriai. Būtent jie užtikrina informacijos mainus tarp imuninės sistemos ląstelių ir jų veiksmų koordinavimą.

Citokinų rinkinys ir kiekis yra signalų (dažnai kintančių), veikiančių ląstelių receptorius, matrica. Šių signalų sudėtingumas paaiškinamas tuo, kad kiekvienas citokinas gali slopinti arba suaktyvinti keletą procesų (įskaitant savo ar kitų citokinų sintezę), receptorių susidarymą ląstelės paviršiuje.

Citokinai imuninėje sistemoje užtikrina tarpusavio ryšį tarp specifinio imuniteto ir nespecifinės apsauginės organizmo reakcijos, tarp humoralinio ir ląstelinio imuniteto. Būtent citokinai bendrauja tarp fagocitų (suteikiančių ląstelinį imunitetą) ir limfocitų (humoralinio imuniteto ląstelių), taip pat tarp skirtingų funkcijų limfocitų.

Per citokinus T pagalbininkai (limfocitai, „atpažįstantys“ svetimus mikroorganizmų baltymus) perduoda komandą T-žudikams (ląstelėms, naikinančioms svetimą baltymą). Panašiai citokinų pagalba T-slopintuvai (limfocitų rūšis) kontroliuoja T-žudikų funkciją ir perduoda jiems informaciją, kad sustabdytų ląstelių sunaikinimą.

Jei toks ryšys nutrūksta, ląstelių mirtis (jau savų kūnui, o ne svetimų) tęsis. Taip vystosi autoimuninės ligos: IL-12 sintezė nekontroliuojama, ląstelių sukeltas imuninis atsakas bus pernelyg aktyvus.

Infekcinės ligos eiga ir baigtis priklauso nuo jos patogeno (ar jo komponentų) gebėjimo sukelti citokino IL-12 sintezę. Pavyzdžiui, Candida albicans grybų rūšis gali sukelti IL-12 sintezę, kuri prisideda prie veiksmingos ląstelių apsaugos nuo šio patogeno vystymosi. Leišmanija slopina IL-12 sintezę – išsivysto lėtinė infekcija. ŽIV slopina IL-12 sintezę, o tai sukelia ląstelinio imuniteto defektus sergant AIDS.

Citokinai taip pat reguliuoja specifinį organizmo imuninį atsaką į patogeno patekimą. Jei vietinės gynybos reakcijos neveiksmingos, tai citokinai veikia sistemos lygmeniu, tai yra, veikia visas sistemas ir organus, kurie dalyvauja palaikant homeostazę.

Jiems veikiant centrinę nervų sistemą, pasikeičia visas elgesio reakcijų kompleksas, kinta daugumos hormonų sintezė, baltymų sintezė, plazmos sudėtis. Tačiau visi įvykę pokyčiai nėra atsitiktiniai: jie arba būtini apsauginėms reakcijoms sustiprinti, arba padeda pakeisti organizmo energiją kovai su patogeniniu poveikiu.

Būtent citokinai, sudarantys ryšį tarp endokrininės, nervų, kraujodaros ir imuninės sistemos, dalyvauja visoms šioms sistemoms formuojant sudėtingą apsauginę organizmo reakciją į patogeninį agentą.

Makrofagai sugeria bakterijas ir išskiria citokinus (3D modelis) – video

Citokinų genų polimorfizmo analizė

Citokinų genų polimorfizmo analizė yra genetinis tyrimas molekuliniu lygiu. Tokie tyrimai suteikia daug informacijos, leidžiančios nustatyti polimorfinių genų (prouždegiminių variantų) buvimą tiriamame asmenyje, numatyti polinkį į įvairias ligas, parengti tokių ligų profilaktikos programą šiam konkrečiam asmeniui, ir tt

Priešingai nei pavienės (sporadinės) mutacijos, polimorfiniai genai randami apie 10 % populiacijos. Tokių polimorfinių genų nešiotojai turi padidėjusį imuninės sistemos aktyvumą chirurginių intervencijų, infekcinių ligų, mechaninio poveikio audiniams metu. Tokių asmenų imunogramoje dažnai aptinkama didelė citotoksinių ląstelių (ląstelių žudikų) koncentracija. Tokiems ligoniams dažnai išsivysto sepsinės, pūlingos ligų komplikacijos.

Tačiau kai kuriose situacijose toks padidėjęs imuninės sistemos aktyvumas gali trukdyti: pavyzdžiui, apvaisinimui in vitro ir embrionų persodinimui. O interleukino-1 arba IL-1 (IL-1), interleukino-1 receptorių antagonisto (RAIL-1), naviką nekrozuojančio faktoriaus alfa (TNF-alfa) priešuždegiminių genų derinys yra persileidimą skatinantis veiksnys. nėštumas. Jei tyrimo metu nustatoma, kad yra uždegimą skatinančių citokinų genų, tuomet būtinas specialus pasiruošimas nėštumui arba IVF (apvaisinimas in vitro).

Citokinų profilio analizė apima 4 polimorfinių genų variantų aptikimą:


  • interleukinas 1-beta (IL-beta);

  • interleukino-1 receptoriaus antagonistas (ILRA-1);

  • interleukinas-4 (IL-4);

  • naviką nekrozuojantis faktorius-alfa (TNF-alfa).

Norint atlikti analizę, specialaus pasiruošimo nereikia. Tyrimo medžiaga – žando gleivinės įbrėžimas.

Šiuolaikiniai tyrimai parodė, kad esant įprastam persileidimui moterų organizme, dažnai nustatomi genetiniai trombofilijos veiksniai (polinkis į trombozę). Šie genai gali lemti ne tik persileidimą, bet ir placentos nepakankamumą, vaisiaus augimo sulėtėjimą, vėlyvą toksikozę.

Kai kuriais atvejais vaisiaus trombofilijos geno polimorfizmas yra ryškesnis nei motinos, nes vaisius genus taip pat gauna iš tėvo. Protrombino geno mutacijos lemia beveik šimtaprocentinę vaisiaus intrauterinę mirtį. Todėl ypač sunkiais persileidimo atvejais reikalingas tyrimas ir vyras.

Imunologinis vyro tyrimas padės ne tik nustatyti nėštumo prognozę, bet ir nustatyti jo sveikatos rizikos veiksnius bei galimybę naudoti prevencines priemones. Jei motinai nustatomi rizikos veiksniai, patartina atlikti vaiko apžiūrą – tai padės sukurti individualią vaiko ligų profilaktikos programą.

Esant nevaisingumui, patartina nustatyti visus šiuo metu žinomus veiksnius, galinčius jį sukelti. Išsamus genetinis genų polimorfizmo tyrimas apima 11 rodiklių. Apžiūra gali padėti nustatyti polinkį į placentos disfunkciją, aukštą kraujospūdį, preeklampsiją. Tiksli nevaisingumo priežasčių diagnozė leis atlikti reikiamą gydymą ir išlaikyti nėštumą.

Išplėstinė hemostaziograma gali suteikti informacijos ne tik akušerinei praktikai. Ištyrus genų polimorfizmą, galima nustatyti genetinio polinkio į aterosklerozės, koronarinės širdies ligos išsivystymo veiksnius, numatyti jos eigą ir tikimybę susirgti miokardo infarktu. Netgi staigios mirties tikimybę galima apskaičiuoti naudojant genetinius tyrimus.

Taip pat tirta genų polimorfizmų įtaka lėtiniu hepatitu C sergančių pacientų fibrozės išsivystymo greičiui, pagal kurią galima prognozuoti lėtinio hepatito eigą ir baigtį.

Daugiafaktorinių ligų molekuliniai genetiniai tyrimai padeda ne tik sukurti individualią sveikatos būklės prognozę ir prevencines priemones, bet ir sukurti naujus gydymo metodus, naudojant anticitokininius ir citokininius vaistus.

Citokinų terapija

Navikinių ligų gydymas
Citokinų terapija gali būti taikoma bet kurioje (net IV) piktybinės ligos stadijoje, esant sunkiai gretuinei patologijai (kepenų-inkstų ar širdies ir kraujagyslių nepakankamumui). Citokinai selektyviai naikina tik piktybines naviko ląsteles ir nepaveikia sveikų. Citokinų terapija gali būti naudojama kaip savarankiškas gydymo metodas arba kaip kompleksinės terapijos dalis.

Vėžiu sergančių pacientų imunologiniai tyrimai parodė, kad daugumą piktybinių ligų lydi susilpnėjęs imunologinis atsakas. Jo slopinimo laipsnis priklauso nuo naviko dydžio ir gydymo (radioterapijos ir chemoterapijos). Gauti duomenys apie citokinų (interleukino-2, interferonų, naviko nekrozės faktoriaus ir kt.) biologinį poveikį.

Citokinų terapija onkologijoje taikoma jau kelis dešimtmečius. Tačiau anksčiau daugiausia buvo naudojami interleukinas-2 (IL-2) ir interferonas-alfa (IFN-alfa) – veiksmingi tik odos melanomai ir inkstų vėžiui gydyti. Pastaraisiais metais buvo sukurti nauji vaistai, išsiplėtė jų veiksmingo vartojimo indikacijos.

Vienas iš citokinų preparatų – naviko nekrozės faktorius (TNF-alfa) – veikia per receptorius, esančius ant piktybinės ląstelės. Šį citokiną žmogaus organizme gamina monocitai ir makrofagai. Sąveikaujant su piktybinės ląstelės receptoriais, citokinas sukelia šios ląstelės mirties programą.

TNF-alfa buvo pradėtas naudoti onkologinėje praktikoje JAV ir Europoje dar devintajame dešimtmetyje. Jis naudojamas ir šiandien. Tačiau didelis vaisto toksiškumas riboja jo naudojimą tik tais atvejais, kai organą su naviko procesu galima išskirti iš bendros kraujotakos (inkstų, galūnių). Vaistas šiuo atveju cirkuliuoja širdies ir plaučių aparato pagalba tik paveiktame organe ir nepatenka į bendrą kraujotaką.

Rusijoje Refnot (TNF-T) buvo sukurtas 1990 m., susiliejus timozino alfa ir naviko nekrozės faktoriaus genams. Jis yra 100 kartų mažiau toksiškas nei TNF, praėjo klinikinius tyrimus, o nuo 2009 metų leidžiamas naudoti įvairių tipų ir lokalizacijų piktybiniams navikams gydyti.

Atsižvelgiant į sumažėjusį vaisto toksiškumą, jį galima leisti į raumenis arba po oda. Vaistas veikia tiek pirminį naviko židinį, tiek metastazes (įskaitant tolimas), priešingai nei TNF-alfa, kuri gali turėti įtakos tik pirminiam židiniui.

Kitas perspektyvus citokinų vaistas yra gama interferonas (IFN-gama). Jos pagrindu 1990 metais Rusijoje buvo sukurtas vaistas Ingaron. Jis turi tiesioginį poveikį navikinėms ląstelėms arba paleidžia apoptozės programą (pati ląstelė programuoja ir vykdo savo mirtį), padidina imuninių ląstelių efektyvumą.

Vaistas taip pat praėjo klinikinius tyrimus ir nuo 2005 m. buvo patvirtintas naudoti piktybiniams navikams gydyti. Vaistas aktyvina tuos piktybinės ląstelės receptorius, su kuriais vėliau sąveikauja Refnot. Todėl dažniausiai citokinoterapija Refnot derinama su Ingaron vartojimu.

Šių vaistų vartojimo būdas (į raumenis arba po oda) leidžia gydyti ambulatoriškai. Citokinoterapija draudžiama tik nėštumo ir autoimuninių ligų metu. Be tiesioginio poveikio piktybinei ląstelei, Ingaron ir Refnot turi netiesioginį poveikį - jie aktyvina savo imuninės sistemos ląsteles (T-limfocitus ir fagocitus), padidina bendrą imunitetą.

Deja, citokinų terapijos efektyvumas yra tik 30-60%, priklausomai nuo naviko stadijos ir vietos, piktybinio naviko tipo, proceso paplitimo, bendros paciento būklės. Kuo aukštesnė ligos stadija, tuo mažiau ryškus gydymo poveikis.

Tačiau net ir esant daugybinėms ir tolimoms metastazėms bei chemoterapijos negalimybei (dėl bendros paciento būklės sunkumo), pastebimi teigiami rezultatai – pagerėja bendra savijauta ir sustabdomas tolesnis gydymas. ligos vystymąsi.

Pagrindinės šiuolaikinių vaistų-citokinų veikimo kryptys:


  • tiesioginis poveikis paties naviko ląstelėms ir metastazėms;

  • chemoterapijos priešnavikinio poveikio stiprinimas;

  • metastazių ir naviko pasikartojimo prevencija;

  • chemoterapijos nepageidaujamų reakcijų mažinimas slopinant kraujodarą ir imunosupresiją;

  • gydymas ir infekcinių komplikacijų prevencija gydymo metu.

Galimos citokinų terapijos rezultatų pasirinkimo galimybės:


  • visiškas naviko išnykimas arba jo dydžio sumažėjimas (dėl apoptozės sužadinimo – užprogramuotos naviko ląstelių mirties);

  • proceso stabilizavimas arba dalinis naviko regresija (kai ląstelių ciklas sustabdomas naviko ląstelėse);

  • poveikio stoka - auglio augimas ir metastazės tęsiasi (auglio ląstelės nejautrus vaistui dėl mutacijų).

Iš to, kas pasakyta, matyti, kad klinikinis citokinų terapijos rezultatas priklauso nuo paties paciento navikinių ląstelių savybių. Citokinų panaudojimo efektyvumui įvertinti atliekami 1-2 gydymo kursai ir įvairiais instrumentiniais tyrimo metodais įvertinama proceso dinamika.

Galimybė taikyti citokinų terapiją nereiškia kitų gydymo metodų (chirurgijos, chemoterapijos ar spindulinės terapijos) atsisakymo. Kiekvienas iš jų turi savų pranašumų, turinčių įtakos navikui. Kiekvienu konkrečiu atveju turėtų būti naudojami visi nurodyti ir galimi gydymo būdai.

Citokinai labai palengvina spinduliuotės ir chemoterapijos toleravimą, apsaugo nuo neutropenijos (leukocitų skaičiaus sumažėjimo) ir infekcijų išsivystymo chemoradioterapijos metu. Be to, Refnot padidina daugumos chemoterapinių vaistų veiksmingumą. Naudojant kartu su Ingaron likus savaitei iki chemoterapijos pradžios ir toliau vartojant citokiną po chemoterapijos kurso, apsisaugosite nuo infekcijų arba išgysite jas be antibiotikų.

Citokinų terapijos schema paskiriama kiekvienam pacientui individualiai. Abu vaistai praktiškai neturi toksiškumo (skirtingai nei chemoterapiniai vaistai), nesukelia šalutinių reakcijų ir yra gerai toleruojami pacientų, neslopina kraujodaros, didina specifinį priešnavikinį imunitetą.

Šizofrenijos gydymas

Tyrimais nustatyta, kad citokinai dalyvauja psichoneuroimuninėse reakcijose ir užtikrina konjuguotą nervų ir imuninės sistemos darbą. Citokinų balansas reguliuoja defektuotų ar pažeistų neuronų regeneracijos procesą. Tai yra naujų šizofrenijos gydymo metodų – citokinų terapijos – taikymo pagrindas: imunotropinių citokinų turinčių vaistų vartojimas.

Vienas iš būdų yra naudoti anti-TNF-alfa ir anti-IFN-gama antikūnus (antikūnus prieš naviko nekrozės faktorių-alfa ir interferono-gama antikūnus). Vaistas švirkščiamas į raumenis 5 dienas, 2 r. per dieną.

Taip pat yra sudėtinio citokinų tirpalo naudojimo metodas. Jis skiriamas inhaliacijomis naudojant purkštuvą, 10 ml vienai injekcijai. Priklausomai nuo paciento būklės, pirmąsias 3-5 dienas vaistas skiriamas kas 8 valandas, vėliau 5-10 dienų - 1-2 rubliai per dieną, o vėliau dozė sumažinama iki 1 r. per 3 dienas ilgą laiką (iki 3 mėnesių), visiškai panaikinus psichotropinius vaistus.

Intranazalinis citokinų tirpalo (sudėtyje yra IL-2, IL-3, GM-CSF, IL-1beta, IFN-gama, TNF-alfa, eritropoetino) vartojimas pagerina pacientų, sergančių šizofrenija, gydymo veiksmingumą (įskaitant pirmąjį priepuolį). liga), ilgesnė ir stabilesnė remisija. Šie metodai naudojami Izraelio ir Rusijos klinikose.


Daugiau apie šizofreniją

Citokinai iš prigimties yra baltymai, kuriuos gamina imuninės sistemos ląstelės (literatūroje dažnai vadinami „faktoriais“). Jie dalyvauja naujagimių imuninės sistemos ląstelių diferenciacijoje, suteikdami joms tam tikras savybes, kurios yra imuninių ląstelių įvairovės šaltinis, taip pat užtikrina tarpląstelinę sąveiką. Kad šį procesą būtų lengviau suprasti, galime palyginti imuninių ląstelių gamybą su gamykla. Pirmajame etape nuo surinkimo linijos išeina identiški ląstelių ruošiniai, tada antrajame etape, naudojant skirtingas citokinų grupes, kiekviena ląstelė yra aprūpinta specialiomis funkcijomis ir surūšiuojama į grupes, kad vėliau galėtų dalyvauti imuniniuose procesuose. Taip iš identiškų ląstelių gaunami T limfocitai, B limfocitai, neutrofilai, bazofilai, eozinofilai, monocitai.

Mokslą domina citokino poveikio ląstelei ypatumai, dėl kurių ši ląstelė gamina kitus citokinus. Tai yra, vienas citokinas sukelia kitų gamybą citokinų.

Citokinai, priklausomai nuo poveikio imuninėms ląstelėms, skirstomi į šešias grupes:

  • Interferonai
  • Interleukinai
  • kolonijas stimuliuojantys veiksniai
  • augimo faktoriai
  • Chemokinai
  • Naviko nekrozės veiksniai

Interferonai yra citokinai, kuriuos gamina ląstelės, reaguodamos į virusinę infekciją ar kitus stimulus. Šie baltymai (citokinai) blokuoja viruso dauginimąsi kitose ląstelėse ir dalyvauja imuninėje tarpląstelinėje sąveikoje.

Pirmasis tipas (turi antivirusinį ir priešnavikinį poveikį):

interferonas-alfa

interferonas-beta

Interferonas-gama

Interferonai alfa ir beta veikia panašiai, tačiau juos gamina skirtingos ląstelės.

Interferoną-alfa gamina mononukleariniai fagocitai. Iš to išplaukia jo pavadinimas - " leukocitų interferonas».

Beta interferoną gamina fibroblastai. Iš čia ir pavadinimas - fibroblastų interferonas».

Pirmojo tipo interferonai turi savo užduotis:

  • Padidinti interleukinų (IL1) gamybą
  • Sumažinkite pH lygį tarpląstelinėje aplinkoje, kylant temperatūrai
  • Prisijungia prie sveikų ląstelių ir apsaugo jas nuo virusų
  • Geba slopinti ląstelių dauginimąsi (augimą), blokuodamas aminorūgščių sintezę
  • Kartu su natūraliomis žudančiomis ląstelėmis jos skatina arba slopina (priklausomai nuo situacijos) antigenų susidarymą

Gama interferoną gamina T limfocitai ir natūralios žudikų ląstelės. Turi vardą - imuninis interferonas»

Antrojo tipo interferonas taip pat turi užduotis:

  • Suaktyvina T-limfocitus, B-limfocitus, makrofagus, neutrofilus,
  • Slopina timocitų dauginimąsi,
  • Stiprina ląstelinį imunitetą ir autoimunitetą,
  • Reguliuoja normalių ir užkrėstų ląstelių apoptozę.

Interleukinai(sutrumpintai kaip IL) yra citokinai, reguliuojantys leukocitų sąveiką. Mokslas nustatė 27 interleukinus.

kolonijas stimuliuojantys veiksniai yra citokinai, reguliuojantys kaulų čiulpų kamieninių ląstelių ir kraujo ląstelių pirmtakų dalijimąsi ir diferenciaciją. Šie citokinai yra atsakingi už limfocitų gebėjimą klonuotis, taip pat gali stimuliuoti ląstelių, esančių už kaulų čiulpų ribų, funkcionalumą.

Augimo faktoriai – reguliuoja įvairių audinių ląstelių augimą, diferenciaciją ir funkcionalumą

Iki šiol buvo nustatyti šie augimo veiksniai:

  • transformuojantys augimo faktorius alfa ir beta
  • epidermio augimo faktorius
  • fibroblastų augimo faktorius
  • trombocitų augimo faktorius
  • nervų augimo faktorius
  • į insuliną panašus augimo faktorius
  • hepariną surišantis augimo faktorius
  • endotelio ląstelių augimo faktorius

Labiausiai ištirtos yra augimo faktoriaus beta transformavimo funkcijos. Jis yra atsakingas už T-limfocitų augimo ir aktyvumo slopinimą, slopina kai kurias makrofagų, neutrofilų, B limfocitų funkcijas. Nors šis veiksnys yra susijęs su augimo faktoriais, iš tikrųjų jis dalyvauja atvirkštiniuose procesuose, tai yra, slopina imuninį atsaką (slopina imuninėje gynyboje dalyvaujančių ląstelių funkcijas), kai infekcija pašalinama ir imuninių ląstelių darbas. nebereikia. Būtent šio veiksnio įtakoje žaizdų gijimo metu sustiprėja kolageno sintezė ir IgA imunoglobulino gamyba, generuojamos atminties ląstelės.

Chemokinai yra mažos molekulinės masės citokinai. Pagrindinė jų funkcija – pritraukti leukocitus iš kraujotakos į uždegimo židinį, taip pat reguliuoti leukocitų judrumą.

Naviko nekrozės veiksniai(sutrumpintai kaip TNF) yra dviejų tipų citokinai (TNF-alfa ir TNF-beta). Jų veikimo rezultatai: išsivysto kacheksija (dėl to labai išsekus organizmui sulėtėja fermento, prisidedančio prie riebalų kaupimosi organizme, veikla); toksinio šoko vystymasis; imuninės sistemos ląstelių apoptozės (ląstelių mirties) slopinimas, naviko ir kitų ląstelių apoptozės indukcija; trombocitų aktyvinimas ir žaizdų gijimas; angiogenezės (kraujagyslių proliferacijos) ir fibrogenezės (audinio degeneracijos į jungiamąjį audinį) slopinimas, granulomatozė (granuliomų susidarymas – fagocitų proliferacija ir transformacija) ir daugelis kitų rezultatų.

Šiame skyriuje bus nagrinėjamas integruotas požiūris į citokinų sistemos vertinimą, naudojant anksčiau aprašytus šiuolaikinius tyrimo metodus.

Pirmiausia aprašome pagrindines citokinų sistemos sąvokas.

Citokinai šiuo metu laikomi baltymų-peptidų molekulėmis, kurias gamina įvairios kūno ląstelės ir kurios atlieka tarpląstelinę ir tarpsisteminę sąveiką. Citokinai yra universalūs ląstelės gyvavimo ciklo reguliatoriai, jie kontroliuoja pastarųjų diferenciacijos, proliferacijos, funkcinio aktyvavimo ir apoptozės procesus.

Citokinai, kuriuos gamina imuninės sistemos ląstelės, vadinami imunocitokinais; jie atstovauja imuninės sistemos tirpių peptidinių mediatorių klasei, būtinų jos vystymuisi, veikimui ir sąveikai su kitomis organizmo sistemomis (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Kaip reguliuojančios molekulės, citokinai atlieka svarbų vaidmenį įgyvendinant įgimtas ir adaptacines imuniteto reakcijas, užtikrina jų tarpusavio ryšį, kontroliuoja kraujodaros, uždegimų, žaizdų gijimą, naujų kraujagyslių formavimąsi (angiogenezę) ir daugelį kitų gyvybiškai svarbių procesų.

Šiuo metu yra keletas skirtingų citokinų klasifikacijų, atsižvelgiant į jų struktūrą, funkcinį aktyvumą, kilmę ir citokinų receptorių tipą. Tradiciškai, atsižvelgiant į biologinį poveikį, įprasta išskirti šias citokinų grupes.

1. Interleukinai(IL-1-IL-33) – imuninės sistemos sekreciją reguliuojantys baltymai, užtikrinantys mediatorių sąveiką imuninėje sistemoje ir jos ryšį su kitomis organizmo sistemomis. Interleukinai pagal funkcinį aktyvumą skirstomi į priešuždegiminius ir priešuždegiminius citokinus, limfocitų augimo faktorius, reguliuojančius citokinus ir kt.

3. Naviko nekrozės faktoriai (TNF)- citokinai, turintys citotoksinį ir reguliuojantį poveikį: TNFa ir limfotoksinai (LT).

4. Hematopoetinių ląstelių augimo faktoriai- kamieninių ląstelių augimo faktorius (Kit - ligandas), IL-3, IL-7, IL-11, eritropoetinas, trobopoetinas, granulocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius - GM-CSF, granulocitinis CSF - G-CSF, makrofagas-

ny KSF – M-CSF).

5. Chemokinai- С, СС, СХС (IL-8), СХ3С - įvairių ląstelių tipų chemotaksės reguliatoriai.

6. Ne limfoidinių ląstelių augimo faktoriai- įvairių audinių priklausomybių ląstelių augimo, diferenciacijos ir funkcinio aktyvumo reguliatoriai (fibroblastų augimo faktorius – FGF, endotelio ląstelių augimo faktorius, epidermio augimo faktorius – epidermio EGF) ir transformuojantys augimo faktoriai (TGFβ, TGFα).

Be kita ko, pastaraisiais metais buvo aktyviai tiriamas makrofagų migraciją slopinantis veiksnys (migraciją slopinantis faktorius – MIF), kuris laikomas neurohormonu, turinčiu citokinų ir fermentų aktyvumą (Suslov A.P., 2003; Kovalchuk L.V. ir kt.). ,

Citokinai skiriasi struktūra, biologiniu aktyvumu ir kitomis savybėmis. Tačiau, kartu su skirtumais, citokinai turi bendrosios savybės, būdingas šiai bioreguliacinių molekulių klasei.

1. Citokinai, kaip taisyklė, yra vidutinės molekulinės masės (mažiau nei 30 kD) glikozilinti polipeptidai.

2. Citokinus gamina imuninės sistemos ląstelės ir kitos ląstelės (pavyzdžiui, endotelis, fibroblastai ir kt.), reaguodamos į aktyvuojantį dirgiklį (su patogenais susijusias molekulines struktūras, antigenus, citokinus ir kt.) ir dalyvauja reakcijose. įgimto ir adaptyvaus imuniteto, reguliuojančio jų stiprumą ir trukmę. Kai kurie citokinai sintetinami konstituciškai.

3. Citokinų išskyrimas yra trumpas procesas. Citokinai išlieka ne kaip iš anksto suformuotos molekulės, o veikiau

sintezė visada prasideda nuo genų transkripcijos. Ląstelės gamina citokinus mažomis koncentracijomis (pikogramais mililitre).

4. Daugeliu atvejų citokinai gaminami ir veikia tikslines ląsteles, kurios yra arti (trumpojo nuotolio veikimas). Pagrindinė citokinų veikimo vieta yra tarpląstelinė sinapsė.

5. Perteklius Citokinų sistema pasireiškia tuo, kad kiekvienas ląstelių tipas gali gaminti keletą citokinų, o kiekvieną citokiną gali išskirti skirtingos ląstelės.

6. Visi citokinai yra charakterizuojami pleiotropija, arba veiksmo daugiafunkciškumas. Taigi uždegimo požymiai pasireiškia dėl IL-1, TNFα, IL-6, IL-8 įtakos. Funkcijų dubliavimas užtikrina citokinų sistemos patikimumą.

7. Citokinų poveikį tikslinėms ląstelėms sąlygoja labai specifiniai, didelio afiniteto membraniniai receptoriai, kurie yra transmembraniniai glikoproteinai, dažniausiai susidedantys iš daugiau nei vieno subvieneto. Tarpląstelinė receptorių dalis yra atsakinga už citokinų surišimą. Yra receptorių, kurie pašalina citokinų perteklių patologiniame židinyje. Tai vadinamieji apgaulės receptoriai. Tirpieji receptoriai yra tarpląstelinis membranos receptoriaus domenas, atskirtas fermentu. Tirpieji receptoriai geba neutralizuoti citokinus, dalyvauti juos transportuojant į uždegimo židinį ir pašalinant iš organizmo.

8. Citokinai veikia tinklo pagrindu. Jie gali veikti kartu. Atrodo, kad daugelis funkcijų, iš pradžių priskirtų vienam citokinui, atsirado dėl kelių citokinų suderinto veikimo. (sinergizmas veiksmai). Citokinų sinergetinės sąveikos pavyzdžiai yra uždegiminių reakcijų (IL-1, IL-6 ir TNFa) stimuliavimas, taip pat IgE sintezė.

(IL-4, IL-5 ir IL-13).

Kai kurie citokinai skatina kitų citokinų sintezę (kaskados). Kaskadinis citokinų veikimas yra būtinas uždegiminiam ir imuniniam atsakui vystytis. Vienų citokinų gebėjimas padidinti arba sumažinti kitų gamybą lemia svarbius teigiamus ir neigiamus reguliavimo mechanizmus.

Antagoninis citokinų poveikis yra žinomas, pavyzdžiui, IL-6 gamyba reaguojant į TNF-a koncentracijos padidėjimą gali būti

neigiamas reguliavimo mechanizmas, kontroliuojantis šio mediatoriaus gamybą uždegimo metu.

Tikslinių ląstelių funkcijų citokinų reguliavimas atliekamas naudojant autokrininius, parakrininius arba endokrininius mechanizmus. Kai kurie citokinai (IL-1, IL-6, TNFα ir kt.) gali dalyvauti įgyvendinant visus aukščiau išvardintus mechanizmus.

Ląstelės atsakas į citokinų poveikį priklauso nuo kelių veiksnių:

Nuo ląstelių tipo ir jų pradinio funkcinio aktyvumo;

Nuo vietinės citokino koncentracijos;

Nuo kitų mediatorių molekulių buvimo.

Taigi, prodiuserinės ląstelės, citokinai ir jų specifiniai receptoriai tikslinėse ląstelėse sudaro vieną tarpininkų tinklą. Tai yra reguliuojančių peptidų rinkinys, o ne atskiri citokinai, lemiantys galutinį ląstelės atsaką. Šiuo metu citokinų sistema laikoma universalia viso organizmo lygmens reguliavimo sistema, užtikrinančia apsauginių reakcijų vystymąsi (pavyzdžiui, infekcijos metu).

Pastaraisiais metais kilo idėja apie citokinų sistemą, kuri jungia:

1) gamintojų ląstelės;

2) tirpūs citokinai ir jų antagonistai;

3) tikslinės ląstelės ir jų receptoriai (7.1 pav.).

Įvairių citokinų sistemos komponentų pažeidimai lemia daugybės patologinių procesų vystymąsi, todėl šios reguliavimo sistemos defektų nustatymas yra svarbus teisingai diagnozei ir tinkamo gydymo paskyrimui.

Pirmiausia panagrinėkime pagrindinius citokinų sistemos komponentus.

Citokinus gaminančios ląstelės

I. Pagrindinė ląstelių grupė, gaminančių citokinus adaptaciniame imuniniame atsake, yra limfocitai. Ramybės ląstelės neišskiria citokinų. Atpažinus antigeną ir dalyvaujant receptorių sąveikai (CD28-CD80/86 – T-limfocitams ir CD40-CD40L – B-limfocitams), įvyksta ląstelių aktyvacija, dėl kurios vyksta citokinų genų transkripcija, transliacija ir glikozilintų peptidų sekrecija. į ekstraląstelinę erdvę.

Ryžiai. 7.1. Citokinų sistema

CD4 T pagalbininkus atstovauja subpopuliacijos: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, kurios viena nuo kitos skiriasi išskiriamų citokinų spektru, reaguodamos į įvairius antigenus.

Th0 gamina platų citokinų spektrą labai mažomis koncentracijomis.

Diferenciacijos kryptis Th0 lemia dviejų imuninio atsako formų vystymąsi, kai vyrauja humoraliniai arba ląsteliniai mechanizmai.

Antigeno prigimtis, jo koncentracija, lokalizacija ląstelėje, antigeną pateikiančių ląstelių tipas ir tam tikras citokinų rinkinys reguliuoja Th0 diferenciacijos kryptį.

Dendritinės ląstelės po antigeno surinkimo ir apdorojimo pateikia antigeninius peptidus Th0 ląstelėms ir gamina citokinus, kurie reguliuoja jų diferenciacijos į efektorines ląsteles kryptį. Atskirų citokinų vaidmuo šiame procese parodytas fig. 7.2. IL-12 indukuoja T-limfocitų ir ]ChGK IFNγ sintezę. IFNu suteikia Th1 diferenciaciją, kuri pradeda išskirti citokinus (IL-2, IFNu, IL-3, TNFa, limfotoksinus), kurie reguliuoja reakcijų į tarpląstelinius patogenus vystymąsi.

(uždelsto tipo padidėjęs jautrumas (DTH) ir įvairių tipų ląstelių citotoksiškumas).

IL-4 užtikrina Th0 diferenciaciją į Th2. Aktyvuotas Th2 gamina citokinus (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 ir kt.), kurie lemia B-limfocitų dauginimąsi, tolesnę jų diferenciaciją į plazmines ląsteles ir antikūnų atsakų, daugiausia prieš ekstraląsteliniai patogenai.

IFNy neigiamai reguliuoja Th2 ląstelių funkciją ir, atvirkščiai, Th2 išskiriami IL-4, IL-10 slopina Th1 funkciją (7.3 pav.). Šio reguliavimo molekulinis mechanizmas yra susijęs su transkripcijos faktoriais. T-bet ir STAT4 ekspresija, nustatyta IFNy, nukreipia T-ląstelių diferenciaciją Th1 keliu ir slopina Th2 vystymąsi. IL-4 indukuoja GATA-3 ir STAT6 ekspresiją, kas atitinkamai užtikrina naivių Th0 pavertimą Th2 ląstelėmis (7.2 pav.).

Pastaraisiais metais buvo aprašyta atskira T pagalbinių ląstelių (Th17) subpopuliacija, gaminanti IL-17. IL-17 šeimos narius gali ekspresuoti aktyvuotos atminties ląstelės (CD4 CD45RO), y5T ląstelės, NKT ląstelės, neutrofilai, monocitai, veikiami IL-23, IL-6, TGFβ, kuriuos gamina makrofagai ir dendritinės ląstelės. ROR-C yra pagrindinis diferenciacijos faktorius žmonėms ir ROR-γ pelėms. lĮrodytas esminis IL-17 vaidmuo lėtinio uždegimo ir autoimuninės patologijos vystymuisi (žr. 7.2 pav.).

Be to, T limfocitai užkrūčio liaukoje gali diferencijuotis į natūralias reguliuojančias ląsteles (Treg), ekspresuojančias CD4+ CD25+ paviršiaus žymenis ir FOXP3 transkripcijos faktorių. Šios ląstelės gali slopinti Th1 ir Th2 ląstelių sukeliamą imuninį atsaką per tiesioginį tarpląstelinį kontaktą ir TGFβ bei IL-10 sintezę.

Th0 klonų ir jų išskiriamų citokinų diferenciacijos schemos parodytos Fig. 7.2 ir 7.3 (taip pat žr. spalvų intarpą).

T-citotoksinės ląstelės (CD8+), natūralūs žudikai – silpni citokinų, tokių kaip interferonai, TNFa ir limfotoksinai, gamintojai.

Per didelis vienos iš Th subpopuliacijų aktyvavimas gali lemti vieno iš imuninio atsako variantų išsivystymą. Lėtinis Th aktyvacijos disbalansas gali sukelti imunopatologinių būklių, susijusių su apraiškomis

mi alergijos, autoimuninė patologija, lėtiniai uždegiminiai procesai ir kt.

Ryžiai. 7.2.Įvairios T-limfocitų subpopuliacijos, gaminančios citokinus

II. Įgimtoje imuninėje sistemoje pagrindiniai citokinų gamintojai yra mieloidinės ląstelės. Naudodami į Toll panašius receptorius (TLR), jie atpažįsta panašias įvairių patogenų molekulines struktūras, vadinamuosius su patogenais susijusius molekulinius modelius (PAMP), pvz., pasikartojimus ir kt.

Ši sąveika su TLR sukelia tarpląstelinį signalo perdavimo kaskadą, vedančią prie dviejų pagrindinių citokinų grupių genų ekspresijos: priešuždegiminio ir 1 tipo IFN (7.4 pav., taip pat žr. spalvotą intarpą). Dažniausiai šie citokinai (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, chemokinai ir kt.) skatina uždegimų vystymąsi ir yra susiję su organizmo apsauga nuo bakterinių ir virusinių infekcijų.

Ryžiai. 7.3. Th1 ir Th12 ląstelių išskiriamų citokinų spektras

III. Ląstelės, kurios nėra imuninės sistemos dalis (jungiamojo audinio, epitelio, endotelio ląstelės), konstitutyviai išskiria autokrininius augimo faktorius (GGF, EGF, TGFr ir kt.). ir citokinai, palaikantys hematopoetinių ląstelių dauginimąsi.

Citokinai ir jų antagonistai yra išsamiai aprašytos daugelyje monografijų (Kovalchuk L.V. ir kt., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Ryžiai. 7.4. TLR sukelta citokinų gamybos indukcija, kurią sukelia įgimtos imuninės ląstelės

Pernelyg didelė citokinų ekspresija yra nesaugi organizmui ir gali sukelti per didelę uždegiminę reakciją, ūminės fazės atsaką. Įvairūs inhibitoriai dalyvauja reguliuojant uždegimą skatinančių citokinų gamybą. Taigi buvo aprašyta nemažai medžiagų, kurios nespecifiškai suriša citokiną IL-1 ir neleidžia pasireikšti jo biologiniam poveikiui (a2-makroglobulinas, komplemento C3-komponentas, uromodulinas). Specifiniai IL-1 inhibitoriai gali būti tirpūs jauko receptoriai, antikūnai ir IL-1 receptorių antagonistai (IL-1RA). Vystantis uždegimui, didėja IL-1RA geno ekspresija. Tačiau net ir paprastai šio antagonisto kraujyje yra didelė koncentracija (iki 1 ng / ml ar daugiau), blokuodamas endogeninio IL-1 veikimą.

tikslinės ląstelės

Citokinų poveikis tikslinėms ląstelėms yra tarpininkaujamas per specifinius receptorius, kurie labai dideliu afinitetu jungiasi su citokinais, o atskiri citokinai gali naudoti

bendrieji receptorių subvienetai. Kiekvienas citokinas jungiasi prie savo specifinio receptoriaus.

Citokinų receptoriai yra transmembraniniai baltymai ir skirstomi į 5 pagrindinius tipus. Labiausiai paplitę yra vadinamieji hematopoetiniai receptoriai, turintys du tarpląstelinius domenus, iš kurių viena turi bendrą aminorūgščių liekanų seką iš dviejų triptofano ir serino pasikartojimų, atskirtų bet kuria aminorūgštimi (WSXWS motyvas). Antrojo tipo receptoriai gali turėti du tarpląstelinius domenus su daugybe konservuotų cisteinų. Tai yra IL-10 ir IFN šeimos receptoriai. Trečiasis tipas yra citokinų receptoriai, priklausantys TNF grupei. Ketvirtasis citokinų receptorių tipas priklauso imunoglobulino receptorių šeimai, kurios ekstraląsteliniai domenai yra panašūs į imunoglobulino molekulių struktūrą. Penktasis receptorių tipas, jungiantis chemokinų šeimos molekules, yra transmembraniniai baltymai, kurie kerta ląstelės membraną 7 vietose. Citokinų receptoriai gali egzistuoti tirpios formos, išlaikant gebėjimą surišti ligandus (Ketlinsky S.A. ir kt., 2008).

Citokinai gali paveikti tikslinių ląstelių proliferaciją, diferenciaciją, funkcinį aktyvumą ir apoptozę (žr. 7.1 pav.). Biologinio citokinų aktyvumo pasireiškimas tikslinėse ląstelėse priklauso nuo įvairių tarpląstelinių sistemų dalyvavimo perduodant signalą iš receptoriaus, kuris yra susijęs su tikslinių ląstelių savybėmis. Apoptozės signalas, be kita ko, perduodamas tam tikros TNF receptorių šeimos srities, vadinamosios „mirties“ srities, pagalba (7.5 pav., žr. spalvotą intarpą). Diferenciacijos ir aktyvacijos signalai perduodami per intraląstelinius Jak-STAT baltymus – signalų keitiklius ir transkripcijos aktyvatorius (7.6 pav., žr. spalvų intarpą). G baltymai dalyvauja perduodant signalą iš chemokinų, o tai padidina ląstelių migraciją ir adheziją.

Sudėtinga citokinų sistemos analizė apima šiuos dalykus.

I. Gamintojų ląstelių įvertinimas.

1. Išraiškos apibrėžimas:

Receptoriai, atpažįstantys patogeną arba TCR antigeną, TLR) genų ir baltymų molekulių lygyje (PGR, srauto citometrijos metodas);

Adapterio molekulės, vedančios signalą, sukeliantį citokinų genų transkripciją (PGR ir kt.);

Ryžiai. 7.5. Signalo perdavimas iš TNF receptoriaus

Ryžiai. 7.6. Jak-STAT – 1 tipo citokinų receptorių signalizacijos kelias

Citokinų genai (PGR); citokinų baltymų molekulės (žmogaus mononuklearinių ląstelių citokinų sintezės funkcijos įvertinimas).

2. Ląstelių subpopuliacijų, turinčių tam tikrus citokinus, kiekybinis nustatymas: Th1, Th2 Th17 (citokinų intracelulinio dažymo metodas); ląstelių, išskiriančių tam tikrus citokinus, skaičiaus nustatymas (ELISPOT metodas, žr. 4 skyrių).

II. Citokinų ir jų antagonistų įvertinimas biologinėse organizmo terpėse.

1. Citokinų biologinio aktyvumo tyrimas.

2. Kiekybinis citokinų nustatymas ELISA metodu.

3. Imunohistocheminis citokinų dažymas audiniuose.

4. Priešingų citokinų (pro- ir priešuždegiminių), citokinų ir citokinų receptorių antagonistų santykio nustatymas.

III. Tikslinės ląstelės įvertinimas.

1. Citokinų receptorių raiškos genų ir baltymų molekulių lygiu nustatymas (PGR, srauto citometrijos metodas).

2. Signalinių molekulių nustatymas viduląsteliniame turinyje.

3. Tikslinių ląstelių funkcinio aktyvumo nustatymas.

Buvo sukurta daugybė citokinų sistemos vertinimo metodų, skirtų įvairiai informacijai gauti. Tarp jų išskiriami:

1) molekuliniai biologiniai metodai;

2) kiekybinio citokinų nustatymo imunologinio tyrimo metodais;

3) citokinų biologinio aktyvumo tyrimas;

4) intracelulinis citokinų dažymas;

5) ELISPOT metodas, leidžiantis aptikti citokinus aplink vieną citokinus gaminančią ląstelę;

6) imunofluorescencija.

Pateikiame trumpą šių metodų aprašymą.

Naudojant molekuliniai biologiniai metodai galima tirti citokinų genų raišką, jų receptorius, signalines molekules, tirti šių genų polimorfizmą. Pastaraisiais metais buvo atlikta daugybė tyrimų, kurie atskleidė ryšį tarp citokinų sistemos molekulių genų alelių variantų ir polinkio.

daugeliui ligų. Citokinų genų alelinių variantų tyrimas gali suteikti informacijos apie genetiškai užprogramuotą konkretaus citokino gamybą. Jautriausia yra realaus laiko polimerazės grandininė reakcija – PGR-RT (žr. 6 sk.). hibridizacijos metodas savo vietoje leidžia išsiaiškinti citokinų genų ekspresijos lokalizaciją audiniuose ir ląstelėse.

Kiekybinį citokinų nustatymą biologiniuose skysčiuose ir periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių kultūrose ELISA metodu galima apibūdinti taip. Kadangi citokinai yra vietiniai tarpininkai, tikslingiau jų kiekį atitinkamuose audiniuose išmatuoti po audinių baltymų ekstrahavimo arba natūraliuose skysčiuose, pvz., ašarose, išplovus ertmes, šlapime, vaisiaus vandenyse, smegenų skystyje ir kt. Citokinų kiekis serume ar kituose kūno skysčiuose atspindi esamą imuninės sistemos būklę, t.y. citokinų sintezė kūno ląstelėse in vivo.

Citokinų gamybos lygio nustatymas periferinio kraujo mononuklearinėse ląstelėse (PBMC) parodo funkcinę ląstelių būklę. Spontaniška MNC citokinų gamyba kultūroje rodo, kad ląstelės jau aktyvuotos. in vivo. Sukelta (įvairių stimuliatorių, mitogenų) citokinų sintezė atspindi potencialų, rezervinį ląstelių gebėjimą reaguoti į antigeninį dirgiklį (ypač į vaistų poveikį). Sumažėjusi citokinų gamyba gali būti vienas iš imunodeficito būklės požymių. Citokinai nėra specifiniai konkrečiam antigenui. Todėl specifiškai diagnozuoti infekcines, autoimunines ir alergines ligas, nustatant tam tikrų citokinų kiekį, neįmanoma. Tuo pačiu metu citokinų kiekio įvertinimas leidžia gauti duomenis apie uždegiminio proceso sunkumą, jo perėjimą į sisteminį lygį ir prognozę, imuninės sistemos ląstelių funkcinį aktyvumą, Th1 ir Th2 ląstelių santykį. kuri yra labai svarbi daugelio infekcinių ir imunopatologinių procesų diferencinei diagnostikai.

Biologinėje terpėje citokinus galima kiekybiškai įvertinti naudojant įvairius imunologinio tyrimo metodai, naudojant polikloninius ir monokloninius antikūnus (žr. 4 skyrių). ELISA leidžia sužinoti, kokios yra tikslios citokinų koncentracijos bio-

loginiai kūno skysčiai. ELISA citokinų aptikimas turi nemažai pranašumų prieš kitus metodus (didelis jautrumas, specifiškumas, nepriklausomumas nuo antagonistų buvimo, tikslios automatizuotos apskaitos galimybė, apskaitos standartizavimas). Tačiau šis metodas taip pat turi savo apribojimų: ELISA neapibūdina citokinų biologinio aktyvumo ir gali duoti klaidingus rezultatus dėl kryžminės reakcijos epitopų.

biologinis tyrimas atliekami remiantis žiniomis apie pagrindines citokinų savybes, jų poveikį tikslinėms ląstelėms. Biologinio citokinų poveikio tyrimas leido sukurti keturių tipų citokinų tyrimus:

1) indukuojant tikslinių ląstelių proliferaciją;

2) citotoksiniu poveikiu;

3) skatinant kaulų čiulpų pirmtakų diferenciaciją;

4) antivirusiniu poveikiu.

IL-1 nustatomas pagal stimuliuojantį poveikį pelių timocitų, aktyvuotų mitogeno, proliferacijai. in vitro; IL-2 – pagal gebėjimą stimuliuoti limfoblastų proliferacinį aktyvumą; tirtas citotoksinis poveikis pelių fibroblastams (L929), TNFa ir limfotoksinai. Kolonijas stimuliuojantys veiksniai vertinami pagal jų gebėjimą palaikyti kaulų čiulpų pirmtakų, kaip kolonijų, augimą ant agaro. Antivirusinis IFN aktyvumas nustatomas slopinant citopatinį virusų poveikį diploidinių žmogaus fibroblastų kultūroje ir pelių fibroblastų L-929 navikų linijoje.

Sukurtos ląstelių linijos, kurių augimas priklauso nuo tam tikrų citokinų buvimo. Lentelėje. 7.1 yra citokinų tyrimams naudojamų ląstelių linijų sąrašas. Pagal gebėjimą paskatinti jautrių tikslinių ląstelių dauginimąsi, atliekami IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 ir kt., Tačiau šie tyrimo metodai. nėra labai jautrūs ir informatyvūs. Inhibitorių ir antagonistų molekulės gali užmaskuoti biologinį citokinų aktyvumą. Kai kurie citokinai pasižymi bendru biologiniu aktyvumu. Nepaisant to, šie metodai idealiai tinka specifiniam rekombinantinių citokinų aktyvumui tirti.

7.1 lentelė. Ląstelių linijos, naudojamos citokinų biologiniam aktyvumui patikrinti

Lentelės pabaiga. 7.1

7-1 laboratorija

IL-1 biologinio aktyvumo nustatymas pagal jo komitogeninį poveikį pelių timocitų proliferacijai

Biologinio IL-1 tyrimo metodas pagrįstas citokino gebėjimu stimuliuoti pelių timocitų proliferaciją.

IL-1 galima nustatyti LPS stimuliuojamų monocitų kultūroje, taip pat bet kuriame kūno skystyje. Būtina atkreipti dėmesį į daugybę smulkmenų.

1. Tyrimams naudojami C3H/HeJ pelių timocitai, stimuliuojami daugintis mitogenais (konkanavalinu A – ConA ir fitohemagliutininu – PHA). C3H/HeJ timocitai pasirinkti neatsitiktinai: šios inbredinės linijos pelės nereaguoja į LPS, kurios gali būti tiriamojoje medžiagoje ir sukelti IL-1 gamybą.

2. Timocitai reaguoja į IL-2 ir mitogenus, todėl IL-1 tirtuose preparatuose taip pat reikia nustatyti IL-2 ir mitogenų buvimą.

Veikimo procedūra

1. Paimkite 12×10 6 /ml terpės RPMI 1640 koncentracijos timocitų suspensiją, kurioje yra 10 % galvijų vaisiaus serumo ir 2-merkaptoetanolio (5×10 -5 M).

2. Paruošiama iš eilės eksperimentinių (kūno skysčių) ir kontrolinių mėginių dvigubų skiedimų serija. Biologiniai skysčiai, turintys IL-1, arba mėginiai, gauti inkubuojant mononuklearines ląsteles be LPS, ir laboratorinis standartinis preparatas, turintis IL-1, naudojami kaip kontrolė. 96 šulinėlių apvaliadugnėse plokštelėse po 50 µl kiekvieno skiedimo perpilama į 6 šulinėlius.

3. Į tris kiekvieno skiedimo duobutes įpilkite 50 µl išgryninto PHA (Wellcome), ištirpinto pilnoje terpėje, kurios koncentracija yra 3 µg/ml, ir 50 µl terpės į kitas 3 duobutes.

4. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 µl timocitų suspensijos ir inkubuokite 48 valandas 37°C temperatūroje.

6. Prieš baigiant auginimą, į šulinėlius įpilama 50 μl [" 3 H]-timidino tirpalo (1 μCi / ml) ir inkubuojama dar 20 valandų.

7. Radioaktyvumo lygiui nustatyti kultūros ląstelės perkeliamos ant filtravimo popieriaus naudojant automatinį ląstelių rinktuvą, filtrai išdžiovinami ir etiketės įtraukimas nustatomas skysčių scintiliacijos skaitikliu.

8. Rezultatai išreiškiami stimuliacijos koeficientu.

kur m cp yra vidutinis impulsų skaičius 3 skylėse.

Jei timocitai reaguoja į stimuliavimą standartiniu IL-1, tai tirto mėginio stimuliacijos indeksas, viršijantis 3, patikimai rodo IL-1 aktyvumą.

Biologinis tyrimas yra vienintelis metodas citokino veikimui įvertinti, tačiau šis metodas turėtų būti papildytas įvairių tipų tinkamomis specifiškumo kontrolės priemonėmis, naudojant monokloninius antikūnus. Tam tikrų monokloninių antikūnų pridėjimas prie citokinų kultūroje blokuoja biologinį citokino aktyvumą, o tai įrodo, kad signalas ląstelių linijos proliferacijai yra aptinkamas citokinas.

Naudojant biologinį tyrimą interferonui nustatyti. IFN biologinio aktyvumo vertinimo principas grindžiamas jo antivirusiniu poveikiu, kuris nustatomas pagal tiriamojo viruso dauginimosi slopinimo laipsnį ląstelių kultūroje.

Darbe gali būti naudojamos IFN veikimui jautrios ląstelės: iš pradžių tripsinizuotos vištienos ir žmogaus embrioninės fibroblastų ląstelės, persodinamos žmogaus diploidinių fibroblastų ląstelės bei pelių ląstelių kultūra (L929).

Vertinant antivirusinį IFN poveikį, patartina naudoti trumpo dauginimosi ciklo, didelio jautrumo IFN veikimui virusus: pelių encefalomielito virusą, pelių vezikulinį stomatitą ir kt.

7-2 laboratorija

Interferono aktyvumo nustatymas

1. Diploidinių žmogaus vaisiaus fibroblastų suspensija terpėje su 10 % galvijų embrionų serumo (ląstelių koncentracija - 15-20×10 6 /ml) pilama į sterilias 96 šulinėlių plokščiadugnes lėkštes, po 100 μl į duobutę ir dedama. CO 2 -inkubatoriuje 37 °C temperatūroje.

2. Susidarius pilnam monosluoksniam, auginimo terpė pašalinama iš šulinėlių ir į kiekvieną šulinėlį įpilama 100 µl palaikomosios terpės.

3. IFN aktyvumas tiriamuosiuose mėginiuose titruojamas naudojant dvigubo praskiedimo metodą viename fibroblastų sluoksnyje.

Kartu su mėginiais į duobutes įvedamas pelių encefalomielito virusas (VEM), kurio dozė 48 valandas po užsikrėtimo sukelia 100 % ląstelių pažeidimą.

4. Šuliniai su nepažeistomis (neapdorotomis) virusu užkrėstomis ląstelėmis naudojami kaip kontroliniai mėginiai.

Kiekviename tyrime kaip etaloniniai preparatai naudojami žinomo aktyvumo etaloniniai IFN mėginiai.

5. Mėginio skiedimo plokštelės inkubuojamos 24 valandas 37°C temperatūroje 5 % CO 2 atmosferoje.

6. IFN aktyvumo lygis nustatomas pagal maksimalaus tiriamojo mėginio praskiedimo, dėl kurio viruso citopatinis poveikis atitolinamas 50 %, grįžtamąją vertę ir išreiškiamas aktyvumo vienetais 1 ml.

7. Norint nustatyti IFN tipą, į sistemą pridedamas antiserumas prieš IFNα, IFNβ arba IFNγ. Antiserumas panaikina atitinkamo citokino veikimą, todėl galima nustatyti IFN tipą.

Slopinamojo faktoriaus migracijos biologinio aktyvumo nustatymas.Šiuo metu susiformavusios visiškai naujos idėjos apie MITO prigimtį ir savybes, atrastas praėjusio amžiaus 60-aisiais kaip ląstelinio imuniteto tarpininkas ir daugelį metų paliktas be deramo dėmesio (Bloom B.R., Bennet B., 1966; David J.R. , 1966). Tik per pastaruosius 10–15 metų paaiškėjo, kad MITAS yra vienas iš svarbiausių biologinių tarpininkų organizme, atliekantis įvairias biologines citokino, hormono ir fermento funkcijas. MIF poveikis tikslinėms ląstelėms realizuojamas per CD74 receptorių arba per neklasikinį endocitozės kelią.

MITAS laikomas svarbiu uždegimo tarpininku, aktyvinančiu makrofagų funkciją (citokinų gamybą, fagocitozę, citotoksiškumą ir kt.), taip pat endogeniniu imunoreguliaciniu hormonu, moduliuojančiu gliukokortikoidų aktyvumą.

Sukaupiama vis daugiau informacijos apie MITO vaidmenį daugelio uždegiminių ligų, įskaitant sepsį, reumatoidinį artritą (RA), glomerulonefritą ir kt., patogenezėje. Sergant RA, MITO koncentracija pažeistų sąnarių skystyje žymiai padidėja. , kuris koreliuoja su ligos sunkumu. MIF įtakoje padidėja priešuždegiminių citokinų gamyba tiek makrofagų, tiek sinovijų ląstelėse.

Yra įvairių MIF aktyvumo tyrimo metodų, kai migruojančios ląstelės (MIF tikslinės ląstelės) dedamos į stiklinį kapiliarą (kapiliarinis testas), į agarozės lašą arba į agarozės šulinį.

Pateikiame gana paprastą atrankos metodą, pagrįstą ląstelių mikrokultūrų (leukocitų arba makrofagų) formavimu standartiniu plotu ir ląstelių skaičiumi 96 šulinėlių plokščiadugnės plokštelės šulinių apačioje, po to jų kultivavimu maistinėje terpėje. ir šių mikrokultūrų ploto pokyčio nustatymas veikiant MIF (Suslov A.P., 1989).

7-3 laboratorija

MITO veiklos apibrėžimas

MIF biologinio aktyvumo nustatymas atliekamas naudojant ląstelių mikrokultūrų formavimo prietaisą (7.7 pav.) - MIGROSCRIN (Rusijos medicinos mokslų akademijos N. F. Gamaleya pavadintas epidemiologijos ir mikrobiologijos tyrimų institutas).

1. Į 96 šulinėlių plokštelės šulinukus (Flow, UK ar panašiai) įpilkite 100 µl mėginio, praskiesto auginimo terpėje, kuriame nustatomas MIF aktyvumas (kiekvienas skiedimas 4 lygiagrečiais, eksperimentiniai mėginiai). Auginimo terpėje yra RPMI 1640, 2 mM L-glutamino, 5% galvijų vaisiaus serumo, 40 μg/ml gentamicino.

2. Į kontrolinius šulinėlius įpilkite auginimo terpės (4 lygiagrečiai) 100 µl.

3. Paruošiama pilvaplėvės makrofagų ląstelių suspensija, kuriai 2 hibridinėms pelėms (CBAxC57B1 / 6) F1 į pilvaplėvės ertmę įšvirkščiama 10 ml Hanko tirpalo su heparinu (10 V/ml), pilvas švelniai masažuojamas 2-3 min. . Tada gyvūnas skerdžiamas nupjaunant galvą, kirkšnies srityje atsargiai perveriama pilvo siena, o eksudatas švirkštu įsiurbiamas per adatą. Pilvaplėvės eksudato ląstelės du kartus plaunamos Hanko tirpalu, centrifuguojant jas 10-15 minučių 200 g greičiu. Tada paruošiama ląstelių suspensija, kurios koncentracija yra 10±1 mln./ml terpės RPMI 1640. Skaičiavimas atliekamas Gorjajevo kameroje.

4. Surenkama MIGROSCRIN sistema, kuri yra stelažas, skirtas kryptiniam ir standartiniam antgalių fiksavimui su ląstelių kultūromis griežtai vertikalioje padėtyje tam tikrame aukštyje virš 96 šulinėlių kultūros plokštelės šulinėlio centro, taip pat apima 92 antgalius. automatinei pipetei iš Costar, JAV (.7.7 pav.).

Įkiškite trikojo kojeles į plokštės kampinius šulinius. Ląstelių suspensija surenkama automatine pipete į antgalius – po 5 μl, nuplaunama nuo ląstelių pertekliaus vieną kartą panardinant į terpę ir vertikaliai įkišama į sistemos stovo lizdus. Užpildytas stovas su antgaliais laikomas kambario temperatūroje 1 valandą ant griežtai horizontalaus paviršiaus. Per šį laiką suspensijos ląstelės nusėda šulinėlių dugne, kur susidaro standartinės ląstelių mikrokultūros.

5. Atsargiai nuimkite antgalių laikiklį nuo plokštės. Plokštelė su ląstelių mikrokultūra dedama griežtai horizontalioje padėtyje CO 2 inkubatoriuje, kur kultivuojama 20 val.. Kultivavimo metu ląstelės migruoja šulinėlio dugnu.

6. Rezultatų kiekybinis įvertinimas po inkubacijos atliekamas naudojant žiūroną, vizualiai įvertinant kolonijos dydį okuliaro viduje esančioje skalėje. Mikrokultūros yra apskritimo formos. Tada tyrėjai nustato vidutinį kolonijos skersmenį pagal kolonijų matavimų rezultatus 4 bandymo arba kontroliniuose šuliniuose. Matavimo paklaida yra ±1 mm.

Migracijos indeksas (MI) apskaičiuojamas pagal formulę:

Mėginys turi MITO aktyvumą, jei MI reikšmės yra lygios

Įprasto MYTH aktyvumo vieneto (U) atvirkštinė vertė yra lygi didžiausio mėginio (mėginio) praskiedimo vertei, kai migracijos indeksas yra 0,6 ± 0,2.

Biologinis PEO aktyvumasα yra įvertintas pagal jo citotoksinį poveikį transformuotų fibroblastų L-929 linijai. Rekombinantinis TNFa naudojamas kaip teigiama kontrolė, o ląstelės auginimo terpėje naudojamos kaip neigiama kontrolė.

Citotoksinis indeksas (PI) apskaičiuojamas:

kur a- gyvų ląstelių skaičius kontrolėje; b- gyvų ląstelių skaičius eksperimente.

Ryžiai. 7.7. Schema MIGROSCRIN - prietaisai, skirti kiekybiniam ląstelių kultūrų migracijos įvertinimui

Ląstelės nudažomos dažais (metileno mėlynuoju), kuris patenka tik į negyvas ląsteles.

Įprastam TNF aktyvumo vienetui imama atvirkštinio mėginio praskiedimo vertė, kuri būtina norint gauti 50 % ląstelių citotoksiškumo. Specifinis mėginio aktyvumas yra aktyvumo savavališkais vienetais 1 ml ir mėginyje esančio baltymo koncentracijos santykis.

Intraląstelinis citokinų dažymas. Ląstelių, gaminančių įvairius citokinus, santykio pokytis gali atspindėti ligos patogenezę ir būti ligos prognozės bei gydymo vertinimo kriterijus.

Intraląstelinio dažymo metodas nustato citokino ekspresiją vienos ląstelės lygyje. Srauto citometrija leidžia suskaičiuoti ląstelių, ekspresuojančių tam tikrą citokiną, skaičių.

Išvardinkime pagrindinius tarpląstelinių citokinų nustatymo etapus.

Nestimuliuojamos ląstelės gamina nedidelį kiekį citokinų, kurie, kaip taisyklė, nenusėda, todėl svarbus žingsnis vertinant tarpląstelinius citokinus yra limfocitų stimuliavimas ir šių produktų išsiskyrimo iš ląstelių blokavimas.

Baltymų kinazės C aktyvatorius forbol-12-miristato-13-acetatas (PMA) kartu su kalcio jonoforo jonomicinu (IN) dažniausiai naudojamas kaip citokinų induktorius. Šio derinio naudojimas sukelia plataus spektro citokinų sintezę: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. FMA-IN naudojimo trūkumas yra CD4 molekulių aptikimo limfocitų paviršiuje problema po tokio aktyvavimo. Be to, naudojant mitogenus (PGA), T-limfocitai skatina citokinų gamybą. B ląstelės ir monocitai stimuliuoja

Vienabranduolinės ląstelės inkubuojamos su citokinų gamybos induktoriais ir jų intracelulinio transportavimo blokatoriumi – brefeldinu A arba monenzinu, 2-6 valandas.

Tada ląstelės resuspenduojamos buferiniame tirpale. Fiksavimui pridėti 2% formaldehido, inkubuoti 10-15 min kambario temperatūroje.

Tada ląstelės apdorojamos saponinu, kuris padidina ląstelės membranos pralaidumą, ir dažomos monokloniniais antikūnais, būdingais nustatytinams citokinams. Preliminarus paviršiaus žymenų (CD4, CD8) dažymas padidina gaunamos informacijos apie ląstelę kiekį ir leidžia tiksliau nustatyti jos populiacijos priklausomybę.

Aukščiau aprašytų metodų taikymas turi tam tikrų apribojimų. Taigi naudojant juos neįmanoma išanalizuoti vienos ląstelės citokinų sintezės, neįmanoma nustatyti citokinus gaminančių ląstelių skaičiaus subpopuliacijoje, neįmanoma nustatyti, ar citokinus gaminančios ląstelės ekspresuoja unikalius žymenis, ar skiriasi citokinus sintetina skirtingos ląstelės arba tos pačios. Atsakymas į šiuos klausimus gaunamas naudojant kitus tyrimo metodus. Norint nustatyti citokinus gaminančių ląstelių dažnį populiacijoje, naudojamas ribinio praskiedimo metodas ir su fermentais susieto imunosorbento tyrimo ELISPOT variantas (žr. 4 skyrių).

In situ hibridizacijos metodas. Metodas apima:

2) fiksavimas paraformaldehidu;

3) mRNR aptikimas naudojant pažymėtą cDNR. Kai kuriais atvejais citokinų mRNR yra nustatoma pjūviuose naudojant radioizotopų PGR.

Imunofluorescencija. Metodas apima:

1) organo užšaldymas ir kriostato sekcijų paruošimas;

2) fiksavimas;

3) pjūvių apdorojimas fluoresceinu pažymėtais anticitokinų antikūnais;

4) vizualinis fluorescencijos stebėjimas.

Šie metodai (hibridizacija savo vietoje ir imunofluorescencija) yra greiti ir nepriklauso nuo išskiriamo produkto slenkstinės koncentracijos. Tačiau jie nenustato išskiriamo citokino kiekio ir gali būti techniškai sudėtingi. Būtina įvairiai atidžiai stebėti nespecifines reakcijas.

Taikant pateiktus citokinų vertinimo metodus, nustatyti patologiniai procesai, susiję su įvairių lygių citokinų sistemos sutrikimais.

Taigi citokinų sistemos įvertinimas itin svarbus apibūdinant organizmo imuninės sistemos būklę. Įvairių lygių citokinų sistemos tyrimas leidžia gauti informacijos apie skirtingų tipų imunokompetentingų ląstelių funkcinį aktyvumą, uždegiminio proceso sunkumą, jo perėjimą į sisteminį lygmenį, ligos prognozę.

Klausimai ir užduotys

1. Išvardykite bendrąsias citokinų savybes.

2. Pateikite citokinų klasifikaciją.

3. Išvardykite pagrindinius citokinų sistemos komponentus.

4. Išvardykite citokinus gaminančias ląsteles.

5. Apibūdinkite citokinų receptorių šeimas.

6. Kokie yra citokinų tinklo veikimo mechanizmai?

7. Papasakokite apie citokinų gamybą įgimtoje imuninėje sistemoje.

8. Kokie pagrindiniai metodai kompleksiniam citokinų sistemos įvertinimui?

9. Kokie yra kūno skysčių citokinų tyrimo metodai?

10. Kokie yra citokinų sistemos defektai sergant įvairiomis patologijomis?

11. Kokie yra pagrindiniai IL-1, IFN, MIF, TNFa biologinio tyrimo metodai biologiniuose skysčiuose?

12. Apibūdinkite citokinų tarpląstelinio kiekio nustatymo procesą.

13. Apibūdinkite vienos ląstelės išskiriamų citokinų nustatymo procesą.

14. Apibūdinkite metodų, naudojamų nustatant defektą citokinų receptoriaus lygyje, seką.

15. Apibūdinkite metodų, naudojamų defektui nustatyti citokinus gaminančių ląstelių lygyje, seką.

16. Kokią informaciją galima gauti tiriant citokinų gamybą mononuklearinių ląstelių kultūroje, kraujo serume?

Citokinams priskiriami įvairūs 15-40 kDa molekulinės masės baltymai, kuriuos sintetina įvairios organizmo ląstelės. Citokinai – tai molekulės, užtikrinančios imuninės sistemos, kraujagyslių endotelio, nervų sistemos ir kepenų ląstelių sąveiką. Šiuo metu žinoma daugiau nei 200 citokinų.

Tuos pačius citokinus gali sintetinti skirtingų tipų ląstelės – imuninės sistemos, blužnies, užkrūčio liaukos, jungiamojo audinio. Kita vertus, tam tikra ląstelė gali gaminti daug skirtingų citokinų. Didžiausią citokinų įvairovę sudaro limfocitai, dėl to limfocitinis imunitetas sąveikauja su kitais imuniniais mechanizmais ir su visu kūnu.

Esminis citokinų bruožas, priešingai nei hormonų ir kitų signalinių molekulių, yra vienodas, skirtingas ar net priešingas jų veikimo skirtingoms ląstelėms rezultatas. Tie. Galutinis citokino poveikio rezultatas priklauso ne nuo jo tipo, o nuo tikslinės ląstelės vidinės programos, nuo jos individualių užduočių!

Citokinų funkcijos

Citokinų vaidmenį reguliuojant kūno funkcijas galima suskirstyti į 4 pagrindinius komponentus:

1. Organų, įskaitant imuninės sistemos organus, embriogenezės, klojimo ir vystymosi reguliavimas.

2. Audinių augimo procesų reguliavimas:

3. Individualių fiziologinių funkcijų reguliavimas:

  • užtikrinti ląstelių funkcinį aktyvumą,
  • endokrininės, imuninės ir nervų sistemos reakcijų koordinavimas,
  • kūno homeostazės (dinaminės pastovumo) palaikymas.

4. Apsauginių organizmo reakcijų reguliavimas vietiniu ir sisteminiu lygiu:

  • imuninio atsako trukmės ir intensyvumo pokyčiai (antinavikinė ir antivirusinė organizmo apsauga),
  • uždegiminių reakcijų moduliavimas,
  • dalyvavimas autoimuninių reakcijų vystyme.
  • ląstelių augimo stimuliavimas arba slopinimas,
  • dalyvavimas hematopoezės procese.