Цел на PCR и принцип на метода. Полимеразна верижна реакция (PCR) и нейното приложение

SEI HPE „Красноярска държавна медицинска академия

на името на Федералната агенция за здравеопазване и социално развитие Ясенецки »

Катедра по медицинска генетика и клинична неврофизиология, IPO

ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ

Методическо ръководство за студенти от 3-4 курса

по специалностите обща медицина (060101) и

Красноярск - 2007г

Шнайдер, Н. А., Бутянов, Р. А. Основни принципи на метода на полимеразна верижна реакция. Методическо ръководство за извънаудиторна работа на студенти от 3-4 курса по специалностите обща медицина (060101) и педиатрия (060103). - Красноярск: Издателство на GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42с.

Методическото ръководство напълно отговаря на изискванията на Държавния стандарт (2000) и отразява основните аспекти на съвременния метод за диагностика на наследствени заболявания на човека - метода на полимеразна верижна реакция, учебният материал е адаптиран към образователните технологии, като се вземат предвид спецификите обучение в 3-4 курса на медицински и педиатрични факултети.

Рецензенти:Ръководител на катедрата по медицинска генетика, Държавно учебно заведение за висше професионално образование

"Новосибирски държавен медицински университет на Федералната агенция за здравеопазване и социално развитие", доктор на медицинските науки, професор;

репликация на ДНК

Обектът на изследване на този метод е дезоксирибонуклеиновата киселина (ДНК). ДНК е универсален носител на генетична информация във всички организми, съществуващи на Земята (с изключение на РНК-съдържащите микроорганизми). ДНК е двойна верига, усукана в спирала. Всяка верига се състои от последователно свързани нуклеотиди. Веригите на ДНК имат противоположна посока: 5'-краят на едната верига съответства на 3'-края на втората верига. Уникалното свойство на ДНК е способността й да се дублира. Този процес се нарича репликация. Репликацията на ДНК молекулата се извършва по време на синтетичния период на интерфазата. Всяка от двете вериги на "родителската" молекула служи като шаблон за "дъщерната". След репликацията новосинтезираната ДНК молекула съдържа една "майчина" верига, а втората - "дъщерна", новосинтезирана (полуконсервативен метод). За шаблонен синтез на нова ДНК молекула е необходимо старата молекула да бъде деспирализирана и разтегната. Репликацията започва на няколко места в молекулата на ДНК. Участъкът на ДНК молекула от началото на една репликация до началото на друга се нарича репликон.

Стартът на репликацията е активиран грундове(семена), състоящи се от 100-200 базови двойки. Ензимът ДНК хеликаза се развива и разделя родителската спирала на ДНК на две вериги, върху които, съгласно принципа на комплементарност, с участието на ензима ДНК полимераза, се сглобяват „дъщерни“ ДНК вериги. За да може ензимът да започне своята работа, е необходимо наличието на стартов блок - малък първоначален двойноверижен фрагмент. Началният блок се образува, когато праймерът взаимодейства с комплементарния регион на съответната верига на родителската ДНК. Във всеки репликон ДНК полимеразата може да се движи по "майчината" верига само в една посока (5`=>3`).

На водещата верига, докато репликонът се развива, „дъщерна“ верига постепенно расте непрекъснато. На изоставащата верига дъщерната верига също синтезира в посока (5`=>3`), но на отделни фрагменти, докато репликонът се развива.

По този начин прикрепването на комплементарни нуклеотиди на "дъщерните" нишки върви в противоположни посоки (антипаралелно). Репликацията във всички репликони се извършва едновременно. Фрагменти и части от "дъщерни" нишки, синтезирани в различни репликони, се лигират в една нишка от ензимна лигаза. Репликацията се характеризира с полуконсервация, антипаралелизъм и прекъсване. Целият геном на една клетка се репликира веднъж за период от време, съответстващ на един митотичен цикъл. В резултат на процеса на репликация от една ДНК молекула се образуват две ДНК молекули, в които едната верига е от родителската ДНК молекула, а втората, дъщерната, е новосинтезирана (фиг. 1).

Ориз. един. Диаграма на репликация на ДНК молекула.

По този начин цикълът на репликация на ДНК включва три основни етапа:

1. размотаване на спиралата на ДНК и разминаване на вериги (денатурация);

2. закрепване на грундове;

3. завършване на веригата на дъщерната нишка.

Принцип на PCR метода

Именно репликацията на ДНК формира основата на PCR. При PCR изброените по-горе процеси се извършват в епруветка в цикличен режим. Преходът от един етап на реакцията към друг се постига чрез промяна на температурата на инкубационната смес. Когато разтворът се нагрее до 93-95°C, настъпва денатурация на ДНК. За да преминете към следващата стъпка - добавяне или "отгряване" на праймери - инкубационната смес се охлажда до 50-65°C. След това сместа се нагрява до 70-72°C - оптималната работа на taq-ДНК полимераза - на този етап се завършва нова ДНК верига. След това цикълът се повтаря отново. С други думи PCR методът е многократно увеличаване на броя на копията (усилване) специфичен участък от ДНК, катализиран от ензима ДНК полимераза.

Удължаването на дъщерните ДНК вериги трябва да се случи едновременно на двете вериги на майчината ДНК, така че репликацията на втората верига също изисква свой собствен праймер. Така в реакционната смес се въвеждат два праймера: един за "+"-веригата, вторият за "-"-веригата. Свързвайки противоположните вериги на ДНК молекулата, праймерите се ограничават до тази част от нея, която впоследствие ще бъде многократно удвоена или амплифицирана. Дължината на такъв фрагмент, който се нарича ампликон, обикновено е няколко стотин нуклеотида.

PCR стъпки

Всеки цикъл на усилване включва 3 етапа, протичащи при различни температурни условия (фиг. 2).

· Етап 1:денатурация на ДНК . Тече при 93-95° за 30-40 секунди.

· Етап 2:грунд отгряване . Прикрепването на праймера се извършва комплементарно на съответните последователности на противоположни ДНК вериги в границите на специфично място. Всяка двойка праймери има собствена температура на отгряване, чиито стойности са в диапазона 50-65°C. Време за отгряване 20-60 сек.

· Етап 3:удължаване на ДНК веригите Допълнителното удължаване на ДНК веригите става от 5" края до 3" края на веригата в противоположни посоки, като се започне от местата на свързване на праймера. Материалът за синтеза на нови ДНК вериги са дезоксирибонуклеозид трифосфати, добавени към разтвора. Процесът на синтез се катализира от ензима taq-полимераза и протича при температура 70-72°C. Време за синтез - 20-40 сек.

Новите ДНК вериги, образувани в първия амплификационен цикъл, служат като шаблони за втория амплификационен цикъл, в който се образува специфичен ампликонен ДНК фрагмент (фиг. 3). В следващите цикли на амплификация ампликоните служат като шаблон за синтеза на нови вериги.

По този начин има натрупване на ампликони в разтвор съгласно формулата 2", където n е броят на циклите на амплификация. Следователно, дори ако само една двуверижна ДНК молекула първоначално е била в първоначалния разтвор, тогава около 108 ампликони молекули се натрупват в разтвора за 30-40 цикъла.Това количество е достатъчно за надеждно визуално откриване на този фрагмент чрез електрофореза в агарозен гел.

Процесът на усилване се извършва в специален програмируем термостат ( велосипедист), който по зададена програма автоматично променя температурите според броя на циклите на усилване.

За усилване са необходими следните компоненти:

· ДНК шаблон(ДНК или нейна част, съдържаща желания специфичен фрагмент);

· Грундове(синтетични олигонуклеотиди (20-30 нуклеотидни двойки), комплементарни на ДНК последователностите в границите на специфичния фрагмент, който се определя). Изборът на специфичен фрагмент и подборът на праймери играят основна роля за специфичността на амплификацията, което влияе върху качеството на анализа.

· Смес от дезоксинуклеотидни трифосфати (dNTPs)(смес от четири dNTP, които са материалът за синтеза на нови комплементарни ДНК вериги в еквивалентни концентрации от 200-500 микрона)

· ЕнзимTaq- полимераза(термостабилна ДНК полимераза, катализираща удължаването на праймерните вериги чрез последователно добавяне на нуклеотидни бази към нарастващата верига на синтезираната ДНК, 2-3 mm).

· буферен разтвор(реакционна среда, съдържаща Mg2+ йони, необходими за поддържане на ензимната активност, PH 6.8-7.8).

За да се определят специфични региони на генома на РНК вируси, първо се получава ДНК копие от РНК матрица, като се използва реакция на обратна транскрипция (RT), катализирана от ензима обратна транскриптаза (обратна транскриптаза).

Ориз. 2. Усилване (1-ви цикъл).

Ориз. 3. Усилване (2-ри цикъл).

Основни приложения на PCR

клинична медицина:

o диагностика на инфекции,

o откриване на мутации, включително диагностика на наследствени заболявания,

o генотипизиране, включително HLA генотипиране,

o клетъчни технологии

екология (като начин за наблюдение на състоянието и качеството на обектите на околната среда и храните)

дефиниция на трансгенни организми (ГМО)

Лична идентификация, бащинство, криминалистика

обща и частна биология,

Основни принципи

организиране на диагностични лаборатории

Работата в PCR лабораторията се извършва в съответствие с „Правилата за дизайн, безопасност, промишлена санитария, противоепидемичен режим и лична хигиена при работа в лаборатории (отдели, отдели) на санитарни и епидемиологични институции на системата на здравеопазването.

Замърсяване на ДНК проби

Провеждането на PCR диагностика е свързано с проблем, породен от високата чувствителност на метода – възможността замърсяване. Ако следи от положителна ДНК попаднат в реакционната епруветка (специфични продукти за амплификация на ДНК - ампликони; ДНК стандарт, използван като положителна контрола; положителна ДНК от клинична проба) води до амплификация на специфичен ДНК фрагмент по време на PCR и в резултат на това до появата на фалшиви положителни резултати.

В хода на работата може да се срещнете два вида замърсяване:

1. кръстосано замърсяванеот проба на проба (по време на обработка на клинични проби или при изкопаване на реакционната смес), което води до появата на спорадични фалшиво положителни резултати;

2. замърсяване на усилващия продукт(ампликони), което е от най-голямо значение, тъй като по време на PCR процеса ампликоните се натрупват в огромни количества и са идеални продукти за реамплификация.

Замърсяването с следи от ампликони на съдове, автоматични пипети и лабораторно оборудване, повърхността на лабораторните маси или дори повърхността на кожата на лабораторните работници води до появата на систематични фалшиви положителни резултати. Определянето на източника на замърсяване може да бъде много трудно и изисква значителна инвестиция на време и пари. Натрупаният досега опит в работата на лаборатории, използващи метода PCR за диагностика, ни позволява да формулираме основните изисквания за организацията на такива лаборатории и провеждането на самите анализи. Спазването на тези изисквания елиминира възможността за замърсяване и получаване на фалшиво положителни резултати.

Етапи на PCR анализ

Географски разделени, поставяйки ги в отделни стаи (фиг. 4.5):

· Предварителна PCR стая,където се извършва обработка на клинични проби, извличане на ДНК, подготовка на реакционната смес за PCR и PCR (при наличие на условия се препоръчва и последните две стъпки да се извършват в допълнително отделно помещение). В тези помещения е забранено извършването на всички други видове работа с изследваните агенти, чиято PCR диагностика се извършва в тази лаборатория.

· Стая за пост-PCR,където се извършва откриването на продукти на амплификация. В тази стая могат да се използват други методи за откриване. Желателно е помещението за откриване на продукти на амплификация да се разположи възможно най-далече от помещенията за пре-PCR.

Работните помещения са оборудвани с ултравиолетови лампи с максимална радиация от порядъка на 260 nm (тип DB-60) при скорост 2,5 W на 1 m3. Лампите са разположени така, че повърхностите на работните маси, оборудването и материалите, с които операторът влиза в контакт по време на PCR анализа, са изложени на пряка радиация. Облъчването се извършва в рамките на 1 час преди началото на работа и в рамките на 1 час след края на работата.

Лаборантите работят в специални лабораторни дрехи, които се сменят при преминаване от една стая в друга и в ръкавици за еднократна употреба. Обработката на дрехи от различни стаи се извършва отделно. На различни етапи от PCR анализа работят различни служители.

За работа се използват отделни комплекти дозатори, пластмасови и стъклени съдове, лабораторно оборудване, престилки и ръкавици, предназначени за различни етапи на анализ и непреносими от една стая в друга. Оборудването, материалите и инвентарът във всяка стая са съответно етикетирани.

Всички етапи на работа се извършват само с използване на консумативи за еднократна употреба: накрайници за автоматични пипети, епруветки, ръкавици и др. Не забравяйте да смените накрайниците, когато преминавате от проба на проба. Необходимо е да се използват накрайници с аерозолен бариерен филтър, за да се предотврати навлизането на микрокапки от разтвора в пипетата. Използваните епруветки и накрайници се изхвърлят в специални контейнери или контейнери, съдържащи дезинфекционен разтвор. Клиничните проби се съхраняват отделно от реагентите.

За обработка и почистване на работното място във всяка стая има памучно-марлеви тампони (салфетки), пинсети, дезинфектанти и дезактивиращи разтвори.

В PCR диагностичната лаборатория се изключва работата, свързана с производството (клониране) и изолирането на рекомбинантни плазмиди, съдържащи ДНК последователности или генни фрагменти на патогени, които се диагностицират в тази лаборатория.

Събиране на клиничен материал

Изследваният материал за PCR може да бъде изстъргване от епителни клетки, кръв, плазма, серум, плеврална и цереброспинална течност, урина, храчка, слуз и други биологични секрети, биопсични проби.

Вземането на проби от материала се извършва в условията на лечебната зала на съответния профил. След вземане на проби, пробите трябва да бъдат отнесени в PCR диагностичната лаборатория възможно най-скоро.

Вземането на проби трябва да се извършва с помощта на стерилни, за предпочитане инструменти за еднократна употреба, само в стерилни пластмасови или стъклени тръби за еднократна употреба, предварително обработени за един час с хромна смес, старателно измити с дестилирана вода и калцинирани в пещ при температура 150 ° C за 1 час.

Зона на детекция (друг етаж или друга сграда).

Ориз. четири. PCR лабораторен апарат с детекция чрез електрофореза.

Зона на откриване (различен етаж или сграда)

Ориз. 5. PCR лабораторен апарат с флуоресцентна детекция (количествен анализ).

Ориз. 6. Стая за екстракция на ДНК.Показана е настолна кутия с бактерицидна лампа.

Ориз. 7. стая за усилване.

Ориз. осем. Стая за откриване.

Ориз. 9. Кръвни проби за ДНК диагностика на наследствени заболявания.

Съхранение и транспортиране на пробите

За диагностика на наследствени заболявания кръвните проби се съхраняват на специални хартиени форми или в епиндорфи (пластмасови епруветки) в замразено състояние за дълго време (фиг. 9).

За диагностика на инфекциозни заболявания пробите се съхраняват при стайна температура за не повече от 2 часа. Ако е необходимо по-продължително съхранение, пробите могат да се поставят в хладилник при температура 2-8°C за период не по-дълъг от 24 часа. Допустимо е по-продължително съхранение (до 2 седмици) при замразяване във фризер при температура минус 20°C. Не се допуска повторно замразяване-размразяване на проби.

Ако диагностичната лаборатория за PCR и процедурната зала за вземане на проби са териториално разделени, тогава пробите трябва да се транспортират в термоси или термоконтейнери в съответствие с правилата за съхранение на проби и правилата за транспортиране на инфекциозни материали.

Екстракция на ДНК от проби

Методът на твърдофазова сорбция, който се състои в добавяне на лизиращ агент, съдържащ разтвор на гуанидин, сорбция на ДНК върху сорбент, многократно промиване и резорбция на ДНК с буферен разтвор, стана широко разпространен. В случай на обработка на серум, плазма или цяла кръв обикновено се използва методът на фенолна екстракция. Методът включва депротеинизация с фенол/хлороформ, последвана от утаяване на ДНК (или РНК) с етанол или изопропанол. Обработката се извършва в микроцентрофужни епруветки тип Eppendor P с обем 1,5 ml. Времето за обработка е 1,5-2 часа (фиг. 10).

Ориз. десет. Изолиране на ДНК.

Провеждане на PCR

Определено количество от пробата от обработената клинична проба се прехвърля в специална микроцентрофужна епруветка тип Eppendorf с обем 0,2 или 0,5 ml Към сместа за амплифициране се добавя вода, PCR буфер, dNTP разтвор, праймерен разтвор и разтвор. същата епруветка Taq-полимераза (добавена последна към сместа) Обикновено обемът на реакционната смес е 25 µl След това към всяка епруветка се добавя една капка минерално масло, за да се предотврати изпаряването на реакционната смес по време на амплификацията Епруветките се прехвърлят в програмируем термостат (усилвател), при който усилването се извършва в автоматичен режим по зададена програма (фиг. 11).

Ориз. единадесет. усилвател " Термоциклер ».

Времето за реакция в зависимост от зададената програма е 2-3 часа. Успоредно с експерименталните проби се поставят контролни проби: положителната контрола включва всички компоненти на реакцията, но вместо материала на клиничната проба се въвежда контролен ДНК препарат на изследвания ген. Отрицателната контрола включва всички компоненти на реакцията, но вместо клиничния материал или ДНК препарат се добавя подходящо количество дейонизирана вода или екстракт, който не съдържа изследваната ДНК. Необходима е отрицателна контрола, за да се проверят компонентите на реакцията за отсъствие на ДНК в тях поради замърсяване и да се изключат фалшиви положителни резултати.

Регистрация на резултатите

Амплифицираният специфичен ДНК фрагмент се открива чрез електрофореза в агарозен гел в присъствието на етидиев бромид. Етидиевият бромид образува стабилно интерстициално съединение с ДНК фрагменти, което се появява като светещи ленти, когато гелът се облъчи с UV лъчение с дължина на вълната 290-330 nm. В зависимост от размера на получените PCR ампликони се използва гел, съдържащ 1,5% до 2,5% агароза. За да се приготви агарозен гел, смес от агароза, буфер и вода се разтопява в микровълнова фурна или на водна баня и се добавя разтвор на етидиев бромид. Охладената до 50-60°С смес се изсипва във формата с дебелина 4-6 мм, като със специални гребени в гела се правят джобове за нанасяне на пробата. Гребените се поставят така, че между дъното на ямките и основата на гела да остане слой агароза 0,5-1 mm. След втвърдяване на гела върху джобовете се нанася амплификат в количество от 5-15 µl. Препоръчително е да се извърши електрофореза на смес от маркери за дължина на ДНК фрагменти успоредно с контролни и експериментални проби. Обикновено такава смес съдържа десет ДНК фрагмента със 100, 200, 300 и т.н. дълги базови двойки.

Създаването на такава проба ви позволява да проверите дължината на ампликоните в контролните и експерименталните проби. Гелът с нанесената проба се прехвърля в камера за електрофореза, пълна с буфер, камерата се свързва към източник на захранване и се извършва електрофоретично разделяне на продуктите на амплификацията в продължение на 30-45 минути при сила на електрическото поле 10-15 V/см. В този случай предната част на багрилото, което е част от реакционната смес, трябва да премине най-малко 3 cm.

След края на електрофорезата гелът се прехвърля върху трансилюминаторното стъкло и се гледа на ултравиолетова светлина. За документация гелът се снима на филм Mikrat 300 или се записва с помощта на видео система, свързана с компютър.

Първо се оценяват контролните проби. В електрофоретичната лента, съответстваща на положителната контрола, трябва да присъства оранжева светеща лента. Неговата електрофоретична подвижност трябва да съответства на дължината на ампликона, посочена в инструкциите.

В електрофоретичната следа, съответстваща на отрицателната контрола, такава лента трябва да отсъства. Наличието на такава лента в отрицателната контрола показва замърсяване - замърсяване на използваните реагенти с изследваната ДНК или ампликон. Тестовите проби се оценяват по наличието в съответната лента на лента, която е разположена на същото ниво като лентата в положителната контролна проба. Интензитетът на светене на лентата съответства на количеството изследвана ДНК в пробата, което позволява полуколичествена оценка на PCR. Обикновено положителните резултати се оценяват по четиристепенна скала. Ако светенето на лентата в експерименталната проба е много слабо, тогава такава проба трябва да бъде пренаредена (фиг. 12).

Ориз. 12. Електрофореза в агарозен гел.

PCR приложения задиагностика на точкови мутации и генни полиморфизми

Една от водещите области на приложение на PCR в практическото здравеопазване е диагностицирането на точкови мутации и генни полиморфизми. . Има директни и косвени методи за ДНК диагностика. В тези ситуации, когато е известен ген, чието увреждане води до развитие на наследствено заболяване, това увреждане може да бъде открито чрез молекулярно-генетични методи. Такива методи се наричат ​​директни. Чрез директни методи се откриват нарушения в първичната нуклеотидна последователност на ДНК (мутации и техните видове). Директните методи се характеризират с точност, достигаща почти 100%.

На практика обаче тези методи могат да се прилагат при определени условия.:

с известна цитогенетична локализация на гена, отговорен за развитието на наследствено заболяване;

Генът на заболяването трябва да бъде клониран и неговата нуклеотидна последователност да е известна.

Целта на директната ДНК диагностика е да се идентифицират мутантни алели.

По този начин, в тези ситуации, когато е известно какъв вид увреждане на ДНК води до наследствено заболяване, ДНК фрагментът, съдържащ увреждането, се изследва директно, т.е. използва се директен метод за ДНК диагностика.

Въпреки това, към днешна дата гените на много заболявания не са картографирани, тяхната екзон-интронна организация е неизвестна и много наследствени заболявания се характеризират с изразена генетична хетерогенност, което не позволява пълно използване на директни методи за ДНК диагностика. Следователно, в случаите, когато локализацията на увреждането не е известна, се използва различен подход, свързан с изследване на близостта на гена, отговорен за генното заболяване, в комбинация с фамилен анализ, тоест косвени методи за молекулярно-генетична диагностика на наследствени заболявания се използват.

Могат да се използват различни методи за откриване на точкови мутации и малки делеции, но всички те се основават на използването на PCR метода. Тази реакция ви позволява многократно да умножавате нуклеотидната последователност на ДНК и след това да търсите мутации. Методите за търсене на ДНК фрагменти, носещи мутации, се основават на сравнителен анализ на мутантни и нормални ДНК нуклеотидни последователности.

Анализ на PCR продукти

в процеса на директна ДНК диагностика

Това включва изследване на специфични характеристики на амплифицираната област на гена. По този начин, при заболявания, причинени от експанзията на тринуклеотидни повторения, продуктите на амплификация се различават по дължината си (отразяваща различен брой триплети в изследвания генен регион) и, като резултат, по скоростта им на движение в гела. Благодарение на това се постига ясно електрофоретично разделяне на нормални и мутантни алели и точно определяне на патологично удължения фрагмент, т.е. ДНК диагностика на заболяването (фиг. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Ориз. четиринадесет. Диагностика на изтриване GAG в ген DYT 1 при пациенти с допа-независима дистония (електрофореза с полиакриламиден гел). Следи 2,3,6 - болен; ленти 1,4,5 - контролни. Тънката стрелка показва нормалния алел, удебелената стрелка показва мутантния по-къс алел (делеция на три нуклеотида).

Ако изследваната ДНК област е изцяло включена в разширена делеция, тогава PCR амплификация на ДНК от този изтрит алел няма да бъде извършена поради липсата на места за праймерна хибридизация. В този случай хомозиготна делеция ще бъде диагностицирана въз основа на пълното отсъствие на PCR продукта на реакцията (синтезът на ДНК е невъзможен и от двете копия на гена). При хетерозиготна делеция е възможно да се открие PCR продукт, синтезиран от нормален (безопасен) алел, но за надеждна диагностика на такава мутация е необходимо да се използват по-сложни методи за визуализация на ДНК, които позволяват да се оцени дозата на крайната PCR продукт.

За откриване на точкови мутации (най-често нуклеотидни замествания) на определени места се използва методът PCR в комбинация с други методи на молекулярно-генетичен анализ. Ако местоположението и природата на предложената точкова мутация са точно известни, тогава за целенасоченото откриване на такава мутация, рестрикционни ендонуклеази (рестриктази) са специални клетъчни ензими, изолирани от различни щамове бактерии.

Тези ензими разпознават специфични нуклеотидни последователности с дължина от четири до десет нуклеотида. След това те извършват рестрикцията (лат. (разрязване) на тези последователности като част от двуверижна ДНК молекула. ​​Всеки рестрикционен ензим разпознава и отрязва на фиксирано място строго определена, специфична нуклеотидна последователност - рестрикционно място (место за разпознаване).

В случаите, когато точкова мутация променя естественото място на разпознаване за определен рестрикционен ензим, този ензим няма да може да разцепи мутантния PCR-амплифициран фрагмент. В някои случаи мутацията води до появата на ново място за разпознаване на определен рестрикционен ензим, който отсъства в нормата.

И в двете ситуации мутантните и нормалните PCR продукти, третирани с избрания рестрикционен ензим, ще дадат рестрикционни фрагменти с различни дължини, които могат лесно да бъдат открити чрез електрофореза (фиг. 15).

По този начин, ако е необходимо бързо да се открие някаква конкретна точкова мутация, задачата се свежда до търсене на съответния рестрикционен ензим, чието място за разпознаване е локализирано на мястото на нарушената нуклеотидна последователност. Третирането на PCR продукти с този рестрикционен ензим ще позволи лесно диференциране на нормални и мутантни алели. Рестрикционният анализ значително опростява откриването на известни точкови мутации и в момента се използва широко за директна ДНК диагностика на наследствени заболявания.

финален етап молекулярно-генетичен анализ на мутациие определяне на нуклеотидната последователност на изследвания ДНК фрагмент (секвениране), която се сравнява с нормата и се формулира окончателната генетична диагноза. Благодарение на напредъка в молекулярната генетика вече са разработени методи за ДНК диагностика на повече от 400 наследствени заболявания.

Ориз. петнадесет. Откриване на точкова мутация чрез рестрикционен анализ:А - амплифицируем регион на гена, съдържащ рестрикционно мястоAGCTза рестрикционна ендонуклеазаАлу аз. МутацияЖ→ Апроменя тази нуклеотидна последователност, което води до рестрикционен ензимАлуиблокиран; B - електроферограма на рестрикционни продукти: лента 1 - хомозиготност за нормалния алел; лента 2, хомозиготност за мутацията; лента 3 - хетерозиготно състояние (нормален алел + мутация).

Диагностика на наследствени заболявания, основана на директно изследване на мутантни алели при пациенти, членове на техните семейства или предполагаеми хетерозиготни носители на патологични мутации, е подходяща за пресимптоматична и пренатална диагностика, която може да се прилага в най-ранните етапи на развитие на плода, преди появата на всякакви клинични или биохимични симптоми заболяване.

Независимо от метода за откриване на мутации, точна молекулярна характеристика на всяка мутация може да се получи само чрез директно секвениране. За автоматизиране на този процес през последните години широко се използват специални устройства - секвенсори, които позволяват значително да се ускори процесът на четене на ДНК информация.

Пътят за по-широко приложение на молекулярно-биологичните изследвания в клинико-диагностичните лаборатории се отваря чрез ускоряване на аналитичния процес чрез извършване на всички процедури в един континуум, без трансфер на проба, създаване на условия за предотвратяване на замърсяване при паралелно изследване на редица аналити и с обективна регистрация резултати във всеки цикъл.

Основни модификации на PCR метода

Използва се за бързо сканиране и търсене на известни генни мутации.

Мултиплекс (мултипраймер) PCR

Този метод се основава на едновременната амплификация на няколко екзона на изследвания ген в една реакция. Това позволява икономичен бърз скрининг на най-честите мутации. Например, за бързо диагностициране на носителството на делеции в гена за дистрофин при пациенти с прогресивна мускулна дистрофия на Дюшен/Бекер, се извършва едновременна амплификация на набор от най-често мутиращи екзони на този ген. Тъй като тези заболявания се унаследяват по Х-свързан рецесивен тип и са свързани с увреждане на единствената Х хромозома при момчетата, в случай на разширена делеция, електрофорезата на реакционните продукти ще разкрие липсата на един или повече ДНК фрагменти (екзони). ), което може да служи като молекулярно потвърждение на диагнозата. В допълнение, чрез избиране на специфични генни региони за PCR амплификация е възможна сравнително точна оценка на общата дължина на делецията и точките на прекъсване на гена (до екзона).

Комбинираното използване на няколко мултиплексни реакции прави възможно диагностицирането на до 98% от всички делеции, които се появяват при пациенти с прогресивна мускулна дистрофия на Дюшен/Бекер. Това е приблизително 60% от общия брой известни мутации в гена за дистрофин и показва много висока ефективност на този скрининг метод за ДНК диагностика на дистрофинопатия (фиг. 16).

Ориз. 16. Директна ДНК диагностика на мускулна дистрофия на Дюшен чрез мултиплексна PCR (електрофореза в агарозен гел). Във всеки от изследваните индивиди четири екзона на дистрофиновия ген са амплифицирани едновременно (екзони 17, 19, 44 и 45; стрелките показват съответните продукти на амплификация). Ивица 1 - контрола, ленти 2-5 - пациенти с мускулна дистрофия на Дюшен с различни делеции на гена за дистрофин (лента 2 и 5 - делеция на екзон 45, лента 3 - делеция на екзон 44, лента 4 - делеция на екзон 17 и 19 ).

Алел-специфична амплификация

Методът се основава на използването на две независими двойки праймери за специфична област на гена: единият праймер и в двете двойки е общ, а вторият праймер във всяка двойка има различна структура и е комплементарна към нормална или мутантна ДНК последователност. В резултат на такава реакция в разтвор могат да се синтезират едновременно два вида PCR продукти - нормални и мутантни. Освен това дизайнът на използваните праймери прави възможно ясното разграничаване на нормалните и мутантните продукти на амплификация по техния молекулен размер. Този метод е много ясен и ви позволява да проверите както хомо-, така и хетерозиготно носителство на мутантния алел.

Метод за сайт-насочена модификация на амплифицирана ДНК

Методът се основава на използването в PCR на т. нар. mismatch праймер (не напълно комплементарен на шаблона), който се различава от матричната ДНК последователност с един нуклеотид. В резултат на включването на посочения праймер в състава на мутантния PCR продукт, в него се образува изкуствено създаден рестрикционен сайт за една от рестрикционните ендонуклеази, което позволява директна ДНК диагностика на определена известна мутация чрез рестрикционен анализ. Създаването на такъв изкуствен рестрикционен сайт може да се наложи, ако търсенето не разкри съществуването на известен и достъпен ензим, чийто "естествен" рестрикционен сайт е засегнат в резултат на появата на изследваната мутация в ДНК молекулата .

PCR метод с обратна транскриптаза (RT- PCR)

Този метод се използва в случаите, когато е по-удобно да се използва не геномна ДНК като обект на изследване, а по-компактна и богата на информация сДНК, получена след подходяща обработка на тъканни проби, като биопсичен материал или клетъчни линии от лимфоцити, фибробласти , и т.н. Важно условие тук е експресията (поне минимална) на желания ген в изследваната тъкан.

На първия етап се извършва обратна транскрипция на иРНК и получените cDNA молекули служат като шаблон за PCR. Впоследствие, критичната сДНК област, амплифицирана в достатъчно количество, се подлага на секвениране и други методи за скрининг на мутации, директно електрофоретично изследване (откриване на делеции, инсерции и т.н.) или интегриране в експресионна система, за да се получи протеинов продукт и неговия директен анализ .

Този метод е особено ефективен за откриване на мутации, водещи до синтеза на "пресечен" протеин (безсмислени мутации, сплайсинг мутации, големи делеции) - така нареченият PTT анализ (Protein Truncation Test). PTT анализът обикновено се използва при изследване на разширени мулти-екзон гени, като гена за мускулна дистрофия на Дюшен/Бекер, атаксия-телеангиектазия или неврофиброматоза тип 1.

PCR в реално време(PCR в реално време)

Всяка година в практическото здравеопазване PCR в реално време става все по-популярен диагностичен метод. Основната му характеристика е мониторинг и количествен анализ на натрупването на продукти от полимеразна верижна реакция и автоматично регистриране и интерпретиране на резултатите. Този метод не изисква етап на електрофореза, което намалява изискванията за PCR лаборатория. Благодарение на спестяването на производствено пространство, намаляването на броя на персонала и търсенето на количествено определяне на ДНК/РНК, този метод се използва успешно през последните години в най-големите санитарни епидемични, диагностични и изследователски центрове в развитите страни на света, заменяйки PCR в сегашния му („класически“) формат.

PCR в реално време използва флуоресцентно белязани олигонуклеотидни сонди за откриване на ДНК по време на амплификация. PCR в реално време позволява пълен анализ на проба в рамките на 20-60 минути и теоретично е в състояние да открие дори една ДНК или РНК молекула в проба.

Ориз. 17. PCR в реално време.

PCR в реално време използва системата TaqMan за контролиране на кинетиката на PCR директно по време на амплификация с помощта на резонансно гасене на флуоресценция. За откриване се използва сонда, носеща флуорофор и гасител, комплементарни към средната част на амплифицирания фрагмент. Когато флуорофорът и гасителят са свързани с олигонуклеотидната проба, се наблюдава само малко количество флуоресцентна емисия. По време на процеса на амплификация, поради 5'-екзонуклеазната активност на Taq полимеразата, флуоресцентният етикет преминава в разтвор, като се освобождава от околността на гасителя и генерира флуоресцентен сигнал, който се увеличава в реално време пропорционално на натрупването на усилват (фиг. 17).

Основни предимства на PCR-Real-Time пред PCR с гел електрофореза:

Целият метод се извършва в една епруветка;

· Методът отнема 1 час;

Достатъчно 1-2 работни стаи;

Наред с качествената оценка на резултата става възможно да се определи количествено (например, когато се предписва антивирусна терапия за СПИН или вирусен хепатит, е необходимо да се знае вирусният товар, т.е. количеството вирус на 1 единица, което осигурява реално -време PCR);

· Драматично намалява риска от замърсяване.

Заключение

PCR методът е един от най-разпространените методи за молекулярно-биологични изследвания. Този метод трябва да се използва смислено от клиницистите, а лекарят, който реши да използва PCR в работата си, трябва да има определени познания за характеристиките и възможностите на този метод. Второ, трябва да има тясна обратна връзка между клинициста и PCR лабораторията, която е необходима за анализа на сложни случаи и разработването на правилната диагностична стратегия. Трето, PCR анализът не е панацея в диагностиката (предимно на инфекциозни заболявания) и не замества съществуващите методи на изследване, а само ги допълва. И най-важното е, че PCR не може да замени интуицията и аналитичното мислене, които трябва да притежава лекарят, който очаква успех.

П . С . Молекулярно-биологични изследвания - промяна на ориентирите на диагностика и лечение. Използването на молекулярно-биологични методи е свързано с перспективата за радикална промяна на акцентите в лабораторната диагностика. Можем да говорим не просто за навременна информация, а за нейното предварително получаване. Ако сега лабораторните изследвания в повечето случаи се извършват вече с напреднало заболяване и започнато лечение, тогава се очаква молекулярно-биологичната лабораторна информация да позволи да се идентифицира склонността на дадено лице към определени видове патология и степента на чувствителност към определени лекарства, които ще позволи да се обоснове предсказуем, превантивен и персонализиран характер на медицината на бъдещето.

ПРОМЯНА НА ДИАГНОЗАТА И ФОКУСИТЕ НА ЛЕЧЕНИЕТО

НАСЛЕДСТВЕНИ БОЛЕСТИ

Днес В бъдещето

Диагноза Генетичен паспорт

8. Колко работни помещения са необходими за PCR лаборатория с флуоресцентна детекция (количествен анализ, Real-Time PCR)?

9. Какво е откриване?

10. Какви методи за ДНК диагностика се разграничават?

11. Кой ензим работи на базата на PCR?

12. Защо зоната на детекция трябва да бъде отделена от другите работни зони?

13. Какво е сайт за ограничаване?

14. Каква е разликата между директния метод на ДНК диагностика и индиректния?

15. Какво е секвениране?

16. Какво е мултиплексна PCR?

17. Какви видове мутации се определят чрез PCR?

18. Какво е замърсяване?

19. Каква е същността на метода за алел-специфична амплификация?

20. Условия за съхранение на PCR материал?

21. Какво устройство се използва за усилване?

22. Какво представлява методът PCR с обратна транскриптаза (RT-PCR)?

23. Какъв е материалът за PCR диагностика?

24. Избройте видовете замърсяване?

Тестове за самоподготовка

1. Рестрикционни ендонуклеази:

а) ензими, които "разбиват" ДНК на строго определени места;

б) ензими, които зашиват прекъсвания в молекулата на ДНК;

в) ензими, които осигуряват съединения, които извършват възстановяване на ДНК.

2. Генна амплификация:

3. Кой от методите на молекулярната генетика се използва за диагностициране на заболявания, причинени от мутантен ген с известна последователност?

а) използването на специфична рестриктаза;

б) директно откриване с помощта на специфични молекулярни проби;

в) фамилен анализ на разпределението на нормалния полиморфизъм на дължината на рестрикционния фрагмент.

4. ДНК секвениране:

а) идентифициране на базовата последователност на ДНК;

б) многократно повторение на който и да е ДНК сегмент;

в) изолиране на ДНК фрагмент, съдържащ изследвания ген.

5. ДНК проби могат да бъдат получени с помощта на :

б) хорионни въси;

в) амниотична течност;

г) клетки от околоплодна течност;

д) биопсии на кожа, мускули, черен дроб,

д) всичко е правилно, с изключение на точка "в",

g) всичко е правилно, с изключение на точка "d",

з) Всичко по-горе е правилно.

6. Кои мутации се диагностицират чрез PCR?

а) геномни;

б) хромозомни;

в) ген (точка).

7. Праймерът е:

а) допълнителен участък от ДНК;

b) белязана (радиоактивно или флуоресцентно) последователност със синтетичен олигонуклеотид, комплементарна на мутантен или нормален ген;

в) олигонуклеотид, действащ като "зародиш" и иницииращ синтеза на полинуклеотидна верига върху ДНК или РНК матрица.

8. Кой е разработил принципа на PCR метода?

б) К. Мълис

9. Използва ли се PCR методът за диагностициране на експанзията на тринуклеотидни повторения (динамичен тип мутации)?

10. В какви области се използва PCR?

а) клинична медицина;

б) дефиниция на трансгенни организми (ГМО)

в) идентификация на личността, установяване на бащинство, криминалистика

г) всичко по-горе

г) нито едно от горните.

Примерни отговори: 1 - а; 2 - b; 3 - б; 4 - а; 5 - д; 6 - в; 7 - в; 8 - b; 9 – а, 10 – г.

Основен

1. Генетика на Бочков. Москва. ГЕОТАР, 2002.

Допълнителен

1., Бахарев и лечението на вродени и наследствени заболявания при деца. - Москва, 2004 г.

2. ДНК диагностика и медико-генетично консултиране. - Москва, 2004 г.

3. Генетика на Гинтер. - Москва, 2003 г.

4. Горбунов основи на медицинската генетика. - Санкт Петербург: Интермедика, 1999.

5. Дж. Макгий. Молекулярна клинична диагностика. – Свят, 1999г.

6. Меншиков - биологични изследвания в клиничната лабораторна диагностика: възможностите на проблема (лекции). Клинична лабораторна диагностика, № 3, 2006 г.

7. Корниенко за работата на PCR лабораторията по време на вградения анализ на биологичен материал. Клинична лабораторна диагностика, бр.10, 2006г.

8. Организация на работата на PCR лабораторията. Методически указания. MU 1.3.1794-03. Главен санитарен лекар на Руската федерация, 2003 г.

9. Ерлих Х. А. PCR технология. – Пърчин-Елмър Сетус, 1993 г.

10. Heid C. A., Stevens J. Количествен PCR в реално време. Genome Res. - бр.6, 1996г.

ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ

Методическо ръководство за извънаудиторна работа на студенти от 3-4 курса по специалностите обща медицина (060101) и педиатрия (060103).

SEI HPE "Красноярска държавна медицинска академия на Федералната агенция за здравеопазване и социално развитие"

Русия, Красноярск,

Федерална агенция за образование

Държавно учебно заведение

Висше професионално образование

"Карелска държавна педагогическа академия"

Курсова работа по темата:

Полимеразна верижна реакция (PCR) и нейното приложение

Изпълнено от: студент Корягина Валерия Александровна

Проверено от: Карпикова Наталия Михайловна

Петрозаводск 2013 г

Въведение

Глава 1 Преглед на литературата

1.5.4 Ефект на платото

1.5.6 Усилване

Заключение

Въведение

Последните двадесет години бяха белязани от широкото въвеждане на молекулярно-генетичните методи в биологичните, медицинските и селскостопанските науки.

До началото на 70-те години изглеждаше, че молекулярната биология е достигнала известна степен на съвършенство. През този период микроорганизмите са основният обект на молекулярно-генетичните изследвания. Преходът към еукариоти поставя изследователите пред напълно нови проблеми, които не могат да бъдат решени с помощта на методите за генетичен анализ, съществуващи по това време. Пробивът в развитието на молекулярната генетика стана възможен благодарение на появата на нов експериментален инструмент - рестрикционни ендонуклеази. През следващите години броят на методите за директен ДНК анализ, базирани на качествено различни подходи, започна бързо да нараства.

В много случаи съвременните технологии позволяват да се започне изследване на фината структурна и функционална организация на ядрените и извънядрените геноми на различни организми на по-дълбоко ниво. Това беше от особено значение за разработването на нови методи за диагностика и лечение на различни заболявания. Не по-малко важна беше възможността за използване на постиженията на молекулярната генетика в популационната биология и развъждането за идентифициране и анализ на генетичната променливост на популации, сортове и щамове, идентифициране и сертифициране на икономически ценни индивиди, създаване на генетично модифицирани организми и решаване на други проблеми.

Всеки метод има своите предимства и недостатъци. Няма универсален метод, който да разреши всички възникнали проблеми. Следователно изборът на конкретен метод за провежданото изследване е един от най-важните етапи на всяка научна работа.

Глава 1 Преглед на литературата

1.1 История на откриването на полимеразната верижна реакция (PCR)

През 1983 г. К.Б. Мълис и др. публикуват и патентоват метода на полимеразна верижна реакция (PCR), който е предопределен да има дълбоко въздействие върху всички области на изследване и приложение на нуклеинови киселини. Значението на този метод за молекулярната биология и генетика се оказва толкова голямо и очевидно, че седем години по-късно авторът е удостоен с Нобелова награда за химия.

В началото на използването на метода, след всеки цикъл на нагряване-охлаждане, към реакционната смес трябваше да се добави ДНК полимераза, тъй като тя беше инактивирана при висока температура, необходима за разделяне на веригите на ДНК спиралата. Реакционната процедура беше относително неефективна, изискваше много време и ензими. През 1986 г. методът на полимеразна верижна реакция е значително подобрен. Предложено е да се използват ДНК полимерази от термофилни бактерии. Тези ензими се оказаха термостабилни и успяха да издържат на много реакционни цикли. Използването им направи възможно опростяването и автоматизирането на PCR. Една от първите термостабилни ДНК полимерази е изолирана от бактерии Thermus aquaticusи именуван Taq- полимераза.

Възможността за амплифициране на всеки ДНК сегмент, чиято нуклеотидна последователност е известна, и получаването му след PCR в хомогенна форма и препаративно количество, прави PCR алтернативен метод за молекулярно клониране на къси ДНК фрагменти. В този случай не е необходимо да се прилагат сложни методологични техники, които се използват в генното инженерство при конвенционалното клониране. Развитието на PCR метода значително разшири методологичните възможности на молекулярната генетика, и по-специално на генното инженерство, дотолкова, че коренно промени и засили научния потенциал на много от нейните области.

1.2 Разновидности на полимеразна верижна реакция (PCR)

· Вложен PCR- използва се за намаляване на броя на страничните продукти от реакцията. Използвайте два чифта праймери и извършете две последователни реакции. Втората двойка праймери амплифицира ДНК региона в продукта от първата реакция.

· Обърнат PCR- се използва, когато е известна само малка област в желаната последователност. Този метод е особено полезен, когато е необходимо да се определят съседни последователности след вмъкване на ДНК в генома. За прилагането на инвертирана PCR се извършва серия от ДНК разрези с рестрикционни ензими<#"justify">праймер за полимеразна верижна реакция

· Групово-специфична PCR- PCR за роднини<#"center">1.3 Полимеразна верижна реакция

Открита в средата на 80-те години на миналия век, полимеразната верижна реакция (PCR) може да увеличи броя на копията на оригинална проба милиони пъти в рамките на няколко часа. По време на всеки цикъл на реакцията се образуват две копия от оригиналната молекула. Всяко от синтезираните ДНК копия може да служи като шаблон за синтеза на нови ДНК копия в следващия цикъл. Така многократното повторение на циклите води до експоненциално увеличаване на броя на копията. От изчисленията следва, че дори да има 30 цикъла, броят на копията на оригиналната молекула ще бъде повече от 1 милиард. Дори ако вземем предвид, че не всички ампликони се дублират по време на всеки цикъл, общият брой копия въпреки това е доста голяма цифра.

Всеки цикъл на полимеразна верижна реакция (PCR) се състои от следните стъпки:

· Денатурация - Повишаването на температурата кара двуверижната молекула на ДНК да се развие и да се раздели на две едноверижни;

· Отгряване - Понижаването на температурата позволява на праймерите да се прикрепят към комплементарни области на ДНК молекулата;

· Удължаване - Ензимът ДНК полимераза завършва комплементарната верига.

За амплификация на избрания фрагмент се използват два олигонуклеотидни праймера (семена), фланкиращи определена ДНК област. Ориентирани към грундове 3 - завършват един към друг и по посока на последователността, която трябва да се усили. ДНК полимеразата осъществява синтеза (завършването) на взаимно допълващи се ДНК вериги, започвайки с праймери. По време на синтеза на ДНК праймерите се вмъкват физически във веригата от новосинтезирани ДНК молекули. Всяка верига на ДНК молекулата, образувана с помощта на един от праймерите, може да служи като матрица за синтеза на комплементарна ДНК верига, използвайки другия праймер.

1.4 Провеждане на полимеразна верижна реакция (PCR)

Полимеразната верижна реакция се извършва в специални тънкостенни полипропиленови епруветки, съвместими по размер с използвания термоциклер (усилвател) - устройство, което контролира температурните и времевите характеристики на етапите на полимеразната верижна реакция (PCR) .

1.5 Принцип на метода на полимеразна верижна реакция

Полимеразна верижна реакция (PCR) е in vitro метод за усилване на ДНК, който може да изолира и умножи специфична ДНК последователност милиарди пъти в рамките на няколко часа. Възможността за получаване на огромен брой копия на една строго определена област на генома значително опростява изследването на съществуваща ДНК проба.

За провеждане на полимеразна верижна реакция трябва да бъдат изпълнени редица условия:

1.5.1 Наличие на редица компоненти в реакционната смес

Основните компоненти на реакционната (PCR) смес са: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, смес от нуклеотидни трифосфати (ATP, GTP, CTP, TTP), праймери (олигонуклеотиди), анализиран ДНК препарат, термостабилна ДНК полимераза. Всеки от компонентите на реакционната смес участва пряко в полимеразната верижна реакция (PCR), а концентрацията на реагентите пряко влияе върху хода на амплификацията.

· Tris-HCl - определя pH на реакционната смес, създава буферен капацитет. Активността на ДНК полимеразата зависи от pH на средата, така че стойността на pH пряко влияе върху хода на полимеразната верижна реакция. Обикновено стойността на pH е в диапазона 8 - 9,5. Високото pH се дължи на факта, че с повишаването на температурата pH на Tril-HCl буфера пада.

· KCl - концентрацията на калиев хлорид до 50 mm влияе върху хода на процесите на денатурация и отгряване, концентрацията над 50 mm инхибира ДНК полимеразата.

· MgCl 2- тъй като ДНК полимеразата е Mg 2+- зависим ензим, тогава концентрацията на магнезиеви йони влияе върху активността на ензима (Mg 2+образува комплекси с NTP - именно тези комплекси са субстрат за полимераза). Високата концентрация води до увеличаване на неспецифичното усилване, а ниската води до инхибиране на реакцията, оптималната (за различни полимерази) е в областта от 0,5 - 5 mM. В допълнение, концентрацията на магнезиеви соли влияе върху хода на процесите на денатурация и отгряване - повишаване на концентрацията на Mg 2+причинява повишаване на температурата на топене на ДНК (т.е. температурата, при която 50% от двойноверижните ДНК вериги се разпадат на едноверижни вериги).

· NTP - нуклеотидните трифосфати са директни мономери на нуклеиновите киселини. За да се предотврати прекъсването на веригата, се препоръчва еднакво съотношение на четирите нуклеотидни трифосфата. Ниската концентрация на тези компоненти в реакционната смес увеличава вероятността от грешки при изграждането на комплементарната ДНК верига.

· Грундове - Най-оптимално е използването на грундове с разлика в точката на топене не повече от 2 - 4 о C. Понякога при продължително съхранение при температура 4 о С, или след голям брой замразяване - размразяване, праймерите образуват вторични структури - димери, намаляващи ефективността на PCR. Отстраняването на този проблем се свежда до инкубиране на водна баня (Т=95 о В) за 3 минути и последващо бързо охлаждане до 0o ОТ.

· ДНК препарати - количеството и качеството на ДНК препарата (матрицата) пряко влияе върху хода и параметрите на полимеразната верижна реакция. Излишната ДНК проба инхибира полимеразната верижна реакция (PCR). Примесите на различни вещества в ДНК препарата също могат да намалят ефективността на полимеразната верижна реакция (PCR): натриев ацетат, натриев хлорид, изопропанол, етанол, хепарин, фенол, урея, хемоглобин и др.

· ДНК полимераза - при използване на малко количество ДНК полимераза се наблюдава намаляване на синтеза на крайния продукт правопропорционално на размера на фрагментите. Излишъкът от полимераза 2-4 пъти води до появата на дифузни спектри и 4-16 пъти - неспецифични спектри с ниско молекулно тегло. Диапазонът на използваните концентрации е 0,5 - 1,5 единици активност по отношение на 25 µl от PCR сместа.

В допълнение към основните компоненти на PCR сместа се използват редица допълнителни вещества, които подобряват качествените и количествените показатели на PCR: ацетамид (5%) - повишаване на разтворимостта на основните компоненти; бетаин (натриева сол) - стабилизиране на ДНК полимераза, понижаване на точката на топене на ДНК, изравняване на точката на топене; говежди албумин (10-100 μg / ml) - стабилизиране на ДНК полимераза; диметилсулфоксид (1-10%) - повишаване на разтворимостта на основните компоненти; формамид (2-10%) - повишаване на специфичността на отгряването; глицерол (15-20%) - повишаване на термичната стабилност на ензима, намаляване на температурата на денатурация на ДНК проба; амониев сулфат - понижаване на температурата на денатурация и отгряване.

1.5.2 Цикъл и температура

Общият изглед на програмата за полимеразна верижна реакция (PCR) е както следва:

сцена. Продължителна първична денатурация на ДНК препарата.1 цикъл

сцена. Бърза денатурация на ДНК препарата. Грунд отгряване. Удължение.30 - 45 цикъла.

сцена. Продължително удължаване. Охлаждане на реакционната смес 1 цикъл.

Всеки елемент от етапа - денатурация, отгряване, удължаване - има индивидуални температурни и времеви характеристики. Параметрите на температурата и времето на протичане на всеки елемент се избират емпирично, в съответствие с качествените и количествени показатели на продуктите на амплификацията.

Денатурация. По време на този елемент от полимеразната верижна реакция двуверижната ДНК молекула се разделя на две едноверижни. Температурните параметри на денатурация са в диапазона 90 - 95 о С, но в случай на ДНК проба с високо съдържание на гуанин и цитозин, температурата трябва да се повиши до 98 о C. Температурата на денатуриране трябва да е достатъчна за пълно денатуриране - разцепване на ДНК веригите и избягване на "внезапно охлаждане" или бързо отгряване, но термостабилната ДНК полимераза е по-малко стабилна при високи температури. По този начин изборът на оптимални температурни параметри на денатурация за съотношението праймер/проба (приготвяне на ДНК) е важно условие за амплификация. Ако температурата на денатурация в първия етап е над 95 о C, се препоръчва да се добави ДНК полимераза към реакционната смес след първична денатурация. Продължителността на този елемент от етапа по време на полимеразната верижна реакция (PCR) трябва да бъде достатъчна за пълна денатурация на ДНК, но в същото време да не повлиява значително активността на ДНК полимеразата при дадена температура.

Отгряване. Температура на отгряване (Т а ) е един от най-важните параметри на полимеразната верижна реакция. Температурата на отгряване за всеки конкретен грунд се избира индивидуално. Зависи от дължината и нуклеотидния състав на праймера. Обикновено е по-ниска с 2 - 4 о От стойността на точката на топене (Т м ) грунд. Ако температурата на отгряване на системата е под оптималната, тогава броят на неспецифичните амплифицирани фрагменти се увеличава и, обратно, по-високата температура намалява броя на амплифицираните продукти. В този случай концентрацията на специфични ампликони може рязко да намалее, до инхибиране на полимеразната верижна реакция (PCR). Увеличаването на времето за отгряване също води до увеличаване на броя на неспецифичните ампликони.

Удължение. Обикновено всеки тип термостабилна ДНК полимераза има индивидуален температурен оптимум на активност. Скоростта на синтез на комплементарна ДНК верига от ензим също е стойност, специфична за всяка полимераза (средно тя е 30–60 нуклеотида в секунда или 1–2 хиляди бази в минута), така че времето за удължаване се избира в зависимост от вида на ДНК полимеразата и дължината на амплифицираната област.

1.5.3 Основни принципи на избор на грунд

При създаването на PCR тестова система една от основните задачи е правилният избор на праймери, които трябва да отговарят на редица критерии:

Грундовете трябва да са специфични. Особено внимание се обръща на 3 - краищата на праймерите, тъй като именно от тях Taq полимеразата започва да завършва комплементарната ДНК верига. Ако тяхната специфичност е недостатъчна, тогава е вероятно в епруветката с реакционната смес да се появят нежелани процеси, а именно синтез на неспецифична ДНК (къси или дълги фрагменти). Вижда се при електрофореза под формата на тежки или леки допълнителни ивици. Това затруднява оценката на резултатите от реакцията, тъй като е лесно да се обърка специфичен продукт на амплификация със синтезирана чужда ДНК. Част от праймерите и dNTPs се изразходват за синтеза на неспецифична ДНК, което води до значителна загуба на чувствителност.

Грундовете не трябва да образуват димери и бримки, т.е. не трябва да се образуват стабилни двойни нишки чрез отгряване на праймерите към самите тях или един към друг.

1.5.4 Ефект на платото

Трябва да се отбележи, че процесът на натрупване на специфични продукти на усилване експоненциално отнема само ограничено време, след което неговата ефективност спада критично. Това се дължи на така наречения ефект на "плато".

срочен ефект плато използвани за описване на процеса на натрупване на PCR продукти в последните цикли на амплификация.

В зависимост от условията и броя на циклите на реакцията на усилване, в момента на постигане на ефекта плато използването на субстрати (dNTPs и праймери), стабилността на реагентите (dNTPs и ензим), количеството инхибитори, включително пирофосфати и ДНК дуплекси, конкуренция за реагенти с неспецифични продукти или праймери-димери, концентрацията на специфичен продукт и непълна денатурация при високи концентрации на продукти на амплификация.

Колкото по-ниска е първоначалната концентрация на таргетната ДНК, толкова по-висок е рискът от реакцията плато". Тази точка може да възникне преди броят на специфичните продукти на амплифициране да е достатъчен за анализиране. Само добре оптимизирани тестови системи могат да избегнат това.

1.5.5 Пробоподготовка на биологичен материал

Използват се различни техники за извличане на ДНК в зависимост от задачите. Тяхната същност се състои в екстракция (извличане) на ДНК от биологичен продукт и отстраняване или неутрализиране на чужди примеси за получаване на ДНК препарат с чистота, подходяща за PCR.

Методът за получаване на чист ДНК препарат, описан от Мармур, се счита за стандартен и вече е станал класически. Включва ензимна протеолиза, последвана от депротеинизация и повторно утаяване на ДНК с алкохол. Този метод дава възможност за получаване на чист ДНК препарат. Това обаче е доста трудоемко и включва работа с такива агресивни и остри вещества като фенол и хлороформ.

Един от популярните в момента методи е методът за екстракция на ДНК, предложен от Boom et al. Този метод се основава на използването на силен хаотропен агент, гуанидин тиоцианат (GuSCN), за клетъчен лизис и последваща сорбция на ДНК върху носител (стъклени перли, диатомит, стъклено мляко и др.). След промиване ДНК остава в пробата, адсорбирана върху носителя, от който може лесно да бъде отстранена с помощта на елуиращ буфер. Методът е удобен, технологичен и подходящ за подготовка на проби за амплификация. Възможни са обаче загуби на ДНК поради необратима сорбция върху носителя, както и по време на многобройни измивания. Това е особено важно при работа с малки количества ДНК в пробата. Нещо повече, дори следи от GuSCN могат да инхибират PCR. Ето защо, когато се използва този метод, правилният избор на сорбент и внимателното спазване на технологичните нюанси са много важни.

Друга група методи за подготовка на пробите се основава на използването на йонообменници тип Chilex, които, за разлика от стъклото, не адсорбират ДНК, а обратното, примеси, които пречат на реакцията. По правило тази технология включва два етапа: кипене на пробата и адсорбция на примеси върху йонообменник. Методът е изключително атрактивен поради своята простота на изпълнение. В повечето случаи е подходящ за работа с клиничен материал. За съжаление, понякога има проби с примеси, които не могат да бъдат отстранени с помощта на йонообменници. Освен това някои микроорганизми не могат да бъдат унищожени чрез обикновено кипене. В тези случаи е необходимо въвеждането на допълнителни етапи на обработка на пробите.

Следователно изборът на метод за подготовка на пробата трябва да се третира с разбиране на целите на предвидените анализи.

1.5.6 Усилване

За да се извърши реакцията на амплификация, е необходимо да се подготви реакционната смес и да се добави анализираната ДНК проба към нея. В този случай е важно да се вземат предвид някои характеристики на отгряването на праймера. Факт е, че като правило в анализираната биологична проба има различни ДНК молекули, към които праймерите, използвани в реакцията, имат частична, а в някои случаи значителна хомоложност. В допълнение, праймерите могат да се отгряват един към друг, за да образуват праймери-димери. И двете водят до значителна консумация на праймери за синтеза на странични (неспецифични) реакционни продукти и в резултат значително намаляват чувствителността на системата. Това прави трудно или невъзможно разчитането на резултатите от реакцията по време на електрофореза.

1.6 Състав на стандартната PCR реакционна смес

x PCR буфер (100 mM разтвор на Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM разтвор на KCl, 25 mM разтвор на MgCl2 ) …….2,5 µl

Вода (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Смес от нуклеотидни трифосфати (dNTP)

mM разтвор на всеки………………………………………….……….0,5 µl

Праймер 1 (10 mM разтвор) ………………………………………….1 µl

Праймер 2 (10 mM разтвор) ……………………………………….….1 µl

ДНК полимераза (5 единици / µl) ………………………………………………0,2 µl

ДНК проба (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Оценка на резултатите от реакцията

За да се оценят правилно резултатите от PCR, е важно да се разбере, че този метод не е количествен. Теоретично продуктите на амплификация на единични целеви ДНК молекули могат да бъдат открити чрез електрофореза след 30-35 цикъла. На практика обаче това се прави само в случаите, когато реакцията протича при условия, близки до идеалните, което не се среща често в живота. Степента на чистота на ДНК препарата има особено голямо влияние върху ефективността на амплификацията; наличието на определени инхибитори в реакционната смес, от които в някои случаи може да бъде изключително трудно да се отървете. Понякога, поради тяхното присъствие, не е възможно да се амплифицират дори десетки хиляди целеви ДНК молекули. По този начин често няма пряка връзка между първоначалното количество целева ДНК и крайното количество продукти на амплификация.

Глава 2: Приложения на полимеразната верижна реакция

PCR се използва в много области за анализ и в научни експерименти.

Криминалистика

PCR се използва за сравняване на така наречените "генетични пръстови отпечатъци". Нуждаем се от проба от генетичен материал от местопрестъплението - кръв, слюнка, сперма, коса и т.н. Сравнява се с генетичния материал на заподозрения. Достатъчно е много малко количество ДНК, теоретично - едно копие. ДНК се нарязва на фрагменти, след което се амплифицира чрез PCR. Фрагментите се разделят чрез ДНК електрофореза. Получената картина на местоположението на ДНК лентите се нарича генетичен пръстов отпечатък.

Установяване на бащинство

Резултати от електрофореза на ДНК фрагменти, амплифицирани чрез PCR. баща. дете. Майка. Детето наследи някои характеристики на генетичния отпечатък на двамата родители, което даде нов, уникален отпечатък.

Въпреки че "генетичните пръстови отпечатъци" са уникални, семейните връзки все още могат да бъдат установени чрез създаване на няколко такива пръстови отпечатъка. Същият метод може да се приложи, с леки модификации, за установяване на еволюционни връзки между организмите.

Медицинска диагностика

PCR позволява значително да се ускори и улесни диагностицирането на наследствени и вирусни заболявания. Генът, който представлява интерес, се амплифицира чрез PCR, като се използват подходящи праймери и след това се секвенира, за да се определят мутациите. Вирусните инфекции могат да бъдат открити веднага след заразяването, седмици или месеци преди появата на симптомите на заболяването.

Персонализирана медицина

Понякога лекарствата са токсични или алергични за някои пациенти. Причините за това са отчасти в индивидуалните различия в чувствителността и метаболизма на лекарствата и техните производни. Тези различия се определят на генетично ниво. Например при един пациент определен цитохром може да е по-активен, при друг - по-малко. За да се определи какъв тип цитохром има даден пациент, се препоръчва да се извърши PCR анализ преди употребата на лекарството. Този анализ се нарича предварително генотипиране.

Генно клониране

Генното клониране е процес на изолиране на гени и в резултат на генно инженерни манипулации получаване на голямо количество от продукта на даден ген. PCR се използва за амплифициране на ген, който след това се вмъква във вектор, част от ДНК, която пренася чуждия ген в същия организъм или друг организъм, който е лесен за отглеждане. Като вектори се използват например плазмиди или вирусна ДНК. Вмъкването на гени в чужд организъм обикновено се използва за получаване на продукт от този ген – РНК или най-често протеин. По този начин се получават много протеини в индустриални количества за използване в селското стопанство, медицината и т.н.

ДНК секвениране

В метода за секвениране, използващ флуоресцентно или радиоактивно белязани дидезоксинуклеотиди, PCR е неразделна част, тъй като по време на полимеризацията нуклеотидните производни, белязани с флуоресцентен или радиоактивен етикет, се вмъкват в ДНК веригата. Това спира реакцията, позволявайки да се определят позициите на специфични нуклеотиди след разделяне на синтезираните нишки в гела.

Мутагенеза

В момента PCR се превърна в основен метод за мутагенеза. Използването на PCR позволи да се опрости и ускори процедурата на мутагенеза, както и да я направи по-надеждна и възпроизводима.

PCR методът направи възможно анализирането на наличието на последователности на човешки папиломен вирус в секции от биопсии на човешки цервикални неоплазми, вградени в парафин 40 години преди това изследване. Освен това с помощта на PCR беше възможно да се увеличат и клонират фрагменти от митохондриална ДНК от вкаменелости на човешкия мозък на възраст 7 хиляди години!

На лизатите на индивидуални човешки сперматозоиди беше демонстрирана възможността за едновременно анализиране на два локуса, разположени на различни нехомоложни хромозоми. Този подход предоставя уникална възможност за фин генетичен анализ и изследване на хромозомна рекомбинация, ДНК полиморфизъм и др. Методът за анализ на отделни сперматозоиди веднага намери практическо приложение в съдебната медицина, тъй като HLA типизирането на хаплоидни клетки позволява да се определи бащинството или да се идентифицира престъпник (HLA комплексът е набор от гени на човешкия основен комплекс за хистосъвместимост; локусите на HLA комплекса са най-полиморфните от всички известни при висшите гръбначни: в рамките на един вид, във всеки локус, има необичайно голям брой различни алели – алтернативни форми на един и същи ген).

С помощта на PCR е възможно да се идентифицира правилността на интегрирането на чужди генетични структури в предварително определена област на генома на изследваните клетки. Общата клетъчна ДНК се загрява с два олигонуклеотидни праймера, единият от които е комплементарен на мястото на ДНК на гостоприемника близо до точката на вмъкване, а другият на последователността на интегрирания фрагмент в антипаралелната ДНК верига. Полимеразната верижна реакция в случай на непроменена хромозомна ДНК структура на предложеното място за вмъкване води до образуването на едноверижни ДНК фрагменти с неопределен размер, а в случай на планирано вмъкване, двойно-верижни ДНК фрагменти от известен размер, определен от разстоянието между местата на отгряване на двата праймера. Освен това степента на амплификация на анализирания регион на генома в първия случай ще зависи линейно от броя на циклите, а във втория - експоненциално. Експоненциалното натрупване по време на PCR на амплифициран фрагмент с предварително определен размер дава възможност да се наблюдава визуално след електрофоретично фракциониране на ДНК препарат и да се направи недвусмислено заключение за вмъкването на чужда последователност в дадена област на хромозомна ДНК.

Заключение

PCR методът в момента е най-широко използваният метод за диагностициране на различни инфекциозни заболявания. PCR ви позволява да идентифицирате етиологията на инфекцията, дори ако пробата, взета за анализ, съдържа само няколко ДНК молекули на патогена. PCR се използва широко в ранната диагностика на HIV инфекции, вирусни хепатити и др. Към днешна дата почти няма инфекциозен агент, който да не може да бъде открит чрез PCR.

Списък на използваната литература

1.Падутов В.Е., Баранов О.Ю., Воропаев Е.В. Методи за молекулярно-генетичен анализ. - Минск: Unipol, 2007. - 176 с.

2.PCR "в реално време" / Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и т.н.; изд. b. н. Д.В. Ребриков; предговор Ел Ей Остерман и акад. RAS и RAAS E.D. Свердлов; 2-ро издание, рев. и допълнителни - М.: БИНОМ. Лаборатория Знание, 2009. - 223 с.

.Патрушев Л.И. Изкуствени генетични системи. - М.: Наука, 2005. - В 2 тона

.Б. Глик, Дж. Пастернак Молекулярна биотехнология. Принципи и приложение 589 стр. 2002г

5.Щелкунов С.Н. генното инженерство. - Новосибирск: Сиб. унив. издателство, 2004. - 496 с.

Редактирано от A.A. Ворбьева „Полимеразна верижна реакция и нейното приложение за диагностика в дерматовенерологията”; Агенция за медицински новини - 72 страници

Http://ru. wikipedia.org

http://учен. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. су/ - медицински журнал

Обучение

Нуждаете се от помощ при изучаването на тема?

Нашите експерти ще съветват или предоставят услуги за обучение по теми, които ви интересуват.
Подайте заявлениепосочване на темата точно сега, за да разберете за възможността за получаване на консултация.

По това време обаче тази идея остава непотърсена. Полимеразната верижна реакция е преоткрита през 1983 г. от Кари Мълис. Неговата цел беше да създаде метод, който да позволи амплификация на ДНК по време на множество последователни дублирания на оригиналната ДНК молекула, използвайки ензима ДНК полимераза. 7 години след публикуването на тази идея, през 1993 г., Мълис получава Нобелова награда за нея.

В началото на използването на метода, след всеки цикъл на нагряване-охлаждане, към реакционната смес трябваше да се добави ДНК полимераза, тъй като тя бързо се инактивира при висока температура, необходима за разделяне на веригите на ДНК спиралата. Процедурата беше много неефективна, изискваше много време и ензими. През 1986 г. той е значително подобрен. Предложено е да се използват ДНК полимерази от термофилни бактерии. Тези ензими се оказаха термостабилни и успяха да издържат на много реакционни цикли. Използването им направи възможно опростяването и автоматизирането на PCR. Една от първите термостабилни ДНК полимерази е изолирана от бактерии Thermus aquaticusи именуван Taq- полимераза. Недостатъкът на тази полимераза е, че вероятността от въвеждане на грешен нуклеотид е доста висока, тъй като този ензим няма механизми за коригиране на грешки (3" → 5" екзонуклеазна активност). Полимерази pfuи Пво, изолирани от археи, имат такъв механизъм, използването им значително намалява броя на мутациите в ДНК, но скоростта на тяхната работа (процесивност) е по-ниска от тази на Taq. В момента се използват смеси Taqи pfuза постигане на висока скорост на полимеризация и висока точност на копиране.

По времето на изобретяването на метода Мълис работи за компанията Cetus (en: Cetus Corporation), която патентова PCR метода. През 1992 г. Cetus продава правата върху метода и патента за използване Taq-компания за полимераза Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) за 300 милиона долара. Оказа се обаче, че Taq-полимеразата е характеризирана от руския биохимик Алексей Каледин през 1980 г., във връзка с което компанията Promega (Promega) се опита да принуди Roche да се откаже от изключителните права върху този ензим в съда. Американският патент за метода PCR изтече през март 2005 г.

Провеждане на PCR

Методът се основава на многократно селективно копиране на определена ДНК област с помощта на ензими при изкуствени условия ( инвитро). В този случай се копира само зоната, която отговаря на зададените условия, и то само ако присъства в изследваната проба. За разлика от амплификацията на ДНК в живите организми (репликация), относително къси участъци от ДНК се амплифицират с помощта на PCR. При конвенционален PCR процес дължината на репликираните ДНК региони е не повече от 3000 базови двойки (3 kbp). С помощта на смес от различни полимерази, с използването на добавки и при определени условия дължината на PCR фрагмента може да достигне 20-40 хиляди базови двойки. Това все още е много по-малко от дължината на хромозомната ДНК на една еукариотна клетка. Например, човешкият геном е дълъг приблизително 3 милиарда базови двойки.

Реакционни компоненти

За PCR в най-простия случай са необходими следните компоненти:

• ДНК шаблон, който съдържа секцията от ДНК, която трябва да бъде амплифицирана.
• Два праймера, комплементарни към противоположните краища на различни вериги на желания ДНК фрагмент.
• термостабилен ДНК полимеразае ензим, който катализира полимеризацията на ДНК. Полимеразата за използване в PCR трябва да остане активна при висока температура за дълго време, следователно се използват ензими, изолирани от термофили - Thermus aquaticus(Taq полимераза), Pyrococcus furiosus(Pfu полимераза), Pyrococcus woesei(Pwo-полимераза) и др.
• Дезоксинуклеозид трифосфати(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Mg 2+ йони, необходими за работата на полимеразата.
• буферен разтвор, осигуряващи необходимите реакционни условия – pH, йонна сила на разтвора. Съдържа соли, говежди серумен албумин.

За да се избегне изпаряването на реакционната смес, в епруветката се добавя масло с висока температура на кипене, като вазелин. Ако се използва циклер с нагрят капак, това не е необходимо.

Добавянето на пирофосфатаза може да увеличи добива на PCR реакцията. Този ензим катализира хидролизата на пирофосфат, страничен продукт от добавянето на нуклеотидни трифосфати към нарастващата ДНК верига, към ортофосфат. Пирофосфатът може да инхибира PCR реакцията.

Грундове

Специфичността на PCR се основава на образуването на комплементарни комплекси между матрица и праймери, къси синтетични олигонуклеотиди с дължина 18-30 бази. Всеки от праймерите е комплементарен към една от веригите на двойноверижния шаблон и ограничава началото и края на амплифицираната област.

След хибридизация на шаблона с праймера (отгряване), последният служи като праймер за ДНК полимераза при синтеза на комплементарната верига на шаблона (виж).

Най-важната характеристика на праймерите е точката на топене (Tm) на комплекса праймер-матрица. Tm е температурата, при която половината от матричната ДНК образува комплекс с олигонуклеотидния праймер. Точката на топене може да се определи приблизително по формулата, където n X е броят на X нуклеотидите в праймера. Ако дължината и нуклеотидният състав на праймера или температурата на отгряване са избрани неправилно, е възможно образуването на частично комплементарни комплекси с други области на матричната ДНК, което може да доведе до появата на неспецифични продукти. Горната граница на температурата на топене е ограничена от оптималната температура на действие на полимеразата, чиято активност спада при температури над 80 °C.

При избора на грундове е желателно да се придържате към следните критерии:

усилвател

Ориз. един: PCR цикъл

PCR се извършва в усилвател - устройство, което осигурява периодично охлаждане и нагряване на епруветки, обикновено с точност най-малко 0,1 ° C. Съвременните циклери ви позволяват да задавате сложни програми, включително възможността за "горещ старт", Touchdown PCR (вижте по-долу) и последващо съхранение на амплифицирани молекули при 4 °C. За PCR в реално време се произвеждат устройства, оборудвани с флуоресцентен детектор. Инструментите се предлагат и с автоматичен капак и отделение за микроплака, което им позволява да бъдат интегрирани в автоматизирани системи.

Прогрес на реакцията

Снимка на гел, съдържащ маркерна ДНК (1) и PCR реакционни продукти (2,3). Числата показват дължината на ДНК фрагментите в нуклеотидни двойки.

Обикновено при провеждане на PCR се извършват 20-35 цикъла, всеки от които се състои от три етапа (фиг. 2).

Денатурация

Двойноверижната ДНК матрица се нагрява до 94-96°C (или 98°C, ако се използва особено термостабилна полимераза) за 0,5-2 минути, за да се даде възможност на ДНК веригите да се разделят. Този етап се нарича денатурациязащото водородните връзки между двете вериги на ДНК са разкъсани. Понякога, преди първия цикъл (преди добавяне на полимеразата), реакционната смес се загрява предварително за 2-5 минути. за пълна денатурация на шаблона и праймерите. Такъв подход се нарича горещ старт, позволява да се намали количеството на неспецифичните реакционни продукти.

Отгряване

Когато нишките се разделят, температурата се понижава, за да се позволи на праймерите да се свържат с едноверижния шаблон. Този етап се нарича отгряване. Температурата на отгряване зависи от състава на праймерите и обикновено се избира 4-5°C под тяхната точка на топене. Времетраене на етапа - 0,5-2 минути. Неправилният избор на температура на отгряване води или до лошо свързване на праймерите към шаблона (при повишена температура) или до свързване на неправилно място и поява на неспецифични продукти (при ниска температура).

Удължение

Разновидности на PCR

• "Вложен" PCR (Nested PCR (англ.)) - използва се за намаляване на броя на страничните продукти от реакцията. Използвайте два чифта праймери и извършете две последователни реакции. Втората двойка праймери амплифицира ДНК региона в продукта от първата реакция.
• „Обърната“ PCR (Inverse PCR (англ.)) – използва се, ако е известна само малка област в желаната последователност. Този метод е особено полезен, когато е необходимо да се определят съседни последователности след вмъкване на ДНК в генома. За прилагането на инвертирана PCR се извършва серия от разрези на ДНК с рестрикционни ензими, последвани от свързване на фрагменти (лигиране). В резултат на това известните фрагменти са в двата края на непознатата област, след което PCR може да се извърши както обикновено.
• PCR с обратна транскрипция (RT-PCR) се използва за амплифициране, изолиране или идентифициране на известна последователност от РНК библиотека. Преди конвенционалната PCR, едноверижна ДНК молекула се синтезира върху иРНК матрицата с помощта на реверсетаза и се получава едноверижна сДНК, която се използва като матрица за PCR. Този метод често определя къде и кога се експресират тези гени.
• асиметрична PCR. Асиметричен PCR) - провежда се, когато е необходимо да се амплифицира предимно една от веригите на оригиналната ДНК. Използва се в някои техники за секвениране и хибридизационен анализ. PCR се провежда както обикновено, с изключение на това, че един от праймерите се взема в голям излишък.
• Количественият PCR (Q-PCR) се използва за бързо измерване на количеството специфична ДНК, сДНК или РНК в проба.
• Количествен PCR в реално време – този метод използва флуоресцентно маркирани реагенти за точно измерване на количеството на реакционния продукт, докато се натрупва.
• Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR(English) ) - с помощта на този метод се намалява влиянието на неспецифичното свързване на праймерите върху образуването на продукта. Първите цикли се извършват при температура над температурата на отгряване, след това на всеки няколко цикъла температурата се намалява. При определена температура системата ще премине през лентата на оптимална праймерна специфичност за ДНК.
• Метод на молекулярни колонии (PCR в гел) Polony-PCR колония) - акриламидният гел се полимеризира с всички PCR компоненти на повърхността и се извършва PCR. В точките, съдържащи анализираната ДНК, настъпва амплификация с образуването на молекулярни колонии.
• PCR с бърза амплификация на cDNA краища Бърза амплификация на cDNA краища, RACE-PCR )
• PCR на дълги фрагменти PCR с голям обхват) - модификация на PCR за амплификация на разширени ДНК сегменти (10 хиляди бази или повече). Използват се две полимерази, едната от които е Taq полимераза с висока процесивност (т.е. способна да синтезира дълга ДНК верига с едно преминаване), а втората е ДНК полимераза с 3'-5' ендонуклеазна активност. Втората полимераза е необходима, за да се коригират грешките, въведени от първата.
• RAPD-PCR Случайна амплификация на полиморфна ДНК PCR , PCR с произволна амплификация на полиморфна ДНК - използва се, когато е необходимо да се разграничат организми, които са близки в генетична последователност, например различни сортове култивирани растения, породи кучета или тясно свързани микроорганизми. Този метод обикновено използва един малък праймер (20-25 bp). Този праймер ще бъде частично допълващ произволни ДНК региони на изследваните организми. Чрез избиране на условията (дължина на праймера, състав на праймера, температура и т.н.) е възможно да се постигне задоволителна разлика в PCR модела за два организма.

Ако нуклеотидната последователност на шаблона е частично известна или не е известна изобщо, може да се използва изродени праймери, чиято последователност съдържа изродени позиции, които могат да съдържат всякакви бази. Например последователността на праймера може да бъде: ...ATH... където H е A, T или C.

Приложение на PCR

PCR се използва в много области за анализ и в научни експерименти.

Криминалистика

PCR се използва за сравняване на така наречените "генетични пръстови отпечатъци". Необходима е проба от генетичен материал от местопрестъплението - кръв, слюнка, сперма, коса и др. Тя се сравнява с генетичния материал на заподозрения. Достатъчно е много малко количество ДНК, теоретично - едно копие. ДНК се нарязва на фрагменти, след което се амплифицира чрез PCR. Фрагментите се разделят с помощта на ДНК електрофореза. Получената картина на подреждането на ДНК лентите се нарича генетичен пръстов отпечатък(Английски) генетичен пръстов отпечатък).

Установяване на бащинство

Ориз. 3: Резултати от електрофореза на ДНК фрагменти, амплифицирани чрез PCR. (1) Баща. (2) Дете. (3) Майка. Детето наследи някои характеристики на генетичния отпечатък на двамата родители, което даде нов, уникален отпечатък.

Въпреки че "генетичните пръстови отпечатъци" са уникални (освен в случай на еднояйчни близнаци), семейните връзки все още могат да бъдат установени чрез създаване на няколко такива пръстови отпечатъка (фиг. 3). Същият метод може да се приложи, с леки модификации, за установяване на еволюционни връзки между организмите.

Медицинска диагностика

PCR позволява значително да се ускори и улесни диагностицирането на наследствени и вирусни заболявания. Желаният ген се амплифицира чрез PCR с помощта на подходящи праймери и след това се секвенира за определяне на мутации. Вирусните инфекции могат да бъдат открити веднага след заразяването, седмици или месеци преди появата на симптомите на заболяването.

Персонализирана медицина

Известно е, че повечето лекарства не действат при всички пациенти, за които са предназначени, а само при 30-70% от техния брой. В допълнение, много лекарства са токсични или алергични за някои пациенти. Причините за това са отчасти в индивидуалните различия в чувствителността и метаболизма на лекарствата и техните производни. Тези различия се определят на генетично ниво. Например, при един пациент определен цитохром (чернодробен протеин, отговорен за метаболизма на чужди вещества) може да бъде по-активен, при друг - по-малко. За да се определи какъв тип цитохром има даден пациент, се препоръчва да се извърши PCR анализ преди употребата на лекарството. Този анализ се нарича предварително генотипиране. проспективно генотипизиране).

Генно клониране

Генното клониране (да не се бърка с клонирането на организми) е процес на изолиране на гени и в резултат на генно инженерни манипулации получаване на голямо количество от продукта на даден ген. PCR се използва за амплифициране на гена, който след това се вмъква в вектор- ДНК фрагмент, който пренася чужд ген в същия или друг удобен за отглеждане организъм. Като вектори се използват например плазмиди или вирусна ДНК. Вмъкването на гени в чужд организъм обикновено се използва за получаване на продукт от този ген – РНК или най-често протеин. По този начин се получават много протеини в индустриални количества за използване в селското стопанство, медицината и т.н.

Ориз. четири: Генно клониране с помощта на плазмид. .
(1) Хромозомна ДНК на организъм А. (2) PCR. (3) Множество копия на гена на организъм А. (4) Вмъкване на гена в плазмид. (5) Плазмид с гена на организъм A. (6) Въвеждане на плазмида в организъм B. (7) Умножаване на броя на копията на гена на организъм A в организъм B.

ДНК секвениране

В метода за секвениране, използващ флуоресцентно или радиоактивно белязани дидезоксинуклеотиди, PCR е неразделна част, тъй като по време на полимеризацията нуклеотидните производни, белязани с флуоресцентен или радиоактивен етикет, се вмъкват в ДНК веригата. Това спира реакцията, позволявайки да се определят позициите на специфични нуклеотиди след разделяне на синтезираните нишки в гела.

Мутагенеза

В момента PCR се превърна в основен метод за мутагенеза. Използването на PCR позволи да се опрости и ускори процедурата на мутагенеза, както и да я направи по-надеждна и възпроизводима.

Бактериална генетика. Информация за втори урок.

полимеразна верижна реакция

Полимеразна верижна реакция е метод, който позволява многократно увеличаване (амплификация) на броя на определени ДНК молекули в анализираната проба (включително биологичен материал или чиста култура).

Основните предимства на PCR като диагностичен метод в микробиологията са неговата много висока чувствителност, която позволява откриването на изключително ниски концентрации на патогени в пробите, както и регулируема специфичност, която прави възможно откриването или идентифицирането на патогени при генерични, видове , или ниво на подвид. Основният недостатък на PCR произтича от неговата изключително висока чувствителност - много лесно е изображенията да замърсят ДНК от положителна контрола, друга проба или PCR продукт, което води до фалшиво положителна реакция. Това налага строги ограничения върху условията, при които PCR се смесва и обработва с готови PCR продукти.

Провеждане на PCR.Приготвя се реакционна смес, съдържаща следните компоненти:

изолирана ДНК от тестовата проба,

буферен разтвор,

Mg2+ йони (необходими за работата на ензима),

Два праймера са едноверижни къси ДНК молекули (най-често с дължина от 18 до 24 нуклеотида), комплементарни на краищата на различни вериги на ДНК последователността, която трябва да бъде открита.

Смес от дезоксинуклеотид трифосфати.

Топлоустойчива ДНК полимераза (най-често използваната е Taq полимераза, полимераза, изолирана от Термус aquaticus).

След това тази реакционна смес се поставя в цикъла, който всъщност е програмируем термостат. В циклера се извършват 30-40 цикъла на температурни промени. Всеки от тези цикли се състои от три етапа (виж фиг. 1):

Денатурация (температура 94 ° C) - водородните вериги се разкъсват и ДНК веригите се разминават.

Отгряване на праймера (температурата обикновено е в района на 50-60 ° C) - праймерите са прикрепени към краищата на ДНК веригите. Като цяло, когато температурата се понижи, енергийно по-благоприятно е повторното обединяване на оригиналните ДНК вериги от изследваната проба (ренатурация), но концентрацията на праймери в реакционната смес е много порядъци по-висока от концентрацията на ДНК от пробата (поне в началните PCR цикли), така че реакцията на отгряване на праймера протича по-бързо от ренатурацията. Температурата на отгряване се избира в зависимост от температурите на топене (денатурация) на праймерите.

Удължаване (температурата обикновено е 72 ° C) - ДНК полимеразата завършва праймерите по шаблона на дълги ДНК вериги. Температурата съответства на оптималната работна температура за използваната ДНК полимераза.

Откриването на резултатите се различава в различните PCR формулировки и е описано в раздела „Разновидности на PCR“.

Динамика на PCR

В ранните PCR цикли броят на двойноверижните ДНК молекули, чийто размер се определя от разстоянието между праймерните места, се удвоява с всеки цикъл. Образуват се и малък брой по-дълги ДНК молекули, които могат да бъдат пренебрегнати (виж Фигура 2).

Така в ранните цикли количеството на PCR продукта се описва с формулата m*2 n, където m е първоначалното количество от желаната ДНК в пробата, n е броят на циклите. След това реакцията достига плато. Това се дължи на натрупването на реакционния продукт, намаляване на концентрацията на праймери и дезоксинуклеотид трифосфати, както и поради повишаване на концентрацията на пирофосфат (виж фиг. 3).

Разновидности на PCR

Конвенционален PCR

При тази версия на PCR настройката реакцията протича за предварително избран брой цикли (30-40), след което се анализира дали е настъпило натрупване на двойноверижни ДНК молекули в реакционната смес.

Този вариант на PCR, когато се използва като диагностичен метод, е качествен метод. Положителната реакция показва наличието на поне следи от желаните ДНК молекули в пробата. Отрицателната реакция показва тяхното отсъствие. Количествената оценка на съдържанието на изходните ДНК молекули в пробата е невъзможна поради достигане на реакцията на плато.

Основният метод за откриване на наличието на продукта е електрофореза в агарозен или полиакриламиден гел. PCR продуктите се разделят в гела под действието на електрическо поле според молекулното им тегло. Към гела се добавя интеркалиращо багрило (флуоресцентно в състояние, свързано с двойноверижна ДНК - най-често етидиев бромид). По този начин, когато се изложи на ултравиолетова светлина, ще бъде възможно да се види наличието или отсъствието на лента, съответстваща на ДНК с необходимото молекулно тегло. При провеждане на PCR с диагностична цел винаги се поставят контроли с положителна и отрицателна реакция, с които се сравняват пробите (виж фиг. 4).

PCR в реално време

В тази версия на PCR настройката количеството на PCR продукта в реакционната смес постоянно се записва по време на протичането на реакцията. Това ви позволява да изградите реакционна крива (вижте фиг. 3) и въз основа на нея да изчислите броя на желаните ДНК молекули в пробите.

Един тип PCR в реално време използва интеркалиращо багрило, което се добавя директно към реакционната смес (SYBRGreen се използва най-често). Друг тип е използването на един от видовете флуоресцентни сонди, които се свързват с място вътре в PCR продукта, което прави възможно увеличаването на специфичността на детекцията (вижте Фиг. 5).Флуоресцентната детекция се осъществява директно в устройството по време на реакцията.

В допълнение към възможността за количествено откриване, има и други предимства на PCR в реално време в сравнение с конвенционалната PCR. Този PCR вариант е по-опростен, по-бърз и не изисква отваряне на епруветки с PCR продукти, което намалява възможността от замърсяване на други проби. Основният недостатък е по-високата цена на усилвател с вградена способност за откриване на флуоресценция в сравнение с конвенционален.

Цифрова количествена PCR

Нова, скъпа и все още нешироко използвана версия на PCR, която позволява по-точно определяне на количеството ДНК в проба.В тази версия реакционната смес, съдържаща флуоресцентно багрило, се разделя на огромен брой микроскопични обеми (напр. , капчици в емулсия). След PCR се анализира в каква част от капчиците реакцията се е оказала положителна и съответно се наблюдава флуоресценция. Тази пропорция ще бъде пропорционална на броя на интересуващите ни ДНК молекули в пробата.

PCR с обратна транскрипция

В този случай, преди един или друг вариант на PCR, се извършва реакция на обратна транскрипция (РНК към ДНК) с помощта на обратния ензим. По този начин този метод позволява качествено или количествено откриване на РНК молекули. Това може да се използва за откриване на РНК-съдържащи вируси или за определяне на нивото на транскрипция (количеството иРНК) на определен ген.

Снимка 1. PCR стъпки. Грундовете са маркирани в червено.

Фигура 2.Натрупване на праймер-ограничени двуверижни ДНК молекули по време на PCR.

Фигура 3Динамиката на PCR реакцията при различни начални концентрации на желаните ДНК молекули в пробата. (a) - най-високата концентрация (b) - междинна концентрация (c) - най-ниската концентрация

Фигура 4Агарозна електрофореза на PCR продукти. K+ - положителна контрола (очевидно е налице необходимото ДНК). 1-7 - тестови проби (от които 1-2 са положителни, 3-7 са отрицателни). K- -отрицателна контрола (определено липсва желаната ДНК). В много случаи, в допълнение към целевия продукт, се виждат по-леки неспецифични реакционни продукти (праймери-димери).

Фигура 5Методи за откриване чрез PCR в реално време. (a) - интеркалиращо багрило - флуоресцира при свързване с двойноверижна ДНК (b) - Taqman сонда - флуоресценция възниква, когато сондата се разцепи от ДНК полимераза с 5'-3' ендонуклеазна активност поради разделянето на флуорофора и гасителя. (c) MolecularBeacon сонда - флуоресценция възниква, когато сондата се хибридизира с целевия фрагмент поради пространственото разделяне на флуорофора и гасителя (d) - LightCycler сонди - акцепторната флуоресценция възниква, когато сондите (съдържащи акцептор и донор) се хибридизират с целта фрагмент, дължащ се на резонансния флуоресцентен трансфер на енергия (FRET).

1. Полимеразна верижна реакция (PCR)

2. Принцип на метода на полимеразна верижна реакция

2.1 Наличие на редица компоненти в реакционната смес

2.2 Температурни цикли

2.3 Основни принципи на избор на грунд

2.4 Ефект на платото

3. Етапи на PCR настройка

3.2 Усилване

3.4.1 Положителни контроли

3.4.2 Вътрешен контрол

4.1 Качествен анализ

4.1.2 Откриване на РНК молекули

3.1 Пробоподготовка на биологичен материал

Използват се различни техники за извличане на ДНК в зависимост от задачите. Тяхната същност се състои в екстракция (извличане) на ДНК от биологичен продукт и отстраняване или неутрализиране на чужди примеси за получаване на ДНК препарат с чистота, подходяща за PCR.

Методът за получаване на чист ДНК препарат, описан от Мармур, се счита за стандартен и вече е станал класически. Включва ензимна протеолиза, последвана от депротеинизация и повторно утаяване на ДНК с алкохол. Този метод дава възможност за получаване на чист ДНК препарат. Това обаче е доста трудоемко и включва работа с такива агресивни и остри вещества като фенол и хлороформ.

Един от популярните в момента методи е методът за екстракция на ДНК, предложен от Boom et al. Този метод се основава на използването на силен хаотропен агент, гуанидин тиоцианат (GuSCN), за клетъчен лизис и последваща сорбция на ДНК върху носител (стъклени перли, диатомит, стъклено мляко и др.). След промиване ДНК остава в пробата, адсорбирана върху носителя, от който може лесно да бъде отстранена с помощта на елуиращ буфер. Методът е удобен, технологичен и подходящ за подготовка на проби за амплификация. Възможни са обаче загуби на ДНК поради необратима сорбция върху носителя, както и по време на многобройни измивания. Това е особено важно при работа с малки количества ДНК в пробата. Нещо повече, дори следи от GuSCN могат да инхибират PCR. Ето защо, когато се използва този метод, правилният избор на сорбент и внимателното спазване на технологичните нюанси са много важни.

Друга група методи за подготовка на пробите се основава на използването на йонообменници тип Chilex, които, за разлика от стъклото, не адсорбират ДНК, а обратното, примеси, които пречат на реакцията. По правило тази технология включва два етапа: кипене на пробата и адсорбция на примеси върху йонообменник. Методът е изключително атрактивен поради своята простота на изпълнение. В повечето случаи е подходящ за работа с клиничен материал. За съжаление, понякога има проби с примеси, които не могат да бъдат отстранени с помощта на йонообменници. Освен това някои микроорганизми не могат да бъдат унищожени чрез обикновено кипене. В тези случаи е необходимо въвеждането на допълнителни етапи на обработка на пробите.

Следователно изборът на метод за подготовка на пробата трябва да се третира с разбиране на целите на предвидените анализи.

3.2 Усилване

За да се извърши реакцията на амплификация, е необходимо да се подготви реакционната смес и да се добави анализираната ДНК проба към нея. В този случай е важно да се вземат предвид някои характеристики на отгряването на праймера. Факт е, че като правило в анализираната биологична проба има различни ДНК молекули, към които праймерите, използвани в реакцията, имат частична, а в някои случаи значителна хомоложност. В допълнение, праймерите могат да се отгряват един към друг, за да образуват праймери-димери. И двете водят до значителна консумация на праймери за синтеза на странични (неспецифични) реакционни продукти и в резултат значително намаляват чувствителността на системата. Това прави трудно или невъзможно разчитането на резултатите от реакцията по време на електрофореза.

3.3 Оценка на резултатите от реакцията

За да се оценят правилно резултатите от PCR, е важно да се разбере, че този метод не е количествен. Теоретично продуктите на амплификация на единични целеви ДНК молекули могат да бъдат открити чрез електрофореза след 30-35 цикъла. На практика обаче това се прави само в случаите, когато реакцията протича при условия, близки до идеалните, което не се среща често в живота. Степента на чистота на ДНК препарата има особено голямо влияние върху ефективността на амплификацията; наличието на определени инхибитори в реакционната смес, от които в някои случаи може да бъде изключително трудно да се отървете. Понякога, поради тяхното присъствие, не е възможно да се амплифицират дори десетки хиляди целеви ДНК молекули. По този начин често няма пряка връзка между първоначалното количество целева ДНК и крайното количество продукти на амплификация.

3.3.1 Метод на хоризонтална електрофореза

Използват се различни методи за визуализиране на резултатите от амплификацията. Най-често срещаният днес е методът на електрофорезата, базиран на разделянето на ДНК молекулите по размер. За да направите това, се приготвя плоча от агарозен гел, който се замразява с агароза след разтопяване в електрофоретичен буфер при концентрация 1,5-2,5% с добавяне на специално ДНК багрило, например етидиев бромид. Замразената агароза образува пространствена решетка. При изливане с помощта на гребени в гела се образуват специални ямки, в които впоследствие се добавят продукти за усилване. Гелната плоча се поставя в хоризонтален апарат за гел електрофореза и се свързва източник на постоянно напрежение. Отрицателно заредената ДНК започва да се движи в гела от минус към плюс. В същото време по-късите ДНК молекули се движат по-бързо от дългите. Скоростта на движение на ДНК в гела се влияе от концентрацията на агароза, силата на електрическото поле, температурата, състава на буфера за електрофореза и, в по-малка степен, GC състава на ДНК. Всички молекули с еднакъв размер се движат с еднаква скорост. Багрилото се вгражда (интеркалира) в равнинни групи в ДНК молекули. След края на електрофорезата, която продължава от 10 минути до 1 час, гелът се поставя върху филтъра на трансилюминатор, излъчващ светлина в ултравиолетовия диапазон (254 - 310 nm). UV енергията, погълната от ДНК при 260 nm, се прехвърля към багрилото, което го кара да флуоресцира в оранжево-червената област на видимия спектър (590 nm).

Яркостта на лентите на усилващите продукти може да бъде различна. Това обаче не може да бъде свързано с първоначалното количество целева ДНК в пробата.

3.3.2 Метод на вертикална електрофореза

Методът на вертикалната електрофореза е фундаментално подобен на хоризонталната електрофореза. Тяхната разлика се състои в това, че в този случай се използват полиакриламидни гелове вместо агароза. Извършва се в специална камера за вертикална електрофореза. Електрофорезата с полиакриламиден гел има по-висока разделителна способност от агарозната електрофореза и дава възможност да се разграничат ДНК молекули с различни размери с точност до един нуклеотид. Приготвянето на полиакриламиден гел е малко по-сложно от агарозата. Освен това акриламидът е токсично вещество. Тъй като рядко възниква необходимостта от определяне на размера на продукта на амплификация с точност до 1 нуклеотид, в рутинната работа се използва методът на хоризонтална електрофореза.

3.4 Мониторинг на хода на реакцията на усилване

3.4.1 Положителни контроли

Като "положителна контрола" използвайте ДНК препарата на желания микроорганизъм. Неспецифичните ампликони се различават по размер от ампликоните, генерирани чрез амплификация с контролен ДНК препарат. Размерът на неспецифичните продукти може да бъде по-голям или по-малък от положителната контрола. В най-лошия случай тези размери могат да съвпаднат и се отчитат при електрофореза като положителни.

За да се контролира специфичността на получения продукт на амплификация, могат да се използват хибридизационни сонди (участъци на ДНК, разположени в амплифициращата последователност), маркирани с ензимни етикети или радиоактивни изотопи и взаимодействащи с ДНК в съответствие със същите принципи като праймерите. Това значително усложнява и удължава анализа, а цената му значително се увеличава.

3.4.2 Вътрешен контрол

Необходимо е да се контролира хода на амплификацията във всяка епруветка с реакционната смес. За целта се използва допълнителен, т. нар. „вътрешен контрол“. Това е всеки препарат на ДНК, който не е подобен на ДНК на желания микроорганизъм. Ако вътрешната контрола се добави към реакционната смес, тогава тя ще стане същата цел за отгряване на праймера като хромозомната ДНК на желания инфекциозен агент. Размерът на вътрешния контролен продукт на амплификация е избран така, че да е 2 или повече пъти по-голям от ампликоните, генерирани от амплификацията на целевата ДНК на микроорганизма. В резултат на това, ако вътрешната контролна ДНК се въведе в реакционната смес заедно с тестовата проба, тогава независимо от наличието на микроорганизъм в биологичната проба, вътрешната контрола ще предизвика образуването на специфични ампликони, но много по-дълги (по-тежки) отколкото ампликона на микроорганизма. Наличието на тежки ампликони в реакционната смес ще покаже нормалния ход на реакцията на амплификация и отсъствието на инхибитори. Ако не са се образували ампликоните с необходимия размер, но не са се образували и вътрешните контролни ампликони, може да се заключи, че анализираната проба съдържа нежелани примеси, които трябва да бъдат елиминирани, но не и липсата на желаната ДНК.

За съжаление, въпреки цялата привлекателност на този подход, той има значителен недостатък. Ако необходимата ДНК присъства в реакционната смес, тогава ефективността на нейното усилване рязко намалява поради конкуренцията с вътрешния контрол за праймери. Това е особено важно при ниски концентрации на ДНК в тестовата проба, което може да доведе до фалшиво отрицателни резултати.

Независимо от това, при условие че проблемът с конкуренцията за праймери е решен, този метод за контролиране на ефективността на амплификацията със сигурност ще бъде много полезен.

4. Методи, базирани на полимеразната верижна реакция

4.1 Качествен анализ

Класическият метод за настройка на PCR, чиито принципи бяха изложени по-горе, е разработен в някои модификации, насочени към преодоляване на ограниченията на PCR и повишаване на ефективността на реакцията.

4.1.1 Как да настроите PCR чрез „горещ старт“

За да се намали рискът от образуване на неспецифични продукти от реакцията на амплификация, се използва подход, наречен "hot-start", чиято същност е да се предотврати възможността за стартиране на реакцията до достигане на условията в тръбата, които осигуряват специфично отгряване на грундове.

Факт е, че в зависимост от състава и размера на HC праймерите имат определена температура на топене (Tm). Ако температурата на системата надвиши Tm, праймерът не може да се прилепи към ДНК веригата и денатурира. При оптимални условия, т.е. температура на отгряване, близка до температурата на топене, праймерът образува двуверижна молекула само ако е напълно комплементарна и по този начин осигурява специфичността на реакцията.

Има различни опции за прилагане на "горещ старт":

Въвеждане на Taq полимераза в реакционната смес по време на първия цикъл след нагряване на епруветката до температурата на денатурация.

Разделяне на съставките на реакционната смес чрез парафинов слой на слоеве (праймери в долната част, Taq полимераза и целева ДНК в горната част), които се смесват, когато парафинът се разтопи (~65-75 0 С).

Използване на моноклонални антитела срещу Taq полимераза. Ензимът, свързан с моноклонални антитела, става активен едва след първия етап на денатурация, когато моноклоналните антитела необратимо денатурират и освобождават активните центрове на Taq полимераза.

Във всички тези случаи, дори ако неспецифичното отгряване е настъпило преди началото на термичния цикъл, удължаване не настъпва и комплексите праймер-ДНК се денатурират при нагряване, така че не се образуват неспецифични продукти. Впоследствие температурата в тръбата не пада под точката на топене, което осигурява образуването на специфичен продукт на усилване.

4.1.2 Откриване на РНК молекули

Възможността за използване на РНК като мишена за PCR значително разширява обхвата на приложение на този метод. Например, геномите на много вируси (хепатит С, грипен вирус, пикорнавируси и др.) са представени от РНК. В същото време в техния жизнен цикъл няма междинна фаза на трансформация в ДНК. За да се открие РНК, тя първо трябва да бъде преобразувана във формата на ДНК. За това се използва обратна транскриптаза, която се изолира от два различни вируса: вирус на миелобластоза при птици и вирус на миша левкемия на Moloney. Използването на тези ензими е свързано с някои трудности. На първо място, те са термолабилни и следователно могат да се използват при температура не по-висока от 42 ° C. Тъй като при тази температура РНК молекулите лесно образуват вторични структури, ефективността на реакцията намалява значително и според различни оценки е приблизително 5%. Правят се опити да се заобиколи този недостатък чрез използване на термостабилна полимераза, получена от термофилния микроорганизъм Thermus Thermophilus, който проявява транскриптазна активност в присъствието на Mn2+, като обратна транскриптаза. Това е единственият известен ензим, способен да проявява както полимеразна, така и транскриптазна активност.

За да се осъществи реакцията на обратна транскрипция, реакционната смес, както и при PCR, трябва да съдържа праймери като зародиш и смес от 4 dNTP като строителен материал.

След реакцията на обратна транскрипция, получените cDNA молекули могат да служат като мишена за PCR.

5. Организация на технологичния процес на настройка на PCR

Потенциално високата чувствителност на полимеразната верижна реакция прави абсолютно необходимо да има особено внимателен дизайн на PCR лабораторията. Това се дължи на най-острия проблем на метода – замърсяването.

Замърсяване - попадане от външната среда в реакционната смес на специфични ДНК молекули, които могат да служат като мишени в реакцията на амплификация и дават фалшиво положителни резултати.

Има няколко начина да се справите с това неприятно явление. Едно от тях е използването на ензима N-урацил гликозилаза (UG). Този метод се основава на способността на UG да разцепва ДНК молекули с вграден урацил. Реакцията на амплификация се провежда с помощта на dNTP смес, в която dTTP е заменен с урацил, и след термичен цикъл всички ампликони, образувани в епруветката, ще съдържат урацил. Ако HC се добави към реакционната смес преди амплификация, тогава ампликоните, които влизат в реакционната смес, ще бъдат унищожени, докато нативната ДНК ще остане непокътната и впоследствие ще служи като мишена за амплификация.

По този начин този метод само до известна степен елиминира източника на замърсяване и не гарантира срещу фалшиви положителни резултати.

Друг начин за справяне с резултатите от замърсяването е значително намаляване на броя на реакционните цикли (до 25-30 цикъла). Но дори и при този подход рискът от получаване на фалшиво положителни резултати е висок, тъй като в този случай, при липса на инхибитори, е лесно да се получи продукт на амплификация поради замърсяване.

По този начин, въпреки ползите от мерките за предварително усилване, насочени към инактивиране на ДНК молекули, които причиняват фалшиви положителни резултати, най-радикалното средство е добре обмислената организация на лабораторията.

Заключение

PCR методът в момента е най-широко използваният метод за диагностициране на различни инфекциозни заболявания. PCR ви позволява да идентифицирате етиологията на инфекцията, дори ако пробата, взета за анализ, съдържа само няколко ДНК молекули на патогена. PCR се използва широко в ранната диагностика на HIV инфекции, вирусни хепатити и др. Към днешна дата почти няма инфекциозен агент, който да не може да бъде открит чрез PCR.