Reef direkt és indirekt módszerek. A szexuális úton terjedő fertőzések laboratóriumi diagnosztikája

Jelenleg széles körben alkalmazzák a szerológiai teszteket, amelyekben jelölt AG-k vagy AT-la vesznek részt. Ide tartoznak az immunfluoreszcens reakciók, a radioimmun és az enzimes immunológiai vizsgálati módszerek.

Alkalmazzák:

1) fertőző betegségek szerodiagnózisára, azaz antitestek kimutatására ismert konjugált (kémiailag kombinált) antigének, különféle jelölésekkel (enzimek, fluorokróm festékek) segítségével;

2) a mikroorganizmus vagy szerovariáns meghatározása standard jelölt diagnosztikai antitestekkel (gyorsdiagnosztika).

A szérumokat úgy állítják elő, hogy az állatokat a megfelelő antigénekkel immunizálják, majd az immunglobulinokat izolálják és világító festékekkel (fluorokrómokkal), enzimekkel és radioizotópokkal konjugálják.

A jelölt SR-ek specifitásukban nem rosszabbak a többi SR-nél, és érzékenységükben felülmúlják az összes SR-t.

Nincs kapcsolódó tartalom

Világító fluorokróm festékeket (fluoriszcein-izotiocianát stb.) használnak jelölésként.

A RIF-nek különféle módosításai vannak. A fertőző betegségek expressz diagnosztikájára - a mikrobák vagy antigénjeik kimutatására a vizsgálati anyagban a Koons szerinti RIF-et használják.

Koons szerint két RIF-módszer létezik: közvetlen és közvetett.

Közvetlen RIF komponensek:

1) a vizsgált anyag (a nasopharynx által elválasztott bélmozgás stb.);

2) jelölt specifikus immunszérum, amely AT-la-t tartalmaz a kívánt antigénhez;

3) izotóniás nátrium-klorid oldat.

A vizsgálati anyagból származó kenetet jelölt antiszérummal kezeljük.

AG-AT reakció lép fel. A lumineszcens mikroszkópos vizsgálat azon a területen, ahol az AG-AT komplexek lokalizálódnak, fluoreszcenciát - lumineszcenciát mutat.

Közvetett RIF összetevők:

1) a vizsgált anyag;

2) specifikus antiszérum;

3) antiglobulin szérum (AT-la immunglobulin ellen), fluorokrómmal jelölt;

4) Izotóniás nátrium-klorid oldat.

A tesztanyagból származó kenetet először immunszérummal kezeljük a kívánt antigénnel, majd jelölt antiglobulin szérummal.

A világító AG-AT komplexeket – a jelölt AT-t fluoreszcens mikroszkóppal detektáljuk.

Az indirekt módszer előnye, hogy nincs szükség fluoreszcens specifikus szérumok széles választékának elkészítésére, és csak egy fluoreszcens antiglobulin szérumot használnak.

Az indirekt RIF egy 4 komponensű változatát is izolálják, ha kiegészítést (tengerimalac szérumot) adnak be. Pozitív reakció esetén AG-AT komplex keletkezik - jelölt - AT-komplement.

A RIF baktériumok, rickettsia és vírusok antigénjeinek kombinációján alapul fluoreszcens festékekkel (fluoreszcein-izotiocianát, rodamin, B-izotiocianát, lizatin-rodamin B-200, szulfoklorid stb.) reaktív csoportokkal (szulfokloridciánnal, izotiokloriddal stb.) jelölt antitestekkel. .) . Ezek a csoportok egyesülnek az antitestmolekulák szabad aminocsoportjaival, amelyek nem veszítik el specifikus affinitásukat a megfelelő antigénhez, ha fluorokrómmal kezelik. A keletkező AG-AT komplexek fluoreszcens mikroszkóp alatt jól látható, erősen világító szerkezetekké válnak (7. ábra). A RIF képes kimutatni kis mennyiségű bakteriális és vírusantigént. A RIF módszer két változatban használatos: direkt és indirekt módszerrel.

A közvetlen módszer egy antigén és egy jelölt antitest közvetlen asszociációján alapul. Az indirekt módszer az AG-AT komplex fázisos detektálásán alapul fluoreszcens festékek segítségével. Az első szakasz egy bizonyos antigén és specifikus antitestek immunkomplexeinek kialakításából áll. A második lépés ennek a komplexnek az azonosítása jelzett antigammaglobulinnal történő kezeléssel.

A RIF előnye az egyszerűség, a nagy érzékenység, az eredmény elérésének gyorsasága. A RIF-et az influenza, vérhas, malária, pestis, tularémia, szifilisz stb. korai expressz diagnosztizálására szolgáló módszerként használják. Az ilyen vizsgálatok elvégzéséhez lumineszcens mikroszkópot használnak.

Radioimmunoassay (RIA)

A RIA az egyik legérzékenyebb immundiagnosztikai módszer. A hepatitis B vírus antigénjének kimutatására használják vírusos hepatitisben szenvedő betegeknél. Ehhez referenciaszérumot (a hepatitis B vírus elleni antitesteket tartalmazó szérumot) adnak a vizsgált szérumhoz. A keveréket 1-2 napig inkubáljuk 40 °C-on, majd referencia antigént (125 J izotóppal jelölt antigént) adunk hozzá, és az inkubálást további 24 órán át folytatjuk. A referencia szérumfehérjék ellen kicsapó antiimmunglobulinokat adunk a kapott antigén-antitest komplexhez, ami csapadék képződéséhez vezet (8. ábra). Az eredményt a számláló által rögzített csapadékban lévő impulzusok jelenléte és száma veszi figyelembe. Ha a vizsgált szérumban specifikus antitestekhez kötődő antigén van, az utóbbi nem kötődik a jelölt antigénhez, ezért nem mutatható ki a csapadékban. A RIA tehát a meghatározott antigén és ismert mennyiségű jelölt antigén és az antitestek aktív központjai közötti kompetitív kölcsönhatás elvén alapul, jelölésként radioaktív izotópokat használnak.

A staging technikától függően a RIA két módszerét különböztetjük meg.

1) Technika "folyékony fázis" (klasszikus RIA). Ennek a színpadi technikának a hátránya az igény

a szabad és a kötött jelölt antigének (vagy antitestek) speciális elkülönítése.

2) A "szilárd fázis" technika.

Az ismert specifitású AG vagy AT szorbensekhez kötődik (szilárd fázis) - egy polisztirol kút vagy egy műanyag cső falaihoz. A többi IC komponens szekvenciálisan felszívódik az immobilizált AG-ra (AT).

A reakció természetétől függően a következő módszereket különböztetjük meg:

1) Versenyképes módszer - az AG versenyén alapuló módszer.

A reakció összetevői:

a) kimutatható AG (vizsgálati anyag - vér, köpet stb.);

b) radioizotóppal jelölt antigén, amely azonos a vizsgált antigénnel;

c) ismert koncentrációjú specifikus antitestek kötődnek a szorbenshez;

d) standard AG (kontroll);

e) pufferoldat.

Először a vizsgált AG-t vezetjük be a reakcióba. A szorbens felületén AG-AT komplex képződik. A szorbenst lemossuk, majd jelzett AG-t vezetünk be, minél nagyobb a vizsgált AG tartalma, annál kevésbé kötődik a jelölt AG az AT-m-hez a szorbens felületén. A jelölt antigén koncentrációját a reakció radioaktivitásának számlálók segítségével történő mérésével határozzuk meg. A reakció radioaktivitásának értéke fordítottan arányos a vizsgált mintában lévő AG mennyiségével.

2) Nem kompetitív módszer.

A reakció összetevői:

a) meghatározott AG;

b) ismert koncentrációjú specifikus AT-a, kötött

nye a szorbensen;

c) a kötött antitesttel azonos, jelölt antitestek

radioizotóp;

d) standard AG;

e) pufferoldat.

A vizsgált AG-t hozzáadjuk a kötött antitestekhez. Az inkubáció során AG-AT komplexek képződnek a szorbensen. A szorbenst lemossuk a szabad komponensekről, és jelölt antitesteket adunk hozzá, amelyek a komplexben lévő AG-on szabad vegyértékeihez kötődnek. A radioaktivitás mennyisége arányos a vizsgált AG koncentrációjával.

3) "Szendvics módszer" (indirekt módszer) - a leggyakoribb módszer.

Alkatrészek:

a) tesztszérum (vagy teszt AG);

b) a szorbensre kötött AG-k (vagy az AG-a meghatározásakor a szorbensre kötött AT-la);

c) radioizotópokkal jelölt immunglobulinok elleni diagnosztikai antitestek;

d) kontroll szérumok (vagy antigének);

e) pufferoldatok.

A vizsgált antitestek (vagy AG-k) reakcióba lépnek a szilárd fázisú AG-kkal (AT), majd az inkubált anyagot eltávolítják, és jelölt antiglobulin antitesteket vezetnek be a reakcióba, amelyek a szorbens felületén lévő specifikus AG-AT komplexekhez kötődnek. A reakció radioaktivitásának nagysága egyenesen arányos a vizsgált AT (vagy AG) mennyiségével.

A RIA előnyei:

1) nagy specifitás és érzékenység;

2) a beállítási technika egyszerűsége;

3) az eredmények mennyiségi értékelésének pontossága;

4) könnyen automatizálható.

Hátránya: radioaktív izotópok használata.

Nincs kapcsolódó tartalom

ELISA módszer (ELISA)

A módszert antigének kimutatására használják a megfelelő antitestek felhasználásával, amelyeket jelölt enzimmel (torma-peroxidáz, b-galaktóz vagy alkalikus foszfatáz) konjugálnak. Miután az antigént az enzimmel jelölt immunszérummal kombináltuk, a szubsztrátot és a kromogént hozzáadjuk a keverékhez. A szubsztrátot az enzim hasítja, és bomlástermékei a kromogén kémiai módosulását okozzák. Ebben az esetben a kromogén megváltoztatja a színét – a színintenzitás egyenesen arányos a megkötött antigén- és antitestmolekulák számával (9. ábra).

A legelterjedtebb a szilárd fázisú ELISA, amelyben az immunválasz egyik komponense (antigén vagy antitest) szilárd hordozón adszorbeálódik. A polisztirol mikropaneleket szilárd hordozóként használják. Az antitestek meghatározásakor a betegek vérszérumát, az enzimmel jelölt antiglobulin szérumot, valamint az enzim szubsztrát és a kromogén oldatának keverékét egymás után hozzáadják az adszorbeált antigént tartalmazó üregekhez. A következő komponens hozzáadása után minden alkalommal a meg nem kötött reagenseket alapos mosással távolítjuk el a lyukakból. Pozitív eredmény esetén a kromogén oldat színe megváltozik. A szilárd fázisú hordozó nemcsak antigénnel, hanem antitesttel is érzékenyíthető. Ezután a kívánt antigént szorbeált antitestekkel juttatjuk a lyukakba, hozzáadjuk az enzimmel jelölt antigén elleni immunszérumot, majd hozzáadjuk az enzim és a kromogén szubsztrát oldatainak keverékét.

Az ELISA-val vírusos és bakteriális kórokozók által okozott betegségeket diagnosztizálnak, jelzésként enzimeket használnak: peroxidáz, alkalikus foszfatáz stb.

A reakció indikátora az enzimek azon képessége, hogy a megfelelő szubsztráttal érintkezve színreakciókat váltanak ki. Például a peroxidáz szubsztrátja ortofenil-diamin oldat.

A legszélesebb körben használt szilárd fázisú ELISA. Az ELISA lényege hasonló a RIA-hoz.

Az ELISA eredményei vizuálisan és az optikai sűrűség spektrofotométeren történő mérésével értékelhetők.

Az ELISA előnyei a következők:

Nincs érintkezés radioaktív anyagokkal;

A válaszértékelési módszerek egyszerűsége;

A konjugátumok stabilitása;

Könnyen automatizálható.

A RIA-val összehasonlítva azonban a módszer alacsonyabb érzékenysége figyelhető meg, de bizonyos esetekben az érzékenység jobb, mint a RIF és a RIM.

Példaként a következő típusú ELISA-t mutatjuk be:

versengő típus.

Időpont egyeztetés.

A hepatitis B vírus (HB3 Ad) felszíni antigénjének kimutatására tervezték a szérumban és a plazmában a vírusos hepatitis B diagnosztizálásában és a HB5 Ad hordozásának meghatározásában.

Alkatrészek:

1) vizsgálati anyag szérum vagy vérplazma;

2) polisztirol mikrolemez üregének felületén adszorbeált HB3 Ad elleni antitestek;

3) konjugátum – peroxidázzal jelölt HB3 Ad elleni egér monoklonális antitestek,

4) ortofenilén-diamin (OPD) szubsztrát;

5) foszfáttal pufferolt sóoldat;

6) kontroll szérum:

Pozitív (szérum HBe Addal);

Negatív (szérum HBs Ad nélkül). Előrehalad

1) Kontroll- és tesztszérumok bevezetése.

2) Inkubálás 1 óra 37 °C-on.

3) Mosó kutak.

4) A konjugátum bevezetése.

5) Inkubálás 1 óra 37 °C-on.

6) Mosó kutak.

7) Az OFD bevezetése. HBs Ad jelenlétében az oldat sárgává válik a lyukakban.

Az ELISA-t az optikai sűrűség alapján, fotométerrel veszik figyelembe. Az optikai sűrűség mértéke fordítottan arányos a vizsgált HBs Ad koncentrációjával.

Gépezet

A reakció három fázisban megy végbe:

1) HB3 A vizsgált szérum (plazma) vérnyomása a lyuk felületén adszorbeált homológ antitestekhez kötődik. IR AG-AT képződik. (NVz Ad - agl \ NVz AT).

2) A peroxidázzal jelölt HBs Ad antitestek az AG-AT komplex fennmaradó szabad HBs Ad determinánsaihoz kötődnek. AT-AG-vel jelölt Abs komplex (egy!1 HBs AT-HBs Ad-ap(1 HBs Abs peroxidázzal jelölt) képződik.

3) Az OPD kölcsönhatásba lép (peroxidázzal) az AT-AG-AT komplexszel, és sárga elszíneződés lép fel.

közvetett típus

Ez a HIV-fertőzés diagnosztizálásának fő tesztreakciója.

Cél: HIV-fertőzés szerológiai diagnosztikája - HIV antigének elleni antitestek kimutatása, Összetevők:

1) vizsgálati anyag - vérszérum;

2) szintetikus

Immunfluoreszcens reakció - RIF (Koons-módszer) Háromféle direkt módszer létezik, indirekt módszer, komplementtel. A Koons-reakció egy gyors diagnosztikai módszer mikrobiális antigének kimutatására vagy antitestek kimutatására.

A direkt RIF módszer azon alapszik, hogy a fluorokrómmal jelölt antitestekkel ellátott immunszérummal kezelt szöveti antigének vagy mikrobák képesek világítani a fluoreszcens mikroszkóp UV sugaraiban. Az ilyen lumineszcens szérummal kezelt kenetben lévő baktériumok zöld szegély formájában világítanak a sejt perifériáján.

Az indirekt RIF módszer az antigén-antitest komplex azonosításából áll

fluorokrómmal jelölt antiglobulin (anti-antitest) szérum. Ehhez a mikrobák szuszpenziójából származó keneteket antimikrobiális nyúldiagnosztikai szérum antitesteivel kezelik. Ezután a mikrobiális antigénekhez nem kötődő antitesteket lemossák, és a kenet antiglobulin (antinyúl) szérummal történő kezelésével kimutatják a mikrobákon maradó antitesteket.

fluorokrómok. Ennek eredményeként komplex mikroba + antimikrobiális nyúl antitestek + fluorokrómmal jelölt anti-nyúl antitestek képződnek. Ez a komplex fluoreszcensben figyelhető meg

mikroszkóp, mint a közvetlen módszernél.

23. Enzim immunoassay Összetevők, formulázás, elszámolás, értékelés. Felhasználási területek.

I Radioimmunoassay.

A radioimmun módszer vagy elemzés (RIA) egy rendkívül érzékeny módszer, amely az antigén-antitest reakción alapul, radionukliddal jelölt antigének vagy antitestek (125J, 14C, 3H, 51Cr stb.) felhasználásával. Kölcsönhatásuk után a keletkező radioaktív immunkomplexet leválasztják, és megfelelő számlálóban (béta- vagy gamma-sugárzás) meghatározzák radioaktivitását. A sugárzás intenzitása egyenesen arányos a megkötött antigén- és antitestmolekulák számával.

adjuk hozzá a páciens szérumát, az enzimmel jelölt antiglobulin szérumot és az enzim szubsztrátját/kromogénjét.

II. Az antigén meghatározásakor az antigént (például a kívánt antigént tartalmazó vérszérumot) a szorbeált antitestekkel ellátott üregekbe juttatják, az ellene diagnosztikai szérumot és az enzimmel jelölt másodlagos (diagnosztikai szérum elleni) antitesteket, és akkor szubsztrát/kromogén az enzim számára.

24. Immunlízis reakciók, alkalmazása. Komplementkötési reakció. Összetevők, összeállítás, elszámolás, értékelés. Alkalmazás.

A komplement rögzítési reakció (RCC) abból áll, hogy amikor az antigének és az antitestek megfelelnek egymásnak, akkor immunkomplexet alkotnak, amelyhez az antitestek Fc fragmentumán keresztül a komplement (C), a komplement pedig az antigén-antitest kötődik. összetett. Ha az antigén-antitest komplex nem képződik, akkor a komplement szabad marad. Az RSC-t két fázisban hajtják végre: 1. fázis - antigén + antitest + komplement tartalmú keverék inkubálása, 2. fázis (indikátor) - szabad komplement kimutatása a keverékben birka vörösvértestekből és hemolitikus szérumból álló hemolitikus rendszer hozzáadásával ellenanyagot tartalmaz. A reakció 1. fázisában, amikor antigén-antitest komplex képződik, komplementkötés következik be, majd a 2. fázisban az antitestekkel érzékenyített vörösvértestek hemolízise nem következik be (a reakció pozitív). Ha az antigén és az antitest nem egyezik (nincs antigén vagy antitest a vizsgált mintában), a komplement szabad marad, és a 2. fázisban csatlakozik az eritrocita-antieritrocita antitest komplexhez, hemolízist okozva (negatív reakció).

25. A sejtes immunválasz kialakulásának dinamikája, megnyilvánulásai. Immunológiai
memória.

Az immunsejt-válasz (CIR) az immunrendszer komplex, többkomponensű kooperatív reakciója, amelyet egy idegen antigén (T-sejt-epitópok) indukál. Az immunitás T-rendszere hajtja végre. KIO szakaszok

1. APC Antigen Capture

2. Processzor. AG proteaszómákban.

3. A komplex peptid + MHC I. és II. osztály kialakulása.

4. Az APC membránhoz való transzport kiegészítése.

5. Kiegészítő felismerés AG-specifikus T-helperek által 1

6. APC és T-helperek aktiválása 1, IL-2 és gamma-interferon felszabadulása E-helpers által1. Proliferáció és differenciálódás az AG-függő T-limfociták területén.

7. Különböző populációjú érett T-limfociták és memória T-limfociták kialakulása.

8. Érett T-limfociták kölcsönhatása AH-val és a vég-effektor megvalósulása.

A KIO megnyilvánulásai:

fertőzés elleni mesterséges intelligencia:

vírusellenes,

antibakteriális (intracellulárisan elhelyezkedő baktériumok);

IV. és I. típusú allergia;

daganatellenes IO;

transzplantációs AI;

immunológiai tolerancia;

immunológiai memória;

autoimmun folyamatok.

26. A T-limfociták szabályozó és effektor szubpopulációinak jellemzése. Fő
markerek. T-sejt receptor (TCR). A TCR diverzitás genetikai szabályozása

A T-limfociták képviselik a limfociták második fontos populációját, amelyek prekurzorai a csontvelőben képződnek, majd vándorolnak a további éréshez és

a csecsemőmirigybe való differenciálódás (a "T-limfocita" elnevezés a csecsemőmirigy-függőséget tükrözi, mint az érés korai szakaszának fő helyét).

A biológiai aktivitás spektruma szerint a T-limfociták szabályozó és effektor sejtek, amelyek biztosítják az immunrendszer T-rendszerének adaptív funkcióját. Nem termelnek antitestmolekulákat. A TCR egy membránmolekula, amely különbözik a HCR-től, de szerkezetileg és funkcionálisan hasonló az antitestekhez.

TCR - AG-specifikus. receptor. Ez az Ig szupercsaládba tartozó fő molekula. 3 részből áll: szupramembranosus, membrános és citoplazmatikus. A TCR farkát 2 globuláris alfa és béta molekula alkotja, amelyek változó és konstans doménekkel rendelkeznek (Vα és Vβ, Сα és Сβ).

Vα és Vβ alkotják az aktív TCR komplexet. 3 hipervariábilis régió létezik – konstans determinisztikus régiók (CDO). A KDO funkciója a T-sejt peptidek felismerése és megkötése, azaz. AG meghatározó csoportjai. A TCR szorosan ráül a sejtre, és citoplazmatikus farka, citoplazmatikus része részt vesz az inf. A sejtmagban az AG-val való kölcsönhatás során. Körülbelül 90% TCR. Alfa és béta láncokat hordoznak, és körülbelül 10%-uk gamma és delta láncokat.

A TCR genetikailag kódolt. Az α és γ láncokat az IG könnyű láncokkal analóg módon V, G és C gének kódolják, a β és δ láncokat pedig az IG nehéz láncokkal analóg módon a V, G, E. α és γ a 7. kromoszómán, valamint β és δ a 14. kromoszómán.

A CD-3 receptor egy komplementer szerkezet, egy Ig molekula. 3 transzmembrán fehérje alkotja: εδ, εγ és dimer-zeta., szupramembranosus, vembrán és citoszolos farok. Egyetlen komplexet képviselnek a TCR-rel, amely biztosítja az AG-specifikus jelek továbbítását a sejtmaghoz.

CD4 és CD8. Vagy a TCR-rel egyidejűleg, vagy attól elkülönítve fejeződnek ki. A társreceptorok funkcióját töltik be. Fokozza a tapadást az AG-t prezentáló sejthez. Biztosítják az AG-specifikus jel továbbítását a sejtmaghoz.

A T-limfociták a felismerés típusa szerint vannak felosztva, MOLEKULA:

CD4 rec. Peptide MHC 2. osztály

CD8 peptid + MHC 1. osztály

A T-limfociták fő szubpopulációinak jellemzői: a T-limfociták populációja három osztályba sorolható:

A. Helperek, HRT effektorok (CD 4+) és citotoxikus szuppresszorok (CD 8+);

B. Nem stimulált (CD 45 RA+) és memóriasejtek (CD 45 RO+);

C. 1. típus (IL-2, INF-gamma, TNF-béta termelő);
2. típus – (IL-4, IL-5, IL-6, IL9, IL-10 termelő).

Ez a módszer a lumineszcencia jelenségét használja.

A lumineszcencia jelenségének lényege abban rejlik, hogy amikor bizonyos anyagok molekulái különféle energiákat (fény, elektromos stb.) nyelnek el, azok atomjai gerjesztett állapotba kerülnek, majd visszatérnek eredeti állapotukba. , az elnyelt energiát fénysugárzás formájában bocsátják ki.

A RIF-ben a lumineszcencia fluoreszcencia formájában nyilvánul meg - ez egy olyan izzás, amely az izgalmas fénnyel történő besugárzás pillanatában jelentkezik, és azonnal leáll, miután véget ér.

Sok anyagnak és élő mikroorganizmusnak van saját fluoreszcenciája (az ún. elsődleges), de ennek intenzitása nagyon alacsony. Azokat az anyagokat, amelyeknek intenzív primer fluoreszcenciája van, és a nem fluoreszkáló anyagok fluoreszcens tulajdonságait adják, fluorokrómoknak nevezzük. Az ilyen indukált fluoreszcenciát másodlagosnak nevezzük.

A fluoreszcens mikroszkópiában a fluoreszcencia gerjesztésére leggyakrabban a spektrum ultraibolya vagy kék-lila részét (hullámhossz 300-460 nm) használják. Ebből a célból a laboratóriumokban különféle modellek lumineszcens mikroszkópjai vannak - ML-1-ML-4, "Lumam".

A virológiai gyakorlatban a fluoreszcens mikroszkópia két fő módszerét alkalmazzák: a fluorochromizációt és a fluoreszcens antitesteket (vagy RIF-et).

Fluorokrómozás- ez a készítmények fluorokrómmal való kezelése, lumineszcenciájuk erősségének és kontrasztjának növelése érdekében. A legérdekesebb a fluorokróm-akridin narancs, amely a nukleinsavak polikromatikus fluoreszcenciáját okozza. Tehát, ha a készítményeket ezzel a fluorokrómmal kezelik, a dezoxiribonukleinsav zölden, a ribonukleinsav pedig rubinvörösen fluoreszkál.

A RIF-módszer abból áll, hogy a fluorokrómhoz kapcsolódó antitestek megtartják azt a képességüket, hogy specifikus kapcsolatba lépjenek egy homológ antigénnel. A létrejövő antigén + antitest komplexet a benne lévő fluorokróm jelenléte miatt fluoreszcens mikroszkóp alatt jellegzetes izzással detektáljuk.

Az antitestek előállításához nagy aktivitású hiperimmun szérumokat használnak, amelyekből antitesteket izolálnak és fluorokrómmal jelölnek. A leggyakrabban használt fluorokrómok a FITC-fluoreszcein-izotiocianát (zöld fény) és a PCX-rodamin-szulfoklorid (piros fény). A fluorokrómmal jelölt antitestet konjugátumnak nevezzük.

A készítmények elkészítésének és festésének módja a következő:

• készítsen keneteket, nyomatokat a szervekről vagy fedőlemezeken - fertőzött sejttenyészet üveglemezeken; Szövetmetszet is használható;
• a készítményeket levegőn szárítják és hűtött acetonban szobahőmérsékleten vagy mínusz 15 °C-on rögzítik (15 perctől 4-16 óráig);
• közvetlen vagy közvetett módszerrel festett; fluoreszcens mikroszkóp alatt nyilvántartást vezetni a fény intenzitása szerint, keresztben becsülve.

Ezzel párhuzamosan készítsen és festsen preparátumokat egészséges állatból - kontroll.

A fluoreszcens antitestek alkalmazásának két fő módja van: közvetlen és közvetett.

Közvetlen módszer (egy lépéses). Konjugátumot (a feltételezett vírusra fluoreszkáló szérumot) viszünk fel a rögzített készítményre, és 30 percig inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten nedves kamrában. Ezután a hatóanyagot a meg nem kötött konjugátumról sóoldattal (pH 7,2-7,5) mossuk, levegőn szárítjuk, nem fluoreszcens olajat alkalmazunk és mikroszkóp alatt megvizsgáljuk.

A közvetlen módszer lehetővé teszi az antigén kimutatását és azonosítását. Ehhez minden vírushoz rendelkeznie kell egy fluoreszkáló szérummal.

Közvetett módszer (kétlépcsős). A fixált készítményre a feltételezett vírus elleni antitesteket tartalmazó jelöletlen szérumot felvisszük, 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, a meg nem kötött antitesteket lemossuk. A homológ antivirális antitesteket termelő állattípusnak megfelelő fluoreszcens fajellenes szérumot viszünk fel a készítményre, és 30 percig 37 °C-on inkubáljuk. Ezután a gyógyszert lemossuk a meg nem kötött jelölt antitestekről, levegőn szárítjuk, nem fluoreszcens olajat alkalmazunk és fluoreszcens mikroszkóp alatt megvizsgáljuk.

A fajellenes szérumokat úgy nyerik, hogy az állatokat azon fajok globulinjaival immunizálják, amelyek vírusellenes antitestek termelőjeként szolgálnak. Tehát, ha vírusellenes antitesteket kaptak nyulakon, akkor fluoreszcens anti-nyúl szérumot használnak.

Az indirekt módszer nemcsak az antigén kimutatását és azonosítását teszi lehetővé, hanem az antitesttiter kimutatását és meghatározását is. Ezen túlmenően ez a módszer egyetlen jelölt szérummal képes kimutatni különféle vírusok antigénjeit, mivel fajellenes szérumok felhasználásán alapul. Gyakrabban használják a nyúl-, szarvasmarha-, ló- és tengerimalac-globulinok elleni szérumokat.

Az indirekt módszer több módosítását is kidolgozták. A komplementet használó módszer érdemli a legnagyobb figyelmet. A módszer abból áll, hogy a rögzített készítményre inaktivált, nem fluoreszcens specifikus szérumot és tengerimalac-komplementet viszünk fel, 30 percig 37 °C-on tartjuk, mossuk, és fluoreszcens anti-komplementer szérum alkalmazásával kimutatjuk az antigén+antitest+komplement komplexet. 30 percig 37 °C-on tartva, mossuk, levegőn szárítjuk és fluoreszcens mikroszkóp alatt vizsgáljuk.

RIF előnyei: nagy specifitás és érzékenység; könnyű beállítási technika; minimális számú komponenst igényel. Ez egy expressz diagnosztikai módszer, mivel néhány órán belül választ kaphat. A hátrányok közé tartozik a szubjektivitás a lumineszcencia intenzitásának értékelésében, és sajnos a fluoreszcens szérumok néha rossz minőségűek. Jelenleg a RIF-et széles körben használják vírusos állatbetegségek diagnosztizálására.

Ha hibát talál, jelöljön ki egy szövegrészt, és kattintson rá Ctrl+Enter.

Koons 1942-ben fedezte fel, az immunfluoreszcens reakció nem új kutatási módszer. Azonban a hibridóma technológiák megjelenése, amelyek lehetővé tették a monoklonális antitestek előállítását, "második életet" adott ennek a reakciónak, mivel használatuk lehetővé tette a reakció érzékenységének és specificitásának többszörös növelését.

És ma részletesen elmondjuk Önnek a direkt és indirekt immunfluoreszcencia (RIF) reakcióját, mint Koons diagnosztikai módszert felnőtt férfiak és nők terhesség alatt.

Mi az immunfluoreszcens reakció

Kiváló lehetőséget jelent a pontos diagnózis gyors megszerzésére, az immunfluoreszcens reakció lehetővé teszi a kórokozó jelenlétének meghatározását a kóros anyagban. Ehhez speciálisan jelölt FITC-vel (fluoreszcein-izotiocianát) feldolgozott és heterogén elemzésként vizsgált anyagból kenetet használnak.

Az eredmény eléréséhez fluoreszcens mikroszkópot használnak, amelynek optikai rendszerében egy sor fényszűrő található, amelyek adott hullámhosszúságú kék-ibolya vagy ultraibolya fénnyel biztosítják a készítményt. Ez az állapot lehetővé teszi, hogy a fluorokróm egy adott tartományban ragyogjon. A kutató értékeli a ragyogás tulajdonságait, természetét, az objektumok méretét és egymáshoz viszonyított helyzetét.

Kinek van hozzárendelve

Az immunfluoreszcens reakció lefolytatása számos vírusos betegség diagnosztizálásában előírható. Különösen átfogó vizsgálatot írnak elő a következő tényezők azonosítására:

• vírus jelenléte a szervezetben;
• szalmonella fertőzés;
• bizonyos antigének jelenléte a szervezetben;
• feltárják a szervezet chlamydiával, mikoplazmákkal és más mikroorganizmusokkal való fertőzésének valószínűségét, amelyek képesek emberi vírusos betegségeket kiváltani;
• vírusos betegségek diagnosztizálása állatokban.

Ezek az indikációk lehetővé teszik az immunfluoreszcens reakció alkalmazását különböző természetű vírusos betegségek kimutatására az emberi és állati szervezetben.

Céljai a

Mivel ez a diagnosztikai módszer számos előnnyel rendelkezik, beleértve a nagy hatékonyságot, a lebonyolítás és az eredmények megszerzésének sebességét, valamint a nagyszámú ellenjavallat hiányát, ezért a vírusfertőzések szervezetben való jelenlétének meghatározására használják. Ezért ez az elemzés előírható mind a diagnózis felállításához, mind a diagnózis tisztázásához, amely alapján kezelési rendet írnak elő.

Az eljárás nem okoz kényelmetlenséget, ehhez az elemzéshez szükséges anyagot kell beszerezni, amelyet bármilyen testnedvből vesznek: nyál, köpet, nyálkahártya felületéről származó kaparék. Vér is vehető elemzés céljából. Az immunfluoreszcens reakció gyakoriságát a kezelőorvos írja elő, akinek adatokat kell szereznie a szervezetben előforduló folyamatok dinamikájáról.

Mivel ez az elemzés nem károsítja sem a testet, sem az ember általános jólétét, szükség esetén előírható.

Az ilyen eljárások típusai

Manapság ennek az elemzésnek számos változatát használják, amelyek mindegyike számos sajátos tulajdonsággal rendelkezik, és lehetővé teszi, hogy a legrészletesebb képet kapja a testben előforduló folyamatokról.

Az immunfluoreszcens reakciók típusai a következők:

1. - az egyik leggyorsabban fejlődő diagnosztikai típus, ez az elemzés lehetővé teszi a kvantitatív adatok beszerzését sorozathígítások alkalmazása nélkül. A kapott folyadék optikai sűrűségének mérései segítségével pontosan meghatározható a kívánt komponens koncentrációszintje. Az ilyen típusú elemzések széles lehetőségeit használják fel, amikor monoklonális antitesteket használnak a végrehajtásához, ami lehetővé teszi a fertőző folyamat fázisának, súlyosságának meghatározását;
2. DNS diagnosztika- ez a módszer a nukleotidok komplementer megkötésén alapul, amelyhez folyadékok, például nyál, vér, agy-gerincvelői folyadék, vizelet, köpet, biopsziás minták és vér használható. Ez a módszer a leghatékonyabban kimutatja a papillomavírusok jelenlétét a szervezetben, azonban számos modern tesztrendszer alkalmanként álpozitív és álnegatív eredményeket ad. Ennek oka lehet a specifikus DNS elemzésére szolgáló folyadékminták szennyeződése, amelyek jelenléte beágyazott vagy totális jellegű lehet;
3. immunkromatográfia- a kóros környezet és a vírusok szervezetben való jelenlétének meghatározására szolgáló módszer sajátossága, hogy a reakció során jelölt antitesteket használnak. Ezt a diagnosztikai módszert az A-csoportú streptococcusok, valamint a következő típusú chlamydia fertőzési folyamat azonosítására és aktivitási fokára használják: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia from Oxoid. A legnagyobb érzékenységgel rendelkező tesztrendszerek, amelyek ezen a kutatási módszertanon alapulnak. általában tájékozódási tesztként használják.

A felsorolt ​​fajták viselkedési jellemzőkkel és az eredmények sajátos jellemzőivel rendelkeznek, azonban mindegyik arra irányul, hogy adatokat szerezzen a kóros mikroorganizmusok és vírusok testben való jelenlétéről, valamint szaporodásuk és aktivitásuk mértékéről.

A végrehajtás jelzései

Immunfluoreszcens reakció előírható bármilyen kóros környezet kimutatására a szervezetben.

A chlamydia, a trichomonads, a gonococcusok és minden típusú lamblia meghatározása az ilyen típusú diagnózis során történik. és más betegségek is igényelnek RIF-et. Ennek végrehajtásához orvos kijelölése kötelező.

Ellenjavallatok a tartásra

Mivel ehhez a reakcióhoz bármilyen testfolyadékra van szükség vizsgálati anyagként, ezek bevétele általában nem nehéz, és nincs ellenjavallat az immunfluoreszcens reakció végrehajtásának. Terhesség alatt és 6 hónaposnál fiatalabb gyermekeknél azonban a kutatási célú mintavételt a legnagyobb elővigyázatossággal végezzük.

Az ellenjavallatok hiánya lehetővé teszi az ilyen típusú diagnózis elvégzését, amikor az orvos minden betegnek felírja. Biztonságát fertőtlenített műszer és eldobható fecskendők használata garantálja.

Az eljárás előkészítése

Az elemzéshez nem szükséges anyagokat venni. A vért éhgyomorra veszik, hogy ne legyen benne olyan magas anyagtartalom, amely megváltoztathatja az igaz tanúságot és hamis képet ad.

Milyen a mintavétel

Mivel az analízishez nincs szükség különösebb előkészületre, csak az előtte 12 órával evett, és a kábítószer-használat hiánya kizárt, ezért a vizsgálati anyagot a testfolyadék elemzésre való szokásos folyamataként vesszük.

Az eljárás során a szubjektív érzések az érzékenységtől függően változhatnak.

Az eredmények megfejtése

A modern tesztrendszerek használata lehetővé teszi a legpontosabb elemzési eredmények elérését. Az eredmény megfejtéséhez a következő adatokat használjuk:

• a fluoreszcencia intenzitása;
• fluoreszcens árnyalat;
• a tárgy izzó folyamatának periférikus jellege;
• a vizsgálati anyag morfológiájának jellemzői, a kórokozó elhelyezkedése a vett kenetben és méretei.

A nagyméretű objektumok (például Gardenerella, Trichomonas, vírus által már érintett sejtek) vizsgálata során a fent felsorolt ​​kritériumok lehetővé teszik a legmegbízhatóbb eredmények elérését. A mycoplasma és a chlamydia elemi testeinek mérete azonban a fluoreszcens mikroszkóp felbontásának határán van, ami megnehezíti

megnehezíti a pontos eredmény elérését, mivel a perifériás izzás veszít intenzitásából. A fennmaradó kritériumok már nem elegendőek a vizsgált mikroorganizmusok pontos azonosításához. Emiatt speciális követelményeket támasztanak az ilyen típusú kutatásokat végző szakemberekkel szemben: képzettségük szintjének elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy a rendelkezésre álló adatokkal tudja dolgozni.

Emiatt csak megfelelő képesítéssel rendelkező orvos foglalkozhat a kapott elemzés dekódolásával. A RIF-kutatás áráról alább olvashat.

átlagköltség

Az immunfluoreszcens vizsgálat ára az egészségügyi intézmény helyétől és szintjétől, valamint az elemzést végző szakember képzettségétől függ. Ma a költségek 1280 és 2160 rubel között mozognak.

Az alábbi videó többet mond az immunológiai reakciókról:

Két lehetőség van a RIF (Coons-reakció) beállítására - közvetlen és közvetett immunfluoreszcens reakciók.

A közvetlen RIF egy egyszerű egylépéses reakció, de mivel nagy mennyiségű

jelölt antimikrobiális szérum, akkor ritkábban közvetett, melynek termelését egy jelölt antiszérum biztosítja.

Az indirekt RIF egy kétlépcsős reakció, amelyben az antigént először jelöletlen fajszérummal kötik meg, majd a képződött antigén-antitest immunkomplexet FITC-jelölt antiszérummal kezelik, amely ennek a komplexnek az immunglobulinja elleni antitesteket tartalmaz. Általában az elkészítésének I. szakaszában az állatok megfelelő mikroorganizmussal történő immunizálásával nyert immunnyúlszérumot használják fajszérumként, a II. szakaszban pedig szamarak vagy más, nyúl gamma-globulinokkal immunizált állatok FITC-vel jelölt nyúl elleni szérumát ( 9. ábra).

Közvetlen RIF beállítás. Zsírmentes üveglemezen a vizsgált anyagból vékony keneteket, szervekről és szövetekről keneteket-lenyomatokat készítenek. A készítményeket megszárítjuk, fixált, munkahígításban vett lumineszcens szérumot alkalmazunk rájuk, és 37 °C-os nedves kamrába helyezzük 20-30 percre (25-40 percre szobahőmérsékleten). Ezután a fluoreszcens antitestek feleslegének eltávolítása érdekében a készítményt pufferolt izotóniás nátrium-klorid-oldatban 10-15 percig mossuk, majd 10 percig desztillált vagy folyó vízben öblítjük. Szárítsuk meg szobahőmérsékleten, és vizsgáljuk meg fluoreszcens mikroszkóp alatt, olajimmerziós rendszer segítségével.

A bakteriális sejtek specifikus fluoreszcenciájának intenzitásának értékeléséhez négy plusz skálát használnak: "++++", "+++" - nagyon fényes és fényes; "++", "+" - a sejtek kifejezett és gyenge vastagbél zöld fluoreszcenciája. Három kontroll kötelező: 1) kezelés homológ baktériumok fluoreszcens antitesteivel (pozitív kontroll); 2) heterológ tenyészet (negatív kontroll); 3) nem fertőzött anyag (negatív kontroll).

Antikomplementer RIF. A reakció a CSC módosítása, amelyben FITC-vel jelölt antikomplementer antitestek szolgálnak indikátorrendszerként (10. ábra).

Az indirekt anti-komplementer RIF-et a következőképpen állítjuk fel: az antigén készítményt a RIF-hez hasonlóan üveglemezen készítjük el, de az I. szakaszban nem egy immunszérummal, hanem annak tengerimalac komplementtel való keverékével dolgozzuk fel, majd a szakaszban. II. komplementer FITC-jelölt antitesteket tartalmazó antiszérummal. Az anti-komplementer RIF széles körben elterjedt alkalmazását korlátozza az anti-komplementer antitestek beszerzésének nehézsége és a "címkézés" módja.