S pozitivnim RSC v poskusu opazimo. Reakcija fiksacije komplementa

Reakcija vezave komplementa (RCC) temelji na dejstvu, da specifičen kompleks antigen-protitelo vedno adsorbira (veže) komplement nase.

Ta reakcija se pogosto uporablja pri identifikaciji antigenov in serodiagnostiki okužb, zlasti bolezni *, ki jih povzročajo spirohete (Wassermannova reakcija), rikecije in virusi.

RSK je kompleksna serološka reakcija. Vključuje komplement in dva sistema antigen-protitelo. V bistvu gre za dve serološki reakciji.

Prvi sistem, glavni, sestavljata antigen in protitelo (enega poznamo, drugega ne). Dodana mu je določena količina komplementa. Ko se antigen in protitelo tega sistema ujemata, se bosta povezala in vezala komplement. Nastali kompleks je fino razpršen in ni viden.

Tvorbo tega kompleksa poznamo s pomočjo drugega hemolitičnega ali indikatorskega sistema. Vključuje ovčje eritrocite (antigen) in ustrezen hemolitični serum (protitelesa), to je že pripravljen imunski kompleks. V tem sistemu lahko pride do lize eritrocitov le v prisotnosti komplementa. Če je komplement vezan na prvi sistem (če se antigen in protitelo v njem ujemata), potem v drugem sistemu ne bo hemolize - ker ni prostega komplementa. Odsotnost hemolize (vsebina epruvete je motna ali je na dnu epruvete sediment eritrocitov) se zabeleži kot pozitiven rezultat RSK.

Če se v prvem sistemu antigen ne ujema s protitelesom, potem imunski kompleks ne nastane in bo komplement ostal prost! Ko ostane prost, komplement sodeluje v drugem sistemu, kar povzroči hemolizo - rezultat RSK je negativen (vsebina epruvet je prozorna - "lakasta kri").

Komponente reakcije fiksacije komplementa:

Antigen - običajno lizat, ekstrakt, hapten; odložite manj pogosto.

1.Protitelesa-serum bolnikovega sistema
2. Komplement - serum morskega prašička

3. Antigen - ovčji eritrociti

4.Protitelesa - hemolizin na ovnove eritrocite

5. Izotonična raztopina

Glede na to, da je v RSC vključenih veliko število kompleksnih komponent, jih je treba predhodno titrirati in vzeti v reakcijo v natančnih količinah in v enakih volumnih: 0,5 ali 0,25, manj pogosto 0,2 ml. V skladu s tem se celoten poskus izvaja v volumnih 2,5, 1,25 ali 1,0 ml (večji volumni dajo natančnejši rezultat). Titracijo reakcijskih komponent izvedemo v enakem volumnu kot poskus, pri čemer manjkajoče sestavine nadomestimo z izotonično raztopino.

Priprava sestavin

Hemolitični serum (hemolizin). Serum je razredčen 3-krat manj od njegovega titra (glej str. 211). Pripravite skupno razredčino seruma za celoten poskus, katerega prostornino določite tako, da pomnožite prostornino seruma v eni epruveti (npr. 0,5 ml) s številom epruvet, ki je nekoliko večje od števila teh v poskusu.

2. Ovčji eritrociti. Za celotno število epruvet v poskusu pripravimo 3 % suspenzijo izpranih ovčjih eritrocitov (glej str. 211). Za pripravo hemolitičnega sistema 30 minut pred dodajanjem v poskus zmešamo enake količine razredčenega hemolizina in suspenzije eritrocitov, eritrocitom dodamo serum, temeljito premešamo in inkubiramo 30 minut pri 37 °C.

3. Komplement je običajno razredčen v razmerju 1:10. pred vsakim poskusom ga je treba titrirati. Titer komplementa je njegova najmanjša količina, pri dodajanju v hemolitični sistem pride do popolne hemolize v 1 uri pri 37°C. Shema titracije komplementa je predstavljena v tabeli 21.

Pozor! Kompliment se titrira v enakem volumnu kot glavni poskus, pri čemer se manjkajoče sestavine nadomestijo z izotonično raztopino.

Računovodstvo rezultatov. V kontrolah ne sme biti niti sledi hemolize, saj eni manjka komplement, drugi pa hemolizin. Kontrole kažejo na odsotnost reakcij hemotoksičnosti (zmožnost spontane lize eritrocitov) v komponentah.

V tabeli. Na primer, titer komplementa v razredčitvi 1:10 je 0,15 ml. V poskusu se lahko aktivnost komplementa zmanjša zaradi njegove nespecifične adsorpcije z drugimi komponentami reakcije, zato se za poskus poveča količina komplementa: vzame se odmerek, ki sledi titru. To je delovni odmerek. V navedenem primeru je enak 0,2 komplementa v razredčitvi 1:10. Ker je treba vse komponente, vključene v CSC, vzeti v enakih količinah (v našem primeru je to 0:5 ml), je treba delovnemu odmerku komplementa (0,2 ml 1:10) dodati 0,3 ml izotonične raztopine. Za celotno izkušnjo, volumen vsakega od njih (komplement in izotonična raztopina.

Za celoten poskus se volumen vsakega od njih (komplementa in izotonične fiziološke raztopine) pomnoži s številom epruvet, vključenih v CSC. Na primer, za izvedbo poskusa v 50 epruvetah morate vzeti 10 ml komplementa 1:10 (0,2 ml x 50) in 15 ml izotonične raztopine (0,3 ml x 50).

4. Antigen običajno dobimo že pripravljen z navedbo njegovega titra, tj. količino, ki naj bi jo po razredčitvi antigena vseboval 1 ml. na primer pri titru 0,4 ga razredčimo v 0,96 ml izotonične fiziološke raztopine. V poskusu vzamem količino antigena, ki je enaka polovici titra (0,5 ml). To je njegov delovni odmerek. Povejte skupno razredčino antigena za celotno izkušnjo, pri čemer 0,5 ml pomnožite s številom epruvet v izkušnji.

5. Protitelesa - bolnikov serum. Svež serum pred poskusom inaktiviramo, da uničimo v njem prisoten komplement. Da bi to naredili, ga segrevamo 30 minut pri 56 °C v vodni kopeli ali v inaktivatorju s termostatom. Slednja metoda je boljša: odpravlja možnost pregrevanja seruma, to je njegove denaturacije. Denaturirani serumi niso primerni za testiranje. Bolnikov serum običajno uporabljamo v razredčini od 1:10 do 1:160.

Tabela št. 14

Sestavine, ml	epruvete
izkušnje	nadzor
										Hemolitični sistem	eritrocitov
Izotonična raztopina	1,45	1,4	1,35	1,3	1,25	1,2	1,15	1,1	1,05	1,0	1,5	1,5
Dopolnilo 1:10	0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3	0,35	0,4	0,45	0,5	―	0,5
Hemolitični sistem	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	―
3% suspenzija ovčjih eritrocitov	―	―	―	―	―	―	―	―	―	―	―	0,5
Epruvete temeljito pretresemo in inkubiramo pri 37 °C 1 uro.
rezultat	Brez hemolize	hemoliza	Brez hemolize

Imunski serumi so najpogosteje pripravljeni v industrijskih pogojih in sproščeni inaktivirani. Vzgajajo se 1:50 in več.

Vse komponente so pripravljene z rahlim presežkom.

Sestavine, ml	epruvete

Nadzor nad izkušnjami
	serum	antigen	Hemolitični sistem	Dopolnilo v delovnem odmerku
½
Faza 1 Izotonična fiziološka raztopina	―	0,5	0,5	1,5	1,25	1,0	0,5
Testirani serum razredčen 1:10	0,5	0,5	―	―	―	―	―
Antigen v delovnem odmerku	0,5		0,5	―	―	―	―
Dopolnilo 1:10 v delovnem odmerku	0,5	0,5	0,5	―	0,25	0,5	1,0
Epruvete temeljito pretresemo in inkubiramo pri 37 °C 45 minut 1 uro ali 4 °C 18 ur.
2. faza hemolitičnega sistema	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Epruvete temeljito pretresemo in inkubiramo pri 37 °C do popolne hemolize v 2, 3, 6 in 7 epruvetah.
Rezultat	Pozitivno ali negativno	―	―	++++	(+)	―	―

Tabela št. 15

Vodenje glavne izkušnje

Pri postavitvi poskusa je izjemno; pomemben je vrstni red dodajanja komponent. Poskus poteka v dveh fazah.

I. faza. V epruvete vlijemo zahtevano količino izotonične raztopine natrijevega klorida, nato zahtevano količino razredčenega seruma in delovni odmerki antigena in komplementa v istem volumnu. Izkušnjo nujno spremlja kontrola vseh sestavin, ki sodelujejo pri njej: seruma, antigena, hemolitičnega sistema in komplementa.

Epruvete temeljito pretresemo in inkubiramo pri 37 °C 45 min-1 h ali pri 4 °C (»CSC na hladnem«) 18 h V tem času v prisotnosti specifičnega kompleksa pride do fiksacije komplementa. Izvajanje reakcije "na hladnem" bistveno poveča njeno občutljivost in specifičnost.

Faza II Ob koncu inkubacije dodamo v vse epruvete po 1 ml hemolitičnega sistema, ki ga predhodno 30 minut hranimo v termostatu (senzibiliziramo). Epruvete pretresemo in vstavimo nazaj v termostat.

Računovodski rezultat o pri. Epruvete pustimo v termostatu do popolne hemolize v 2., 3., 6. in 7. epruveti (kontrola seruma, antigena in komplementa za en in dva odmerka). Najprej bo prišlo do hemolize v 7. epruveti, ki vsebuje dvojno količino komplementa. Ko v tej epruveti pride do hemolize in njena vsebina postane popolnoma prozorna, morate skrbno spremljati preostale kontrole. Takoj, ko tekočina v 2., 3. in 6. epruveti postane prozorna, morate stojalo z epruvetami takoj odstraniti iz termostata. Da poskus ni bil v termostatu dlje, kot je bilo potrebno, kaže prisotnost rahle motnosti (nepopolna hemoliza) v 5. epruveti - vsebuje le polovico delovne doze komplementa in popolna hemoliza ob pravilni nastavitvi poskus ne more biti.

Hemoliza v kontrolah seruma in antigena (epruveti 2 in 3) kaže, da sta bila njuna odmerka pravilno izbrana in da se niti serum niti antigen komplementa ne vežeta sama.

Pri kontroli hemolitičnega sistema (epruveta 4), če deluje pravilno, ne bi smelo biti niti sledi hemolize - manjka mu komplement.

Ko se prepričate, da so bile kontrole pravilno opravljene, se lahko upoštevajo izkušnje. Odsotnost hemolize v epruvetah izkušenj se šteje za pozitiven rezultat reakcije. Kaže, da so v serumu protitelesa, ki so specifična za odvzeti antigen. Kompleks, ki ga tvorijo, je vezal komplement in preprečil njegovo sodelovanje v reakciji hemolize. Če v epruvetah pride do hemolize, ocenimo rezultat reakcije kot negativen. V tem primeru ni korespondence med antigenom in protitelesom, komplement ni vezan in sodeluje v reakciji hemolize.

Vzporedno s pacientovim serumom izvedemo enak poskus z znanim pozitivnim serumom (to je s serumom, v katerem so protitelesa proti danemu antigenu) in znanim negativnim, v katerem ni specifičnih protiteles. Pri pravilni postavitvi poskusa naj bi v prvem primeru prišlo do zakasnitve hemolize, v drugem primeru pa do hemolize.

Intenzivnost reakcije je izražena na naslednji način:

Popolna zakasnitev hemolize. Eritrociti tvorijo enakomerno motnost ali se usedejo na dno. V tem primeru tekočina v epruveti postane brezbarvna;

Lizira približno 25% eritrocitov. Usedlina je manjša, tekočina nad njo je rahlo rožnata. Tudi rezultat RSC je ocenjen kot izrazito pozitiven;

Lizira približno 50% eritrocitov. Usedlina je majhna, tekočina je rožnata. Pozitiven rezultat RSK;

Lizira približno 75% eritrocitov. Neznaten sediment, nad njim intenzivno obarvana tekočina. Dvomljiv rezultat RSK;

Vsi eritrociti so bili lizirani. Tekočina je intenzivne barve in popolnoma prozorna. Negativen rezultat RSK.

Laboratorijska diagnostika skoraj vseh nalezljivih bolezni temelji na odkrivanju protiteles v pacientovi krvi, ki se proizvajajo proti antigenom povzročitelja, z metodami seroloških reakcij. V medicinsko prakso so vstopili od konca devetnajstega do začetka dvajsetega stoletja.

Razvoj znanosti je pomagal ugotoviti antigensko strukturo mikrobov in kemijske formule njihovih toksinov. To je omogočilo ustvarjanje ne le terapevtskih, ampak tudi diagnostičnih serumov. Pridobivajo se z dajanjem oslabljenih patogenov laboratorijskim živalim. Po večdnevni izpostavljenosti pripravimo pripravke iz krvi zajcev ali miši, s katerimi s serološkimi testi identificiramo mikrobe ali njihove toksine.

Zunanja manifestacija takšne reakcije je odvisna od pogojev njenega nastanka in od stanja antigenov v bolnikovi krvi. Če so mikrobni delci netopni, se oborijo, lizirajo, vežejo ali imobilizirajo v serumu. Če so antigeni topni, se pojavi pojav nevtralizacije ali precipitacije.

Aglutinacijska reakcija (RA)

Serološka reakcija aglutinacije je zelo specifična. Je enostavna za izvedbo in dovolj vizualna, da lahko hitro ugotovimo prisotnost antigenov v bolnikovem krvnem serumu. Uporablja se za postavitev Vidalove reakcije (diagnoza tifusa in paratifusa) in Weiglove reakcije (tifus).

Temelji na specifični interakciji med človeškimi protitelesi (ali aglutinini) in mikrobnimi celicami (aglutenogeni). Po njuni interakciji nastanejo delci, ki se oborijo. To je pozitiven znak. Za postavitev reakcije se lahko uporabijo živi ali ubiti mikrobi, glive, praživali in somatske celice.

Kemično je reakcija razdeljena na dve stopnji:

Specifična povezava protiteles (AT) z antigeni (AG).
Nespecifično - obarjanje konglomeratov AG-AT, to je tvorba aglutinata.

Indirektna aglutinacijska reakcija (IPHA)

Za njegovo proizvodnjo se uporabljajo prečiščeni ovčji eritrociti in človeške rdeče krvne celice, predhodno obdelani s protitelesi ali antigeni (odvisno od tega, kaj točno želi laboratorij najti). V nekaterih primerih se človeške rdeče krvne celice zdravijo z imunoglobulini. Za serološke reakcije eritrocitov štejemo, da so se ti usedli na dno epruvete. O pozitivni reakciji lahko govorimo, ko so celice razporejene v obliki obrnjenega dežnika, ki zavzema celotno dno. Negativna reakcija se šteje, če so se eritrociti usedli v stolpec ali v obliki gumba na sredini dna.

Reakcija padavine (RP)

Serološki testi te vrste se uporabljajo za odkrivanje izredno majhnih delcev antigenov. To so lahko na primer beljakovine (ali njihovi deli), spojine beljakovin z lipidi ali ogljikovimi hidrati, deli bakterij, njihovi toksini.

Serume za reakcijo dobimo z umetno okužbo živali, običajno kuncev. S to metodo lahko dobite popolnoma kateri koli obarjajoči serum. Nastavitev seroloških precipitacijskih reakcij je po mehanizmu delovanja podobna reakcijam aglutinacije. Protitelesa v serumu se združijo z antigeni in tvorijo velike proteinske molekule, ki se odložijo na dno epruvete ali na substrat (gel). Ta metoda velja za zelo specifično in lahko zazna celo zanemarljive količine snovi.

Uporablja se za diagnosticiranje kuge, tularemije, antraksa, meningitisa in drugih bolezni. Poleg tega se ukvarja s sodnomedicinsko preiskavo.

v gelu

Serološke reakcije se lahko izvajajo ne samo v tekočem mediju, ampak tudi v agar gelu. To se imenuje metoda difuznega obarjanja. Z njegovo pomočjo se proučuje sestava kompleksnih antigenskih mešanic. Ta metoda temelji na kemotaksi antigenov protiteles in obratno. V gelu se premikajo drug proti drugemu z različnimi hitrostmi in ob srečanju tvorijo padavinske črte. Vsaka vrstica je en niz AG-AT.

Reakcija nevtralizacije eksotoksina z antitoksinom (RN)

Antitoksični serumi lahko nevtralizirajo delovanje eksotoksina, ki ga proizvajajo mikroorganizmi. Na tem temeljijo te serološke reakcije. Mikrobiologija uporablja to metodo za titriranje serumov, toksinov in toksoidov ter določanje njihove terapevtske aktivnosti. Moč nevtralizacije toksinov je določena s konvencionalnimi enotami - AE.

Poleg tega je zahvaljujoč tej reakciji mogoče določiti vrsto ali vrsto eksotoksina. To se uporablja za davico, botulizem. Študija se lahko izvaja tako "na steklu" kot v gelu.

Reakcija lize (RL)

Imunski serum, ki vstopi v bolnikovo telo, ima poleg svoje glavne funkcije pasivne imunosti tudi lizirske lastnosti. Sposoben je raztopiti mikrobne povzročitelje, celične tujke in viruse, ki vstopajo v bolnikovo telo. Odvisno od specifičnosti protiteles, vključenih v serum, so izolirani bakteriolizini, citolizini, spirohetolizini, hemolizini in drugi.

Ta specifična protitelesa se imenujejo "komplement". Nahaja se v skoraj vseh človeških telesnih tekočinah, ima kompleksno beljakovinsko strukturo in je izjemno občutljiv na dvig temperature, tresenje, delovanje kislin in direktno sončno svetlobo. Toda v posušenem stanju lahko ohrani svoje lizirajoče lastnosti do šest mesecev.

Obstajajo takšne vrste seroloških reakcij te vrste:

bakterioliza;

hemoliza.

Bakteriolizo izvajamo s pacientovim krvnim serumom in specifičnim imunskim serumom z živimi mikrobi. Če je v krvi dovolj komplementa, bo raziskovalec videl, da bakterije lizirajo, in reakcija se bo štela za pozitivno.

Druga serološka reakcija krvi je, da suspenzijo bolnikovih eritrocitov obdelamo s serumom, ki vsebuje hemolizine, ki se aktivirajo le ob prisotnosti določenega komplimenta. Če obstaja, potem laboratorijski pomočnik opazuje raztapljanje rdečih krvnih celic. Ta reakcija se v sodobni medicini pogosto uporablja za določanje titra komplementa (to je njegove najmanjše količine, ki izzove lizo eritrocitov) v krvnem serumu in za testiranje fiksacije komplementa. Na ta način se izvede serološka reakcija na sifilis -

Reakcija vezave komplementa (CFR)

Ta reakcija se uporablja za odkrivanje protiteles proti povzročitelju okužbe v bolnikovem krvnem serumu, pa tudi za identifikacijo patogena po njegovi antigenski strukturi.

Do te točke smo opisali preproste serološke reakcije. RSK velja za kompleksno reakcijo, saj v njej ne delujeta dva, ampak trije elementi: protitelo, antigen in komplement. Njegovo bistvo je v tem, da do interakcije med protitelesom in antigenom pride le v prisotnosti proteinov komplementa, ki se adsorbirajo na površini nastalega kompleksa AG-AT.

Sami antigeni se po dodatku komplementa bistveno spremenijo, kar kaže na kakovost reakcije. Lahko je liza, hemoliza, imobilizacija, baktericidno ali bakteriostatsko delovanje.

Sama reakcija poteka v dveh fazah:

Tvorba kompleksa antigen-protitelo, ki ga preiskovalec vizualno ne vidi.
Sprememba antigena z delovanjem komplementa. To fazo je največkrat mogoče izslediti s prostim očesom. Če reakcija ni vizualno vidna, se za prepoznavanje sprememb uporabi dodaten indikatorski sistem.

indikatorski sistem

Ta reakcija temelji na fiksaciji komplementa. Prečiščene ovnove eritrocite in hemolitični serum brez komplementa dodamo v epruveto eno uro po nastavitvi RSC. Če nevezani komplement ostane v epruveti, se bo pridružil kompleksu AG-AT, ki nastane med ovčjimi krvnimi celicami in hemolizinom, in povzročil njihovo raztapljanje. To bo pomenilo, da je RSK negativen. Če so eritrociti ostali nedotaknjeni, je reakcija pozitivna.

Hemaglutinacijska reakcija (RHA)

Obstajata dve bistveno različni reakciji hemaglutinacije. Eden od njih je serološki, uporablja se za določanje krvnih skupin. V tem primeru eritrociti komunicirajo s protitelesi.

In druga reakcija ne velja za serološko, saj rdeče krvne celice reagirajo s hemaglutinini, ki jih proizvajajo virusi. Ker vsak patogen deluje samo na določene eritrocite (kokošji, ovčji, opičji), lahko to reakcijo štejemo za zelo specifično.

Po lokaciji krvnih celic na dnu epruvete lahko ugotovite, ali je reakcija pozitivna ali negativna. Če njihov vzorec spominja na obrnjen dežnik, je želeni virus prisoten v pacientovi krvi. In če so vsi eritrociti oblikovani kot stolpec kovanca, potem ni želenih povzročiteljev bolezni.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HITA)

To je zelo specifična reakcija, ki vam omogoča, da ugotovite vrsto, vrsto virusov ali prisotnost specifičnih protiteles v bolnikovem krvnem serumu.

Njegovo bistvo je v tem, da protitelesa, dodana v epruveto s testnim materialom, preprečijo odlaganje antigenov na eritrocite in s tem ustavijo hemaglutinacijo. To je kvalitativni znak prisotnosti v krvi specifičnih antigenov za določen virus, ki nas zanima.

Imunofluorescenčna reakcija (RIF)

Reakcija temelji na sposobnosti zaznavanja kompleksov AG-AT po njihovi obdelavi s fluorokromnimi barvili. Ta metoda je enostavna za uporabo, ne zahteva izolacije čiste kulture in traja malo časa. Nepogrešljiv je za hitro diagnosticiranje nalezljivih bolezni.

V praksi se te serološke reakcije delijo na dve vrsti: neposredne in posredne.

Neposredni RIF je izdelan z antigenom, ki je bil predhodno obdelan s fluorescenčnim serumom. In posredno, zdravilo najprej obdelamo z običajnim diagnostikom, ki vsebuje antigene za protitelesa, ki nas zanimajo, nato pa ponovno nanesemo luminescentni serum, ki je specifičen za proteine kompleksa AG-AT, in mikrobne celice postanejo vidne pod mikroskopom.

Reakcija fiksacije komplementa(RSK) je kompleksna dvostopenjska serološka reakcija. Uporablja pet sestavin, ki sestavljajo dva sistema: antigen, protitelo, komplement (prvi sistem); ovčji eritrociti, senzibilizirani (obdelani) s hemolitičnim serumom, ki vsebuje zanje specifična protitelesa (drugi ali indikatorski sistem hema). V tem primeru interakcija protitelesa z antigenom na prvi stopnji reakcije povzroči nastanek imunskega kompleksa, ki adsorbira komplement, vendar tega ni mogoče vizualno zaznati. Na drugi stopnji se hemski sistem uporablja kot indikator vezave komplementa na kompleks antigen-protitelo, ki ga je kot imunski kompleks sposoben tudi adsorbirati. Navsezadnje sta možna dva izida reakcije. Če protitelo in antigen ustrezata drug drugemu in komplement adsorbira nastali kompleks, ne pride do lize eritrocitov hemskega sistema. Če se protitelo ne ujema z antigenom in obratno, se komplement, ki ostane prost, pridruži sistemu hema in povzroči hemolizo.

Tako kot drugi serološki testi se RSK lahko uporablja za odkrivanje specifičnih protiteles proti znanemu antigenu ali za odkrivanje antigena proti znanim protitelesom.

Splošne značilnosti RSC sestavin.

1. PREISKUSNI SERUM se pred pripravo reakcije segreva v vodni kopeli 30 minut, da inaktivira lastni komplement, in se razredči od 1:5.

2. ANTIGEN so lahko kulture bakterij, njihovi lizati, virusi in materiali, ki vsebujejo viruse, izvlečki patološko spremenjenih organov in tkivni lipidi.

3. DOPOLNILO - serum morskega prašička pridobljen na dan poskusa. Trenutno se uporablja industrijsko suho dopolnilo.

4. HEMOLITIČNI SISTEM je sestavljen iz enakih volumnov zmešanega hemolitičnega seruma in 3% suspenzije ovčjih eritrocitov z usedlino. Za senzibilizacijo eritrocitov s hemolizini zmes hranimo v termostatu pri temperaturi 37 °C 30 minut.

Izjava o glavnem poskusu RSC. V 1 epruveto dodamo SERUM, ANTIGEN IN KOMPLEMENT, v tretjo epruveto dodamo serum, komplement in izotonično raztopino natrijevega klorida namesto antigena (KONTROLA SERUMA), v tretjo epruveto dodamo antigen, komplement in enako raztopino natrijevega klorida (KONTROLA ANTIGENA). Epruvete za 1 uro postavimo v termostat pri temperaturi 37°C. Hkrati se pripravi hemolitični sistem, ki se nato po odstranitvi stojala iz termostata doda v vse tri epruvete. Po mešanju hemskega sistema s sestavinami treh epruvet se le-te ponovno postavi v termostat za 1 uro, po tem času pa se upoštevajo rezultati RSC.

Pri upoštevanju RSC je intenzivnost reakcije označena s plusi: "++++" - izrazito pozitivna reakcija s popolno zamudo pri hemolizi, tekočina v epruveti je brezbarvna, vsi eritrociti so se usedli na dno; "+++", "++" - pozitivna reakcija, za katero je značilno povečanje barve tekočine zaradi hemolize in zmanjšanje števila eritrocitov v usedlini; "+" - šibko pozitivna reakcija, tekočina je intenzivno obarvana, na dnu epruvete je majhna količina rdečih krvničk. Negativna reakcija je označena z znakom "-", medtem ko opazimo popolno hemolizo, ima tekočina v epruveti intenzivno rožnato barvo ("lakasta kri").

RSK je zelo kompleksna, a zelo občutljiva specifična reakcija. Široko se uporablja pri diagnozi sifilisa, kronične gonoreje, oslovskega kašlja, aktinomikoze, vseh rikecioz in virusnih okužb.

Povezani imunosorbentni test.

Metodo so v začetku 70. let neodvisno razvile tri skupine znanstvenikov. Metoda je podobna RIA, vendar temelji na označevanju Ag ali Ab, ki vstopi v reakcijo z encimom. Vzd oznak s podlago običajno spremlja sprememba barve medija. Trenutno so bile ustvarjene številne modifikacije te metode, vendar je najbolj razširjena heterogena ELISA na trdni fazi (trdna faza). Razlikovati:

1) NEPOSREDNA ELISA TRDNE FAZE. V tem primeru:

1. Serum z Ab inkubiramo z Ag fiksiranim na trden substrat (največkrat je to plastična mikroplošča).

2. Ab, ki ga Ag ne veže, se odstrani z večkratnim pranjem.

3. Z encimom označen serum se doda Ag, vezanemu na Ab.

4. Določite število markerskega encima, vezanega na At.

2) KONKURENČNA ELISA TRDNE FAZE.

1. Dodan je serum. Če vsebuje specifične Abs, potem se vežejo na Ag, fiksiran na trden substrat. Če ni specifičnih Abs, potem Ag ni vezan.

2. Pri dodajanju protiteles, specifičnih za fiksni Ag, v prvem primeru ne bodo imela ničesar za interakcijo (večina Ag je že vezanih) Þ vsebnost markerja je nizka. V drugem primeru se bodo specifični Abs vezali na Ag in se med pranjem ne bodo izprali Þ visoka vsebnost markerja.

Podobno, morda. PROTITELESA so fiksirana, različna podjetja pa proizvajajo ravno tablete z že fiksiranimi At.

V primerjavi s klasičnimi metodami za odkrivanje antigenov ta metoda omogoča neposredno registracijo njihove interakcije s protitelesi in ne sekundarnih manifestacij (aglutinacije, precipitacije ali hemolize). Metoda je zelo OBČUTLJIVA (zadostuje koncentracija 1ng/ml).

Določite: klamidijo, klostridijo, HIV itd.

8. Reakcija fagocitoze.

Fagocitozo izvajajo mikrofagi in makrofagi. Stopnje fagocitoze: pristop, lepljenje, potopitev, prebava.

Vrednotenje funkcionalne aktivnosti fagocitnih celic.

Količina fagocitno aktivnost granulocitov in monocitov ocenjujemo v polni krvi, v suspenziji levkocitov ali v obogatenih frakcijah fagocitnih celic. Kot standardni predmeti fagocitoze se uporabljajo monodisperzni delci lateksa s premerom 1,0-2,0 μm, suspenzija toplotno ubitih bakterij ali kvasovkam podobnih gliv.

Fagocite zmešamo s fagocitiranim materialom v razmerju 1:10 ali 1:100 in inkubiramo pri 37°C 30 minut ob stalnem mešanju. Epruvete nato centrifugiramo in pelet resuspendiramo v kapljici krvnega seruma, da pripravimo razmaz. V brisih, fiksiranih z madežem May-Chryunwald in obarvanih po Romanovsky-Giemsi, se izračuna odstotek fagocitnih celic (FP - fagocitni indeks) in število absorbiranih delcev na 1 celico (PF - fagocitno število).

Pri zdravem človeku FP=40-80%, FC=1-5.

9. Diagnostikumi.

Diagnostikumi so suspenzija določenih mikrobnih celic, ubitih s segrevanjem ali formalinom, z znano vsebnostjo celic na prostorninsko enoto. Kot antigen lahko uporabimo tudi suspenzije živih bakterij. Reakcijski fenomen se pojavi vnaprej po dveh urah (pri 37 0 C), končni rezultat se upošteva pri sobni temperaturi po 18-20 urah. Za diagnostiko je pozitivna reakcija zanimiva le v določenem serumskem titru, ki služi kot diagnostika. Torej, z brucelozo je diagnostični titer 1: 200, s tula-remijo -1: 100. Za odkrivanje protiteles lahko izvedemo ekspresne reakcije aglutinacije (obračunski čas je nekaj minut). Na primer: 1. Kapljična reakcija pri tularemiji. Na kapljico bolnikove polne krvi na posebnem kozarcu kanemo kapljico destilirane vode (za hemolizo) in kapljico tularemia diagnosticuma. Reakcija se pojavi v 1-2 minutah, aglutinati so jasno vidni v obliki belkastih grudic. 2. Na steklu za brucelozo izvedemo ekspresno reakcijo aglutinacije po Heddelsonu.

Te reakcije ne omogočajo določitve količine protiteles v serumu b) za identifikacijo čiste kulture povzročiteljev nalezljivih bolezni. V ta namen imunodiagnostični

aglutinacijski serumi, ki jih proizvajajo inštituti za cepiva in serume z imunizacijo živali s celimi mikrobnimi celicami. Za zanesljivost je bolje uporabiti adsorbirane serume, tako da vsebujejo samo protitelesa, ki ustrezajo določeni vrsti ali vrsti mikroorganizma.

Načela pridobivanja imunskih serumov.

Imunski serum (antiserum) je krvni serum, ki vsebuje protitelesa proti določenemu antigenu. V večini primerov se imunski (diagnostični) serumi na mikrobne, tkivne in druge antigene pridobivajo eksperimentalno z imunizacijo živali z ustreznimi antigeni.

Med glavnimi zahtevami za antiserume sta njihova visoka specifičnost in zadostna vsebnost protiteles. Po specifičnosti ločimo polivalentne (polispecifične) in monovalentne (monospecifične) antiserume. Polivalentni serumi vsebujejo protitelesa proti številnim antigenom, monospecifični - proti enemu določenemu antigenu. Monospecifične serume lahko dobite:

1) z uporabo visoko prečiščenih antigenov za imunizacijo živali,

2) čiščenje nativnih serumov od protiteles neželene specifičnosti.

Za to uporabo:

1) imunoafinitetna metoda, ki temelji na vezavi protiteles določene specifičnosti na ustrezne antigene, imobilizirane na trdnofaznem nosilcu, čemur sledi ločevanje nastalih kompleksov AG-AT in izolacija protiteles;

2) metoda adsorpcije po Castellaniju. V ta namen se mikroorganizmi, ki vsebujejo vse skupinske antigene, zaporedno dodajajo k naravnemu imunskemu serumu, ki vsebuje skupinsko specifična navzkrižno reagirajoča protitelesa, in tako adsorbirajo homologna protitelesa.

telo. Takšni adsorbirani monospecifični antiserumi vsebujejo protitelesa proti različnim determinantam molekule antigena, ki so v razredu (podrazredu) heterogeni.

Test vezave komplementa (CFR) in dolgotrajna reakcija vezave komplementa (RDSC)

REAKCIJA VEZI KOMPLEMENTA (RSK) IN REAKCIJA DOLGOTRAJNE VEZI KOMPLEMENTA (RDSK)

COMPLEMENT BONDING REACTION, RSK, Bordet-Jangu reakcija [poimenovana po bakteriologih J. Bordet in O. Gengou, 1901], zelo specifična in zelo občutljiva serološka. reakcija, ki temelji na lastnosti kompleksa antigen-protitelo, da veže prosti komplement.

Komplement (sistem komplementa) (iz lat.complementum - dodatek), skupina globularnih beljakovin v krvnem serumu živali in ljudi, ki so del imunskega sistema telesa. Ko bakterije ali virusi, ki ga okužijo, v telo vstopijo določeni toksini ali ko se pojavijo lastne transformirane celice, se aktivira komplement, zaradi česar se ciljne celice lizirajo (uničijo), toksini in virusi pa se nevtralizirajo. Zato velja sistem komplementa, skupaj z makrofagi, za mejo imunske obrambe telesa.

Ta reakcija se pogosto uporablja pri identifikaciji antigenov in serodiagnostiki okužb, zlasti bolezni, ki jih povzročajo spirohete (Wassermannova reakcija), rikecije in virusi.

RSK je kompleksna serološka reakcija. Vključuje komplement in dva sistema antigen-protitelo. V bistvu gre za dve serološki reakciji.

Prvi sistem – glavni – sestavljata antigen in protitelo (enega poznamo, drugega ne). Dodana mu je določena količina komplementa. Ko se antigen in protitelo tega sistema ujemata, se bosta povezala in vezala komplement. Nastali kompleks je fino razpršen in ni viden.

serodiagnoza reakcije vezave komplementa

Tvorbo tega kompleksa poznamo s pomočjo drugega hemolitičnega ali indikatorskega sistema. Vključuje ovčje eritrocite (antigen) in njim ustrezen hemolitični serum (protitelesa), tj. že pripravljen imunski kompleks. V tem sistemu lahko pride do lize eritrocitov le v prisotnosti komplementa. Če je komplement vezan na prvi sistem (če se antigen in protitelo v njem ujemata), potem v drugem sistemu ne bo hemolize - ker ni prostega komplementa. Odsotnost hemolize (vsebina epruvete je motna ali je na dnu eritrocitni sediment) se zabeleži kot pozitiven rezultat RSK.

Če se v prvem sistemu antigen ne ujema s protitelesom, potem imunski kompleks ne nastane in komplement ostane prost. Ko ostane prost, je komplement vključen v drugi sistem, kar povzroči hemolizo - rezultat RSC je negativen (vsebina epruvet je prozorna - "lakasta kri").

Komponente reakcije fiksacije komplementa:

1. Antigen - običajno lizat, ekstrakt, hapten; manj pogosto suspenzija mikroorganizmov

2. Protitelesa - bolnikov serum

3. Komplement - serum morskega prašička

4. Antigen - ovčji eritrociti Hemolitični sistem

5. Protitelesa - hemolizin na ovčje eritrocite

6. Izotonična raztopina

Priprava sestavin

1. Serum je razredčen 3-krat manj od njegovega titra. Pripravite skupno razredčino seruma za celoten poskus, katerega prostornino določite tako, da pomnožite prostornino seruma v eni epruveti (npr. 0,5 ml) s številom epruvet, ki je nekoliko večje od števila teh v poskusu. Pri pripravi vseh komponent reakcije je potreben presežek tekočine: del ostane na stenah epruvet, bučk, pipet. Volumne razredčenega hemolizina in suspenzije eritrocitov, dodajanje seruma eritrocitom, dobro premešamo in inkubiramo 30 minut pri 37°C (senzibiliziramo).

2. Ovčji eritrociti. Za celotno število epruvet v poskusu pripravimo 3 % suspenzijo opranih ovčjih eritrocitov. Za pripravo hemolitičnega sistema 30 minut pred vnosom v poskus zmešamo enake količine ovčjih eritrocitov s protitelesom proti njim.

3. Komplement je običajno razredčen v razmerju 1 : 10. Pred vsakim poskusom ga je treba titrirati. Titer komplementa je njegova najmanjša količina, pri dodajanju v hemolitični sistem pride do popolne hemolize v 1 uri pri 37°C.

4. Antigen običajno dobimo že pripravljen z navedbo njegovega titra, tj. količino, ki naj bi jo po razredčitvi antigena vseboval 1 ml. Na primer, pri titru 0,4 ga razredčimo v 0,96 ml izotonične raztopine. Pri poskusu vzamemo količino antigena, ki je enaka polovici titra (0,5 ml). To je njegov delovni odmerek. Pripravite skupno razredčino antigena za celoten poskus tako, da pomnožite 0,5 ml s številom epruvet v poskusu.

Izjava o reakciji vezave komplementa (RSC).

Reakcijo damo v prostornino 1 cu. cm (0,2 kubičnih cm vsake komponente).

Testne serume pregledamo v razredčitvi 1:5 in 1:10 (odmerek seruma je 0,04 cc in 0,02 cc s specifičnim antigenom, v razredčitvi 1:5 s kontrolnim antigenom (za specifičnost) in brez antigen (za antikomplementarnost).

Testni in kontrolni serum inaktiviramo na dan reakcije v razredčeni obliki pri 56-65°C (odvisno od vrste živali) za 30 minut. (tudi v RDSC).

Obe stopnji reakcije izvajamo v vodni kopeli pri 37-38 ° C, bakteriolitični sistem hranimo 60 minut, druga stopnja reakcije (s hemolitičnim sistemom) pa 20 minut.

Kontrole glavne izkušnje RSK:

pozitivni serum, razredčen 1:5 brez antigena in s kontrolnim antigenom; v razredčitvah od 1: 5 do njegovega titra s specifičnim antigenom;

negativen serum v razredčitvah 1:5 in 1:10 s specifičnim antigenom, v razredčini 1:5 s kontrolnim antigenom in brez antigena - specifični in kontrolni antigeni v dvojnem odmerku - za antikomplementarnost (komplement +) in za hemotoksičnost (komplement );

hemolitični sistem za hemotoksičnost (komplement).

Računovodstvo rezultatov. V kontrolah ne sme biti niti sledi hemolize, saj ena nima komplementa, druga pa ne vsebuje hemolizina. Kontrole kažejo na odsotnost reakcij hemotoksičnosti (zmožnost spontane lize eritrocitov) v komponentah.

V poskusu se lahko aktivnost komplementa zmanjša zaradi njegove nespecifične adsorpcije z drugimi reakcijskimi komponentami, zato se za poskus poveča količina komplementa: vzame se odmerek, ki sledi titru. To je delovni odmerek.

Obstajajo različne možnosti za postavitev RSC: klasična. metoda nastavitve v obliki makro- in mikrovariant, reakcija dolgotrajne fiksacije komplementa (RDSC) na mrazu, metoda količin. RSC s 50% hemolizo senzibiliziranih eritrocitov itd. Za diagnozo številnih bolezni se uporablja bolj občutljiva metoda - RDSC.

Izjava o reakciji dolgotrajne fiksacije komplementa (RDSC).

Prvo fazo reakcije izvajamo v hladilniku pri 2-6°C 16-18 ur, drugo fazo v vodni kopeli 20 minut pri 37-38°C.

Komplement se uporablja v delovni razredčitvi 1:25 ali 1:30 (pri določanju njegove delovne razredčitve).

Prvi dan se serumi in antigen ustekleničijo za glavni poskus. Reakcijo damo v prostornino 1 cu. cm (0,2 kubičnih cm vsake komponente). Kontrole RDSC so enake kot pri nastavitvi RSC.

Nato dodatek 0,2 cu. cm, odvisno od njegove delovne razredčitve, epruvete pretresemo in postavimo v hladilnik za 16-18 ur. pri 2-6°C.

Naslednji dan se stojala s prvo fazo odstranijo iz hladilnika in po 20-30 minutah. pri sobni temperaturi hemolitični sistem vlijemo v vse epruvete v odmerku (v danem primeru 0,6 kubičnih cm). Rešetke pretresemo in za 20 minut postavimo v vodno kopel. pri 37-38°C.

Shema glavnega eksperimenta RDSC je predstavljena v tabeli 3.

Obračunavanje rezultatov RSC, RDSC se izvede dvakrat: prvič - takoj po vodni kopeli, drugič - po usedanju eritrocitov na dno epruvete (3-4 ure po vodni kopeli) ali naslednji dan pri shranjevanju v hladilniku od 2 ° do 6 ° C.

Za objektivno določitev rezultatov reakcije je priporočljivo oceniti odstotek hemolize. Da bi to naredili, iz reakcije izberemo 5 epruvet s popolno (100%) hemolizo in tekočino iz njih vlijemo v eno epruveto. Iz njega pripravimo razredčine z nižjim odstotkom hemolize, tako imenovano "Standardno" lestvico.

Stopnjo hemolize v epruvetah s preizkušanimi serumi določimo v primerjavi s stopnjo hemolize v "standardnih" epruvetah in odstotek hemolize izrazimo v križnicah.

Stopnja zakasnitve je obratno sorazmerna z odstotkom hemolize eritrocitov:

++++ (4 križci) - ni hemolize, supernatant je prozoren, brezbarven;

+++ (3 križi) - hemoliza 25% eritrocitov;

++ (2 križa) - hemoliza 50% eritrocitov;

+ (1 križ) - hemoliza 75% eritrocitov;

(minus) - popolna hemoliza eritrocitov, brez usedline, tekočina je intenzivno obarvana s hemoglobinom.

Vrednotenje rezultatov RSK, RDSK.

Testne serume ocenjujemo v razredčinah 1:5 in 1:10 (0,04 cc, 0,02 cc) s popolno hemolizo eritrocitov v kontrolnem serumu brez antigena in s kontrolnim antigenom.

Pozitivna reakcija je ocenjena, ko se hemoliza eritrocitov zakasni za 3-4 križe v razredčitvi 1: 10.

Dvomljivo - z zakasnitvijo hemolize eritrocitov z 1 križem v razredčini seruma 1: 10 in od 2 do 4 križi v razredčini 1: 5.

Negativno - s popolno hemolizo eritrocitov v razredčitvah seruma 1: 5 in 1: 10.

Posebna prednost CSC je, da narava antigena, ki je vanj vključen (korpuskularni ali topni), ni pomembna, saj se komplement veže na Fc fragment katerega koli protitelesa, ki je povezano z IgG in IgM, ne glede na njegovo protitelesno specifičnost. Poleg tega je CSC zelo občutljiv: omogoča zaznavanje količine protiteles, ki je 10-krat manjša kot na primer pri precipitacijski reakciji. RSC sta leta 1901 predlagala J. Bordet in O. Zhang. Temelji na dveh lastnostih komplementa:

1) sposobnost vezave na kompleks "antigen + protitelo";

2) liza eritrocitov, ki se uporabljajo za pridobivanje hemolitičnega seruma.

RSK je razdeljen na dve stopnji in v njem sodelujeta dva sistema - eksperimentalni ali diagnostični in indikatorski. Diagnostični sistem je sestavljen iz testnega (ali diagnostičnega) seruma, ki se segreva pri 56 ° C 30 minut, preden se vzpostavi reakcija za inaktivacijo v njem prisotnega komplementa, in antigena.

Temu sistemu je dodan standardni dodatek. Njegov vir je sveža ali posušena sirotka morskega prašička. Zmes inkubiramo pri 37 °C eno uro. Če so v testnem serumu protitelesa, bodo medsebojno delovala z dodanim antigenom in nastali kompleksi antigen + protitelo bodo vezali dodani komplement. Če v serumu ni protiteles, ne bo prišlo do tvorbe kompleksa antigen + protitelo in bo komplement ostal prost.

Na tej stopnji reakcije običajno ni vidnih manifestacij fiksacije komplementa. Zato za razjasnitev vprašanja, ali je prišlo do fiksacije komplementa ali ne, dodamo drugi indikatorski sistem (inaktiviran hemolitični serum + ovčji eritrociti) in zmes vseh komponent CSC ponovno inkubiramo pri 37 °C 30-60 minut, po katerem se ovrednotijo rezultati reakcije. S pametnim telefonom (na primer takim) lahko izračunate natančen reakcijski čas. Če je komplement vezan na prvi stopnji v diagnostičnem sistemu, tj. v bolnikovem serumu so protitelesa in je komplement vezan s kompleksom "protitelo + antigen", ne bo prišlo do lize eritrocitov - RSC je pozitiven. : tekočina je brezbarvna, usedlina je na dnu epruvete eritrociti.

Če v serumu ni specifičnih protiteles in v diagnostičnem sistemu ne pride do vezave komplementa, tj. RSK je negativen, potem se v diagnostičnem sistemu neporabljen komplement veže na kompleks "eritrociti + protitelesa" indikatorskega sistema in pride do hemolize. : v epruveti “lak kri”, brez usedline eritrocitov. Intenzivnost CSC ocenjujemo s štirikrižnim sistemom, odvisno od stopnje zakasnitve hemolize in prisotnosti sedimenta eritrocitov. Reakcijo spremljajo ustrezne kontrole: serumska (brez antigena) in antigenska (brez seruma), saj imajo nekateri serumi in nekateri antigeni antikomplementarne učinke. Pred nastavitvijo RSK se vse komponente, ki so vključene v to, razen preučevanega seruma ali antigena, skrbno titrirajo.

Še posebej pomembno je, da v reakcijo uvedemo točen odmerek komplementa, saj lahko njegovo pomanjkanje ali presežek povzroči napačne rezultate. Titer komplementa je najmanjša količina, ki ob prisotnosti delovnega odmerka hemolitičnega seruma zagotavlja popolno raztapljanje eritrocitov. Za postavitev glavnega poskusa se vzame odmerek komplementa, povečan za 20-25% v primerjavi z ugotovljenim titrom. Titer hemolitičnega seruma je njegova največja razredčitev, ki pri mešanju z enakim volumnom 10% raztopine komplementa popolnoma hemolizira ustrezen odmerek eritrocitov v 1 uri pri temperaturi 37 ° C.

Reakcija indirektne hemolize se uporablja kot pospešena metoda za odkrivanje specifičnih protiteles. Eritrociti se uporabljajo kot nosilci antigenov. Ob prisotnosti specifičnih protiteles v bolnikovem serumu pride do lize senzibiliziranih eritrocitov ob prisotnosti komplementa.

Niste našli prave informacije? Brez problema! Uporabite iskanje po spletnem mestu v zgornjem desnem kotu.